双光子荧光寿命成像激光共聚焦扫描显微镜

双光子荧光寿命成像激光共聚焦扫描显微镜

院系：生命科学联合中心

双光子荧光寿命成像激光共聚焦扫描显微镜线粒体超氧炫、钙离子活动的机制和生理功能，活细胞内CaMKII酶活性和ATP浓度成像

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双光子探针原理

我今天讲解的文献题目是对生物组织中过氧化氢进行比率成像的一种双光子荧光探针。 背景知识：过氧化氢是活性氧族中的重要一员，活性氧族包括（超氧阴离子自由基、过氧氢自由基、羟基自由基、过氧自由基、单线态氧、次氯酸等）在生物组织的生理衰老及病理方面有着重要的作用。但是超过细胞正常水平的过氧化氢会引起DNA损伤、突变以及遗传的不稳定性。 1.与其他探针作比较：主要讲了采用硼酸盐机理保护的探针对过氧化氢具有较高的选择性，并在细胞中稳定成像，但是这些探针大多用于单光子显微镜并要求短波长激发，以上这些都限制了它在深入组织中的成像的应用。 与单光子探针比较。双光子显微镜比单光子显微镜具有穿透力强、定位激发以及延长观察时间等大量优点而在检测活细胞组织中的过氧化氢方面具有很好的应用前景。 2.探针设计要求：对过氧化氢高效的双光子探针应具有以下特点：在水溶液缓冲剂中具有足够大的溶解性、对过氧化氢具有较高的选择性、有较高的双光子活性横截面和在生物PH范围内有较稳定的光谱性质。 探针的合成：通过过氧萘引入含有硼酸基的氨基甲酸酯合成了AN1。与过氧化氢相连的硼酸盐与缺电子的氨基甲酸酯分离会得到富电的AN1，引起更多红移荧光散射。并在模拟生理环境下表征它的光学特性以及AN1的光学特性，而且PN1相对AN1发生了50nm的蓝移。AN1相对PN1有较大的位移是因为更稳定的电荷转移激发前荧光团的形态包括给电子基和吸电子基。 荧光性能测定：PN1与过氧化氢的反应主要通过发射荧光和液相色谱-质谱仪检测，产物AN1是主要的荧光物。 其他性能测定：1然后我们估测PN1在双光子模式下对过氧化氢的探测能力。 2PN1要比其他活性氧类对过氧化氢有更高的选择性。 2接下来力图利用PN1做双光子探针来检测细胞环境里过氧化氢含量的变化。 为了进一步建立PN1在生物成像领域的应用，我们也做了这个新探针在检测活的组织中过氧化氢含量变化的能力。 结论：最后我们得出结论，我们研究的这种新型双光子探针PN1具有大的荧光活性面、对过氧化氢有一个很明显的有蓝变绿的一个颜色变化过程、对活性氧类具有较好的选择性、低细胞毒性、对生物活性体内PH的变化不敏感等优点。这个新的探针可以对活细胞以及活组织中的过氧化氢深度范围成像而不受其他生物活性氧类的干扰。当前的努力主要是利用PN1以及对过氧化氢在复杂生物样本内的荧光成像化学过程的研究。

【CN209946009U】光学相干层析和双光子荧光同步成像系统【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)实用新型专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201920375721.9 (22)申请日 2019.03.22 (73)专利权人 中国科学院苏州生物医学工程技 术研究所 地址 215163 江苏省苏州市高新区科技城 科灵路88号 (72)发明人 徐欣　高峰　张欣　金幸杰　 (74)专利代理机构 北京远大卓悦知识产权代理 事务所(普通合伙) 11369 代理人 韩飞 (51)Int.Cl. G01N 21/64(2006.01) (ESM)同样的发明创造已同日申请发明专利 (54)实用新型名称 光学相干层析和双光子荧光同步成像系统 (57)摘要 本实用新型公开了一种光学相干层析和双 光子荧光同步成像系统，包括双光子光源、快轴 扫描模块、慢轴扫描模块、第一二向色镜、共用扫 描模块、光学相干层析模块、第二二向色镜、双光 子荧光成像模块以及成像显微物镜。本实用新型 的光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，通 过将双光子扫描成像技术和光学相干层析成像 技术相结合，采用共光路共振镜同步扫描成像方 法有效减少了系统硬件，实现了光学相干层析技 术和双光子荧光扫描成像扫描速度的有效利用， 达到了样品荧光快速面成像和断层成像的目的。权利要求书2页 说明书6页 附图2页CN 209946009 U 2020.01.14 C N 209946009 U

