外源蛋白在芽孢杆菌中分泌表达的研究进展

《生物工程进展》2000,Vol.20,No.5

外源蛋白在芽孢杆菌中分泌表达的研究进展

邓兵兵综述　熊凌霜校审

(军事医学科学院八所　北京　100071)

摘要　芽孢杆菌是很有潜力的分泌型基因工程宿主菌。本文概述了利用芽孢杆菌分泌表达外源基因时,影响目的蛋白产率的一些主要因素,如蛋白酶水解作用、缺乏适宜的分子伴侣、信号肽的选择不当等,并讨论了相应的解决对策。

关键词　芽孢杆菌　分泌表达　外源蛋白

外源蛋白以分泌形式表达的优点主要在于,目

的蛋白能以活性结构生成而不发生聚集,避免了复

性的困难,产物与大量的细胞蛋白分离,较易于纯

化。因此,用分泌型宿主菌生产外源蛋白的研究越

来越为人们所关注。

芽孢杆菌具有良好的分泌特性,其发酵工艺和

产物回收技术也较成熟,用作外源蛋白的分泌型宿

主菌,具有很大的潜力[1]。研究表明,不少外源蛋

白都能在芽孢杆菌中分泌表达,有些还获得了较高

的产率。当然,芽孢杆菌分泌表达系统还存在不少

问题,如何构建有效的芽孢杆菌分泌系统并获得较

高的外源蛋白产率,涉及的内容很多,本文仅就引起

外源蛋白分泌障碍的主要因素作一介绍,并简要讨

论相应的解决对策,包括如何保护外源蛋白抵抗宿

主蛋白酶的降解作用,如何利用信号系统和分子伴

侣等来优化分泌系统等。

1　蛋白酶的水解作用

表1　枯草芽孢杆菌蛋白酶的性质

基因蛋白酶类型信号肽前肽成熟序列

npr E中性蛋白酶Ⅱ27194300

胞　外蛋白酶apr E枯草杆菌蛋白酶Ⅰ2977275 epr次要丝氨酸蛋白酶Ⅰ2776645 bpf芽孢杆菌肽酶FⅠ165681433 m pr次要金属蛋白酶Ⅱ3458

胞内isp21Ⅰ319

蛋白酶isp22Ⅰ

芽孢杆菌自身能产生并分泌多种蛋白酶[2],以枯草芽孢杆菌(B.subtilis)为例,其蛋白酶如表1所示,Ⅰ类为丝氨酸蛋白酶,Ⅱ类为金属蛋白酶,其中中性蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶被称为主要蛋白酶,它们的酶活加起来占总酶活的95%以上。这些蛋白酶的特性有:①胞外酶都由含前肽序列的前体合成,可能有共同的分泌和成熟机制;②Ⅰ类蛋白酶的N端氨基酸序列高度相似,次要丝氨酸蛋白酶和芽孢杆菌肽酶F的C端可缺失。但Ⅱ类蛋白酶组成差异较大,次要金属蛋白酶的组成与真核生物的酶(如人蛋白酶E)更相似;③蛋白酶基本上在稳定期形成;④主要蛋白酶由相同的调节基因族调控,如spo0、prt R、sac Q、sac U、sac V、hpr、sen S等。随着研究的进展,新的蛋白酶还在不断地被发现,如在B.subtilis中发现了依赖A TP的Lon2like蛋白酶。

芽孢杆菌分泌的外源蛋白往往被这些高水平分泌的蛋白酶降解,严重影响了目的蛋白的产率,为解决这个问题进行了以下探索:

111　构建蛋白酶突变菌株

通过基因转换或替代技术产生的蛋白酶突变株,可使一种或数种蛋白酶失活或根本不表达。目前已报道了多种芽孢杆菌蛋白酶突变株,均显示出外源蛋白产率的提高,而且菌体的生长及孢子的形成没有受到影响。WB600和WB700分别是缺失六种和七种蛋白酶的B.subtilis突变株,其残余蛋白酶活性分别只相当于野生株的013%和011%,用于生产antidigoxin?SCA片断和链激酶,产率和稳定性都得以显著提高[3]。另一种六种蛋白酶缺失的B. subtilis突变株,其分泌的β-内酰胺酶的半衰期从115h延长到了85h[4]。

一般来说,缺失的蛋白酶基因种类越多,越有利于外源蛋白的产率和活性维持。不过蛋白酶突变株并不能完全解决外源蛋白被降解的问题,尤其是那些蛋白酶高敏性蛋白,即使仅存011%的蛋白酶活也足以使其降解。另外,有报道蛋白酶突变株较之

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野生株在生长稳定期易发生裂解,这可能是因为突变同时也降低了蛋白酶对自溶酶的作用。

112　采用很少或根本不分泌蛋白酶的芽孢杆菌菌株

短小芽孢杆菌(B.brevis)在这方面前途看好,它有较强的分泌能力,而且胞外蛋白酶活性很弱。如B.brevis47的胞外蛋白酶活性水平只是B.sub2 tilis的116%,B.brevis HPD31的蛋白酶活性几乎检测不到。利用B.brevis的这些特点,已构建成功多种有效的外源蛋白分泌载体。如用B.brevis生产抗人尿激酶原的鼠/人嵌合抗体(Fab’),经简单的摇瓶培养,产量就能达到100mg/L[5]。在Udaka 等构建的一系列B.brevis分泌表达载体中,细菌蛋白的产量一般可达到高于1g/L水平,动物蛋白产量大多比细菌蛋白的低1～2个数量级,不过他们用B.brevis481和926中的pWT481和pS0926质粒构建的分泌载体p H Y481和p HT100,稳定性相当好,用以生产hEGF,产量高达3g/L[6]。这些结果显示,B.brevis用于外源蛋白的分泌表达很有潜力,尤其用于真核生物蛋白的生产,比其它芽孢杆菌更具优势。

113　控制外源蛋白在对数生长期分泌

芽孢杆菌的蛋白酶基本上在稳定期分泌,在对数生长期分泌的很少,所以如果能使外源蛋白在对数生长期分泌,就有可能大大减少蛋白酶对它的降解。这方面应用较多的是果聚糖蔗糖酶(levansu2 crase)系统[7]。果聚糖蔗糖酶是芽孢杆菌的一种胞外酶,由sac B基因编码。利用sac B基因启动子2信号序列构建的诱导型表达/分泌载体,经蔗糖诱导,能使外源蛋白在对数生长期分泌表达。此外,还可通过恒化培养延长对数生长期,以提高外源蛋白产量。

114　采用蛋白酶抑制剂

PMSF和ED TA是最常用的蛋白酶抑制剂,但它们对菌体的生长有一定副作用,应谨慎使用。某些氨基酸、多肽和糖类(如葡萄糖)以及温度、p H等发酵条件,对蛋白酶的合成或降解作用的速率也会有一定的抑制作用。

2　分子伴侣及相关酶的协助作用

分子伴侣具有识别并调节细胞内多肽的折叠、装配,介导线粒体蛋白跨膜转运、调控信息传递通路和转录复制、参与微管形成与修复等多重功能。缺乏合适的分子伴侣是许多外源蛋白,尤其是真核生物蛋白,在芽孢杆菌中分泌表达的一个重要障碍。例如,大肠杆菌OmpA和Omp F的易位需要分子伴侣secB的协助,将它们融合于芽孢杆菌α2淀粉酶信号肽,在B.subtilis中虽然能合成蛋白前体,但却不能被分泌,其原因很可能就是由于B.subtilis中缺乏SecB。提高芽孢杆菌自身某些分子伴侣的表达水平,或引入适宜的外源分子伴侣,是解决这一问题的两种途径。

