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Southern杂交操作步骤

Southern杂交操作步骤
Southern杂交操作步骤

一基因组酶切和电泳

在200 μl 微量离心管中加入:

25 μl DNA样品(约10μg),

3μl 限制性内切酶(MBI,10 U/ μl)

5 μl 相应的10×buffer,

补水到50μl。

然后加一滴矿物油覆盖, 稍微离心后放于37℃水浴8-12小时。酶切完后,取5μl 酶切DNA样品于0.8%的琼脂糖凝胶上检测酶是否充分。如果酶切充分,灌制0.8%的agrose胶,加入上样buffer后,在25—30V 稳压电泳12—16hrs。

注意:在southern杂交中对,DNA的质量要求较高,否则酶切不完全导致失败。

二转膜

1 用0.2MHCl 脱嘌呤处理,偶尔轻轻振荡至溴酚蓝完全变成黄色,大约需要15~30分钟。然后用水漂洗凝胶2~3次,将水倒尽,加入碱变性液,偶尔轻轻振荡至溴酚蓝完全恢复到原来的蓝色(大约需要20~30分钟)。

注意:此方法对酶切后目标片段大于15kb时用,如果小于15kb最好不要进行脱嘌呤处理,否则容易将片段打断,导致转膜后结合不紧密。

2 取一磁盘架上一洗净玻璃板,在磁盘中倒入适量的转膜缓冲液,在玻璃板上架两层长滤纸(30cm左右)(注意不要产生气泡)搭成盐桥。(滤纸比胶弱宽)依胶大小裁好尼龙膜,写好标记,正面向下,紧贴于胶上,防止有气泡产生,接这压两张同样大小的滤纸,不可过大以免短路,胶周围用X光片压条。胶应反面朝上因为DNA多在胶的底层。堆积吸水纸。上面放一小玻板,板上加一500 g左右的重物。

注意:防止短路

3 转膜16---20hrs后,将尼龙膜取下,胶染色,观察转膜效果。将膜用2xSSC浸泡20分钟,滤纸吸干后放在烘箱中烘2hrs(80℃)。待用。

三杂交

¨杂交炉与杂交管预热至65℃

¨尼龙膜用2×SSC浸泡

配置杂交液

ssDNA沸水变性10min,冰浴10min,置冰浴备用

Components Volume (ml) Note

ddH2O 20.7

50×Denhardts 0.6

P/H stock 8.1

20% SDS (OR 10% SDS) 0.3 (OR 0.6)

Total 30 ml for 2 blots. 65℃预热.

Add prepared ssDNA (10mg/L)≥0.3 ml

倒入杂交液,加入尼龙膜,65℃预杂交4~5小时(新膜)

注意:赶尽膜与膜之间的气泡后把几张膜同时放入杂交管,并用玻棒赶尽膜与管壁之间的气泡,最后加入杂交液,盖好管盖。

四探针标记

(for1~2 blots)

ddH2O 7 ml

Marker 1.5 ml

模板DNA 2 ml (about 100 ng)

沸水变性8min,冰浴10min,瞬时离心

Add Buffer+Primer 7.5 ml

Add dNTPs(-dCTP) 3 ml

Add Klenow (about 1.5U) 1 ml (2U/ml)

瞬时离心

Add 32p-dCTP 1~2 ml (10~20 uCi per blot)

37℃水浴≥4小时

五杂交

向标记探针的离心管中

Add 等体积TE 25 ml

Add 10×体积变性剂(杂交液)250 ml

沸水变性10min,冰浴10min,将变性好的探针加入到杂交液中,混匀,65℃杂交过夜(12~16小时)。六洗膜

1. 2×SSC,0.5%SDS 5min

2. 0.1×SSC,0.1%SDS xmin (RT)

3. 0.1×SSC,0.1%SDS χmin (65℃)

(洗膜过程中不断检测放射性强度直至200~500)