权　利　要　求　书1/2页CN 209946009 U 1.一种光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，其特征在于，包括双光子光源、快轴扫描模块、慢轴扫描模块、第一二向色镜、共用扫描模块、光学相干层析模块、第二二向色镜、双光子荧光成像模块以及成像显微物镜； 所述光学相干层析模块中发出的样品光经过所述慢轴扫描模块后透射所述第一二向色镜，所述双光子光源发出的飞秒激光经过所述快轴扫描模块后被所述第一二向色镜反射，与透射所述第一二向色镜的样品光相结合，共同经过所述共用扫描模块后透射所述二向色镜，再经过所述成像显微物镜后照射到样品上；飞秒激光激发样品产生的荧光经所述成像显微物镜后被所述第二二向色镜反射至所述双光子荧光成像模块进行荧光成像，样品光照射到样品上被反射形成的成像光沿原路返回，依次经所述成像显微物镜、透射第二二向色镜、共用扫描模块、透射第一二向色镜、慢轴扫描模块后进入所述光学相干层析模块进行层析成像。 2.根据权利要求1所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，其特征在于，所述双光子荧光成像模块包括沿光路依次设置的成像聚焦透镜、滤光片和探测器，样品被激发后发出的荧光经所述第二二向色镜反射后，依次经所述成像聚焦透镜、滤光片后由所述探测器接收，进行荧光成像。 3.根据权利要求2所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，其特征在于，所述快轴扫描模块包括快轴扫描振镜和快轴聚焦透镜，所述慢轴扫描模块包括慢轴扫描振镜和慢轴聚焦透镜。 4.根据权利要求3所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，其特征在于，所述共用扫描模块包括依次设置的共用扫描振镜、共用聚焦透镜和中继透镜组。 5.根据权利要求4所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，其特征在于，所述快轴扫描振镜的扫描轴方向与共用扫描振镜的扫描方向相互垂直，且所述快轴扫描振镜的扫描轴分别与所述双光子光源发出光的光轴以及快轴聚焦透镜的光轴垂直； 所述慢轴扫描振镜的扫描轴方向与快轴扫描振镜的扫描方向相互平行，且所述慢轴扫描振镜的扫描轴分别与所述光学相干层析模块发出光的光轴方向以及慢轴聚焦透镜的光轴垂直； 所述共用扫描振镜与所述快轴扫描振镜的扫描方向相互垂直，且所述共用扫描振镜的扫描轴分别与所述共用聚焦透镜、中继透镜组的光轴垂直。 6.根据权利要求5所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，其特征在于，所述慢轴聚焦透镜和共用聚焦透镜构成4f系统，所述慢轴扫描振镜和共用扫描振镜位于4f系统的透镜焦点位置；所述快轴聚焦透镜和共用聚焦透镜构成4f系统，所述快轴扫描振镜和共用扫描振镜位于4f系统的透镜焦点位置。 7.根据权利要求1所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，其特征在于，所述光学相干层析模块包括谱域光学相干层析系统或者扫频源光学相干层析系统。 8.根据权利要求1所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，其特征在于，所述第一二向色镜截止波长为900nm，长波反，短波通，其透射所述光学相干层析模块发出的样品光以及样品反射的成像光均，且反射所述双光子光源发出的飞秒激光。 9.根据权利要求1所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，其特征在于，所述第二二向色镜截止波长为650nm，长波通，短波反，其透射所述双光子光源发出的飞秒激光、 2

激光共聚焦扫描显微镜简介

激光共聚焦扫描显微镜简介 一、激光共聚焦显微镜的基本组成 激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope LSCM)是20世纪80年代发展起来的一项具有划时代意义的高科技新产品，是当今世界最先进的细胞生物学分析仪器。激光共聚焦显微镜利用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦的原理和装置，以及通过针孔的选择和PMT的收集，并带有一套对其所观察到的对象进行数字图像分析处理的系统软件。与传统光学显微镜相比，它具有更高的分辨率，实现多重荧光的同时观察并可形成清晰的三维图象等优点。所以它问世以来在生物学的研究领域中得到了广泛应用。 激光共聚焦显微镜主要有四部分组成：1、显微镜光学系统。2、扫描装置。3、激光光源。4、检测系统。整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。 1.1 显微镜光学系统 显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成象质量。显微镜光路以无限远光学系统可方便地在其中插人光学选件而不影响成象质量和测量精度。物镜应选取大数值孔径平场复消色差物镜，有利于荧光的采集和成象的清晰。物镜组的转换，滤色片组的选取，载物台的移动调节，焦平面的记忆锁定都应由计算机自动控制。 1.2 扫描装置 LSCM使用的扫描装置在生物领域一般为镜扫描。由于转镜只需偏转很小角度就能涉及很大的扫描范围，图象采集速度大大提高，512×512画面每秒可达5帧以上，有利于那些寿命短的离子作荧光测定。扫描系统的工作程序由计算机自动控制。 1.3 激光光源 LSCM使用的激光光源有单激光和多激光系统。多激光器系统在可见光范围使用多谱线氩离子激光器，发射波长为457nm、488nm和514nm的蓝绿光，氦氖绿激光器提供发射波长为543nm的绿光，氦氖红激光器发射波长为633nm的红光。 1.4 检测系统 LSCM为多通道荧光采集系统，一般有三个荧光通道和一个透射光通道，能升级到四个荧光通道，可对物体进行多谱线激光激发，样品发射荧光的探测器为感光灵敏度高的光电倍增管PMT，配有高速12位A/D转换器，可以做光子计数。PMT前设置针孔，由计算机软件调节针孔大小，光路中设有能自动切换的滤色片组，满足不同测量的需要,也有通过光栅或棱镜分光后进行光谱扫描功能的设置。 二、激光共聚焦显微镜的特点以及在生物领域的应用 与传统光学显微镜相比，激光共聚焦显微镜具有更高的分辨率，实现多重荧光的同时观察并可形成清晰的三维图象等优点，在对生物样品的观察中，激光共聚焦显微镜有如下优越性： 1、对活细胞和组织或细胞切片进行连续扫描，可获得精细的细胞骨架、染色体、细胞器和细胞膜系统的三维图像。 2、可以得到比普通荧光显微镜更高对比度、高解析度图象、同时具有高灵敏度、杰出样品保护。 3、多维图象的获得，如7 维图象(XYZaλIt): xyt 、xzt 和xt 扫描,时间序列扫描旋转扫描、区域扫描、光谱扫描、同时方便进行图像处理。

