DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定
山东大学实验报告 2013年 10 月 22日至11月19日
姓名系年级 2011级生技一班学号 201100140112 组别四题目DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定同组者
一、【实验目的】
1.学习和掌握限制性内切酶的分类、特性与作用原理。
2.掌握对DNA进行限制性内切酶酶切的实验技术。
3.学习和掌握DNA连接酶的作用原理以及利用T4DNA连接酶构建重组DNA分子的实验技术。
4.学习和掌握利用CaCl2制备E.coli感受态细胞的原理与方法。
5.学习和掌握热激法转化E.coli感受态细胞的原理与方法。
6.掌握α-互补筛选法的原理。
7.学习用试剂盒提取质粒DNA的方法。
8.复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法。
9.学习和掌握利用琼脂糖凝胶电泳筛选重组质粒。
二、【实验原理】
通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，导致核酸分子多核苷酸链发生水解断裂的蛋白酶叫做核酸酶，其中特异水解断裂RNA分子的酶被称为核糖核酸酶，而特异性水解断裂DNA分子的酶被称为脱氧核糖核酸酶。核酸酶按其水解断裂核酸分子的不同方式，分为两种类型，一种是从核酸分子的末端开始，一个一个核苷酸地消化降解多核苷酸链，叫做核酸外切酶。另一种是从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫做核酸内切酶。
重组质粒的构建需要对DNA分子进行切割，并连接到合适的载体上进行体外重组。限制性核酸内切酶和DNA连接酶的发现与应用，为重组质粒的构建提供了有力的工具。
1．限制性核酸内切酶
（1）限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的酶，主要是从原核生物中分离纯化出来的。
根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解，Ⅰ型酶切割位点是随机的，至少距识别位点1000bp；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解，Ⅱ型限制酶的切割位点一般
在识别序列上或与之靠近，而且具有序列特异性，故在基因克隆中有特别广泛的用途。。III 型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。Ⅲ型限制酶的切割位点距识别序列3'端为24—26bp。
（2）限制-修复系统：在限制性核酸内切限制酶的作用下，侵入细菌的“外源”DNA 分子便会被切割成不同大小的片段，而细菌自己固有的DNA 由于修饰酶(通常是一种甲基化酶)的保护作用，则可免受限制酶的降解。限制作用的本质是限制性核酸内切酶的切割反应，修饰作用的本质是甲基化酶的甲基化作用，这两种酶分别为宿主hsdR和hsdM基因的产物，它们作用时的位点识别需要hsdS基因产物的协助。
（3）Ⅱ型核酸内切限制酶具有3个基本的特性：①在DNA 分子双链的特异性识别序列部位切割DNA 分子，产生链的断裂；②2个单链断裂部位在DNA 分子上的分布通常不是彼此直接相对的；
③断裂结果形成的DNA 片段往往具有互补的单链延伸末端。
（4）限制性核酸内切酶的命名：限制性核酸内切酶的命名普遍采用H·Smith和D·Nathaus 于1973年提出的命名系统，根据分理出该酶的微生物的学名进行的，通常为3个字母：第一个字母大写，用斜体，来自微生物属名的第一个字母；第二、第三个字母小写，用斜体，来自微生物种名的头两个字母，如果该微生物有不同的变种和品系，则再加一个来自变种或品系的第一个字母，大写还是小写应根据具体情况而定，但要用正体；从同一种微生物中发现的几种限制酶，则根据其被发现和分离的顺序用I、II、III等罗马数字表示，用正体。例如从E.coli(Escherichia coli)R株中发现并分离的第一种限制酶被称为EcoR I。
（5）限制性核酸内切酶的基本特点
①位点特异性：绝大多数的II型限制性核酸内切酶都能够识别由4-8个核苷酸组成的特定的核苷酸序列，这些特定的序列大多呈回文结构，我们称这样的序列为限制性核酸内切酶的识别序列。不过有的限制性核酸内切酶可识别两种以上的核苷酸序列。
②同裂酶和同尾酶：有一些来源不同的限制酶能识别同样的核苷酸靶序列，这类酶特称为同裂酶，同裂酶产生同样的切割，形成同样的末端。与同裂酶对应的一类限制性核酸内切酶，它们来源不同，识别的靶序列也各不相同，但都产生相同的黏性末端，称为同尾酶。由一对同尾酶分别产生的黏性末端共价结合形成的位点，称之为杂种位点，但是这类杂种位点的结构，一般是不能够再被原来的任何一种同尾酶所识别的。
（6）限制性核酸内切酶对DNA 底物的酶切作用是否完全，直接关系到连接反应、重组体分子的筛选和鉴定等实验结果。核酸内切限制酶活性的充分发挥受到以下几个因素的影响：
①DNA纯度：在DNA样品中若含有蛋白质,或没有去除干净制备过程中所用的乙醇、EDTA、SDS、酚、氯仿和某些高浓度金属离子,均会降低限制酶的催化活性,甚至使限制酶不起作用。②核酸内切限制酶的缓冲液：核酸内切限制酶的标准缓冲液包括氯化镁、氯化钠或氯化钾、
Tris-HCL、巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白(BSA)等.使用所有限制酶均可发挥活性的一种缓冲液。不同限制性内切酶对NaCl浓度的要求不同,这是不同限制酶缓冲液组成上的一个主要的不同。据此可分为高盐、中盐和低盐缓冲液,在进行双酶解或多酶解时,若这些酶切割可在同种缓冲液中作用良好,则几种酶可同时酶切；若这些酶所要求的缓冲液有所不同,可采用以下三种方法进行消化反应：先用要求低盐缓冲液的限制性内切酶消化DNA,然后补足适量的NaCl,再用要求高盐缓冲液的限制酶消化；先用一种酶进行酶解,然后用乙醇沉淀酶解产物,再重悬于另一缓冲液中进行第二次酶解。③酶切消化反应的温度：DNA消化反应的温度,是影响限制内切酶活性的一个重要因素.不同的核酸内切限制酶,具有各自的最适反应温度.多数限制内切酶的最适反应温度是37℃,少数限制性内切酶的最适反应温度高于或低于37℃。④DNA的分子结构：DNA分子构型对核酸内切限制酶的活性有很大影响,如消化超螺旋的DNA比消化线性DNA用酶量要高出许多倍.有些限制酶在消化它们自己的处于不同部位的限制位点,其效率也有明显差异.限制性内切酶反应的终止。
（7）限制性核酸内切酶的星号活性
限制性核酸内切酶通常有严格的识别特异性，能精确地识别DNA排列顺序。但在某些反应条件下，如离子强度降低、pH增大、辅因子（Mg2+)被其他二价阳离子取代、有机溶剂污染、甘油浓度过高和限制酶过量等，酶识别顺序的特异性可能发生变化，通常是特异性降低，可识别和切割额外的位点，这种特异性降低的内切酶活性被称为“星号活性”。
星号活性主要是由以下一些因素引起的：①甘油浓度过高②离子强度不合适③二价阳离子变化④溶液pH变化⑤有机溶剂的残留。
2．DNA酶切
体外构建重组DNA 分子，首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性核酸内切酶都不能在目的基因内部有专一的识别位点，即当用一种或者两种限制性核酸内切酶切割外源供体DNA 时，能够得到完整的目的基因。其次，选择具有相应的单一酶切位点的质粒、噬菌体等载体分子作为克隆的载体。常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。
（1）双酶切法：如果只在要克隆的目的DNA 二端具有不同的限制性核酸内切酶的识别位点，而目的基因内部没有相应的识别序列，可用这二种限制性核酸内切酶酶切，则目的DNA可产生二种不同的黏性末端。选择同样具有这二种限制性核酸内切酶识别位点的合适载体，酶切
后，同样产生二个不同的黏性末端，当构建重组分子时，目的DNA 可以一定的方向插入载体中，这样操作效率高，也利于重组子的筛选。
（2）单酶切法：:如果目的DNA 片段只能用一种限制性核酸内切酶切割，酶切后的片段两端产生相同的粘性末端或者平末端。选择具有同样限制性核酸内切酶识别位点的合适载体，在构建重组分子时，除了形成正常的重组子之外，还可能会出现目的DNA 片段以相反方向插入载体分子中，或者目的DNA 串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象，因此重组效率较低。如果没有很好的方法区分转化子中的重组子，筛选重组子会比用双酶切法构建重组DNA 分子的工作量大很多。
单酶切法和双酶切法各有优缺点，在实际操作时要根据具体情况来定。不同限制性内切酶对NaCl浓度的要求不同,这是不同限制酶缓冲液组成上的一个主要的不同。据此可分为高盐、中盐和低盐缓冲液,在进行双酶解或多酶解时,若这些酶切割可在同种缓冲液中作用良好,则几种酶可同时酶切；若这些酶所要求的缓冲液有所不同,可采用以下三种方法进行消化反应：先用要求低盐缓冲液的限制性内切酶消化DNA,然后补足适量的NaCl,再用要求高盐缓冲液的限制酶消化；先用一种酶进行酶解,然后用乙醇沉淀酶解产物,再重悬于另一缓冲液中进行第二次酶解。