芽孢杆菌自身含有较高水平的分子伴侣,如Gro ES、Gro EL、DnaJ和Grp E等。Wong等报道,B. subtilis的Gro EL和Gro ES超量生成,使目的蛋白antidigoxin?SCA的产量提高了215倍[8]。PrsA是芽孢杆菌中蛋白分泌后期的一种重要分子伴侣,它在易位后蛋白的正确折叠以及释放等过程中发挥作用。不少实验证明其超量生成能提高目的蛋白的产量,并推测它可能是分泌机制的限速成份之一。

在B.subtilis中共表达大肠杆菌secB能刺激MBP(maltose2binding protein)前体(带天然MBP信号序列)的加工以及成熟MBP的分泌。这说明,如果一种外源分子伴侣与芽孢杆菌分泌系统活性兼容,共表达该分子伴侣可能有利于目的蛋白的分泌。有时利用芽孢杆菌自身的信号序列引导外源蛋白分泌,也能达到同样的效果。如上例中采用 B.sub2 tilis枯草杆菌蛋白酶信号序列时,不需要共表达secB,MBP也能分泌。

影响外源蛋白分泌的另一个影响因素是与折叠相关的酶,如肽基脯氨酰顺反异构酶(PPⅠ)和二硫键氧化还原酶(BDB),它们分别协助蛋白中脯氨酸残基的顺反异构化和二硫键的形成,有利于新生肽链的正确折叠,尤其对真核生物蛋白的分泌有利。这两种酶已被克隆到芽孢杆菌工程菌中,用以提高目的蛋白的产量。

3　信号肽的选择及其与成熟蛋白的融合

信号肽的功能在于调节蛋白前体折叠,引导蛋白易位(translocation),对蛋白的分泌起着至关重要的作用。在芽孢杆菌宿主系统中,革兰氏阳性菌的胞外蛋白基因一般都能利用自身的启动子和信号肽有效分泌表达,其产物也能相对地耐受宿主蛋白酶;而革兰氏阴性菌胞外蛋白和真核蛋白的分泌表达则比较困难,通常都要借助于带有芽孢杆菌胞外蛋白启动子和信号序列的分泌载体才能有效进行。值得注意的是,同一种蛋白在不同信号肽的作用下,即使都能分泌表达,其分泌效率也会相差甚远。如Na2

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garajan 选择了枯草杆菌蛋白酶、中性蛋白酶、芽孢

杆菌RNA 酶(barnase )和果聚糖蔗糖酶等四种酶的信号肽,以芽孢杆菌B E1510为宿主菌,分别研究它们对重组链霉抗生物素蛋白(streptavidin )分泌效果的影响。结果表明,携带四种融合基因的菌株都能有效分泌四聚体链霉抗生物素蛋白,但以用中性蛋白酶信号肽时效率最高[9]。

构建芽孢杆菌分泌载体的另一环节是信号肽和外源蛋白之间的融合,通常是将成熟蛋白基因的5′端与信号序列的3′端融合,且保持阅读框不发生改变。融合位点多选择在紧跟信号肽或其下游几个氨基酸残基处。正确的融合位点对于保持分泌蛋白的天然N 端、

维持切割位点处于能够被有效加工的状态是非常重要的。Hemila 等分别在信号肽疏水核心的始端、末端、紧随信号肽和成熟α2淀粉酶的4号碱基位等处,将解淀粉芽孢杆菌α2淀粉酶的信号肽与胡罗卜软腐欧文氏杆菌(Erw i nia carotovora )的聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase )构成融合蛋白。结果表明,当融合位点在疏水核心末端的脯氨酸残基处时,信号肽加工效率最高,聚半乳糖醛酸酶产量也最高[10]。

4　信号肽及成熟蛋白的结构

根据研究报道,芽孢杆菌信号肽自身结构对分泌效率的影响至少表现在四个方面:①增加信号肽N 端的正电荷有利于提高信号肽的加工效率。②增

加信号肽疏水核心H 区的疏水性或长度,有利于提高信号肽的加工效率。③C 端氨基酸残基的缺失,使H 区更靠近切割位点,可能有利于蛋白的易位;而增加信号肽C 端的极性,则可能会使信号肽的空间结构发生变化,降低其加工效率。④信号肽切割位点的氨基酸序列的改变会影响信号肽的加工效率。由此看来,适当改造信号肽结构,可提高外源蛋白的分泌效率。Sagiya 等利用提高N 端正电荷和

H 区疏水性的方法,使金枪鱼生长激素(tuna growth hormone ,t GH )产率提高了10倍,终产量达240mg/L [11]。

许多成熟蛋白内部都存在影响自身易位的重要序列,其长度、折叠构象直接影响分泌效果。通过蛋白质工程改造成熟蛋白的结构以满足分泌表达的需要,是值得探索的方法。有研究报道,将链激酶靠近切割位点一侧的氨基酸序列由疏水性改变为亲水性,能提高分泌链激酶的活性,从而提高了目的蛋白产率。另外,用极性残基替代外源蛋白表面暴露区域的非极性残基,或在C 端或N 端加入一种促溶解

基元(motif ,含三个Lys 残基),都可以提高蛋白的可溶性和产率,这已在大肠杆菌中得到了验证[8]。5　分泌系统的过载

外源蛋白在高拷贝质粒中的高表达可能会使芽孢杆菌分泌系统过载,阻碍目的蛋白的分泌,尤其是当外源蛋白与分泌载体不完全匹配时,过载引起的分泌障碍更显突出。在蛋白合成、转运的各个阶段都可能出现过载现象,引发这种现象的因素也较多,如强启动子、高拷贝数、增强因子(如degU9)等。改变启动子和拷贝数,可在一定程度上解决这一问题。如用B.subtilis 表达金黄色葡萄球菌(S.

aureus )蛋白A 时,用其自身的启动子构建高拷贝

质粒,没有目的产物生成;替换成较弱启动子时,就能得到分泌表达的目的蛋白。当然,最好是设法提高表达载体的分泌能力。芽孢杆菌中存在一系列的与分泌相关的蛋白因子(如Sec 家族),超量或共同表达这些因子,有可能提高表达载体的分泌能力[8]。

6　细胞壁的障碍

芽孢杆菌的细胞壁由肽聚糖和磷壁酸或糖醛酸质构成,在细胞外形成一个带负电荷的网。分泌蛋白穿过细胞壁的过程主要与细胞壁结构的性质(如金属离子交联度、多孔性等)和蛋白自身的特性(如分子量、折叠特性等)有关,多数分泌蛋白均可顺利完成,但有些蛋白则会遇到不容忽视的障碍。如,人血清白蛋白在B.subtilis 中能顺利易位,但只有除去细胞壁的肽葡聚糖层时,它才能被分泌到培养基中。这方面B.brevis 的情况好些,它的肽葡聚糖层要薄得多,分泌蛋白较易穿过其细胞壁。也有人采用芽孢杆菌的抗生素抗性突变株,改变了细胞壁结构,使目的蛋白的分泌效率有所提高。另外,改变培