荧光成像的原理和方法

荧光成像的原理与方法 荧光成像在基因组学和蛋白质组学等生物学领域应用中的独特优势： 高灱敏度：灱敏度进超比色法，在大部分应用中其灱敏度近乎放射性同素。 多组样品一次成像：将不同样品（如：对照、处理）通过不同发射波长的荧光素标记（如 Cy3或 Cy5等）可以同时检测多样品荧光信号。 稳定性高：较放射性同位素相比，荧光素标记的抗体、杂交探针、PCR引物等的信号稳定性优势明显，可稳定存在数月以上，这使需要大规模标记并多阵列之间的标准化比较成为了可能。 低毒性成本低：多数情况下，荧光标记和检测的全过程试验用手套即可对实验者提供足够的保护。易于运输和实验后处理，多数情况下实验成本低于放射性同位素。 商业可获得性：许多重要的荧光标记型生物大分子如各种单抗、多抗、CAT等及荧光标记用试剂盒都可以方便获得,同时一些公司提供荧光标记的外包服务。 荧光信号的产生及信号捕获原理： 荧光物质被特定外界能量激发（如激光等高能射线），引起其电子轨道向高能轨道跃迁， 并最终释放能量回归基态的过程中会产生可被检测的荧光信号。当然不是所有的物质都能被激发产生荧光，只有当该物质与激发光具有相同的频率并在吸收该能量后具有高的荧光效率而非将能量消耗于分子间碰撞过程中，其荧光信号才可被光学设备所检测（Fig.1）。 Fig.1 ①激发能②无辐射弛豫能③荧光发射能。三种荧光素（绿色：fluorescein；黄色：DNA-bound TOTO TM；红色：DNA-bound EB）的激发光波长(a)和发射光波长(b)。 荧光成像系统的组件和工作原理： 荧光物质被激发后所发射的荧光信号的强度在一定范围内是与荧光素存在的量成线性关系的，这是荧光成像系统应用于生物学研究的理论基础，激光扫描系统的性能指标主要有：系统分辨率、线性范围、均一性、灱敏度。 为了实现荧光信号的激发、捕获和放大的检测过程，按照顺序荧光成像系统主要包括以下组件：激发源（Excitation resource）、激光传输组件（Light delivery optics）、荧光收集组件（Light collection optics）、发射滤镜（Emission filter）和信号检测放大组件（Detection and amplification）（Fig.2）。在荧光成像系统工作的过程中，每个组件的性能都关系着最终荧光信号的收集和检测结果。

激光共聚焦显微镜的原理与应用范围

激光共聚焦显微镜的原理与应用范围 激光扫描共聚焦显微镜是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。把光学成像的分辨率提高了30%~40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代的研究工具。 1激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）的原理 从基本原理上讲,共聚焦显微镜是一种现代化的光学显微镜,它对普通光镜从技术上作了以下几点改进: 1．1用激光做光源因为激光的单色性非常好,光源波束的波长相同,从根本上消除了色差。1．2采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个当中带有小孔的挡板,将焦平面以外的杂散光挡住,消除了球差;并进一步消除了色差 1．3采用点扫描技术将样品分解成二维或三维空间上的无数点,用十分细小的激光束(点光源)逐点逐行扫描成像,再通过微机组合成一个整体平面的或立体的像。而传统的光镜是在场光源下一次成像的,标本上每一点的图像都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。这两种图像的清晰度和精密度是无法相比的。 1．4用计算机采集和处理光信号,并利用光电倍增管放大信号图 在共聚焦显微镜中,计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像,得到的图像是数字化的,可以在电脑中进行处理,再一次提高图像的清晰度。而且利用了光电倍增管,可以将很微弱的信号放大,灵敏度大大提高。由于综合利用了以上技术。可以说ＬＳＣＭ是显微镜制作技术、光电技术、计算机技术的完美结合,是现代技术发展的必然产物。 2ＬＳＣＭ在生物医学研究中的应用 目前,一台配置完备的ＬＳＣＭ在功能上已经完全能够取代以往的任何一种光学显微镜,它相当于多种制作精良的常用光学显微镜的有机组合,如倒置光学显微镜、紫外线显微镜、荧光显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜(ＰＨ)、微分干涉差显微镜(ＤＩＣ)等,因此被称为万能显微镜,通过它所得到的精细图像可使其他的显微镜图像无比逊色。

双光子显微镜的独特优势.