酶切和连接是两个密切相关的步骤，要达到高效率的连接，必须酶切完全，酶切的DNA 数量要适当。另外，酶切反应的规模也取决于需要酶切的DNA的数量，以及相应的酶量。一般的，酶切0.2-1.0ug的DNA分子时，反应体积约为15-20ul，DNA的量增大，反应体积可按比例适当放大。酶的用量参考标准：一个标准单位酶能在指定的缓冲液系统和温度下，1h完全酶解1ugpBR322DNA。如果酶活力低，可以适当增加酶的用量，但是最高不能超过反应总体积的10%，因为限制性核酸内切酶一般是保存在50%甘油的缓冲液中，如果酶切反应体系中甘油的含量超过5%，将会抑制酶的活性。
3．DNA 连接
（1） DNA 连接酶能催化双链DNA 片段紧靠在一起的3'羟基末端与5'磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接。目前用于连接DNA 片段的DNA 连接酶有E.coli DNA 连接酶和T4 DNA 连接酶。E.coli DNA 连接酶只能催化双链DNA 片段互补黏性末端之间的连接，不能催化双链DNA 片段平末端之间的连接。T4DNA 连接酶既可用于双链DNA 片段互补黏性末端之间的连接，也能催化双链DNA 片段平末端之间的连接，但平末端之间连接的效率比较低。 DNA 连接酶同限制性核酸内切酶一样，都是在体外构建重组DNA 分子所必不可少的基本工具酶。限制性核酸内切酶可以将DNA 分子切割成不同大小的片段，然而要将不同来源的DNA
片段组成新的杂交DNA 分子，还必须将它们彼此连接起来。目前有3 种体外连接DNA 片段的方法：①用DNA 连接酶连接具有互补黏性末端的DNA 片段；②用T4 DNA 连接酶直接将平末端的DNA 片段连接起来，或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA poly(dA)-poly(dT)尾之后，再用DNA 连接酶连接起来；③先在DNA 片段末端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成黏性末端，再用DNA 连接酶连接起来。这3 种方法虽然互有差异，但共同的一点都是利用DNA 连接酶所具有的连接和封闭单链DNA 的功能。
（2）连接反应
外源DNA 片段与载体分子的连接，即DNA 分子体外重组，主要依赖于DNA 连接酶来完成。DNA 连接酶催化两双链DNA 片段相邻的5’-磷酸和3’-羟基间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的DNA 连接酶是来自T4 噬菌体的DNA 连接酶：T4 DNA 连接酶，该酶需要ATP 作为辅助因子。目的DNA 片段与载体DNA 片段之间的连接方式主要有以下几种：
①互补粘性末端片段之间的连接
当载体和外源DNA 用同一种限制性内切酶切割时，产生相同的粘性末端，连接后仍保留原限制性内切酶的识别序列；如果用两种能够产生相同的粘性末端的限制酶（同尾酶）切割时，虽然可以有效地进行连接，但是获得的重组DNA 分子消失了原来用于切割的那两种限制性核酸内切酶的识别序列，这样不利于从重组子上完整地将插入片段重新切割下来。定向克隆：根据核酸内切限制酶的性质，用两种不同的限制酶同时消化一种特定的DNA分子，将会产生出具有两种不同粘性末端的DNA 片段。十分明显，如果载体分子和待克隆的DNA 分子都是用同一对核酸内切酶切割，然后混合起来，那么载体分子和外源DNA 片段将按一种取向退火形成重组DNA 分子。
互补粘性末端连接方案中还有一个问题：片段的多拷贝插入。当需要表达蛋白质产物时，多拷贝的插入，在没有拼连剪切信号的情况下，将会导致表达困难或紊乱。所以需要用内切酶图谱对单拷贝插入片段进行鉴定和筛选。适当的插入片段与载体分子比率能减少多拷贝插入片段的形成，一般比例为2:1（插入片段摩尔数:载体摩尔数）。
②平末端及非互补黏性末端片段之间的连接
载体分子和外源DNA 插入片段并不一定总能产生出互补的粘性末端。实际上有许多情况都是例外的，因为有些限制酶切割DNA 分子之后所形成的都是平末端的片段；有的实验要用两种不同的限制酶分别切割载体分子和外源DNA，形成的也多半是非互补的粘性末端或平末端；再如用机械切割法制备的DNA 片段，PCR 扩增的和化学合成的DNA 片段或由RNA 为模板反转录合成的cDNA 片段，也不会具有互补的粘性末端。
既然在一定反应条件下，用T4 DNA 连接酶可以将平末端的DNA 片段有效地连接起来，那么对于上面提到的非互补粘性末端的两种DNA 片段之间，经过专门作用于单链DNA 的S1 核酸酶处理变成平末端或用大肠杆菌DNA 聚合酶I 的Klenow 片段填补后变成平末端，一样也可以使用T4 DNA 连接酶进行有效地连接。不过，平末端DNA 片段间的连接作用不仅在效率上明显地低于粘性末端间的连接作用，而且重组之后一般不能从原位删除下来。
（3）连接反应的体系的反应条件
①连接酶：从理论上讲，酶浓度高，催化的反应速度快，产量也高。但是酶是保存在50%的甘油中的，添加过多的酶，会使连接反应体系甘油含量过多而影响连接的效率。
②底物浓度:一般采用提高载体DNA和外源DNA的浓度来提高重组效率，但是底物浓度过高，连接效果也会受影响，而且载体DNA自连的概率和外源DNA多拷贝插入的概率也会提高。将载体DNA和外源DNA的摩尔数之比控制在1:（1-3）之间可以有效地解决外源DNA多拷贝插入的现象。
③缓冲液：商品连接酶都配有现成的连接酶反应的缓冲液，Mg2+ ATP等为辅助因子，其中ATP提供能量；DTT为酶的活性稳定剂；BSA用于维持蛋白浓度，防止酶的变性失活。
④反应条件：连接反应所用的连接酶的最适反应温度是37o C,但是在这个温度下，黏性末端的氢键结合是不稳定的，一般中间四个互补碱基对的结合不足以抵抗该温度下的分子热运动。因此实际操作过程中，黏性末端DNA分子之间连接反应采用介于酶作用速率和末端结合速率之间的温度，一般为16o C，平末端适当提高连接反应温度，一般选择20-25o C较为合适。反应时间与温度有关，随温度的提高，反应速率增加，所需时间会相应减少，16o C下最常用的连接时间为12-16h。
4．转化
体外连接的DNA 重组分子导入合适的受体细胞才能大量地进行复制、增殖和表达，将外源重组体分子导入受体细胞的途径，包括转化（或转染）、转导、显微注射和电穿孔等多种不同的方式。重组质粒DNA 分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称之为转化（transformation）。细菌转化的本质是受体菌直接吸收来自供体菌的游离DNA 片段，即转化因子，并在细胞中通过遗传交换将之组合到自身的基因组中，从而获得供体菌的相应遗传性状的过程。
大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌，自然条件下很难进行转化，其主要原因是转化因子的吸收较为困难，尤其是那些与其亲缘关系较远的DNA 分子更是如此。通常的做法是采用人工的方法制备感受态细胞，然后进行转化处理，热击法和电穿孔法是常用的人工转化的方法
①热击法：CaCl2诱导的大肠杆菌制备感受态细胞，CaCl2诱导的大肠杆菌转化的原理是将处于对数生长期的细菌置于0℃，CaCl2 低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，同时钙离子使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态。此时加入DNA，钙离子又与DNA 结合形成抗脱氧核糖核酸酶（Dnase）的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上。42℃热击处理90S，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA 分子便趁机进入细胞内，在不含抗生素的培养基中至少培养1h,使受损伤的细胞复苏，转化细胞产生足够的抗性蛋白，便于在含有抗生素的平板上长出抗性菌落。
②电穿孔法：对制备好的感受态细胞，在电场作用下，细胞膜产生孔洞，使外源DNA分子直接通过微孔，进入细胞。
5.α互补筛选法
利用β-半乳糖苷酶筛选系统，跟据菌落颜色筛选含有重组质粒的转化子。载体上插入了β-半乳糖苷酶的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列，而其对应的宿主菌染色体上整合有β-半乳糖苷酶C端序列的遗传信息。当质粒载体导入相应宿主菌后，通过α互补作用，形成完整的β-半乳糖苷酶。在加有氨苄青霉素的麦康凯培养基平板上，不含质粒pUC19的E.coli DH5α无法生长；含有质粒pUC19的E.coli DH5α利用β-半乳糖苷酶分解培养基中的乳糖产生有机酸，pH降低，培养基中的指示剂变红，菌落变为红色；含有重组质粒的E.coli DH5α具有氨苄青霉素抗性可以生长，但质粒pUC19中有外源基因插入到多克隆位点，使β-半乳糖苷酶N端的基因不能表达，无法实现α互补作用，所以其菌落为白色。6．转化子的筛选与验证
重组质粒是外源基因通过单酶切（或双酶切）与用相同的（或二种）限制性核酸内切酶切割的质粒载体理解后获得的，因此在连接处仍保留原限制性核酸内切酶的识别序列，用该酶（或二种酶）再次切割重组质粒，能把插入片段切离载体，根据琼脂糖凝胶电泳检测可见有载体片段和插入的外源DNA片段，并可知插入片段的大小。