滤纸吸干洗液,保鲜膜包好,暗室中压片,根据放射性强度暴光若干天。

冲洗X光片。

50×Tris-乙酸(TAE)缓冲液:

成分及终浓度配制1L溶液各成分的用量

2mol/L Tris碱

1mol/L 乙酸

100 mmol/L EDTA

水242g

57.1 ml的冰乙酸(17.4 mol/L)

200ml的0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)

补足1L

5×Tris-硼酸(TBE)缓冲液:

成分及终浓度配制1L溶液各成分的用量

445 mmol/L Tris碱

445 mmol/L 硼酸盐

10 mmol/L EDTA

水54g

27.5g 硼酸

20 ml的0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)

补足1L

分子生物学实验室常用仪器及使用方法

实验指导 目录 实验一分子生物学实验室常用仪器及使用方法实验二质粒DNA的提取-碱裂解法 实验三琼脂糖凝胶电泳 实验四限制性内切核酸酶的酶切与鉴定 实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 实验六动物组织细胞基因组 DNA提取 实验七 DNA的定量 实验八 PCR基因扩增 实验九琼脂糖凝胶电泳分离与纯化目的DNA 实验十 DNA重组 实验十一动物组织细胞总RNA的提取 实验一分子生物学实验室常用仪器及使用

事实证明,在科学飞速发展的今天,无论从事哪个领域的研究,要想突破,除了有良好的理论基础外,更重要的是依赖于先进的技术和优良的仪器设备以及良好的研究环境。一个标准的分子生物学实验室除了具有一般生物学实验室的常规仪器设备外,还具有一些特殊用途的仪器,这些仪器一般较精密,价格昂贵。下面介绍这些仪器的使用方法和注意事项。 一、冷冻离心机 低温分离技术是分子生物学研究中必不可少的手段。基因片段的分离、酶蛋白的沉淀和回收以及其它生物样品的分离制备实验中都离不开低温离心技术,因此低温冷冻离心机成为分子生物学研究中必备的重要仪器。在国内,有多个厂家生产冷冻离心机,本实验室的高速冷冻离心机为GL-20G-Ⅱ型(上海安亭),落地式。配有角式转头:6×50ml、12×10ml和12×1.5ml。极限转速20000rpm。 1. 安装与调试 离心机应放置在水平坚固的地面上,应至少距离10cm以上且具有良好的通风环境中,周围空气应呈中性,且无导电性灰尘、易燃气体和腐蚀性气体,环境温度应在0~30℃之间,相对湿度小于80%。试转前应先打开盖门,用手盘动转轴,轻巧灵活,无异常现象方可上所用的转头。转子准确到位后打开电源开关,然后用手按住门开关,再按运转键,转动后立即停止,并观察转轴的转向,若逆时针旋转即为正确,机器可投入使用。 2. 操作程序 (1)插上电源,待机指示灯亮;打开电源开关,调速与定时系统的数码管显示的闪烁数字为机器工作转速的出厂设定,温控系统的数码管显示此时离心腔的温度。 (2)设定机器的工作参数,如工作温度,运转时间,工作转速等。 (3)将预先平衡好的样品放置于转头样品架上,关闭机盖。 (4)按控制面板的运转键,离心机开始运转。在预先设定的加速时间内,其运速升至预先设定的值。 (5)在预先设定的运转时间内(不包括减速时间),离心机开始减速,其转速在预先设定的减速时间内降至零。 (6)按控制面板上的停止键,数码管显示dedT,数秒钟后即显示闪烁的转速值,这时机器已准备好下一次工作。 3. 注意事项 (1)离心机应始终处于水平位置,外接电源系统的电压要匹配,并要求有良好的接地线,机器不使用,要拔掉电源插头。