相关技术指标与进口必要性 双光子显微镜的独特优势有以下几点： 1）双光子显微镜采用长波长激发，长波长的光比短波长的光受散射影响较小，容易穿透标本，双光子显微镜的穿透深度通常是共聚焦显微镜的2到3倍。对于皮层较深处神经元的活动观察更加全面。 2）焦平面外的荧光分子不被激发，成像的亮度和信噪比高。更加适合活体 下微弱荧光信号的观察。 3）长波长的近红外光比短波长的光对细胞毒性小，比较适合活细胞长时间的动态观察。 4）使用双光子显微镜观察标本的时候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。 所以，双光子显微镜比单光子显微镜更适合用来观察厚标本、更适合用来观察活细胞、或用来进行定点光漂白实验。 利用活体双光子显微镜，我们可以对脑科学的几个前沿领域进行更加深入的研究。利用活体双光子显微镜的光遗传学操作能力，我们可以对某类神经元的激活和失活进行高精度的操作，对这些神经元的特殊功能的进行研究。在活体水平下，我们可以对皮层在清醒、静息状态下就存在有组织的脑功能活动进行观察，从而加深我们对大脑在内外环境的监测、情节记忆及自我意识方面的理解。利用活体双光子显微镜的多点光激活能力，我们可以研究多个神经细胞之间的连接和控制，来更好的了解神经信号之间复杂动态的编码过程。目前国内没有同类产品，其他设备在各个技术层面都无法满足我单位要求，为更好的开展神经学研究，故申请购置此套设备。 主要技术指标： 1 显微镜 1.1 适用于活体动物操作的正置显微镜，物镜下自由空间高度≥23 cm； 1.2 显微镜镜体置于XY电动载物台之上，可通过移动显微镜镜体的方式 对样品进行定位和观察； 1.3 显微镜镜体移动通过软件控制，XY方向行程≥35 mm，步进≤100 nm； 1.4 配备长寿命落射荧光光源； 1.5 配备可观察FITC和DsRed的滤色块； 1.6 配备全角度物镜转盘，物镜可旋转、可倾斜，能够以任何角度垂直

LeicaSP8激光扫描共聚焦显微镜快速操作手册2013-5-13

Leica激光扫描共聚焦显微镜 快速操作手册 制作：徕卡显微系统（上海）贸易有限公司 2013年3月

目录： 1 系统的组成 系统组成 (3) 光路示意图 (4) 2 系统的使用 2.1 开机顺序 (5) 2.2 软件界面简介 (7) 2.3 在显微镜下观察样品 (8) 2.4 采集共聚焦图像 (9) 2.5 XYZ三维扫描（Z-Stack） (11) 2.6 时间序列扫描（Timeseries or xyt Scan） (15) 2.7 波长扫描（xyλScan） (16) 2.8 HyD检测器 (17) 2.9 图像的保存及输出 (18) 2.10 关机 (20) 3 系统的维护 (21)

Leica SP8 系统组成图

1可见波长激光或白激光15UVIS, HIVIS或VISIR的光路镀膜 2声光调制器（AOTF）16扫描视场旋转镜（Abbe-Konig 旋转）* 3红外激光（IR）* 17在NND位置上的反射光检测器（RLD）* 4电光调制器18物镜（可提供各种选择）* 5紫外激光* 19在NND位置上的透射光检测器（TLD）* 6 AOTF或直接调制器（DMOD）20正方型针孔 7STED 激光* 21Fluorifier盘* 8Setlight监控二极管22X1出口接口* 9AOBS, 及其他选配件23外置检测器* 10用于FRAP的光束增强镜* 24色散棱镜 11红外激光耦合25分开的荧光光谱 12与CS2紫外光路耦合的紫外激光26最多5个光电倍增管或4个HyD检测器 13STED激光耦合*选配组件 14全视野扫描镜及串行高速扫描镜选件

双光子荧光显微镜的原理特点

双光子荧光显微镜的原理特点 双光子荧光显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新技术。 双光子激发的基本原理是： 在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收2个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子;其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。 双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。 这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度只有100飞秒，而其周期可以达到80至100兆赫。 在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时，物镜的焦点处的光子密度是的，双光子激发只发生在物镜的焦点上，所以双光子显微镜不需要共聚焦针孔，提高了荧光检测效率。 为形态学、分子细胞生物学、神经科学、和药理学等研究领域中重要的研究手段。 1.双光子显微镜出现的背景----传统激光共聚焦显微镜的两大局限: 1)一是光毒性现象： 因为共聚焦的针孔必须足够小以获得高分辨率的图像，而孔径小又会挡掉很大部分从样品发出的荧光，包括从焦平面发出的荧光，相应的，激发光必须足够强以获得

足够的信噪比; 而高强度的激光会使荧光染料在连续扫描过程中迅速褪色，荧光信号会随着扫描进程度进行变得越来越弱。 2)光毒作用是另外一个问题，在激光照射下，许多荧光染料分子会产生诸如单态氧或自由基等细胞毒素，所以实验中要限制扫描时间和激发光的光功率密度以保持样品的活性。 在针对活性样品的研究中，尤其是活性样品生长、发育过程的各个阶段，光漂白和光毒现象使这些研究受到很大的限制。 2.为什么说双光子显微镜一般不需要配备紫外激发激光器? 双光子显微镜技术是建立在双光子激发效应的基础上的一种荧光激发技术：荧光染料分子可以同时吸收低能量的两个光子而被激发(两个光子到达荧光分子的时间间隔小于1飞秒)，其激发效果可以等同于吸收一个1/2波长的高能量光子。 例如，吸收两个红色波长的光子，相当于一个吸收紫外的分子。长波长的光子不易被细胞吸收，因此对活细胞的光毒性减少，也降低了光漂白。这样即起到紫外激发的功能，又避免了紫外光线对样品的伤害。 3.双光子显微镜的激光器有何特别之处? 双光子吸收几率依赖于两个入射光子在空间和时间上的重合程度(两个光子必须在10-18秒内到达)。双光子吸收截面很小，只有在具有很大光子流量的区域的荧光团才会被激发。 因此所用激光器多为钛宝石激光器，可以达到皮秒或者飞秒级的扫描速度，且具有非常高的峰值功率和较低的平均功率，从而可以减小或者消除光漂白和光毒作用。