三、【实验试剂与器材】
1.菌株：E.coli DH 5α
2.培养基： LB培养基、麦康凯培养基
3.试剂材料：
氨苄青霉素、酶切Buffer、Hin d Ⅲ、ddH2O、连接buffer、T4 DNA连接酶、0.1M CaCl2
、OMEGA公司的质粒提取试剂盒（含有Rnase A的溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，HB buffer,DNA
washing buffer，Elution buffer）、琼脂糖，TAE缓冲液、上样缓冲液，EB 染液
4. 仪器器材：
20、200、1000ul 的枪和枪尖，1.5 ml的Ep管，恒温培养箱，水浴锅，培养皿，三角瓶，试管，接种环，牙签，酒精灯，火柴，冰箱，离心机，电泳仪
四、【实验步骤】
1.准备实验
准备10ul、200ul、1ml枪尖各一盒灭菌，1.5ml离心管若干于500ml三角瓶中灭菌，牙签若干灭菌，无菌水，配制LB液体培养基，分装至100ml三角瓶中20ml，300ml的三角瓶中50ml，灭菌；配制1.2%琼脂的LB固体培养基150ml于300ml的三角瓶中。另配麦康凯培养基250ml于500ml的三角瓶中，灭菌；准备3-4支试管，灭菌；培养皿18个；
2.酶切及酶切产物的验证
（1）酶切
①在冰上按照表一依次把ddH2O、10×M buffer、DNA、Hin d III加入到1.5ml无菌Ep管中。
②每管样品混合均匀后，4000rpm离心1min，将液体集中于管底。
③将反应体系放在37o C水浴锅中1-2h。
表一限制性内切酶反应体系
加样顺序反应体系成分 I II III
pUC19(各组）λDNA(商品） pUC19（商品）
1 ddH2O/ul 13.0 70.0 64.0
2 10×M
buffer/ul
2.0 10.0 8.0
3 DNA/ul 4.0 15.0 4.0
4 Hind III/ul 1.0 5.0 4.0
总体积/ul 20.0 100.0 80.0 备注各组一份全班一份全班一份（2）酶切产物的验证-酶切产物琼脂糖凝胶电泳
①配制缓冲液：将50×TAE稀释至1×TAE缓冲液
②制胶：称取0.4g琼脂糖于300ml三角烧瓶中，加40ml 1×TAE制成1%琼脂糖凝胶。微波炉加热至琼脂糖完全溶化，待冷却至60℃左右，缓慢倒入架有梳子的电泳胶板中，勿产生气泡，静置冷却30min以上。待其完全凝固，垂直向上拔出梳子，将胶连同托盘一起放入电泳槽中央，加入缓冲液，液面应高于胶面1-2mm，准备上样。
③上样：取8.0ul酶切反应液、2.0ul 10×loading buffer混匀，在加样孔上方1-2mm处垂直点样，同时点样1.0ul 10×loading buffer和4.0ulλ/Hin d III、1.0ul 10×loading buffer和100 ngλDNA、1.0ul 10×loading buffer和4.0ulλ/Hin d III（Test）、1.0ul 10×loading buffer和100 ngpUC19（商品）、1.0ul 10×loading buffer和4.0ulpUC19(商品)/H III。
表二酶切产物琼脂糖凝胶电泳点样顺序
泳道 1 2 3 4 5 6 (17)
加入的物质λ/H
III
λDNA λ
/Hin d
III
（Test
）
pUC19
（商
品）、
pUC19(
商
品)/Hi
n d III
第一组
酶切反
应液
……第十二
组酶切
反应液
样品量 4.0ul 100 ng 4.0ul 100 ng 4.0ul 8.0ul 8.0ul 8.0ul 10×
loadin
g
buffer
1.0ul 1.0ul 1.0ul 1.0ul 1.0ul
2.0ul 2.0ul 2.0ul 点样量 5.0ul 5.0ul 5.0ul 10.0ul 10.0ul 10.0ul
④电泳（实际时间根据电泳条带的迁移情况判断）。
⑤染色及观察电泳完成后，将胶放入0.5ug/ml的EB染液中染色约10min，水洗，在凝胶成像仪中观察电泳结果，摄片，剪辑，保存，分析结果。
3.连接
①在冰上按照表三依次把ddH2O、10xT4 连接酶Buffer、pUC19/Hind III、λ/Hind III、T4 DNA 连接酶加入到1.5ulEp管中（我们组分别做了老师提供的质粒和自己的质粒酶
切后的连接）。
②将样品混匀，然后4000rpm离心1min，将液体集中于管底。
③将反应体系放入16o C水浴锅中连接过夜。
表三连接反应体系
加样
顺序成分体积(μl)
1 ddH2O 3.2
2 10xT4 连接酶Buffer 1.0
3 pUC19/Hin d III 1.5-2.0
4 λ/Hin d III 3.5-3.0
5 T4 DNA 连接酶0.8
10.0
总体
积
/ul
4.感受态细胞的制备及质粒转化
（1）感受态细胞的制备
①从LB平板上挑取新活化的E.coli DH5α单菌落于5mL LB 液体培养基里，37℃振荡培养过夜。
②以1%的接种量将过夜培养的E.coli DH5α接种于新鲜的20mL LB 培养基中，37℃振荡培养2—3 小时后冰浴。
③分别取1.5mL 菌液于2 个无菌的1.5mL 离心管中，4℃，4000rpm 离心5min，收集菌体。重复上述操作，使每个离心管中收集3mL培养液的菌体。残留液体漩涡振荡使菌体混匀。
④每支离心管中加入用冰预冷的100mmol/LCaCl2 800ul，轻轻悬浮细胞，冰上放置10min，4000rpm 离心5min。
⑤弃上清液，加入100ul预冷的100mmol/LCaCl2 溶液，用1ml移液枪吹吸轻轻悬浮细胞，冰上放置20min，即为感受态细胞。
⑥将上述2 管制备的感受态细胞分装到4 个离心管中，每管50ul。
（2）质粒转化
①取制备好的摇匀后的,4 管感受态细胞悬液，I号加入老师提供的酶切质粒的连接产物
5.0ul，II号加1.0μL pUC19（自提），III号不再加物质，IV加入自己质粒酶切的连接产物将以上各管轻轻摇匀。
②冰上放置10min。
③在42℃水浴中热击90s，然后迅速置于冰上冷却5min。
④向上述4 管中分别加入900ul新鲜的无菌LB液体培养基，摇匀，37℃孵育1h，使受体菌恢复正常生长状态。
（3）稀释和涂布平板
①取准备的麦康凯培养基，冷却至55-60℃左右加入氨苄青霉素，另准备1个不加氨苄青霉素的平板。
②涂布平板
I号:实验组一（老师提供的酶切质粒连接产物的转化)：取50ul、100ul、150ul、200ul 培养液分别涂布含有氨苄青霉素的麦康凯培养基，每个梯度涂二个。
IV号：实验组二（为自提质粒酶切后连接产物的转化)：由于培养基不够，所以我们组选了100ul、200ul各涂布了一个
II号：转化对照组：取50ul培养液涂布于含有氨苄青霉素的麦康凯培养基。
III号：细胞对照组：分别取50ul 受体菌液涂布含有氨苄青霉素和不含氨苄青霉素的麦康凯培养基。
③当菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，于37℃恒温培养约24-26h，观察菌落生长情况并记录是否生长、菌落的数量、培养的颜色等现象。
4.重组子的筛选与验证
①取一个含有氨苄青霉素的麦康凯培养基平板，在底部划线分成4 个区域。
②从实验组一平板上分别选取个3个单个的白色转化子菌落，用接种环划线转接到上述3个区域，编号为1,2,3，实验组二平板上取一个单个的白色转化子菌落，用接种环划线转接到上述第4个区域，编号为4，37℃培养过夜。
③在划线的1,2，3单菌落中选取2 个白色菌落，用牙签分别转接到5ml含氨苄青霉素的LB液体培养基的试管中，编号为4-1,4-2。编号为从4中选取一个白色菌落用牙签转接到到5ml含氨苄青霉素的LB液体培养基的试管中，编号为4-3，37℃振荡培养12-16h。
④分别取4-1和4-3菌液，用OMEGA公司的质粒提取试剂盒提取重组质粒。
1）分别取1.5mL 菌液于2 个无菌的1.5mL 离心管中,室温下，10000rpm 离心1min，收集细菌。
2）倒弃培养基，重复步骤1一次。
3）倒弃培养基，加入250ulSolution I/RNase A混合液，涡旋震荡使细胞完全悬浮。
4）往重悬混合液中加入250ul Solution II，轻轻颠倒混匀4-6次，这步要避免剧烈混匀，且反应时间不要超过5min.
5)加入350ul Solution III，温和颠倒数次至形成白色絮状沉淀。
6）室温下，13000rpm 离心10min.
7）转移上清液至套有2ml收集管的HiBind DNA结合柱中，室温下，10000rpm 离心1min，倒去收集管中的滤液。
8）把柱子重新装回收集管，加入500ulHB Buffer，10000rpm 离心1min，弃去滤液。
9）把柱子重新装回收集管，加入700ul DNA Wash Buffer ，13000rpm 离心1min，弃去滤液。
10）弃去滤液，重复步骤9一次
11）弃去滤液，把柱子重新装回收集管，10000rpm 离心2min以甩干柱子基质。
12）把柱子装在干净的1.5ml离心管上，加入30-50ul Elution Buffer到柱子基质中，放置1-2min，10000rpm 离心1min洗脱出DNA.