养基中的限定成份(如Mg ++、PO 3+

4)可以改变细胞壁的阴离子多聚层(anionic polymer )的结构,引起蛋白分泌量的改变[12]。7　培养条件的改进

改进发酵培养条件,有时能起到意想不到的作用。有报道采用琥珀酸和低通气量,可将目的蛋白

TEM β2内酰胺酶的产量提高50～60倍[1]。另外,在

B.brevis 蛋白酶突变株培养中添加0101%

Tween40和2%聚乙二醇4000,t GH 的产量提高了

4

6

50倍[11]。其原因可能是由于Tween40降低了目的蛋白和细胞膜间的相互作用,聚乙二醇则加速了蛋白的折叠。

除了上述的内容,关于芽孢杆菌分泌表达系统尚有其他问题有待进一步研究。首先需更深入地探索其分泌机制,透彻了解蛋白转运及折叠过程,尤其是分泌限速因素,对基因工程菌株的构建工作有重要的指导作用。其次,应利用先进的发酵技术和蛋白的优化设计,补偿菌株自身的某些缺陷,提高目的蛋白的产率。另外,将各种改进策略有机地结合使用,应能更显著地提高外源蛋白的分泌效率。

总之,近年来对在芽孢杆菌中分泌表达外源蛋白的研究取得了很大进展,建立了一系列有效的外源蛋白表达系统,尤其是B.subtilis和B.brevis表达系统,已在一些有价值的多肽生产上获得了成功(表2),显示出良好的应用前景。

表2　在芽孢杆菌中分泌外源蛋白

Protein Origin Host Production(g/L)Secretion Ref Prok auyotes

α2Amylase B.licheniformis B.brevis 3.5+6 CTB Vibrio cholene5698 B.brevis 1.4+13 S2subunit of PTB Bordetella Pertussis Tohama B.brevis0.07+14α2Toxin Clostridium Perfringens B.brevis+15α2Amylase Thermactinomyces vulgaris B.subtilis0.07+16β2Lactanase Bcillus cereurs B.subtilis0.5+17 Euk aryotes

mEGF mouse B.brevis0.05+18 Fab’human B.brevis0.1(shake flask culture)+5 IL22human B.brevis0.12+19α2Amylase human B.brevis>1+20 hEGF human B.brevis>1+20 hEGF human B.brevis3+6 Growth homone tuna B.brevis0.24+6 Isomerase Humicola insolens(?) B.brevis0.3+6 Growth homone human B.subtilis0.05～0.21+21 antidigoxin?SCA B.subtilis0.05(shake flask culture)+8 IL23human B.licheniformis0.1+

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(2):101-112

Advances in the Studies of Secretion Expressing of Foreign Proteins in Bacillus species

Deng Bing2bing　Xiong Ling2shuang

(Institute of Biotechnology,Beijing100071)

Abstract　B acill us species are promising hosts for the production of heterologous secretory proteins.This article reviews the factors affecting production and secretion of foreign proteins in B acill us expressing system, such as the proteolysis of proteases,the lacking of proper chaperones,the selection of signal peptides and so on. Some solutions to these problems are discussed.

K ey w ords　B acill us　Secretion expressing　Foreign protein

(接第56页)

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枯草芽孢杆菌在农业领域的应用研究进展

龙源期刊网 https://www.wendangku.net/doc/c95415499.html, 枯草芽孢杆菌在农业领域的应用研究进展 作者：张洁朱仁胜王春芳千淋兆冯梦喜许鹏 来源：《现代农业科技》2019年第13期 摘要 ; ;本文綜述了近年来枯草芽孢杆菌在农业中的应用研究进展，包括提高作物抗性、促进作物生长、改良土壤、改良作物品质等方面内容，以期为枯草芽孢杆菌未来在农业上的应用提供一定的参考。 关键词 ; ;枯草芽孢杆菌;作物生长;土壤改良 中图分类号 ; ;S154.3 ; ; ; ;文献标识码 ; ;A 文章编号 ; 1007-5739（2019）13-0163- 01 ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; 开放科学（资源服务）标识码（OSID） 枯草芽孢杆菌是一种植物根际促生细菌，于1872年由Cohn正式命名[1]，其广泛存在于 自然界中，便于筛选分离，其所需营养成分简单、生长繁殖速度快、适应性及抗逆性极强，利于大量培养。枯草芽孢杆菌能够分泌多种蛋白类和激素类活性物质，天然无毒害，是一种高效、经济、环保的微生物“工具”。近年来，枯草芽孢杆菌在提高作物抗性、促进作物生长、改良土壤、改良作物品质4个方面的研究不断深入，笔者对此进行了综述。 1 ; ;提高作物抗性 枯草芽孢杆菌通过降低作物病害、增加作物抗逆境能力以及克服作物连作障碍等3个方面综合提高作物的抗逆性。枯草芽孢杆菌具备定殖能力，可以在作物根、茎、叶内部和土壤中成功定殖，定殖量均可达到104 CFU/g以上的水平[2-3]，从而抢占空间与营养，阻碍病原菌对作物的侵染与伤害。同时，枯草芽孢杆菌在定殖后可以产生抗生素[4]、抗菌蛋白等活性物质使 菌丝发生扭曲、肿胀和变形[5]，进而抑制病原菌的生长，实现对病害的防治。郑小亮[6]通过分级沉淀，获得一种新的抗菌粗蛋白，可使菌丝生长的形态畸形、底端膨大并抑制孢子的萌发，实现对禾谷镰刀菌的抑制。 枯草芽孢杆菌还可以诱导作物在逆境中产生抗性，经枯草芽孢杆菌GB03菌液浸泡处理后的紫花苜蓿种子，发芽势与发芽率均显著提高，株高、根长和生物量在不同盐浓度处理下，均有不同程度提升[7]。尹汉文等[8]研究发现，在1 g/L NaCl胁迫下，添加枯草芽孢杆菌增加了苜蓿株高与叶面积，苜蓿产量较未添加菌剂处理增加18%且在一定程度上提高了苜蓿的耐盐性。

蛋白质结构与功能的研究进展

《生物化学》课程论文 姓名：曹SS 学号：11310300SS 专业：SS教育 成绩： SS学院生命科学学院 2015年 1 月 1 日

文献综述 蛋白质结构与功能的研究进展 学生：曹SS 指导老师：杜SS 【摘要】人类基因组计划即将完成。虽然基因组的序列作为信息库拥有大量的、重要的生物信息资源，但并不是基因本身,而是基因组所编码的蛋白质才能够直接参与和指导绝大多数的生物学过程。毫无疑问，只有阐明蛋白质的作用机理，才能够真正理解基因的功能。蛋白质结构与功能关系的揭示将有助于人类对于如生殖、发育、疾病等生命活动的基本机理的了解。同时，将对于人类疾病的防治和药物的发明具有重要的指导意义。 【关键词】蛋白质；结构；功能 1.引言 在人类进人21世纪新纪元之际,生命科学也迎来一个崭新的时代,即“后基因组时代(Post一genome era)”。在这一时代中,生命科学的中心任务是揭示基因组及其所包含的全部基因的功能,并在此基础上阐明遗传、发育、进化、功能调控等基本生物学问题,以及进一步解决与医学、环境保护、农业密切相关的问题。由于基因的功能最终总是通过其表达产物—蛋白质来实现的,因此,要了解基因组全部功能活动,最终也必须回到蛋白质分子上来。现已知道,以蛋白质为主体的生物大分子的功能主要决定于它们的三维结构,所以也有人认为当代生物学研究已经进人了“结构基因组时代(structural genomics era)”。目前,我们还不可能只用基因组DNA的一维序列去确定生命活动的机理(mechanism)和途径(path-way),也难以仅用基因的信息去解释疾病发生与发展的分子机理。显然,在人类基因组之后的时代,在有关生命活动整合知识的指导下,以蛋白质及其复合物、组装体为主体的生物大分子的精细三维结构及其在分子、亚细胞、细胞和整体水平上的生物学功能的研究是生命科学的重大前沿课题,也是当前生物学领域中最具有挑战性的任务之一,在后基因组时代生物学发展中处于战略性的关键地位。因此,在从现在到今后的5到15年中,我国在重点基础研究发展的战略性规划中,不失时机地组织精干的结构生物学研究队伍,开展对重要功能基因表达产物—蛋白质及其复合物、组装体的结构与功能的研究具有重要的科学意义,是推动我国生物学研究在21世纪生物学领域占据一席之地的必要措施[1]。 另外，以蛋白质为主体的生物大分子及其复合物和组装体三维结构与功能关系研究是生