激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用

激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用 一、激光扫描共聚焦显微镜的原理 传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM)采用点光源照射样本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜搜集，并沿原照射光路回送到由双色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点被挡在探测针孔之外不能成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学切面，避免了非焦平面上杂散光线的干扰，克服了普通显微镜图像模糊的缺点，因此能得到整个焦平面上清晰的共聚焦图像。 原理图 二、激光扫描共聚焦显微镜组成特点 LSCM由显微镜光学系统，激光光源，扫描装置和检测系统构成，整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地

进行。显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成像质量。通常有倒置和正置两种形式，前者在切片、活细胞检测等生物医学应用中使用更广泛。 三、激光扫描共聚焦显微镜的应用 （一）细胞的三维重建 普通荧光显微镜分辨率低，显示的图像结构为多层面的图像叠加，结构不够清晰。LSCM能以0.1μm的步距沿轴向对细胞进行分层扫描，得到一组光学切片，经A/D转换后作为二维数组贮存。这些数组通过计算机进行不同的三维重建算法，可作单色或双色图像处理，组合成细胞真实的三维结构。旋转不同角度可观察各侧面的表面形态，也可从不同的断面观察细胞内部结构，测量细胞的长宽高、体积和断层面积等形态学参数。通过模拟荧光处理算法，可以产生在不同照明角度形成的阴影效果，突出立体感。通过角度旋转和细胞位置变化可产生三维动画效果。LSCM的三维重建广泛用于各类细胞骨架和形态学分析、染色体分析、细胞程序化死亡的观察、细胞内细胞质和细胞器的结构变化的分析和探测等方面。（二）静态结构检测 1.细胞原位检测核酸 用于细胞核定位及其形态学观察、检测细胞内DNA的复制及断裂情况以及染色体定位观察。 2.原位检测蛋白质、抗体及其他分子 原位检测蛋白质、抗体及其他分子 免疫荧光标记技术 检测荧光蛋白 3.检测细胞凋亡 检测细胞凋亡不同时期细胞形态、细胞凋亡相关蛋白

双光子显微镜

双光子显微镜 https://www.wendangku.net/doc/c57346117.html,/view/1428311.htm?fr=ala0_1 双光子荧光显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新 技术。双光子激发的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收 2 个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子；其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度只有100 飞秒，而其周期可以达到80 至100 兆赫。在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时，物镜的焦点处的光子密度是最高的，双光子激发只发生在物镜的焦点上，所以双光子显微镜不需要共聚焦针孔，提高了荧光检测效率。双光子荧光显微镜有很多优点：1）长波长的光比短波长的光受散射影响较小容易穿透标本；2）焦平面外的荧光分子不被激发使较多的激发光可以到达焦平面，使激发光可以穿透更深的标本；3）长波长的近红外光比短波长的光对细胞毒性小；4）使用双光子显微镜观察标本的时候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。所以，双光子显微镜比单光子显微镜更适合用来观察厚标本、更适合用来观察活细胞、或用来进行定点光漂白实验。 激光共聚焦显微镜在进行生物样品研究工作中还存在很多局限和问题： 一是标记染料的光漂白现象。因为共焦孔径光阑必须足够小以获得高分辨率的图像，而孔径小又会挡掉很大部分从样品发出的荧光，包括从焦平面发出的荧光，相应的，激发光必须足够强以获得足够的信噪比；而高强度的激光会使荧光染料在连续扫描过程中迅速褪色，荧光信号会随着扫描进程度进行变得越来越弱。 光毒作用是另外一个问题，在激光照射下，许多荧光染料分子会产生诸如单态氧或自由基等细胞毒素，所以实验中要限制扫描时间和激发光的光功率密度以保持样品的活性。在针对活性样品的研究中，尤其是活性样品生长、发育过程的各个阶段，光漂白和光毒现象使这些研究受到很大的限制。 在传统荧光显微镜中，一个荧光团吸收一个光子，该光子能量对应于荧光团基态和激发态能量之差。通过一个较短寿命的虚态，也可以通过同时吸收两个较低能量（即更高的波长）的光子激发荧光。例如，吸收两个红色波长的光子，可以激发一个吸收紫外的分子。双光子激发是一个非线性过程，对激发光强度有平方依赖关系。

双光子荧光探针的研究进展

有机双光子材料的研究进展 随着以光电子学为中心的信息时代的到来，具有特殊信息处理功能和超快响应的光电材料将成为未来信息材料发展的主体，而非线性光学材料就是其中发展较为迅猛的一种。非线性光学是强光光学，研究的是物质在强光作用下产生的输出光强度与原入射光的非线性关系。非线性光学材料在强光作用下，反映介质性质的物理量（如极化强度P等）不仅与场强E的一次方有关，而且还决定于E的更高幂次项，从而导致许多在线性光学中不能解释的新现象，表现出独特的非线性光学性质。双光子吸收属于三阶非线性光学效应的一种，有着独特的光学和电学效益，使得双光子技术在未来光电子集成、生物分子探测、医学诊断等领域具有巨大的应用潜力和广阔前景[1]。 一、双光子吸收的基本概念 双光子吸收属于三阶非线性光学效应，该理论最早是由Goeppert- Mayer于1931年首次提出的。它是指在强激光激发下，利用近两倍于样品的线性吸收波长的光源激发该样品，使其通过一个虚中间态(virtue state)直接吸收两个光子跃迁至高能态的过程，所吸收的两个光子的能量可以相同(ω1=ω2，简并吸收)，也可以不同(ω1≠ω2，非简并吸收)，其机理如图1所示。 图1 单、双光子吸收和发射机理示意图 和单光子吸收和发射相比，双光子吸收和发射有以下本征特点： （1）在材料中高的穿透深度。单光子荧光过程是短波激发长波发射，吸收和发射所涉及的基元光物理过程服从Stark-Einstein定律。而双光子荧光是长波激发短波发射，所用激发光的波长红移近一倍，一般位于600-900nm，远远低于单光子过程紫外辐照光(波长为250-400nm)的光子能量。这一波段的光具有很好的穿透性，Rayleigh散射小，背景光干扰小，便于观测，并且光损伤、光漂白、光毒性都较小。