DNA实验技术:原位杂交实验要求及步骤

原位杂交组织(或细胞)化学(In situ Hybridization Histochemistry,ISHH)简称原位杂交(In Situ Hybridization),属于固相分子杂交的范畴,它是用标记的DNA或RNA为探针,在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。根据所用探针和靶核酸的不同,原位杂交可分为DNA-DNA杂交,DNA-RNA杂交和RNA-RNA 杂交三类。 根据探针的标记物是否直接被检测,原位杂交又可分为直接法和间接法两类。直接法主要用放射性同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核酸进行杂交,杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。间接法一般用半抗原标记探针,最后通过免疫组织化学法对半抗原定位,间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。 原位杂交最初是以同位素标记探针进行的。尽管同位素标记(如35S,3H,32P等)仍然广泛使用,但非同位素标记探针的迅速发展(尤其是生物素标记探针和地高辛标记探针),更引起科技工作者的极大兴趣。 一、基本要求 1. 组织取材:组织取材应尽可能新鲜。由于组织RNA降解较快,所以新鲜组织和培养细胞最好在30 min 内固定。 2. 固定目的是: (1)保持细胞结构; (2)最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平; (3)使探针易于进入细胞或组织。 最常用的固定剂是多聚甲醛,与其它醛类固定剂(如戊二醛)不同,多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接,因而不会影响探针穿透入细胞或组织。 3. 增强组织的通透性和核酸探针的穿透性: (1)稀酸处理和酸酐处理:为防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合,以降低背景,杂交前标本可用0.25%乙酸酐处理10 min,经乙酸酐处理后,组织蛋白中的碱性基团通过乙酰化而被阻断。组织和细胞标本亦可用0.2 M HCl处理10 min,稀酸能使碱性蛋白变性,结合蛋白酶消化,容易将碱性蛋白移除。 (2)去污剂处理:去污剂处理的目的是增加组织的通透性,利于杂交探针进入组织细胞,最常应用的去污剂是Triton X-100。注意:过度的去污剂处理不仅影响组织的形态结构,而且还会引起靶核酸的丢失。

Southern&northern&western杂交原理

Southern杂交 Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段,将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上,经干烤或者紫外线照射固定,再与相对应结构的标记探针进行杂交,用放射自显影或酶反应显色,从而检测特定DNA分子的含量 基本原理是:具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下,可按碱基互补的原则形成双链,此杂交过程是高度特异的。由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性,综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果,便可绘制出DNA分子的限制图谱。 Southern印迹杂交技术包括两个主要过程:一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物(硝酸纤维素膜或尼龙膜)上,即印迹(blotting);二是固定于膜上的核酸同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火,即分子杂交过程。该技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的,Southern印迹杂交故因此而得名。 Northern 印记杂交 Northern blot 是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法,通过northern blot 的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特定基因表达情况。 原理:在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳,继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。 Western杂交 原理:是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方法。其原理是:生物中含有一定量的目的蛋白。先从生物细胞中提取总蛋白或目的蛋白,将蛋白质样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中,经SDS-PAGE电泳将蛋白质按分子量大小分离,再把分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜(硝酸纤维素膜或尼龙膜)上,接着将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中温育,以封闭其非特异性位点。然后加入特异抗性体(一抗),膜上的目的蛋白(抗原)与一抗结合后,再加入能与一抗专一性结合的带标记的二抗(通常一抗用兔来源的抗体时,二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗体),最后通过二抗上带标记化合物(一般为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)的特异性反应进行检测。根据检测结果,从而可得知被检生物(植物)细胞内目的蛋白的表达与否、表达量及分子量等情况。