外源蛋白在巴氏毕赤酵母中高效表达的策略

第22卷 第3期 吉首大学学报(自然科学版)Vol.22 No.3 2001年9月J ournal of J ishou University(Natural Science Edi ti on)Sept.2001 文章编号:1007-2985(2001)03-0040-05 外源蛋白在巴氏毕赤酵母中高效表达的策略 聂东宋,梁宋平,李 敏 (湖南师范大学生命科学院,湖南长沙 410081) 摘 要:高效表达外源蛋白,在理论和实践上特别是在生物制药中具有重要意义,巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)是表达外源蛋白最理想的真核表达系统之一.影响外源蛋白在P.pas toris中表达的因素很多,主要包括外源基因自身的特性、载体、宿主细胞几个方面,了解和灵活运用它们的联系,有助于获得外源基因在P.pastoris中的高效表达. 关键词:巴氏毕赤酵母;外源蛋白;高效表达 中图分类号:Q75 文献标识码:A 巴氏毕赤酵母(P.pastoris)是一种单细胞真核生物,基因工程菌近年来已被广泛用于商业化生产外源蛋白.与其它表达系统比较,该系统具有以下优点:(1)高表达.该表达系统利用醇氧化酶基因启动子很强,细胞生长速度快,所以该表达系统表达的外源蛋白产量很高,如破伤风毒素蛋白的产量高达12g/L[1],其它表达系统一般为毫克级.(2)高稳定.由于该表达系统的表达载体不是以自主复制的质粒形式存在,而是整合到酵母染色体上,所以构建的菌株十分稳定.(3)高分泌.P.pastoris中一些分泌信号和先导序列如a-因子的分子生物特性已研究得十分清楚,加之它身体的生物学特性,其分泌表达可达10g/L,这在已知的分泌表达系统中是十分罕见的.虽然已有许多蛋白在P.pastoris中实现了高效表达,但仍有一些蛋白表达量相对较低,如 -cryptogein表达量级为1~5mg/L[2],AFP在摇瓶中表达时最高水平不超过5mg/L[3],有些甚至不能表达,如HIV表面糖蛋白[4].此外,酵母表达系统的局限性还在于分泌表达产物的不均一性,如信号肽加工不完全,表达产物内部降解等现象[5] 其次,当利用该系统的载体将外源基因通过双交换整合到宿主体中AOX1基因位置时,AOX1基因被破坏,这样使细胞利用甲醇能力大大降低.从而大大延长了细胞培养发酵时间.这种外源蛋白表达的差异,一方面是由于外源基因本身的特性而引起的,另一方面,表达条件也对表达量起了极其重要的作用.笔者综述了影响甲醇酵母中外源基因高效表达的各种因素,并阐述了优化外源蛋白在P.pastoris中高效表达的策略. 1 外源基因本身的特性对表达的影响 1 1外源基因的A+T组成 外源基因本身的4种核苷酸的组成对基因的表达起重要作用.许多高A+T含量的基因通常会由于提前终止而不能有效转录,共有序列ATTATTTTATAAA就是一个转录提前终止信号 Caro1A Scorer[6]在表达人免疫缺损病毒(HI V)包膜糖蛋白gp120时,这个信号造成了gp120的转录提前终止.提前终止被认为是一种具有种族特异性的现象,如在P.pastoris中不能表达的HIVE NV蛋白在酿酒酵母中表达良好.[4]因此,可以通过调整高A+T含量区的核苷酸的组成来避免提前终止的发生,使其A+T含量在30%~50% 收稿日期:2001-08-05 基金项目:国家自然科学基金资助项目(39670392) 作者简介:聂东宋(1967-),男,湖南省衡阳县人,湖南师范大学硕士研究生,主要从事基因结构与功能研究.

响应面法优化枯草芽孢杆菌产蛋白酶的发酵条件

响应面法优化枯草芽孢杆菌产蛋白酶的 发酵条件 张　智，朱宏亮，钮宏禹，罗欢华 （东北林业大学林学院，黑龙江　哈尔滨 １５００４０） 摘 要：在单因素试验的基础上，应用响应面分析法对影响枯草芽孢杆菌产蛋白酶的因素进行分析，得到了最佳发酵条件为温度４０℃、ｐＨ８．０４、接种量８．３％、发酵时间５６ｈ，此条件下的蛋白酶酶活为２４７．８　Ｕ／ｍｌ，比单因素试验的最高酶活２２８．３Ｕ／ｍｌ提高了８．５４％。关键词：枯草芽孢杆菌；蛋白酶；响应面 Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｂｙ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ｗｉｔｈ　Ｒｅｓｐｏｎｓｅ 　Ｓｕｒｆａｃｅ　Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ＺＨＡＮＧ　Ｚｈｉ，ＺＨＵ　Ｈｏｎｇ－ｌｉａｎｇ，ＮＩＵ　Ｈｏｎｇ－ｙｕ，ＬＵＯ　Ｈｕａｎ－ｈｕａ（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，　Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　Ｈａｒｂｉｎ １５００４０，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ　：Ｏｎ　ｔｈｅ　ｂａｓｉｓ　ｏｆ　ｓｉｎｇｌｅ－ｆａｃｔｏｒ　ｔｅｓｔ，　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ａｎａｌｙｚｅ　ｔｈｅ　ｍａｉｎ　ｆａｃｔｏｒｓ　ａｆｆｅｃｔｉｎｇｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｂｙ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ．　Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ａｒｅ　ａｓ　ｆｏｌｌｏｗｓ：４０　℃，　ｐＨ　８．０４　ａｎｄ　ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ　ａｍｏｕｎｔ　８．３％，　Ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅｓｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，　ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｓ　ｕｐ　ｔｏ　２４７．８　Ｕ／ｍｌ　ａｆｔｅｒｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　５６　ｈｏｕｒｓ．　Ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｓ　ｈｉｇｈｅｒ　８．５４％　ｔｈａｎ　ｔｈｅ　ｈｉｇｈｅｓｔ　ｏｎｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｉｎｇｌｅ－ｆａｃｔｏｒ　ｔｅｓｔ，　ｗｈｉｃｈ　ｉｓｏｎｌｙ　２２８．３　Ｕ／ｍｌ． Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ；ｐｒｏｔｅａｓｅ；ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ 中图分类号：Ｑ８１５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２－６６３０（２００８）１２－０４００－０５ 收稿日期：２００７－１０－１８ 作者简介：张智（１９６４－）女，研究员，硕士，研究方向为食品发酵与食品微生物。Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈｌｗｚ０７＠１６３．ｃｏｍ 枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）是一种安全的蛋白酶 生产菌［１］，它可产生大量的胞外蛋白酶，在工业生产中应用广泛。主要应用有以下五个方面：（１）在食品工业中应用：如奶酪生产、焙烤食品、大豆、玉米的深加工［２－３］ 、水解产物的脱苦以及阿斯巴甜的合成等。（２）在制革行业中应用：如脱毛、脱皮等。（３）洗涤剂行业［４－５］，衣服的主要污染是汗液、血迹、食迹等。在汗液中除脂肪外，干物质的１／３是蛋白质。织物上的蛋白质，特别是陈化以后很难洗除，加入蛋白酶可大大的提高洗涤效果，延长织物的寿命，目前全世界洗涤剂用酶的消费量已达到１００００多吨。现已将蛋白酶加入牙膏、牙粉、漱口水中有助于去除牙垢。（４）医药行业，可作为消化、消炎、化痰止咳等药物以及治疗跌打伤、水肿血肿、消除坏死组织等。（５）除了应用于工业及医药行业外，还可以应用于基础研究中，蛋白酶的选择性肽键裂解可用于阐明结构功能关系、肽链合成以及蛋白质测序［６］等。现在蛋白酶的生产日趋火热。 响应面分析法［８］（ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ，ＲＳＭ）是一种优化工艺条件的有效方法，可用于确定各因素及其交互作用在工艺过程中对指标（响应值）的影响，精确地表述因素和响应值之间的关系，已被广泛地用于同时存在多因素影响的实验优化上。为了得到最佳产酶条件，本实验采用响应面分析法对影响菌种产酶的几个条件做了优化。１材料与方法１．１ 菌种 枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）本实验室保存，是经过选育筛选出来的产蛋白酶性能稳定的菌株。１．２ 培养基 斜面培养基：葡萄糖０．５％、酵母膏１％、蛋白胨０．５％、氯化钠０．２％、琼脂２％、自然ｐＨ值。