LSM780双光子激光共聚焦显微镜技术参数

1.设备名称 双光子荧光寿命成像激光共聚焦扫描显微镜 2.数量 1套 3.设备用途说明 4.工作条件 电源220V±10%，50HZ 室温：20~25℃ 其他：防尘，除湿，抗震动 工作台：牢固，稳定，防震 5.规格、技术要求及参数 5.1 双光子飞秒激光器部分 5.1.1Ar激光：458nm、488nm、514nm，25mW 5.1.2HeNe激光：543nm，1mW 5.1.3HeNe激光：633nm，5mW 5.1.4405激光：405nm，30mW 5.1.5*红外飞秒脉冲激光器，波长范围:680-1080nm, 包含负色散补偿功能 5.1.6根据标本的情况利用飞秒激光器的双光子可观看800微米深度样品数据。 5.1.7*稳定的可见光AOTF，同时控制激光各波长的激光强度，8通道，切换时间<5 微秒。AOTF对激光强度的控制连续可调（0~100%），步进0.1%）。 5.1.8每支激光器通过独立的光纤连接到扫描器部分，光纤即插即用，无需校准。 5.1.9光纤末端具有可对激光进行聚焦的集光镜，电动调节。 5.1.10具有8个激光光路接口和红外飞秒激光器直接耦合端口。 5.2扫描器 1

5.2.1扫描器（含检测器）与显微镜直接连接于显微镜端口（非光纤连接），一体化设 计，一体化像差及色差校正。 5.2.2*整个光路的光学设计适用波长范围为360nm～1000nm全光谱范围。 5.2.3每个荧光检测器具有独立的10级可调数码增益。 5.2.4有可调大小的针孔，调节范围为连续调节，免维护。 5.2.5*光栅分光方式，并且具有减少信号损失的循环光路设计。 5.2.6各荧光检测通道均不采用发射光滤光片，荧光信号经光栅分光后可直接到达检 测器。 5.2.7*共聚焦成像通道：具备34个荧光检测通道，可以同时采集10个荧光通道和 1个透射光通道图像，10种荧光染料可同时分离成像，1个透射光通道（明场DIC效果） 5.2.8*扫描器（含检测器）必须内置高灵敏度GaAsP spectral 检测器，而且该仪 器能够整合FCS技术，使影像品質(S/N ratio)信噪比有2X提升，具有检测微弱的单分子荧光的功能。 5.2.9一个可用于明场和DIC观察的透射光检测通道。 5.2.10*两个独立的电动的10位滤光片转轮，通过滤光片导入激发光、透过荧光并阻 断从样品反射回的激光，可提供多至50种激发光波长组合。其中一个转轮可由用户自由更换滤光片，满足系统升级扩展的需要。 5.2.11可对荧光光谱进行分析，拆分光谱重叠的不同标记的信号，可以解决同时使用 多种荧光标记时，如GFP/YFP双标记，激发光或发射光波长重叠造成的串色问题。 5.2.12具有实时计算机系统（Real time computer ）监控扫描过程、同步及数据采 集，可选择使用16位、12位和8位A/D转换的动态范围。 5.2.13采用X、Y轴独立的双镜扫描，扫描为线性扫描。 5.2.14*扫描分辨率：可以在4 x 1至6144 x 6144之间自由选择。所有通道同时使 1

小动物活体成像技术_浙江大学汇总

小动物活体成像技术 李冬梅万春丽李继承 摘要：随着小动物成像技术的发展，活体小动物非侵袭性成像在临床前研究中发挥着越来越重要的作用。本文围绕五种小动物成像专用设备，综述其特点及主要应用，比较各种设备的优势和劣势，总结小动物活体成像设备的发展趋势。 关键词：小动物；活体；成像技术 Small living animal imaging technology LI Dong-Mei1 WAN Chun-li 2 LI Ji-Cheng 1 （1Medical college of Zhejiang university，2Shanghai sciencelight biology sci&tech Co.,Ltd.）Abstract: With the development of small animal imaging technology, non-invasive imaging in small living animal models has gained increasing importance in pre-clinical research. Based on five kinds of small animal imaging special equipments, this article reviews their characteristics and illustrates their main applications. Meanwhile, this article also compares the advantages and limitations of these equipments and summarizes the trends of small living animal imaging equipments. Key words: small animal;living; imaging technology 动物模型是现代生物医学研究中重要的实验方法与手段，有助于更方便、更有效地认识人类疾病的发生、发展规律和研究防治措施，同时大鼠、天竺鼠、小鼠等小动物由于诸多优势在生命科学、医学研究及药物开发等多个领域应用日益增多。近年来各种影像技术在动物研究中发挥着越来越重要的作用，涌现出各种小动物成像的专业设备，为科学研究提供了强有力的工具。 动物活体成像技术是指应用影像学方法，对活体状态下的生物过程进行组织、细胞和分子水平的定性和定量研究的技术。动物活体成像技术主要分为光学成像(optical imaging)、核素成像（PET/SPECT）、核磁共振成像（magnetic resonance imaging ，MRI）、计算机断层摄影（computed tomography，CT）成像和超声（ultrasound）成像五大类。 活体成像技术是在不损伤动物的前提下对其进行长期纵向研究的技术之一。成像技术可以提供的数据有绝对定量和相对定量两种。在样本中位置而改变，这类技术提供的为绝对定量信息，如CT、MRI和PET提供的为绝对定量信息；图像数据信号为样本位置依赖性的，如可见光成像中的生物发光、荧光、多光子显微镜技术属于相对定量范畴，但可以通过严格设计实验来定量[1]。其中可见光成像和核素成像特别适合研究分子、代谢和生理学事件，称为功能成像；超声成像和CT则适合于解剖学成像，称为结构成像，MRI介于两者之间。 1 可见光成像 体内可见光成像包括生物发光与荧光两种技术[2]。生物发光是用荧光素酶基因标记DNA，利用其产生的蛋白酶与相应底物发生生化反应产生生物体内的光信号；而荧光技术则采用荧光报告基因（GFP、RFP）或荧光染料（包括荧光量子点）等新型纳米标记材料进行标记，利用报告基因产生的生物发光、荧光蛋白质或染料产生的荧光就可以形成体内的生物光源。前者是动物体内的自发荧光，不需要激发光源，而后者则需要外界激发光源的激发[3]。 1.1 生物发光：哺乳动物生物发光，一般是将萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）基因整合到需观察细胞的染色体DNA上，以表达荧光素酶，培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株，当细胞分裂、转移、分化时，荧光素酶也会得到持续稳定的表达[4]。标记后的荧光素酶