微生物实验操作步骤

微生物试验操作步骤 1.前期准备工作(红色字体需要购买) 10ml离心管(80管)、培养皿(预实验36板,正式试验648板,共计684板)、EP管(预实验36管,正式试验108管,144管)、枪头(5ml、1ml、200ul)、生理盐水现配现用(0.85)2.,灭菌处理 将离心管、枪头、生理盐水、培养基放入高压灭菌锅中灭菌处理后待用。 3.制备不同梯度的样品溶液 预实验 a.梯度稀释试验前一天晚上取置于-80℃盲肠食糜样品于4℃冰箱融化,将需要用到的离心管和EP管分别编号待用。试验期间取盲肠食糜0.5~1g于灭菌后的10ml离心管中,按1:10比例加入生理盐水,制成10-1浓度的样品溶液。然后取0.5ml10-1浓度的样品溶液于下一离心管,按1:10比例加入生理盐水,制成10-2浓度的样品溶液。然后然后取0.1ml10-2浓度的样品溶液于EP管中,按1:1010-3比例加入生理盐水,制成10-3浓度的样品溶液。然后依次如上分别配制10-4、10-5、10-6、10-7、10-8样品溶液。每一次取样前离心管和EP管都要在微型振荡器上震荡混匀。 b.接种和培养:按照平板涂布法进行。分别取各稀释管溶液100μl接种到选择性培养基,大肠杆菌选择性培养基置普通培养箱,37℃培养24h。乳酸菌选择性培养基置5%CO2培养箱,37℃培养48h。双歧杆菌选择性培养基置厌氧发酵罐内,37℃培养48h。沙门氏菌选择性培养基置普通培养箱,37℃培养24h。 c. 微生物计数与鉴定:采用常规微生物平板菌落计数法,选择长有30-300个菌落的平板较为合适,用每克肠道内容物中细菌个数的对数表示( 1gCFU /g) 正式试验 按照预实验操作步骤及适宜梯度进行试验。 4.培养基 总需氧菌营养琼脂(NA)34567 乳酸菌MRS琼脂碱性厌氧234567 双歧杆菌BL琼脂厌氧234567产气袋 大肠杆菌麦康凯需氧234567 沙门氏菌XLD 需氧2345

Southern_blot实验方法与步骤

实验名称: Southern blot 一、实验目的 1.学习核酸杂交的基本过程和操作。 二、实验原理 将待检测的DNA分子用限制性内切酶消化后,通过琼脂糖凝胶电泳进行分离,继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上,固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列,则二者通过碱基互补的原理进行结合,游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测,从而显示出待检的片段及其相对大小。用途:检测样品中的DNA及其含量,了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。三、试剂与仪器 (一)器材: 糖瓷盘,台式离心机,恒温水浴锅,电泳仪,水平电泳槽,杂交炉,杂交袋,尼龙膜或硝酸纤维素膜,转印迹装置,滤纸,吸水纸,紫外交联仪,摇床,X线胶片。 (二)试剂: 限制性内切酶,DNA加样缓冲液,DNA Ladder Marker,0.25M HCl 变性液(0.5M NaOH,1.5M NaCl) 中和液(0.5M Tris- HCl PH7.5,3M NaCl), 转印迹液SSC(3M NaCl,0.3M柠檬酸钠,PH7.0) 标记探针, 20×SSC,预杂交液和杂交液, 2×洗液(2×SSC,0.1%SDS) 2×洗液(0.5×SSC,0.1%SDS) 1×缓冲洗液(0.1M马来酸 0.15M NaCl ,PH7.5,0.3%Tween20) 1×封阻液[1%(W/V)封阻剂溶于] 1×马来酸溶液(0.1M马来酸,0.15M NaCl ,PH7.5 1×检测液(0.1M Tris- HCl,0.1M NaCl,PH7.5) 抗-地高辛-碱性磷酸酶。 四、实验步骤 1、制备DNA分子(PCR) 2.琼脂糖凝胶电泳分离DNA 3电泳结束后,将胶小心从电泳槽中取出,用手术刀将胶中没有DNA样品的四周部分略做修剪,然后将胶放入0.25 N HCl中脱嘌呤,当胶中的溴酚蓝变为黄色取出 4将胶从HCl溶液中取出,用ddH2O涮洗两次,然后放入碱变性液(0.5 M NaOH)中处理45 min,使胶中的ds-DNA变为SS-DNA。 5取一个瓷盘,注10×SSC,横跨窄边架上一块玻璃板,在玻璃板上铺2层30cm×10cm滤纸,纸条长两侧垂入10×SSC中 6将胶底朝上放在滤纸上 7裁与胶同样大小的尼龙膜平铺到胶上 8用塑料布盖住尼龙膜四周,裁与尼龙膜同样大小的滤纸一张,铺在尼龙膜上。