饲用枯草芽孢杆菌研究进展

饲用枯草芽孢杆菌研究进展 崔东良 （北京昕大洋科技发展有限公司） 1.枯草芽孢杆菌介绍 枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种。单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。好氧菌, 可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚[1]，广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故而得名。 2.枯草芽孢杆菌的益生作用 枯草芽孢杆菌的芽孢经食道进入胃后，能顺利通过胃酸环境到达肠道，在肠道中孢子萌发形成营养细胞，并开始大量繁殖。枯草芽孢杆菌为好氧菌，进入肠道后会消耗游离氧，有利于厌氧微生物乳酸菌和双歧杆菌的生长，从而调节肠道内微生态的菌群平衡，提高机体免疫和抗病能力，减少肠道疾病的发生；枯草芽孢杆菌在肠道内繁殖会分泌淀粉酶和蛋白酶，和消化道内的消化酶一起发挥作用，帮助对营养物质的消化和吸收；其产生的维生素、氨基酸、短链脂肪酸等物质能增加小肠蠕动速度，改善肠道消化功能[2]。 3.枯草芽孢杆菌的发酵研究 饲用枯草芽孢杆菌的发酵研究的目的是为了获得大量活菌体和抗逆性强的芽孢，发酵研究的重点主要集中在如何用廉价易得的原料通过优化组合得到得高浓度的菌体，没有复杂的代谢调控和次级代谢的研究。目前关于枯草芽孢杆菌的发酵只要有液体发酵和固体发酵两种工艺。 3.1液体深层发酵 深层液体培养目前发酵工业上常用的一种发酵方法。该方法在发酵罐内完成，设备利用率高、产品质量稳定，便于自动控制，已广泛用于食品、化工、环境行业。液态深层培养是当前饲用枯草芽孢杆菌发酵研究的主要方向。周映华[3]等对枯草芽孢杆菌的发酵培养基和发酵条件进行了筛选优化，通过单因素试验及正交试验方法，确定了该枯草芽孢杆菌的优化培养基和最适发酵条件，通过发酵罐放大培养获得的菌体数量约为1.58×109 cfu/mL。刘辉[4]等通过正交优化试验对一株枯草芽孢杆菌的发酵培养基进行了优化, 当培养基中2%豆粕液浓度为15g/L、红糖浓度为20g/L、硫酸铵浓度为10g/L时, 在接种量为5%的情况下, 采用此

蛋白质工程的现状发展及展望

蛋白质工程的现状发展及展望 摘要: 蛋白质工程是用分子生物学手段对蛋白质进行分子改造的技术。介绍了蛋白质工程的几种常用方法及其基本原理和研究进展。 关键词: 蛋白质工程;定点诱变; 定向进化 20世纪70年代以来, 对蛋白质的分子改造渐渐进入研究领域, 通过对蛋白质分子进行突变, 得到具有新的表型和功能或者得到比原始蛋白相对活力更高的突变体,对蛋白质的分子改造技术逐渐纯熟。蛋白质工程的主要技术分为理性进化和非理性进化,已经在农业、工业、医药等领域取得了较大的进展。 1.理性进化 理性进化主要是利用定点诱变技术, 通过在已知DNA序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段达到定点突变氨基酸残基的目的。运用该技术已有不少成功改造蛋白质的例子。Markus Roth通过同源性比对和定点突变技术, 对EcoR DNA甲基化酶进行改造,使其对胞嘧啶的亲和性增加了22倍。定点突变还主要应用于蛋白质结构和功能的研究方面。酰基载体蛋白(ACP)的主要作用是在单不饱和脂肪酸的特定位置引入双键, Caho通过定点突变研究, 发现将五个氨基酸残基置换之后的酶, 由6- 16 : 0- ACP脱氢酶变成9- 18 : 0- ACP脱氢酶。Van den Burg利用蛋白同源建模和定点突变技术结合的方法将从Bacillus stear other mophilus分离出来的嗜热菌蛋白酶突变, 得到的突变体稳定性提高了8倍, 100 在变性剂存在的情况下还能发挥作用,但是大部分单个氨基酸的改变对于整个蛋白的影响比较小,很难在高级结构上改变蛋白质的三级结构, 从而造成很大的影响, 所以在定点突变的基础上又出现了许多新的技术, 用于改造蛋白质分子。[1] 2.非理性进化 非理性蛋白质进化, 又称定向进化或者体外分子进化,在实验室中模拟自然进化过程, 利用分子生物学手段在分子水平增加分子多样性, 结合高通量筛选技术, 使在自然界中需要千百万年才能完成的进化过程大大缩短,在短期内得到理想的变异。这种方法不用事先了解蛋白质结构、催化位点等性质, 而是人为地制造进化条件, 在体外对酶的编码基因进行改造, 定向筛选, 获得具有预期特征的改良酶, 在一定程度上弥补了定点诱变技术的不足, 具有很大的实际应用价值。一个比较成功应用定向进化的例子是对红色荧光蛋白的改造。绿色荧光蛋白由于

毕赤酵母表达手册

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毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白 综述： 基本特征： 作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。 与酿酒酵母相似技术： 许多技术可以通用： 互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。 毕赤酵母是甲醇营养型酵母： 毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。 两种醇氧化酶蛋白： 毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1及AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物。甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。 表达： AOX1基因的表达在转录水平受调控。在甲醇中生长的细胞大约有5%的polyA+ RNA 来自AOX1基因。AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长（去抑制）时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。 AOX1突变表型： 缺失AOX1基因，会丧失大部分的醇氧化酶活性，产生一种表型为Muts的突变株（methanol utilization slow），过去称为Mut，而Muts可更精确地描述突变子的表型。结果细胞代谢甲醇的能力下降，因而在甲醇培养基中生长缓慢。Mut+（methanol utilization plus）指利用甲醇为唯一碳源的野生型菌株。这两种表型用来检测外源基因在毕赤酵母转化子中的整合方式。 蛋白胞内及分泌表达： 外源蛋白可在毕赤酵母胞内表达或分泌至胞外。分泌表达需要蛋白上的信号肽序列，将外源蛋白靶向分泌通路。几种不同的分泌信号序列已被成功应用，包括几种外源蛋白本身分 制作者：陈苗商汉桥