13)把离心管中离心后的液体重新加到柱子基质中，10000rpm 离心1min洗脱。
⑤重组质粒琼脂糖凝胶电泳
1）配制缓冲液：将50×TAE稀释至1×TAE缓冲液
2）制胶：称取0.4g琼脂糖于300ml三角烧瓶中，加40ml 1×TAE制成1%琼脂糖凝胶。微波炉加热至琼脂糖完全溶化，待冷却至60℃左右，缓慢倒入架有梳子的电泳胶板中，勿产生气泡，静置冷却30min以上。待其完全凝固，垂直向上拔出梳子，将胶连同托盘一起放入电泳槽中央，加入缓冲液，液面应高于胶面1-2mm，准备上样。
3）上样：取2μl ddH2O, 2μl质粒，1μl loading buffer混匀，在加样孔上方1-2mm处垂直点样，同时点样6ul超螺旋marker，100ng pUC19。
4）电泳（实际时间根据电泳条带的迁移情况判断）。
5）染色及观察电泳完成后，将胶放入0.5ug/ml的EB染液中染色约10min，水洗，在凝胶成像仪中观察电泳结果，摄片，剪辑，保存，分析结果。
五、【实验结果】
1.实验数据
表四 实验数据
2.酶切产物的琼脂糖凝胶电泳检测
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
图一：酶切产物琼脂糖凝胶电泳结果
泳道1为λ/Hin d III ，泳道2为λDNA ，泳道3为λ/Hin d III （Test ），泳道4为pUC19（商品），泳道5为pUC19(商品)/Hin d III ，泳道9为我们组（四组）的酶切产物。 分析： 从泳道9中我们可以看到两条比较亮的条带，在两条比较亮的条带上面有两条很暗很弱的条带，应该是未除尽的染色体DNA ，两条亮带中靠上的一条和泳道5 pUC19(商品)/Hin d III 的电泳图在同一条线上，所以该条带为我们酶切反应预期想要得到的Hin d III 酶切开的质粒，较亮的条带下方的条带和泳道4 pUC19（商品）的电泳条带在同一条线上，为没有酶切开的超螺旋质粒。图谱下方比较宽而且较模糊的条带应该是提取质粒时没有除净的RNA 。
从图中我们可以看到没有切开的质粒占有很大的比例，如果用该酶切产物继续下一步的连接反应，效果不会很理想，所以我们连接反应做了两组，一组为老师提供的pUC19/Hin d III （商品），一组为我们酶切的质粒。
实验步骤 物质 量
连接反应
pUC19/Hind III （ul ） 2.0 λ/Hind III （ul ） 3.5
试剂盒提取质粒
Elution Buffer （ul ）
35
3.重组子筛选结果
表五重组子的筛选涂布平板结果记录
项目组别培养基涂布的
转化液
的量
/ul
菌落特
征
红色菌
落数量
白色菌
落数量
菌落总
数量
培养基
颜色
培养
基pH
I号：实验组一（用的老师提供的商品化酶切质粒做连接）A+50 菌落较
大，菌
落既有
红色也
有白色
108 14 122 红色 6.0 A+50 121 12 133 红色
A+100 菌落为
中等大
小，菌
落既有
红色也
有白色
263 23 286 红色 5.5 A+100 红色
A+150 菌落偏
小，既
有红色
菌落也
有白色
411 33 444 红色 5.5 A+150 红色
A+200 菌落较
小，既
有红色
菌落也
有白色
无数红色 5.5 A+200 无数红色
IV号：实验组二（用的我们自己的酶切质粒）A+100 菌落中
等大
小，既
有红色
菌落也
有白色
红色 5.5
A+200 菌落中
等大
小，既
有红色
菌落也
有白色
158 16 174 红色
II号：转化对照组A+50 菌落较
小，为
红色，
表面形
成菌膜
无数红色
III 号：细胞对照组A+50 无菌落红色
A- 50 菌落全
为白
色，较
小，连
成片
橙红色7.0
分析：质粒PUC19携带有氨苄青霉素抗性基因（Ampr）,在含有氨苄青霉素平板上筛选转化子，没有导入质粒PUC19的受体细胞，在含有氨苄青霉素的平板上不生长，所以长出的菌落都是转化子，质粒PUC19进入E.coli DH 5α后，通过α-互补作用，形成完整的β-半乳糖苷酶。在麦康凯培养基平板上，转化子利用β-半乳糖苷酶分解培养基中的乳糖产生有机酸，pH降低，培养集中的指示剂变红，转化子的菌落变红。不含质粒的E.coli DH 5α，没有β-半乳糖苷酶活性，不能利用培养集中的乳糖产生有机酸，而是利用培养集中的有机碳源，不使培养基pH降低，在不含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上形成白色菌落。重组后的载体DNA因为目的基因的插入位点在PUC19乳糖利用基因内部，不能形成α-互补作用，所以也不能利用培养集中的乳糖产生有机酸，在含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上形成白色菌落。
所以实验组菌落既有红色也有白色，转化对照组菌落全为红色，细胞对照组在含氨苄青霉素的麦康凯培养基上不生长，在不含氨苄青霉素的麦康凯培养基上菌落为白色。实验结果如预期所料的一样。
从实验结果记录上可以明显的看到涂有重组质粒转化E. coli DH5α的平板上，菌落数量随加入菌液量的增多而增加，其中菌落以红色菌落为主，零星散布有白色小菌落，根据红白菌落的多少，计算了一下重组效率，涂布50ul转化液的平板的重组效率为11.4%，涂布1000ul转化液的平板的重组效率为8.7%，涂布150ul转化液的平板的重组效率为8.0%。转化效率是指外源DNA导入细菌的效率，通常用每微克DNA获得转化体的数量表示。涂布50ul 转化液的平板的转化效率大约为1.22×105个/ugDNA, 涂布100ul转化液的平板的转化效率大约为1.36×105个/ugDNA,涂布150ul转化液的平板的转化效率大约为2.12×105个/ugDNA,转化效率较低。
实验发现细胞对照组不加氨苄青霉素的培养基变为橙红色，其他的培养基仍为红色，是因为麦康凯培养基中含有少量的中性红，而中性红是一种酸碱指示剂，当溶液pH小于6.8时显示红色，pH大于8.0时显示黄色。细胞对照组由于没有转进质粒，无法通过α互补作用分解利用乳糖，不产生乳酸，它是利用其他有机物质，所以由于没有产生酸，培养基称弱碱性，培养基为橙黄色。
4.重组子的电泳检测
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
图二：重组子的琼脂糖凝胶电泳结果
泳道1和泳道9为超螺旋marker，泳道2为pUC19，泳道3-7和泳道10-16为1-6组的重组质粒。
分析：泳道11和泳道12为我们组(四组）的重组子的琼脂糖凝胶电泳检测，超螺旋marker 电泳条带自上而下的分子量对应的是2087bp、3049bp、3997bp、5026bp、6122bp、8023bp、10085bp、11849bp，pUC19的分子量为2686bp，λDNA经Hin d III酶切后的片段大小有125bp、564bp、2027bp、2322bp、4361bp、6557bp、9416bp、23130bp。泳道11为4-1实验组重组子，对应超螺旋marker的条带，该条带在2087bp至3049bp之间，大小大约2800bp，所以该重组子是插入了125bp的片段。泳道12为4-2实验组重组子，对应超螺旋marker的条带，该条带在8023bp至10085bp之间，大小约在9200bp，最有可能是插入了大小为6551bp的片段，也可能是同时插入了4361bp的片段和2322bp的片段，也可能是插入了4361bp的片段和2027bp的片段，也可能是插入了3个2322bp的片段，因为插入的片段总分子量较大，所以可能情况很多，不过插入的片段不论是几个，其总分子质量应该在6500bp左右。
六、【注意事项】
a.酶切
1.限制性核酸内切酶的酶切反应属于微量操作技术，必须严格注意吸样量的准确性并确保样品和酶全部加入到反应体系中。
2.酶切反应中所用的Ep管，枪尖等必须是新的，经过高温灭菌，操作时打开使用。
3.注意酶切加样的顺序，一般先加重蒸水，其次加缓冲液和DNA，最后加酶，加酶前先把前几步加的物质甩到管底，。酶液从冰箱中取出后要放在冰上，取酶液时吸头应从表面吸取，防止由于插入过深而使吸头外壁沾染过多的酶液，以致影响酶的活性，取出的酶液应立即加入反应混合液的叶面以下，并充分混匀。酶液使用完毕后应立即放回冰箱，防止酶的失活。
4.Ep管的盖子要盖紧，防止水浴时水汽进入管内，并且做好标记，防止混淆。
5.酶切反应结束后，装有酶切样品的管盖上有大量的冷凝水，应离心2S，使样品集中于管底，再开盖取样检测，注意防止污染。
b.连接
在微量操作技术、无菌技术、加样技术等方面加以注意。
C感受态细胞的制备和转化
1.感受态细胞必须从纯种开始，要从划线纯化的单菌落开始，进行活化培养，不要使用多次转接或储存在4o C冰箱的培养菌液，因为要保证菌株的纯度和活力。
2.控制细胞的生长状态和密度是转化效率的关键，细胞生长浓度以刚进入对数生长期时为好，细胞浓度不足或过高均会使转化效率下降。
3.用于转化的质粒DNA应是超螺旋状态的DNA。
4.转化过程要防止杂菌和其他DNA的污染，整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用的器材和试剂要经过高温灭菌处理，以防被微生物DNA污染。
七、【实验讨论和思考题】
1.从电泳图上如何判断质粒DNA是否单酶切完全？
如果酶切完全，酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图上结果只有一条条带，且与你点的pUC19/Hin d III电泳条带在一条线上，完全没有酶切的质粒处于超螺旋状态，因此在电泳图上原则上只能看到超螺旋条带，如果单酶切不完全可能出现超螺旋状态和线状质粒条带同时存在。
2.感受态细胞是什么？
感受态细胞是处于能够进行转化摄入核酸分子的生理状态的细胞。在生长的某个阶段会自然产生感受态细胞(如枯草孢芽杆菌)。但一般未经特殊处理的培养细胞对重组DNA分子不敏感,不易转化成功。在0℃经钙离子对大肠杆菌进行诱导,即可产生感受态细胞;加甘油在-80℃冻存,可保持其活力。
3.连接体系里会发生哪些反应？连接产物都有什么?