原位杂交原理及具体操作

原位杂交原理及具体操作

原位杂交实验原理与方法 一、目的 本实验的目的是学会原位杂交的使用方法。了解各种原位杂交的基本原理和优缺点。 二、原理 原位杂交组化(简称原位杂交,in situ hybridization histochemistry;ISHH)属于分子杂交的一种,是一种应用标记探针与组织细胞中的待测核酸杂交,再应用标记物相关的检测系统,在核酸原有的位置将其显示出来的一种检测技术。原位杂交的本质就是在一定的温度和离子浓度下,使具有特异序列的单链探针通过碱基互补规则与组织细胞内待测的核酸复性结合而使得组织细胞中的特异性核酸得到定位,并通过探针上所标记的检测系统将其在核酸的原有位置上显示出来。 当然杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补,所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序(即某种程度的同源性)就可以形成杂交双链。 探针的种类按所带标记物可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两大类。目前,大多数放

射性标记法是通过酶促反应将标记的基因掺入DNA中,常用的同位素标记物有3H、35S、125I 和32P。同位素标记物虽然有灵敏性高,背底较为清晰等优点,但是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害,近来有被非同位素取代的趋势。非同位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。 探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探针、cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸探针。cDNA 探针又可分为双链cDNA探针和单链cDNA探针。原位杂交又可分为菌落原位杂交和组织原位杂交。 菌落原位杂交(Colony in situ hybridization)菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸 纤维素滤膜上,然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。将NDA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交,放射自显影检测菌落杂交信号,并与平板上的菌落对位。 组织原位杂交(Tissue in situ hybridization)组织原位杂交简称原位杂交,指组织或细胞的原位杂交,它与菌落的原位杂交不同。菌落原位杂交需裂解细菌释出DNA,然后进行杂交。而原位

southern

Southern印迹杂交

Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段,将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上,经干烤或者紫外线照射固定,再与相对应结构的标记探针进行杂交,用放射自显影或酶反应显色,从而检测特定DNA分子的含量

实验原理 核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的具体方法之一。其基本原理是:具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下,可按碱基互补的原则形成双链,此杂交过程是高度特异的。由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性,综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果,便可绘制出DNA分子的限制图谱。但为了进一步构建出DNA分子的遗传图,或进行目的基因序列的测定以满足基因克隆的特殊要求,还必须掌握DNA分子中基因编码区的大小和位置。有关这类数据资料可应用Southern印迹杂交技术获得。

Southern印迹杂交技术包括两个主要过程:一是 将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定 的固相支持物(硝酸纤维素膜或尼龙膜)上,即印迹(blotting);二是固定于膜上的核酸同位素标记的探针 在一定的温度和离子强度下退火,即分子杂交过程。 该技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的,Southern印迹杂交故因此而得名。 早期的Southern印迹是将凝胶中的DNA变性后, 经毛细管的虹吸作用,转移到硝酸纤维膜上。近年来 印迹方法和固定支持滤膜都有了很大的改进,印迹方 法如电转法、真空转移法;滤膜则发展了尼龙膜、化 学活化膜(如APT、ABM纤维素膜)等。利用Southern 印迹法可进行克隆基因的酶切、图谱分析、基因组中 某一基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性 片断长度多态性分析(RFLP)等。