产蛋白酶菌株枯草芽孢杆菌的分离

实验一产蛋白酶菌株枯草芽孢杆菌的分离 一、教学目标及基本要求 1. 学习从各种样品中分离微生物的操作技术 2. 掌握分离微生物时定性测定产物的筛选方法 3. 学习和掌握枯草芽孢杆菌的分离技术 4. 掌握高产蛋白酶菌株的初筛方法 二、实验原理 枯草杆菌是属于芽孢杆菌属的一类细菌。枯草芽孢杆菌的分布十分广泛，主要存在于土壤或腐烂的稻草之中。由于能够形成芽孢，因此能够抵抗高温，低温等不良环境，所以是实验室及工业生产中主要污染菌之一，危害极大。但是许多枯草芽孢杆菌能分泌蛋白酶、淀粉酶、抗菌素等物质，是工业酶制剂生产的重要菌种。例如，我国使用的BF7658枯草芽孢杆菌生产а-淀粉酶，用于淀粉水解，纺织品退浆等。又如AS1398枯草杆菌是生产蛋白酶的重要菌株。 1. 枯草芽孢杆菌的芽孢耐热的特点。 由于芽孢具有较强的抗高温能力，分离纯化时可采用热处理的方法，即通过高温加热杀死其中不生芽孢的菌种，使耐热的芽孢菌得到富集。 2. 枯草芽孢杆菌的产酶特征。 利用枯草芽孢杆菌产生水解酶的特性，可以选择酪蛋白或淀粉为主要营养成分的分离培养基，因菌体分泌的酶可以将大分子的蛋白或淀粉水解而在菌落周围形成透明圈。根据透明圈直径(H)和菌落直径(C)之比值(H/C)可以初步确定酶活力，其比值越大，酶活力越高，进而可筛选出高产酶活的菌株。 3. 枯草芽胞杆菌的形态特征 枯草芽孢杆菌的细胞大小0.7×2～3 μm，营养细胞为杆状，杆端钝圆、单生或者短链，着色均匀，无荚膜，周边运动，革兰氏染色阳性。有芽孢0.6×1～1.5 μm，芽孢中生或近中生，壁薄，不膨大，孢子呈椭圆或长筒形，常为两端染色。菌落变化很大，枯草芽孢杆菌在麦芽汁琼脂培养基斜面上，菌落呈细皱状，干燥或颗粒状。在土豆培养基上菌落呈细皱状，干燥，有时呈现天鹅绒状的菌苔，在液体培养基表面形成银白色的菌膜。菌落粗糙，扁平、扩展，不透明，不闪光，表面干燥，污白色或微带黄色。 4. 枯草芽胞杆菌的生理生化特性 枯草芽孢杆菌能够液化明胶，冻化牛乳，还原硝酸盐，不产生吲哚，H2S，V-P反应阳性，水解淀粉。葡萄糖发酵产酸不产气，需氧，适温25～31℃生长。 三、实验材料 1. 样品：从地表下10~15cm的土壤或者枯枝烂叶、腐烂稻草中用无菌小铲、纸袋取土样， 并记录取样的地理位置、pH、植被情况等。（学生自取） 2. 培养基 ①肉汤培养基（附录Ⅱ-1.1）：100 mL/组，其中20 mL液体培养基/250 mL△中（内装玻璃

蛋白质工程及其应用研究进展

蛋白质工程及其应用研究进展 摘要：蛋白质工程是生物工程中五大工程之一，本文对蛋白质工程作了简要概述，介绍了蛋白质工程的特点，并从蛋白质结构分析结构、功能的设计和预测、蛋白的创造和改造等方面对蛋白质工程研究内容进行详细论述，并以实例作了蛋白工程的应用。 关键词：蛋白质工程特点；研究内容；实际应用；展望 蛋白质是生命的体现者，离开了蛋白质，生命将不复存在。可是，生物体内存在的天然蛋白质，有的往往不尽人意，需要进行改造。由于蛋白质是由许多氨基酸按一定顺序连接而成的，每一种蛋白质有自己独特的氨基酸顺序，所以改变其中关键的氨基酸就能改变蛋白质的性质。而氨基酸是由三联体密码决定的，只要改变构成遗传密码的一个或两个碱基就能达到改造蛋白质的目的。蛋白质工程的一个重要途径就是根据人们的需要，对负责编码某种蛋白质的基因重新进行设计，使合成的蛋白质变得更符合人类的需要。这种通过造成一个或几个碱基定点突变，以达到修饰蛋白质分子结构目的的技术，称为基因定点突变技术。 蛋白质工程是在基因重组技术、生物化学、分子生物学、分子遗传学等学科的基础之上，融合了蛋白质晶体学、蛋白质动力学、蛋白质化学和计算机辅助设计等多学科而发展起来的新兴研究领域。其内容主要有两个方面：根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质；确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系。在此基础之上，实现从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能，设计合成具有特定生物功能的全新的蛋白质，这也是蛋白质工程最根本的目标之一。 目前，蛋白质工程尚未有统一的定义。一般认为蛋白质工程就是通过基因重组技术改变或设计合成具有特定生物功能的蛋白质。实际上蛋白质工程包括蛋白质的分离纯化，蛋白质结构和功能的分析、设计和预测，通过基因重组或其它手段改造或创造蛋白质。从广义上来说，蛋白质工程是通过物理、化学、生物和基因重组等技术改造蛋白质或设计合成具有特定功能的新蛋白质。 1概念 按人们意志改变蛋白质的结构和功能或创造新的蛋白质的过程。包括在体外改造已有的蛋白质，化学合成新的蛋白质，通过基因工程手段改造已有的或创建新的编码蛋白质的基因去合成蛋白质等。为获得的新蛋白具备有意义的新性质或新功