连接体系里有Hin d III酶切的质粒pUC19，还有Hin d III酶切的125bp、564bp、2027bp、
2322bp、4361bp、6557bp、9416bp、23130bp的λDNA片段，所有这些都是经Hin d III酶酶切的，产生的黏性末端可以连接在一起，所以连接体系里会有很多类型的连接，可能有pUC19/Hin d III 与125bp、564bp、2027bp、2322bp、4361bp、6557bp、9416bp、23130bp 的单个λDNA片段发生连接，还可能有pUC19/Hin d III与两个或多个λDNA片段发生连接，pUC19/Hin d III的自连，两个pUC19/Hin d III连接，λDNA片段之间的连接。
4.影响质粒DNA转化效率的因素有哪些？
①细胞生长状态和密度。密度不足或过高会使转化率下降。
②质粒DNA的质量和浓度。用于转化的质粒DNA应主要是共价闭环DNA。转化率与外源DNA 的浓度在一定范围内成正比，量过多货体积过大时，转化率下降。
③CaCl2法0℃放置时间的影响：细菌经0℃ CaCl2处理后转化率随时间的推移而增加，24h 达到最高，之后转化率逐渐下降。
④化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上，联合其他二价金属离子(如Mn2+，CO2+)、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化率提高100～1000倍。
⑤质粒大小、构型的影响：通过构建相同复制起点的不同大小质粒进行转化时发现，从2kb 到3．2kb的转化效率上升，此后到66kb转化效率线性下降。同时，开环状质粒只有超螺旋质粒转化率的75％，线型质粒的转化率更要低100～1000倍，线型转化率低是因菌体中核酸外切酶将进入的线型DNA降解的原因。
5.重组质粒电泳时，pUC19的对照意义？
重组质粒电泳时除了用超螺旋marker外还点样了pUC19，因为可以用重组子电泳条带与pUC19电泳条带相比较来判断是空载体还是重组子以及大致判断出插入片段的大小。
6.单一白菌落中所有的细胞中有几种质粒？（质粒的不相容性）
同种的或亲缘关系相近的两种质粒不能同时稳定地保持在一个细胞内的现象，称为质粒不相容性，整合到寄主染色体中的质粒和自主性质粒之间也具有不相容性，单一白色菌落是由一个细菌分裂而来的，由于质粒不相容性，一个细菌中只有一种质粒，所以单一白色菌落的所有细胞中只有一种质粒。
7.蓝白筛选和红白筛选的原理
蓝白筛选：由α-互补而产生的β-半乳糖苷酶在IPTG(异丙基硫代β-D半乳糖苷)诱导下用X-Gal显出蓝色菌落，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，不能通过α-互补产生有功能活性的β-半乳糖苷酶，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。
红白筛选：由α-互补而产生的β-半乳糖苷酶分解培养基中的乳糖产生乳酸，使pH下降，
因而产生红色菌落，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，不能通过α-互补产生有功能活性的β-半乳糖苷酶，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。
不过白色菌落的产生原因可能是重组质粒的菌落，也可能是质粒自连后发生突变的菌落。
八、【实验总结】
这次的实验历时较长，做了从质粒的酶切、连接、转化到重组子的筛选和鉴定这么一系列连续的实验，如果没有事先对重组质粒的构建、转化、连接、筛选有一定的整体的理解，做实验时很容易不知道自己在做什么，这一次的实验用的上一次的产物的原因是什么，不知道实验是怎么连续下来的，所以实验前先预习，知道大致的原理非常必要。还有就是微量操作技术，学会了怎么样加入微量的试剂以及试剂加入的顺序，知道了红白筛选的原理及用红白筛选法筛选重组子。
双酶切连接反应常见问题分析
前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了14个质粒。现就自己的体会，谈一下质粒重组的一些个人经验。 1. 回收PCR产物： 在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。 双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。 2. 纯化问题： 纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。 3. 酶量的问题： 对1单位酶的定义如下：在50μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml 菌液提出的DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。 4. 酶切、回收后的PCR产物与载体的连接： 摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则非常有必要。回收的载体片段：回收的PC R产物片段=1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000（注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg，也可以直接用这个公式套。1pmol 1000bp DNA=0.66μg，如载体是5380b p，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524μg。 5. 测DNA浓度： 测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的MARKER每个条带约50ng。 6. 连接反应： TAKARA的连接酶上的说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λD NA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNa段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350 U/μl ，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3个小时足已。 7.转化： ①全量（10 μl）加入至100μl JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。 ②42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。 ③加入890 μl AMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。 取100μl铺板。也可离心后余100μl 几个非常重要的问题： 1 做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解。为保险起见，一般连接3小时，16度。
双酶切连接反应之全攻略
双酶切连接反应之全攻略 1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照： 双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。 纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒 酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。 而该酶浓度约为15单位/ 微升，在除外酶降解的 因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约 为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的 质量好，酶切完全切得动。 2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接 摩尔比的计算: 很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则 非常有必要。回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。 pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为 0.03×5.38×0.66=0.106524μg。 测DNA浓度: 可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER 进行估测，如MARKER2000，5微升的 MARKER每个条带约50ng。 连接反应：TAKARA的 连接酶上的 说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段 被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350 U/μl ，所以完全够用。连 接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3个小时足已。 3、转化： a、全量（10 μl）加入至100 μl JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。 b、42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。 c、加入890 μl AMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。 取100μl铺板。也可离心后余100μl 几个非常重要的问题 1 做转化的时候,进行酶连接反应时,注意保持低温状态,因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见,一般 连接3小时,16度.
质粒的酶切、连接、与转化
质粒DNA酶切、连接、转化、筛选、鉴定 (2011-04-29 10:42:22) 转载▼ 质粒DNA酶切、连接、转化、筛选、鉴定 实验目的 1、学习和掌握限制性内切酶的特性 2、掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法 3、掌握利用CaCl2制备感受态细胞的方法 4、学习和掌握热击法转化E.coli的原理和方法 5、掌握α互补筛选法的原理 6、学习用试剂盒提取重组质粒DNA的方法 7、复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法 实验原理 重组质粒的构建需要对DNA分子进行切割，并连接到合适的载体上进行体外重组。限制性核酸内切酶和DNA连接酶的发现与应用，为重组质粒的构建提供了有力的工具。 限制性核酸内切酶酶切分离法适于从简单基因组中分离目的基因。质粒和病毒等DNA 分子小的只有几千碱基，大的也不超过几十万碱基，编码的基因较少，获得目的基因的方法也比较简单。 DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-羟基间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的DNA连接酶是来自Ｔ４噬菌体的DNA 连接酶：T4 DNA连接酶。T4 DNA 连接酶在分子克隆中主要用于：1、连接具有同源互补粘性末端的ＤＮＡ片段；2、连接双链DNA分子间的平端；3、在双链平端的DNA分子上添加合成的人工接头或适配子。 目的DNA片段与载体DNA片段之间的连接方式（以T4DNA连接酶为例）主要有以下几种： （一）、具互补粘性末端片段之间的连接 大多数的核酸内切限制酶都能够根据识别位点切割DNA分子，形成1~4核苷酸单链的粘性末端。当载体和外源DNA用同一种限制性内切酶切割时，产生相同的粘性末端，连接后仍保留原限制性内切酶的识别序列；如果用两种能够产生相同的粘性末端的限制酶（同尾酶）切割时，虽然可以有效地进行连接，但是获得的重组DNA分子消失了原来用于切割的那两种限制性核酸内切酶的识别序列，这样不利于从重组子上完整地将插入片段重新切割下来。 （二）、平末端的连接 载体分子和外源DNA插入片段并不一定总能产生出互补的粘性末端。实际上有许多情况都是例外的，因为有些限制酶切割DNA分子之后所形成的都是平末端的片段；有的实验要用两种不同的限制酶分别切割载体分子和外源DNA，形成的也多半是非互补的粘性末端或平末端；再如用机械切割法制备的DNA片段，PCR扩增的和化学合成的DNA片段或由RNA为模板反转录合成的cDNA片段，也不会具有互补的粘性末端。 理论上任何一对DNA平末端均能在T4DNA连接酶催化下进行连接，这给不同DNA分子的连接带来了方便。但是，平末端连接更为复杂，且速度也慢得多，因为一个平末端的5’磷酸基团或3’羟基与另一个平末端的3’羟基和5’磷酸基团同时相遇的机会显著减少，通常