生物实验操作步骤

生物实验操作步骤 一、安装显微镜和对光: A 、操作步骤: 1.一手握住镜臂,一手托住镜座,把显微镜轻轻地放在实验台上,镜臂靠近身体略偏左,镜座距实验台边缘约5厘米。安装好目镜和物镜。 2.转动转换器,使低倍物镜对准通光孔。转动遮光器,使最大的光圈对准通光孔。 3、左眼注视目镜内,同时双手转动反光镜(光强用使用平面镜、光弱使用凹面镜),使光线反射到镜筒里,直到整个视野呈雪白色为止。 4.整理复位:把显微镜的外表擦拭干净。取下镜头放入镜盒内,并将镜筒缓缓下降到最低处。最后把显微镜放进镜箱里,放回原处。 B 、去年考卷: C 、评分标准: (1)安装好物镜和目镜(1分) (2)能将显微镜对好光观察(2分) 记录:雪白色或亮白色(1分) (3)整理器材(1分) 二、制作并观察洋葱鳞片叶临时玻片标本: A 、操作步骤: 1、用干净的纱布把载玻片和盖玻片擦干净。 2、用滴管在载玻片中央滴一滴清水。 3、用刀片在洋葱内表面划一个“井”字,用镊子撕下表皮,然后把它放在载玻片中央的水滴中,用解剖针轻轻地将其展平; 4、用镊子夹起盖玻片,使其一边接触载玻片上面的液滴,然后缓缓地盖在液滴上,盖片时要防止装片上出现气泡; 5、在载玻片的一侧滴一滴碘液,在另一侧用吸水纸吸引,重复几次,使染液浸润到整个标本; 6、安装显微镜和对光; 7、将制作的装片安放在显微镜的载物台上,然后将镜筒缓缓下降直到物镜接近玻片; 8、用左眼注视目镜,调节粗准焦螺旋使镜筒缓缓上升,直到在视野中看到细胞图像,然后旋转细准焦螺旋,使物像更清晰; 9、移动装片,在视野中找到一个完整的细胞进行仔细观察; 10、整理复位:取下玻片标本,平移方式(防止折断盖玻片)取下盖玻片并连同载玻片一起放回原处。取下镜头放入镜盒内,将镜筒下降到最低处,然后把显微镜放进镜箱里。把其他废弃物放入垃圾桶并把实验桌抹干净。 B 、去年考卷: C 、评分标准: (1)用纱布将载玻片、盖玻片擦拭干净(1分) (2)在载玻片中央滴一滴清水(1分) (3)用刀片切取一块洋葱鳞片叶,用镊子撕取鳞片叶的内表皮置于载玻片上清水中并用解剖针将表皮展平,盖上盖玻片(1分) (4)将一滴碘液滴在盖玻片的一侧,用吸水纸从对侧引流使碘液扩散到整个标本(1分) (5)将制作好的临时装片放在显微镜下观察(1分) 记录:气泡(1分) 细胞核(1分) 细准焦螺旋(1分) 左上方(1分) (6)整理器材(1分) 三、制作并观察口腔上皮细胞临时玻片标本: A 、操作步骤: 1、用干净的纱布把载玻片和盖玻片擦干净; 2、用滴管在载玻片中央滴一滴生理盐水; 3、用清水漱口,清除口腔中食物碎屑,用消毒牙签粗的一端在口腔侧壁上轻轻刮几下; 4、将牙签上附着的碎屑放在载玻片的生理盐水中涂抹几下; 用镊子夹起盖玻片让一侧先接触生理盐水在轻轻放平,避免出现 。 你观察到的细胞内染色最深的结构是 如果想让物像更清晰,应转动 。如果物像在视野的左上方,应将玻片标本向 移动,才能使物像移到视野中间。