毕赤酵母表达外源基因存在的问题与对策

万方数据

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毕赤酵母表达外源基因存在的问题与对策 作者：丁镌， 宋跃芬， 袁野， 刘娣 作者单位：丁镌,宋跃芬(东北农业大学动物科技学院,黑龙江,哈尔滨,150030)， 袁野(中国刑警学院警犬技术系,辽宁,沈阳,110034)， 刘娣(东北农业大学动物科技学院,黑龙江,哈尔滨 ,150030;黑龙江省农科院,黑龙江,哈尔滨,150086) 刊名： 畜牧与兽医 英文刊名：ANIMAL HUSBANDRY & VETERINARY MEDICINE 年，卷(期)：2007,39(2) 被引用次数：1次 参考文献(9条) 1.Li A;Xiong F;Lin Q Low temperature increases the yiede of biologically active herring antifreeze protein in Pichia pastoris[外文期刊] 2001(3) 2.Potter K L;Zhang W;Smith L A Production and purification of the heavy chain fragment C of botulinum neurotoxin,serotype A,expressed in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[外文期刊] 2000(3) 3.Inan M;Meagher M M The effect of ethanol and acetate on protein expression[外文期刊] 2001 4.Brierley R A Secretion of recombinant human insulin-like growth factor I (IGF-1) 1998 5.Dring F;Klapper M;Theis S Use of the glyceroldehyde 3phosphate dehydrogenase promoter for production of functional mammalian membrane transport proteins in the yeast Pichia Pastoris[外文期刊] 1998(2) 6.Goodrick J C;Xu M;Finnegan R High-level expression and stabilization of recombinant human chitinase produced in a continuous constitutive Pichia Pastoris expression system[外文期刊] 2001(06) 7.Scorer C A;Buckholz R G;ClareJ J The intracellular production and secretion of HIV-1 envelope protein in the methylotrophic yeast Pichia pastori[外文期刊] 1993 8.Monteino R;Garcia R;Quintero O Variation in N-linked oligosaccharide structures on heterologous proteins secreted by the methylotrophic yeast Pichia pastoris[外文期刊] 1998(02) 9.隋少飞;陈松林巴氏毕赤酵母表达系统的特点及其研究进展[期刊论文]-生物技术通讯 2004(03) 引证文献(1条) 1.王希辉.岳寿松.胡敬东.黄亦钧.陈金龙.王婷婷.范忠玲.赵宏坤鸡白介素18成熟蛋白突变体在毕赤酵母中的高效表达及其生物活性检测[期刊论文]-微生物学报 2010(9) 本文链接：https://www.wendangku.net/doc/c95415499.html,/Periodical_xmysy200702022.aspx

枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌产酶研究分析

个人收集整理仅供参考学习 枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌产酶分析 一、概述 1. 枯草芽孢杆菌 枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属地一种.单个细胞0.7～0.8 ×2～3微米，着色均匀. 无荚膜，周生鞭毛，能运动.革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9 ×1.0～1.5 微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大.菌落表面粗糙不透明， 污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭.需氧菌.可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚.b5E2RGbCAP 有地菌株是α-淀粉酶和中性蛋白酶地重要生产菌；有地菌株具有强烈降解核苷酸地酶系，故常作选育核苷生产菌地亲株或制取5'-核苷酸酶地菌种.在遗传学研究中应用广泛，对此菌地嘌呤核苷酸地合成途径与其调节机制研究较清楚.广泛分布在土壤及腐败地有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名.p1EanqFDPw

2.地衣芽孢杆菌 地衣芽孢杆菌，种属芽孢杆菌科细菌为革兰氏阳性杆菌；细胞大小：0．8μm×（1．5～3．5）μm；细胞形态及特点：细胞形态和排列呈杆状、单生.细胞内无聚-β-羟基丁酸盐（PHB ）颗粒，产生近中生地椭圆状芽孢，孢囊稍膨大. 在肉汁培养基上地菌落为扁平、边缘不整齐、白色、表面粗糙皱褶，24h 后菌落直径为3mm.本菌有动力.可调整菌群失调达到治疗目地，可促使机体产生抗菌活性物质、杀灭致病菌.能产生抗活性物质，并具有独特地生物夺氧作用机制，能抑制致病菌地生长繁 殖.DXDiTa9E3d 二、产酶地种类 1.枯草芽孢杆菌代谢产酶种类枯草芽孢杆菌产生多种酶和其他代谢产物，主要由以下几个方面：枯草芽孢杆菌菌体在生长过程中产生地枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质对致病菌或内源性感染地条件致病菌有明显地抑制作用；RTCrpUDGiT 枯草芽孢杆菌能迅速消耗消化道内环境中地游离氧，形成肠道低氧环境，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道PH 值，间接抑制其它致病菌地生长；5PCzVD7HxA 枯草芽孢杆菌能刺激动物免疫器官地生长发育，激活淋巴细胞，提高免疫球蛋白和抗体水平，增强细胞免疫和体液免疫功能，提高群体免疫力； jLBHrnAILg 枯草芽孢杆菌菌体能自身合成消化性酶类，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪

枯草芽孢杆菌的应用现状概述

生物学教学2019年(第44卷)第2期枯草芽孢杆菌的应用现状概述 闫杨刘月静陈芳！（山东聊城大学药学院聊城252059) 摘要枯草芽孢杆菌属革兰氏阳性菌#其细胞壁较厚，不含内毒素。枯草芽孢杆菌是一种应用广泛的益生菌，具有对环境友好、 对粮食安全、对人体及动植物无危害的优良特点，被广泛应用于动物饲料、净化水质、医药和植物病害的生物防治中。枯草芽孢杆 菌作为益生菌在微生物益生制剂中的应用也已展现出巨大的发展潜力。本文概述枯草芽孢杆菌应用的现状和发展趋势。 关键词枯草芽孢杆菌益生菌水质净化生物防治 芽孢杆菌是人们最早开始接触并研究的益生菌类 群，而枯草芽孢杆菌是其属中比较受关注的一种细菌。枯草芽孢杆菌是一种分布广泛、能生成抗逆性孢子、可 厌氧繁殖的革兰氏阳性菌[1]。枯草芽孢杆菌具有液化 明胶、还原硝酸盐以及水解淀粉的功能[2]，对动植物及 人体均有益无害。研究表明，枯草芽孢杆菌在动物饲 料、水产养殖业及植物病害防治等方面展现了优良的 特性，具有广阔的应用前景。 1枯草芽孢杆菌在动物饲料生产中的应用 枯草芽孢杆菌是动物饲料中常添加的益生菌种，它以芽孢的形式添加于动物饲料中。芽孢是处于休眠 状态的活细胞，能够耐受饲料加工过程中的不良环境，制备成菌剂后稳定且易存储，并且在进人动物肠道后 能够迅速复苏和繁殖。枯草芽孢杆菌在动物肠道中复 苏增殖后就可发挥其益生特性，包括改善动物肠道菌 群、增强机体免疫力以及提供多种动物所需的酶类等[3]，可以弥补动物体内源酶的不足，促进动物的生长 发育，具有显著的益生作用。例如，徐登峰等[4]的研究 表明，在动物饲料中添加枯草芽孢杆菌可以有效抑制 动物肠道中有害病原菌的生长，营造良好的肠道环境，保护了幼兔的肠黏膜，幼兔的腹泻发生率明显下降;赵 效南等[5]的研究表明，在动物饲料中添加的枯草芽孢 杆菌，能够有效调节动物肠道中菌群的种类结构，增加 肠道微生物菌群的多样性，能在抑制动物肠道中有害 菌生长的同时促进有益菌生长，进而达到促进家禽健 康生长的目的;华洵璐等[)]的研究表明，在动物饲料中 添加芽孢杆菌组合制剂后，仔猪对饲料中营养物质的 消化和吸收水平明显提高;赵玉超等[*]的研究表明，在 饲料中添加枯草芽孢杆菌能够显著影响三疣梭子蟹免 疫相关酶的活力，并能有效提高幼年三疣梭子蟹的存 活率。研究表明，在禽类、牲畜和水产动物的饲料中添 加枯草芽孢杆菌，可明显升高饲料的利用率，有效提高 动物的肠道菌群多样性，增强消化机能，有利于提高肉 品质量。 #枯草芽孢杆菌在水质净化中的应用 枯草芽孢杆菌可以作为微生物调节剂，起到改善 水质、抑制有害微生物的作用，能够创造优良的水生生态环境。水产养殖的水体由于长期高密度养殖动物，有大量的饵料残余、动物残骸和粪便沉积等污染物积 累，容易引起水质恶化进而危害养殖动物的健康，甚至 削减产量引起亏损，对水产养殖业的可持续发展危害 巨大。而枯草芽孢杆菌可以定殖在水体中，并通过营 养竞争或空间位点竞争形成优势菌群，抑制有害病原 菌（如弧菌、大肠杆菌）等有害微生物在水体中的生长 繁殖，从而改变水体和底泥中的微生物数量和结构，有 效预防水产动物因水质恶化而引起的疾病。同时，枯 草芽孢杆菌作为一种可以分泌胞外酶的菌种，其分泌 的多种酶类能够有效分解水体有机物，改善水质。例 如，枯草芽孢杆菌产生的活性物质几丁质酶、蛋白酶和 脂肪酶等，可以分解水体中的有机物，降解动物饲料中 的营养素，不但使动物充分吸收和利用饲料中的营养 物质，而且能大大改善水质;枯草芽孢杆菌还能调节养 殖水体的pH值。 $枯草芽孢杆菌在医药生产中的应用 枯草芽孢杆菌分泌的多种胞外酶已应用到许多不 同领域中，其中脂肪酶和丝氨酸纤溶蛋白酶（即纳豆激 酶）被广泛应用于医药行业。脂肪酶具有多种催化能 力，其在动物或人体的消化道中与原本存在的消化酶 类共同发挥作用，使消化道处于健康的平衡状态。纳 豆激酶是纳豆枯草芽孢杆菌分泌的一种丝氨酸蛋白 酶，该酶具有溶解血栓、改善血液循环、软化血管以及 增加血管弹性等作用。 枯草芽孢杆菌制剂能够有效促进成纤维细胞和血 管内皮细胞的增生，加速烧伤创面肉芽增生，对于预防 和治疗烧伤创面感染以及促进烧伤创面愈合具有良好 的作用[-]。早期新生儿常见高胆红素血症，目前临床 上常用蓝光照射治疗，但是黄疸程度重者常需要反复 照射，所需住院时间较长。黄永昌等[9]的研究发现，枯 草芽孢杆菌活菌胶囊的安全性较高、基本无不良反应，且口感较好，在临床上使用枯草芽孢杆菌活菌胶囊加 蓝光照射共同治疗早期新生儿高胆红素血症得到了很 好的效果，而且具有住院时间短、复发率低等特点。此 外，枯草芽孢杆菌的芽孢可作为黏膜佐剂用于疫苗的 制备，能有效刺激动物机体产生特异性的免疫反应。