实验3酶切与连接
实验三、酶切与连接 一、实验目的与原理简介 限制性内切酶在基因工程中主要应用地以下两个方面：制作基因酶切图谱和进行基因克隆。 制作基因图谱，就是利用特定的酶切出特定的条带； 而利用基因克隆时选择酶应注意以下几个方面： 1）克隆片段的长度；2）克隆片段中切点的情况3）载体上切点的情况； 4）切割与连接方式；5）接头状态。 酶切方式可分为部分酶切和完全酶切两种： 1）部分酶是指同一DNA 片段上有些被切开而另一些未被切开，此法主要应用于基因 的克隆 。用部分酶切法是基于基因内部可能有此酶的位点。进行部分酶切可通过两个方式：一是不同的时间内在同一酶反应管中取样终止反应，利用时间来控制酶切的程度。另一种是在其余条件相同时控制 酶的稀释度，利用不同酶浓度控制酶切程度，这种方法因易于控制反应而被广泛应用。 2）完全酶切法适用于如载体切割、酶切图谱的制作、基因的鉴定与DNA 片段的分离工作。完全酶切又可分为单酶切、多酶切两种。在多酶切反应中当2种或2种以上的酶有相同 的反应条件时，可同时进行酶切，不然须在前一种酶作用完成后将其失活，而后进行第二种酶切反应，这样可以避免片段混乱现象的出现。 二、材料和试剂 限制性内切酶NotI 、EcoRI ；10×Buffer ， PCR 产物、pPIC9K 质粒、10×T4连接Buffer 、T4 Ligase 、DDW 、琼脂糖、电泳缓冲液 、Goldview 染液、胶回收试剂盒；电泳仪、恒温水浴锅、EP 管、移液枪、灭菌枪头、紫外检测仪 三、实验步骤 1）PCR 产物双酶切（NotI ，EcoRI ），pPI9K 质粒双酶切(NotI ，EcoRI )；PCR 体系如下： 2）然后电泳检测后在紫外检测仪下观察（UV ，260nm ）。 3）切胶回收（尽量不要切到不含目的片段的胶），按照胶回收试剂盒标准操作。 4）回收产物电泳检测后进行连接： 连接体系： 10×T4连接Buffer 1μl 目的基因 6μl 质粒载体 2μl 产物酶切体系 pPI9K 质粒酶切体系 DDW 4.6μl DDW 7μl 10×H Buffer 1μl 10×H Buffer 1μl 目的片段 4μl pPI9K 质粒 1.6μl NotI quickcut 0.2μl NotI quickcut 0.2μl EcoRI quickcut 0.2μl(37℃15min) EcoRI quickcut 0.2μl(37 ℃15min)
酶切和连接5页
双酶切： 载体大小为3000bp左右，在SfiⅠ和BssHⅡ位点之间有370bp左右的片段存在。 我想通过SfiⅠ和BssHⅡ双酶切，将370bp的片段切掉，然后装入不同的片段。 我的酶切体系如下： 质粒（载体＋老片段）1ul（约100ng） (NEBlack Eye SfiⅠ1ul (NEBlack Eye BssHⅡ1ul 10×buf 2.2ul 100×BSA 0.2ul 水14.8ul 总体积20ul 50度，2小时。切出了370bp左右的片段，回收载体。 然后取回收载体的1ul自连，铺平板，但是长出了300多个克隆。证明酶切不完全，怀疑有大量载体只是单酶切。50度3小时我试过，但是质粒有降解。酶量应该说是过量的。请问有什么办法可以酶切完全？ 粘性连接 （一）外源DNA和质粒载体的连接反应 外源DNA片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链DNA5’磷酸和相邻的3'羟基之间形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成4个新的磷酸二酯链。但如果质粒DNA已去磷酸化，则吸能形成２个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有２个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复。相邻的５'磷酸和３'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的DNA连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌DNA连接酶和Ｔ４噬菌体DNA连接酶。实际上在有克隆用途中，Ｔ４噬菌体DNA连接酶都是首选的用酶。这是因为在下沉反应条件下，它就能有效地将平端ＤＮＡ片段连接起来。 ＤＮＡ一端与另一端的连接可认为是双分子反应，在标准条件下，其反应速度完全由互相匹配的ＤＮＡ末端的浓度决定。不论末端位于同一ＤＮＡ分子（分子内连接）还是位于不同分子（分子间连接），都是如此。现考虑一种简单的情况，即连接混合物中只含有一种ＤＮＡ，也就是用可产生粘端的单个限制酶切割制备的磷酸化载体ＤＮＡ。在瓜作用的底物。如果反应中ＤＮＡ浓度低，则配对的两个末端同一ＤＮＡ分子的机会较大（因为ＤＮＡ分子的一个末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同ＤＮＡ分子的末端的概率）。这
双酶切连接反应
【原创】双酶切连接反应之全攻略（原创） 双酶切连接反应之全攻略 前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了14个质粒。现就自己的体会，结合战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。 1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照： 双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。 纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒 酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。 2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接 摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则非常有必要。回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者，后者取。pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=μg,如载体是5380bp，则为 ××=μg。 测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的MARKER每个条带约50ng。连接反应：TAKARA的连接酶上的说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为个小时足已。3，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间350 U/μl 3、转化： a、全量（10 μl）加入至100 μl JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。 b、42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。 c、加入890 μl AMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。 取100μl铺板。也可离心后余100μl 几个非常重要的问题 1 做转化的时候,进行酶连接反应时,注意保持低温状态,因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见,一般连接3小时,16度. 2 对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时,注意加AMP时的温度,温度过高,会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为 55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干 3对照的设立： 为验证双酶切是否成功,可做如下对照: A 酶切反应时加各单酶分别切,两管,用同一种BUFFER,跑胶,看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功. 做转化时,也要进行对照. 设4个: A.即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应,这个对照可进一步看双酶切是否成功,如果长出克隆,说明很有可能只进行了单酶切,如没长出克隆,则证明双酶切成功, 当然要保证感受态,培基,连接酶都'正常'的情况下. B.酶切过的未进行连接反应的双酶切产物,进行转化,这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒 C.设原始质粒为对照,意为检测整个操作过程中是否有误. 阴性板上用同一批感受态细胞铺板20微升足够,检测感受态状况. 4.所有的试剂切记低温保存.一步一个脚印.不要偷懒,图省事最后却更费事.注意设立对照。
酶切
DNA的酶切实验 采用粘末端连接必须对目的DNA分子和载体分子进行酶切以获得相应的粘末端进行连接。酶切可以是单酶切也可以是双酶切。单酶切操作比较简单，但双酶切如果两种酶所用缓冲液成分不同（主要是盐离子浓度不同）或反应温度不同，这时可以采用如下措施解决：1）先用一种酶切，然后乙醇沉淀回收DNA分子后再用另外一种酶切；2）先进行低盐要求的酶酶切，然后添加盐离子浓度到高盐的酶反应要求，加入第二种酶进行酶切；3）使用通用缓冲液进行双酶切。具体要根据酶的反应要求进行，尽量避免星号活力。一材料、试剂和仪器： 1 材料：质粒DNA 2 试剂：限制性内切酶、ddH2O 3 仪器：微量移液枪，离心机，水浴锅，电泳仪，紫外透射观测仪 实验程序： I. .单酶切： II. 双酶切： 注：酶切的选择原则一般是尽量扩大酶切体系，这样抑制因素得以稀释；基因组DNA或质粒DNA酶的用量较一般DNA大，一般为1μg/10U;所加酶的体积不能超过酶切总体积的1/10，否则甘油浓度会超过5%，会产生星号活力；对难切的质粒或基因组DNA应延长反应时间4—5hr, 甚至过夜。灭火限制性内切酶活性可以采用加热灭活，乙醇沉淀，酚/氯仿抽提，添加EDTA或SDS等方法，具体每一种酶可能有些方法不能完全灭活，这一点需要注意。 二. 结果与分析： 假若一种酶在环状质粒DNA中只有一个酶切位点, 且酶切彻底，紫外灯下检测电泳结果, 则单酶切应为一条带, 而双酶切则为两条带。如果条带数目多于理论值,那么有可能是酶切不完全。如果酶切结果与酶切前的质粒条带一样（超螺旋、线性和开环三条带），则说明质粒完全没有被切开。 图4 重组质粒HindIII XbaI双酶切琼脂糖凝胶电泳分析
实验2 酶切 片段回收和连接