Southern blot实验方法和操作步骤

Southern Blot原理及实验方法 Southern Blot原理及实验方法原理: 将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后,通过琼脂糖凝胶电泳进行分离,继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上,固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列,则二者通过碱基互补的原理进行结合,游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测,从而显示出待检的片段及其相对大小。 用途:检测样品中的DNA及其含量,了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。 试剂和器材 一、试剂 变性液:1.5mol/L NaCl,0.5mol/L NaOH。 中和液:0.5mol/L Tris-HCl (pH=7.5),1.5mol/L NaCl。 20×SSC:3mol/L NaCl,0.3mol/L 柠檬酸钠。 以上溶液均在100Kpa灭菌20分钟。 2×SSC:用无菌移液管吸取20×SSC溶液5mL,加无菌水45mL。 6×SSC:用无菌移液管吸取20×SSC溶液15mL,加无菌水75mL。 二、器材 22cm×15cm瓷盘 操作方法 1. 在琼脂糖凝胶上电泳分离DNA。取出凝胶,切去边缘多于部分,EB染色,在紫外灯下照相(放一标尺,可从像片中读出DNA迁移的距离)。 2. 将凝胶置于200mL变性液中,浸泡45分钟,并温和地不断振荡,使凝胶上的ds-DNA转变为ss-DNA,然后用重蒸水冲洗凝胶几次。 3. 用中和液浸泡凝胶并不断地振荡45分钟,将凝胶中和至中性。防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜。 4. 取一个瓷盘,在底部放一块玻璃板(或一块海绵)使盛器内的20倍SSC转移滤液低于玻板表面,在玻板表面盖一张3mm的二号滤纸,滤纸两边浸没于20倍SSC溶液中,在玻璃和滤纸之间,赶掉所有的气泡。

Southern杂交实验

Southern 杂交实验 Southern 杂交的原理是将待检测的DNA分子用限制性内切酶消化,通过琼脂糖凝胶电泳进行分离,继而将其变性并按照其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上,固定后再与同位素或其他标记物标记的DNA探针进行反应。如果待测物中含有与探针互补的序列,则二者通过碱基互补原理进行结合,游离的探针洗涤后用显影或其他合适的技术进行检测,从而显示出待检的片段及其相对大小。 一、溶液配制 (1)20 X SSC(1000 mL) : 组分浓度 3.0M的Nacl,0.3M的柠檬酸钠 NaCl 175.32g 柠檬酸钠88.26g NaOH调PH值到7.0,高温高压灭 (2)洗涤缓冲液Washing buffer 200ml 组分浓度:0.1M Maleic acid, 0.15M Nacl; pH 7.5(20℃); 0.3%(v/v) Tween20. Maleic acid:2.32g Nacl: 1.75g Tween20 0.6ml NaOH固体约1.7g调Ph值7.5 (3)马来酸缓冲液Maleic acid buffer 200ml 组分浓度:0.1M Maleic acid, 0.15M Nacl; pH 7.5 (20oC) Maleic acid:2.32g Nacl: 1.75g Tween20 0.6ml NaOH固体约1.7g调Ph值7.5 (4)检测缓冲液Detection buffer 100ml 组分浓度:0.1M Tris-HCl, 0.1M Nacl, pH 9.5(20oC) Tris 1.21g, NaCl 0.584g