激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用-17954讲解

激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用 Tina(2007-10-23 09:40:17 一、激光扫描共聚焦显微镜的原理 传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM采用点光源照射样本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜搜集，并沿原照射光路回送到由双色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点被挡在探测针孔之外不能成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学切面，避免了非焦平面上杂散光线的干扰，克服了普通显微镜图像模糊的缺点，因此能得到整个焦平面上清晰的共聚焦图像。 原理图

二、激光扫描共聚焦显微镜组成特点 LSCM由显微镜光学系统，激光光源，扫描装置和检测系统构成，整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成像质量。通常有倒置和正置两种形式，前者在切片、活细胞检测等生物医学应用中使用更广泛。 三、激光扫描共聚焦显微镜的应用 一）细胞的三维重建

普通荧光显微镜分辨率低，显示的图像结构为多层面的图像叠加，结构不够清晰。LSCM 能以0.1μm的步距沿轴向对细胞进行分层扫描，得到一组光学切片，经A/D转换后作为二维数组贮存。这些数组通过计算机进行不同的三维重建算法，可作单色或双色图像处理，组合成细胞真实的三维结构。旋转不同角度可观察各侧面的表面形态，也可从不同的断面观察细胞内部结构，测量细胞的长宽高、体积和断层面积等形态学参数。通过模拟荧光处理算法，可以产生在不同照明角度形成的阴影效果，突出立体感。通过角度旋转和细胞位置变化可产生三维动画效果。LSCM 的三维重建广泛用于各类细胞骨架和形态学分析、染色体分析、细胞程序化死亡的观察、细胞内细胞质和细胞器的结构变化的分析和探测等方面。 二）静态结构检测：原位鉴定细胞或组织内生物大分子、观察细胞及亚细胞形态结构 1.细胞原位检测核酸 用于细胞核定位及其形态学观察、检测细胞内DNA的复制及断裂情况以及染色体定位观察。 2.原位检测蛋白质、抗体及其他分子 原位检测蛋白质、抗体及其他分子 免疫荧光标记技术 检测荧光蛋白 3.检测细胞凋亡

多功能荧光成像仪

多功能荧光成像仪 一、技术参数 1.设备用途： 采集化学发光（chemiluminescence）、比色（colorimetric）、荧光（fluorescence）及Stain-Free免染成像等核酸凝胶、蛋白凝胶、印迹膜等的数字图像，并对获得的图像进行数据分析。 2.技术规格： 2.1硬件功能 *2.1.1:功能涵盖：化学发光，光密度成像，荧光成像，Stain-Free免染成像等， 2.1.2：CCD检测器：增强型超冷CCD检测器，分辨率6.1M pixel（2,758x2,208） 2.1.3:12.1英寸触摸屏控制，支持多点触控功能（2点） 2.1.4:425nm处绝对Q/E（光电转化率）值：70％，绝对Q/E峰值：75%@525nm 2.1.5:CCD暗电流：0.002 e/p/s；CCD读出噪音：6 e-rms，提供弱光成像所 需 2.1.6:使用f/0.95快速对焦镜头，提高进光量的同时完成自动聚焦 2.1.7:自动优化曝光功能，所有成像过程均保持自动对焦 2.1.8:16bit数据采集（65,536灰度级，4.8OD），所有样品动力学范围>4个 数量级 2.1.9智能样品托盘技术，自动识别插入的样品盘类型，选择成像功能 2.1.10三种样品托盘设计：Chemi/UV/Stain-Free样品盘（化学发光、紫外和 免染样品成像）；白光样品盘（将透射紫外转换为透射白光，考染、银染及其他蛋白成像）；蓝光样品盘（SYBR?等荧光染料） 2.1.11:光源：反射白光，透射紫外，透射白光（可选），透射蓝光（可选） 2.1.12:滤光片转轮位置：8位（5色荧光、标准滤光片、平场校正、化学发 光） 2.1.13:紫外光源：302nm *2.1.14:最大成像面积16.8 x 21 cm