酶切、片段回收与连接 黄华如 （生命科学学院，生技091，29号） 摘要：实验用bt2质粒和pet质粒做酶切材料，回收目的片段，经连接后，转入以氯化钙罚制备的大肠杆菌感受态细胞中，并让转化大肠杆菌在含有抗生素培养基上生长，最后用长出来的大肠杆菌做验证PCR。本次试验中，质粒经过双酶切后，可以清晰的看到目的条带，转化后的大肠杆菌也可以在含有抗生素培养基中长出来，但是最后的验证PCR验证在培养基上生长的是假阳性大肠杆菌。说明了实验中目的基因没有成功转入大肠杆菌。 关键词：重组；酶切；连接；转化；片段回收 基因文库的建立为重组DNA研究工作提供了方便的、有意义的基因。构建基因文库的意义不只是使生物的遗传信息以稳定的重组体形式贮存起来，更重要的是它是分离克隆目的基因的主要途径。对于复杂的染色体DNA分子来说，单个基因所占比例十分微小，要想从庞大的基因组中将其分离出来，一般需要先进行扩增，所以需要构建基因文库。 基因工程(gene engineering)是20世纪70年代以后兴起的一门新技术，即用人工的方法，把遗传物质DNA分离出来，在体外进行基因切割、连接、重组，然后再转移到生物体内并进行表达的技术。基因工程中的关键一步是将目的基因与DNA载体连接成重组DNA，获得重组子，并把重组子筛选出来。近年来，建立了许多方法来筛选重组子，其中较为常用的是利用a互补原理，根据菌落的蓝白颜色进行筛选1oL一互补是指E．coli B一半乳糖苷酶的两个无活性片段(N端片段和c端片段)组合而成为功能完整的酶的过程。现在使用的许多质粒载体都带有一个E．coli DNA的短片段，其中含有B．半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码信息及调控序列。在这个编码区中插入了一个多克隆位点，可在此处插入外源DNA 片段。这种类型的载体适用于可编码B．半乳糖苷酶c端部分的宿主细胞。尽管宿主和载体编码的两个片段都没有活性，但他们能够融合为具有酶活性的蛋白质，在含有底物X-gal的培养基中形成蓝色菌落。当外源DNA片段插入到质粒的多克隆位点后，导致N端片段丧失仪．互补能力，因此，带有重组质粒的宿主细胞将形成白色菌落[1]。 1 材料与设备 1.1 试供材料 大肠杆菌、质粒DNA 1.2 试剂准备 质粒DNA回收试剂盒、灭菌水、琼脂糖、BamHI、HindIII、T4连接酶、T4 Buffer、LB 固体培养基、等 1.3 实验设备及用具 高速冷冻离心机、液氮罐、恒温水浴锅、紫外分光光度计、制冰机、冰箱、移液枪、PH 计、冰盒、恒温培养箱、恒温振荡摇床、高压灭菌锅、恒温水浴锅等。 2 实验步骤 2.1 提取质粒DNA 这个步骤由老师完成 2.2 酶切
酶切反应注意事项
1、DNA纯度 一般而言，纯度高的DNA（即混入的蛋白质、RNA或多糖类物质较少）容易被限制性内切酶消化，基因重组是严重洪的所有酶促反应都有类似共性，因此应尽量提高DNA纯度。若DNA不能被限制性内切核酸酶切割，应对DNA样品进行酚抽提、乙醇沉淀等操作，以提高DNA纯度。下列因素影响DNA纯度： (1)DNA样品中常常杂有RNA，虽然它的存在不影响酶的反应速度，但RNA可和酶蛋白 发生非特异性结合而减少酶的有效浓度，使酶解不彻底。另外，RNA在凝胶电泳中 呈现的区带会掩盖该区带范围内的DNA片段的呈现，干扰DNA片段的观察。 (2)一般来说，少量蛋白质的污染对DNA酶解的影响不大，但如果杂有核酸酶等蛋白质， 就会干扰酶切反应，并影响酶解产物。有一类蛋白质叫结合蛋白，他能与DNA发生 非特异结合，不仅封闭DNA上的识别序列而影响酶切反应，而且DNA与蛋白质结 合物在凝胶电泳上迁移甚慢，从而改变DNA片段在电泳图谱中的位置，影响DNA 片段的定性分析。 (3)样品中杂有其他DNA，如制备的质粒DNA中含有染色体DNA片段等，它们不影响 酶解作用，但干扰酶解产物电泳图谱并影响以后的重组连接反应。 (4)DNA样品中的其他杂志，如Hg2+、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等，这些杂 质常常是制备过程中不慎带进的，它们影响酶切速度，甚至改变识别特异性，出现 酶的第二活性。 2、DNA甲基化 限制性内切核酸酶的识别序列若被修饰酶产生了修饰反应（如甲基化酶的甲基化反应），则该DNA不能被限制酶再切割。甲基化酶是大多数大肠杆菌菌株中都存在 的酶系之一，有dam甲基化酶和dcm甲基化酶两大类。Dam甲基化酶在5’GATC3’ 的A上甲基化，dcm甲基化酶在5’CCAGG3’或5’CCTGG3’的C上甲基化。若出现甲基 化影响，则应使用甲基化酶缺陷菌株（dcm或dam），或使用不受甲基化酶影响的限 制性内切核酸酶，如MboI和Sau3A是同裂酶，因MboI受甲基化影响程度大，则宜 使用几乎不受甲基化酶影响的Sau3A。 3、星号活力 又称第二活力，是指该改变了酶切反应条件后特异序列识别特性降低的一种现象。 由于识别特异性降低，可能对原识别序列相似的序列也产生切割反应。如EcoRI的典型识别序列为GAATTC，条件改变后，其识别序列由原来的六核苷酸降为四核苷酸AATT。 高浓度甘油、高PH、低离子强度、β-巯基乙醇、DMSO、Mn2+等的存在可能导致酶产生星号活力。厂家提供的酶一般存放在50%甘油溶液中，若酶量站反应体系的1/10以上，将可能导致星号活力。小的反应体系若长时间在恒温水浴锅中进行酶切反应，因Eppendorf管里的内外温差将导致水分蒸发，蒸气凝结在盖子上而使反应体积缩小非常明显，将改变反应体系的组成，而容易产生星号活力，因此长时间进行酶切反应，宜使用空气恒温箱为保温设备，可避免水分蒸发和凝结。 4、终止限制性内切核酸酶反应的方法 (1)加EDT A以Mg2+,使酶失去辅助因子而终止酶切反应； (2)65℃下保温5-10min而使酶失活。但是有些酶在此温度下仍有活性，这种酶就不能 用高温失活方法来终止酶切反应； (3)加SDS至终浓度0.1%或加尿素至0.5mol/L，使酶蛋白解聚变形； (4)用等体积酚抽提酶解产物，这种方法使酶活性丧志最彻底，灭火后的样品用乙醇沉 淀法回收DNA；
酶切反应的建议
酶切反应建议 一、建立一个标准的酶切反应 目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。通常，一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可完全反应。 二、选择正确的酶 不言而喻，选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。假设一个GC含量50%的DNA链，一个识别4个碱基的酶将平均在每44（256）个碱基中切割一次；而一个识别6个碱基的酶将平均在每46（4096）碱基切割一次。内切酶的产物可以是粘端的（3'或5'突出端），也可以是平端的片段。粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接。 三、酶 内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。酶的用量视在底物上的切割频率而定。例如，超螺旋和包埋法切割的DNA通常需要超过1U/μg的酶才能被完全切割。 四、DNA 待切割的DNA应当已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂或过多盐离子的污染，以免干扰酶的活性。DNA的甲基化也应该是酶切要考虑到的因素。关于甲基化的内容， 五、缓冲液 对于每一种酶NEB都提供相应的最佳缓冲液，可保证几乎100%的酶活性。使用时的缓冲液浓度应为1X。有的酶要求100μg/ml的BSA以实现最佳活性。在这种情况下，我们也相应提供100X的BSA（10mg/ml）。不需要BSA的酶如果加了BSA也不会受太大影响。 六、反应体积 内切酶活力单位的定义是：1小时内，50μl反应体积中，降解1μg的底物DNA所需的酶为一个活力单位。因此酶：DNA的反应比例可以由此确定。较小的反应体积更容易受到移液器误差的影响。为了将甘油的浓度控制在5%以下，要注意酶的体积不要超过总体积的
双酶切连接反应之全攻略(
原创】双酶切连接反应之全攻略（原创） 转自医学教育网的一篇贴子，很精彩，希望大家有做到的一定仔细看看，也添加了一些自己的体验。希望大家继续补充 双酶切连接反应之全攻略 前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了 14个质粒。现就自己的体会，结合战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。 1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照： https://www.wendangku.net/doc/c56588273.html,/upload/2006/08/13/31219184.pdf。 双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。 纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是TAKARA 的纯化柱试剂盒 酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml 菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。 2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接 摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则非常有必要。回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。 pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为 0.03×5.38×0.66=0.106524μg。 测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的 MARKER每个条带约50ng。 连接反应：TAKARA的连接酶上的说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl 的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350 U/μl ，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3个小时足已。 3、转化： a、全量（10 μl）加入至100 μl JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。 b、42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。 c、加入890 μl AMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。 取100μl铺板。也可离心后余100μl 几个非常重要的问题
连接体系问题解答