蛋白质工程的主要研究方法和进展

蛋白质工程的主要研究方法和进展 李 强 施碧红* 罗晓蕾 左祖祯 邢佩佩 刘 璐 (福建师范大学生命科学学院,福建福州 350108) 摘 要:蛋白质工程是用分子生物学手段对蛋白质进行分子改造的技术。介绍了蛋白质工程的几种常用方法及其基本原理和研究进展。 关键词:蛋白质工程;定点诱变;定向进化 中图分类号 Q816 文献标识码 A 文章编号 1007-7731(2009)05-47-02 Advances in The Techni q ues of P rotein Engineering L i Q iang et al (Co llege o f L ife Sc iences,Fu jian N or m a lU n i versity,Fuzhou350108,Chi na) Ab strac t:P ro tein eng ineer i ng is a techn i que used to i m prove prote i n m o l ecular In th i s paper,seve ra l m ethods and t he ir pr i nci p les and their advantag es f o r m olecu lar m odifica ti on have been rev ie w ed K ey words:P rote i n eng i neer i ng;site-d i rected m utag enesis;d irected evoluti on 20世纪70年代以来,对蛋白质的分子改造渐渐进入研究领域,通过对蛋白质分子进行突变,得到具有新的表型和功能或者得到比原始蛋白相对活力更高的突变体,对蛋白质的分子改造技术逐渐纯熟。蛋白质工程的主要技术分为理性进化和非理性进化,已经在农业、工业、医药等领域取得了较大的进展。 1 理性进化 理性进化主要是利用定点诱变技术,通过在已知D NA序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段达到定点突变氨基酸残基的目的。运用该技术已有不少成功改造蛋白质的例子。M arkus Rot h通过同源性比对和定点突变技术,对E c o R DNA甲基化酶进行改造,使其对胞嘧啶的亲和性增加了22倍[1]。定点突变还主要应用于蛋白质结构和功能的研究方面。酰基载体蛋白(ACP)的主要作用是在单不饱和脂肪酸的特定位置引入双键,Cahoo 通过定点突变研究,发现将五个氨基酸残基置换之后的酶,由 6-16:0-ACP脱氢酶变成 9-18:0-ACP脱氢酶[2]。Van den Burg利用蛋白同源建模和定点突变技术结合的方法将从Bacill us stear other m oph il us分离出来的嗜热菌蛋白酶突变,得到的突变体稳定性提高了8倍,100在变性剂存在的情况下还能发挥作用[3],但是大部分单个氨基酸的改变对于整个蛋白的影响比较小,很难在高级结构上改变蛋白质的三级结构,从而造成很大的影响[4],所以在定点突变的基础上又出现了许多新的技术,用于改造蛋白质分子。 2 非理性进化 非理性蛋白质进化,又称定向进化或者体外分子进化,在实验室中模拟自然进化过程,利用分子生物学手段在分子水平增加分子多样性,结合高通量筛选技术,使在自然界中需要千百万年才能完成的进化过程大大缩短,在短期内得到理想的变异。这种方法不用事先了解蛋白质结构、催化位点等性质,而是人为地制造进化条件,在体外对酶的编码基因进行改造,定向筛选,获得具有预期特征的改良酶,在一定程度上弥补了定点诱变技术的不足,具有很大的实际应用价值。一个比较成功应用定向进化的例子是对红色荧光蛋白的改造。绿色荧光蛋白由于本身独特的发光性质,被应用到细胞生物学当中,作为体内原位跟踪蛋白质的一个极其有效的工具。D i sc oso m a红色荧光蛋白(Ds R ed)在荧光共振能量转移技术(fl uoresce nce resonance e ner gy tr ansfer)中可以和绿色荧光蛋白一起作用,作为研究两种蛋白质相互作用的有效工具,但是野生型的D s Red由于显色速率较慢,而且稳定性较差,B r oo ke B evi s建立随机突变文库,在103-105个转化子中筛选到了大大提高显色效率的突变体,使显色效率提高了10-15倍[5-6]。 易错PCR是利用DNA聚合酶不具有3!-5!校对功能的性质,在PCR扩增待进化酶基因的反应中,使用低保真度的聚合酶,改变四种d NTP的比例,加入锰离子并增加镁离子的浓度,使DNA聚合酶以较低的比率向目的基因中随机引入突变,并构建突变库。M oor e等对鼠伤寒沙门菌Sal m onella t yph m i uri u m产生的门冬氨酰二肽酶(asp art yld i pepti dase)进行改良,经两次易错PCR引入随机突变,并结合D NA改组和正向选择筛选,得到的pepEm3074突变株,其酶活力比野生菌提高47倍[7]。 D NA改组(DNA shuffli ng)技术克服了随机突变的随机性较大的限制,能够直接将多条基因的有利突变直接重组到一起,它的原理是使用D N ase?酶切或超声波断裂多条具有一定同源关系的蛋白编码基因,这些小片段随机出现部分片段的重叠,产生的片段在不加引物的情况下进行几轮PCR,通过随机的自身引导或在组装PCR过程中重 47 安徽农学通报,Anhu iAgri Sci Bu ll 2009,15(5) 作者简介:李强(1983-),男,辽宁抚顺人,硕士研究生,研究方向:分子遗传育种。*通讯作者 收稿日期:2009-01-15