金纳米棒用于双光子荧光成像

金纳米棒用于双光子荧光成像 2016-04-18 12:31来源：内江洛伯尔材料科技有限公司作者：研发部 金纳米棒受激发后光物理过程 对活体生物组织的实时成像是人们一直追求的目标。实现活体成像的一个难点是如何提高深层组织的检测信号强度。由于一般激光和发射光很难透过组织，自身背景荧光的干扰及光在体内组织上的散射等因素都会降低活体深层组织成像的灵敏度，而加大激发光的强度又会对生物体产生伤害。因此，具有在近红外区光学性质可调控的金纳米棒可以在一定程度上解决这一问题。 新型荧光成像技术探索的道路上面临着两个难题：一是细胞在可见光区的自发荧光对标记分子所发信号的掩盖；二是对所研究分子很难进行长期荧光标记观察。这就迫切需要研制开发光稳定性好的近红外荧光探针。 目前，双光子激发有以下优点： (1) 由于用近红外光激发，所需能量低于破坏活体细胞能量阀值几个数量级，对活细胞的损伤很小，适于活体观察，光漂白作用也小； (2) 在组织中由于600～900 nm近红外光比可见光的透过率高，可达几个厘米，因此可观察样品中更深层的荧光像, 能够进行体外或在体内的非破坏、非介入性分析； (3) 许多原本只能在可见区甚至是紫外区使用的荧光探测试剂也可以应用在近红外区域。 (4) TPL信号能很好的与组织自发荧光区分。 Boyd等人最早于1986年报道了金纳米结构的双光子荧光性质(TPL)，但金膜的光电发射效率很低。金纳米棒在受到激光脉冲激发后能发出强烈的TPL, 特别适合做基于TPL的成像试剂。图为金纳米棒受激发后光物理示意图。近红外激光照射金纳米棒，诱导纵向等离子体共振激发，导致大部分光被吸收，少量散射。吸收双光子后，d轨道电子跃迁到sp轨道，形成空穴-电子对，空穴和电子分别再结合后发出双光子荧光。发热也是由电子振荡造成的。

小动物活体成像技术的原理及操作方法

活体动物体内光学成像主要采用生物发光与荧光两种技术。生物发光是用荧光素酶基因（Luciferase）标记细胞或DNA，而荧光技术则采用绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白等荧光报告基因和FITC、Cy5、C

2. 生物发光成像 活体生物荧光成像技术是指在小的哺乳动物体内利用报告基因-荧光素酶基因表达所产生的荧光素酶蛋白与其小分子底物荧光素在氧、Mg2+离子存在的条件下消耗ATP发生氧化反应，将部分化学能转变为可见光能释放。然后在体外利用敏感的CCD设备形成图像。荧光素酶基因可以被插入多种基因的启动子，成为某种基因的报告基因，通过监测报告基因从而实现对目标基因的监测。 生物荧光实质是一种化学荧光，萤火虫荧光素酶在氧化其特有底物荧光素的过程中可以释放波长广泛的可见光光子，其平均波长为560 nm(460—630 nm)，这其中包括重要的波长超过600 nm的红光成分。在哺乳动物体内血红蛋白是吸收可见光的主要成分，能吸收中蓝绿光波段的大部分可见光；水和脂质主要吸收红外线，但其均对波长为590—800 nm的红光至近红外线吸收能力较差，因此波长超过600 nm的红光虽然有部分散射消耗但大部分可以穿透哺乳动物组织被高灵敏的CCD检测到。 生物发光成像的优点可以非侵入性，实时连续动态监测体内的各种生物学过程，从而可以减少实验动物数量，及降低个体间差异的影响；由于背景噪声低，所以具有较高的敏感性；不需要外源性激发光，避免对体内正常细胞造成损伤，有利于长期观察；此外还有无放射性等其他优点。 然而生物发光也有自身的不足之处：例如波长依赖性的组织穿透能力，光在哺乳动物组织内传播时会被散射和吸收，光子遇到细胞膜和细胞质时会发生折射，而且不同类型的细胞和组织吸收光子的特性也不尽相同，其中血红蛋白是吸收光子的主要物质；由于是在体外检测体内发出的信号，因而受到体内发光源位置及深度影响；另外还需要外源性提供各种荧光素酶的底物，且底物在体内的分布与药动力学也会影响信号的产生；由于荧光素酶催化的生化反应需要氧气、镁离子及ATP等物质的参与，受到体内环境状态的影响。 二、小动物活体成像 1. 制作动物模型 可根据实验需要通过尾静脉注射、皮下移植、原位移植等方法接种已标记的细胞或组织。在建模时应认真考虑实验目的和选择荧光标记，如标记荧光波长短，则穿透效率不高，建模时不宜接种深部脏器和观察体内转移，但可以观察皮下瘤和解剖后脏器直接成像。深部脏器和体内转移的观察大多选用荧光素酶标记。 2. 活体成像 小鼠经过常规麻醉（气麻、针麻皆可）后放入成像暗箱平台，软件控制平台的升降到一个合适的视野，自动开启照明灯（明场）拍摄第一次背景图。下一步，自动关闭照明灯，在没有外界光源的条件下（暗场）拍摄由小鼠体内发出的特异光子。明场与暗场的背景图叠加后可以直观的显示动物体内特异光子的部位和强度，完成成像操作。值得注意的是荧光成像应选择合适的激发和发射滤片，生物发光则需要成像前体内注射底物激发发光。