关于连接的提问多集中在连接的体系、DNA的用量、vector和insert的比例、连接酶等。但是我认为，连接不成功，问题并不一定出在连接这步上。 有很多环节影响连接的成败，如酶切的好不好、回收的质量好坏、连接时的浓度或比例、感受态等。以下我详细说明。 1，PCR引物的设计。通俗的不说，需要指出的是设计引物时一定要考虑切点的甲基化问题。做普通的克隆会涉及到甲基化形式有两种：dam甲基化和dcm甲基化。常用的大肠杆菌都有这两种甲基化酶。dam甲基化酶识别GATC位点并甲基化；dcm甲基化酶识别CCWGG位点（W是A或T）并甲基化。如果有这两种位点那么多数情况内切酶是切不开了。容易受甲基化影响的内切酶有：Dpn1（GA/TC）天生就甲基化；Cla1（ATC/GAT）如果前面加个G或后面加个C那么恭喜你，dam甲基化；Xba1（T/CTAGA）如果前面加个GA或后面加个TC也是dam甲基化，等等有好多。这些容易甲基化的切点设计引物时一定要注意，避免引入甲基化位点。如果真是避免不了或者后来才发现问题，那么把甲基化的质粒转化到甲基化酶缺陷型大肠杆菌中再提质粒就没有甲基化，可以切了。甲基化缺陷型菌有：DM1（Invitrogen）、INV110（invitrogen）、JM110等。 2，PCR产物。两种方式：一种纯化后直接酶切连接；一种连T载体再往下切连接。我个人强烈建议第二种，连T载体。因为PCR产物直接酶切我觉得有两个缺点：①由于两头把手太短，虽说有保护碱基，但我觉得还是不如从质粒上往下切好切，而且容易切坏、切碎；②无法从电泳上看出来切没切开，因为也就切下了几个十几个bp，带形没啥变化。连T载体的优点：①进载体后，大提一次的质粒夸张点说够用一辈子的，不用总PCR往出调了，再说PCR 那东西还不太稳定，一把多一把少的。②酶切会很清晰，切下来了就是有带，没切动就是没有，没连上也能知道不是没切开而是别的步骤有问题。连T载体也有些麻烦的地方，如需要的切点有时跟T载体上自带的切点冲突，这就要小心鉴别；而且连T载体最好测序看一下PCR的产物对不对、切点对不对。总体来讲连T载体是很有优势的。 3，提质粒。有时手工小提或粗提的质粒酶切效果不好，这可能是提取的不够纯或者内切酶品质不好。所以若酶切效果不佳建议用柱子精提或大提。 4，酶切。用于连接的酶切很关键。需注意如下几点： ①如果是双酶切A和B，预实验中必须做A和B各自的单酶切和A+B的双酶切,好确认这几种酶都好用，质粒上的切点都好用。如果切不开就要考虑是不是酶的问题，buffer的问题，质粒上有没有这些切点，序列是否甲基化等。 ②酶切尽量用大体系，如50ul、100ul等。大体系能稀释内切酶包装中的甘油，对反应有利。相反，连接尽量用小体系，以增加DNA末端的碰撞机会。 ③如果要回收、连接，酶切用的DNA量我的经验是不用太大。大了会切碎，形成一些不规则的末端，不利于连接。 ④酶切后的电泳，即切胶的那次电泳中，如果切成的条带很清晰，不拖泥带水，没有弥散，没有拖尾，那做回收、连接效果最好。相反，若有弥散、拖尾、不清楚、一团亮等情况就是切的不好，做后续实验成功率会降低。若真是效果很差建议改进体系重新切。 5，回收。回收可以用柱式试剂盒或手工法。柱式回收试剂盒：此类试剂盒适合各种长度DNA，对黏性末端基本没有破坏，回收效率也不错。手工醇沉法步骤如下，把切得的胶弄碎，用Tris-HCl浸泡一段时间，吸出所有的液体，用酚抽提一遍，氯仿抽提一遍，加盐和醇醇沉，沉淀用70％乙醇漂洗，再用Tris溶解。次方法优点是对DNA和黏性末端的损伤最小，缺点是容易损失DNA。若本来DNA数量就不多，用手工法很容易丢失殆尽；如果DNA量很大可以考虑使用。 回收后要电泳，一来估算回收液浓度，二来看回收DNA的质量。若条带有弥散，即自目的
酶切连接经验之谈
酶切 本实验室条件下酶切连接经验之谈 1、PCR产物可以切胶回收后酶切，用Elution buffer溶解即可，不影响后续实验。 2、50ulPCR产物切胶回收后用35ul Elution buffer溶解后只需取一半体积用于后续实验即可 满足要求。 3、PCR产物可以用乙醇沉淀法获得DNA用于后续反应，但需取少于一半的量用于后续实验， 否则会不能完全切开而导致实验失败。 4、双酶切时，若2种酶不是同一厂家时，可以根据Thermo厂家该2种酶的共同buffer， 选用Tango缓冲液，一般50ul体系各加1ul酶，而快切酶只需0.5ul,切3小时即可。 5、添加酶切试剂时，应先将buffer和样品振荡均匀后再加入相应的酶，轻弹混匀即可。 6、观察酶切后的载体片段会比质粒大很多，PCR产物双酶切后的片段也比未酶切时要大， 并且酶切后产物有时会呈现稍微弥散的宽带，由此可以判断是否切开。 7、部分限制性内切酶对甲基化的DNA不能切割，如FbaI和MboI等，一般生物公司提供的内切酶说明中均有说明。 大多数酶切位点的甲基化不影响切割，而有些会影响，如XbaI, BclI等。而且甲基化只发生在特定序列，以XbaI为例，只有在位点序列旁出现GA或TC，该XbaI位才会被甲基化。 而要解除这种限制修饰作用通常有两种方法： （1）选用上述酶的同功酶，如Sau3AI，DNA识别切割位点与MboI相同；但不受甲基化影响； （2）利用甲基化酶缺失的受体细胞进行DNA的制备，如E.coli JM110和链霉菌等，前者Dam和Dcm甲基化酶已敲出，而后者细胞内本就没有甲基化酶，从这些细胞中抽提的DNA就能被上述酶切割。 8：E.coli JM110 要排除dam,dcm甲基化的影响，需要用特定的dam-,dcm-的菌株，如JM110 如果由JM110或SCS110等甲基化缺失的菌株产生的质粒，则不会被甲基化. 若酶切不成功可以考虑以下因素的影响 a)有些内切酶对PCR产物酶切效率较低 b)双酶切无共同buffer时，可以采用分步酶切 c)PCR产物直接双酶切不成功，可以选择先做TA克隆后再双酶切 d)当载体的2个酶切位点很接近，或者其中一个酶切效率很差时，可以对载体进行去磷酸 化，该酶为牛小肠碱性磷酸酶，在大多数限制酶缓冲液中均有活性 e)导致“星星活性”可能是体系中甘油浓度过高、高PH、较低的离子强度所致。 连接 1、一定要选择未经过反复冻融的连接buffer，并准确加入，确保其终浓度准确。 2、目的片段和载体比例不是影响连接成功与否的关键原因，依据经验，取相等质量的的目 的片段和载体即可，载体可以尽量少加一点。3ug 载体（5kb）相当于2pmol 线性DNA 或者4pmol双酶切产物。 3、多个片段连接时，体系中，终浓度的各个片段与载体相同即可。
双酶切连接反应的注意要点
双酶切连接反应的注意要点 双酶切： 1、在双酶切载体时如果2个酶切位点靠得很近，必须注意酶切顺序。因为有的限制性内切酶要求其识别序列的两端至少保留有若干个碱基才能保证酶的有效切割。有的酶要求识别序列两端有多个碱基的，则必须先切，否则就可能造成酶切失败。 2、回收PCR产物：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。pmol为单位的DNA转换为为?g单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为?g,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524?g。 3、双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，一般酶切3个小时，对于PCR产物，可以过夜酶切，效果会很好。酶切体系不宜过大，会影响质粒和酶的碰撞机会，效果降低；质粒量不应该超过酶切要求的最大量，否则酶切不完全，酶的用量控制在1U酶在15-20ul体系中酶解1ugDNA。 4、两种酶切的条件不同时，分别进行两次酶切，切完一个纯化后再切：温度要求不同，先酶切低温要求的，再酶切高温要求的；若盐浓度要求不同，先酶切低盐浓度要求的，再酶切高盐浓度要求的。 5、若质粒是在TE中保存的，TE 中的EDTA可能与酶的激活因子螯合，影响酶切效果，可放大酶切体积或重新浓缩质粒。 6、限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。 7、纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。 8、酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml 菌液提出的DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。 9、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接：摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则非常有必要。回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。pmol为单位的DNA转换为为?g单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为?g,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol 为0.03×5.38×0.66=0.106524?g。测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的MARKER 每个条带约50ng。 10、连接反应：TAKARA的连接酶上的说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350 U/μl ，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3个小时足已。
双酶切反应
双酶切buffer的选择： 1、U ：Supplied with its own unique reaction buffer that is different from the four standard NEBuffers. Its compatibility with the four standard NEBuffers is indicated by the chart. 2、BSA ：Supplied with a separate vial of bovine serum albumin (10 mg/ml). To obtain 100% activity BSA should be added to the 1X reaction mix to a final concentration of 100 μg/ml. 3、SAM ：Supplied with a separate vial of S-adenosyl-methionine (SAM). To obtain 100% activity, SAM should be added to the 1X reaction mix as specified on the product data card. 4、dd ：When performing a double digest with this enzyme, this NEBuffer is recommended because it minimizes star activity. Purified by scientists at SibEnzyme and supplied with a SibEnzyme buffer (B, K, O, W or Y) which ensures 100% activity. Its compatibility with the NEBuffer System is indicated on the chart. 5、NR :This buffer is not recommended for use with with this enzyme。 6、Buffer Compositions ：(1X): NEBuffer 1 (yellow): 10 mM Bis Tris Propane-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT (pH 7.0 at 25℃). NEBuffer 2 (blue): 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 1 mM DTT (pH 7.9 at 25℃). NEBuffer 3 (red): 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 1 mM DTT (pH 7.9 at 25℃). NEBuffer 4 (green): 20 mM Tris-acetate, 10 mM magnesium acetate, 50 mM potassium acetate, 1 mM DTT (pH 7.9 at 25℃). 双酶切连接反应的经验谈： 双酶切： 1、在双酶切载体时如果2个酶切位点靠得很近，必须注意酶切顺序。因为有的限制性内切酶要求其识别序列的两端至少保留有若干个碱基才能保证酶的有效切割。有的酶要求识别序列两端有多个碱基的，则必须先切，否则就可能造成酶切失败。 2、回收PCR产物：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。pmol为单位的DNA转换为为?g单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为?g,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524μg。 3、双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，一般酶切3个小时，对于PCR产物，可以过夜酶切，效果会很好。酶切体系不宜过大，会影响质粒和酶的碰撞机会，效果降低；质粒量不应该超过酶切要求的最大量，否则酶切不完全，酶的用量控制在1U酶在15-20ul体系中酶解1ugDNA。