原位杂交实验操作步骤

原位杂交实验操作步骤 一质粒制备 1质粒的转化和扩增 1.1制备XL1-Blue感受态细菌 1.取400uLXL1-Blue菌种加入到含200mlLB培养基的锥形瓶中,37℃、100rpm 培养4h,离心,倒置,以冰冷的0.1mol/LCaCl_2重悬细菌,冰浴30min,离心,弃上清,倒置,再加4ml(含15%甘油)冰冷的CaCl2重悬细菌,分装(200μ/tube),-80℃保存。 2.转化:在冰浴中将1管XL1-Blue感受态菌解冻,将浓度为2ng/μ1的质粒DNA4μ1加入到8Oμ1感受态菌中。 3.轻轻摇匀,冰浴30min。 4.42℃热激9O秒,然后迅速冰浴2min。 5.加入LB培养液(无氨苄青霉素)0.8ml,在37℃,100转/min水浴孵育60min。 6.取200μl菌液铺于琼脂板上(涂有X-Gal(20mg/ml)-IPTG(200mg/ml)的LB-氨苄青霉素50mg/ml,1μl/ml培养基),待菌液全部被吸收后,倒置平板于37℃培养12-16h。 1.2鉴定和挑选含重组质粒的菌落 1.用无菌牙签挑取单菌落,接种到10ml含氨苄青霉素的LB培养液的离心管中,于37℃,200转/分培养2h,取1ml之一Eppendorf离心管,加 50μl10mmol/L EDTA(pH8.0)。 2.加入50μl新配置的0.2mol/LNaOH、0.5%SDS、20%蔗糖溶液后,振荡30秒。 3.在70℃温育5min,然后冷却到室温。 4.加1.5μ14mol/LKCl和0.5μ1含0.4%溴酚兰染液,振荡3O秒后,冰浴5min。 5.12000g,4℃离以3min,以除去细菌碎片。 6.制备1%的琼脂糖凝胶(含EB0.5μg/ml),取50μl上清液加入到样品孔中,其中一孔加入中等分子量DNAMarker。恒压50V,进行电泳。 7.当溴酚兰迁移到凝胶全长的2/3-3/4时,停止电泳,在紫外灯下检查质粒DNA 分于量的大小是否与转入质粒相符。

Southern Blot操作流程

Southern Blot 操作流程 1、哺乳动物基因组DNA 的提取(或用OMEGA 试剂盒E.Z.N.A.TM Tissue DNA Kit ) 1、 取约30mg 样品,加入600 ul SNET ,再加入12 ul (20.2mg/ml )的蛋白酶 K ,使蛋白酶K 的终浓度为400ug/ml ; 2、 55℃振荡过夜; 3、 加入0.6 ul RNaseA ,室温下孵育10 min ,后置于65℃ 10 min ; 4、 加入300 ul Tris 饱和酚,288 ul 氯仿和12 ul 异戊醇,室温下振荡30 min ; 5、 17,000 g 离心5min ,转移上层水相(600 ul )至一新的离心管; 6、 加入等体积(600 ul )的异丙醇沉淀DNA ,于4℃下13,250 g 离心15 min ; 7、 小心除去异丙醇,加入1 ml 70%的乙醇。离心5 min 后除去乙醇,室温下干 燥15~20 min ; 8、 加入100 ul TE ,使核酸沉淀溶解。 一、 酶切 1、 拷贝数的计算 哺乳动物基因组全长3.0×109个碱基对,按插入基因单拷贝计算如下: () g plasmid of mass bp bp DNA of Insertion μ10100.39 = ? 2、 酶切体系 基因组DNA 10 ug 10*Buffer 10 ul 酶(10U/ul) 10 ul Total 100 ul 3、 混合后置于适宜酶切温度进行酶切反应; 4、 对酶切产物进行纯化,用30 ul TE 洗脱; 5、 制备1%浓度的琼脂糖凝胶(不加EB ); 6、 将纯化后的酶切产物敞开盖子于70℃放置15 min ,以除尽残留乙醇和消除

原位杂交操作流程

原位杂交操作流程 1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交第一天 1)二甲苯于37℃脱蜡2次,每次15分钟; 2)无水乙醇浸泡2次,每次3分钟; 3) 95%乙醇浸泡2次,每次3分钟; 4) PBS清洗3分钟; 5) 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟; 6) PBS清洗10分钟; 7)加入胃蛋白酶25ul/ml,37℃孵育15分钟; 8) PBS清洗2次,每次3分钟; 9) 0.2N的HCl孵育30分钟; 10)PBS清洗2次,每次3分钟; 11)0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟; 12)PBS清洗2次,每次5分钟; 13)预杂交缓冲液孵育30分钟; 14)准备核酸探针混合物:使用预杂交缓冲液稀释探针,85℃加热5分钟,置于冰块中10分钟; 15)杂交;第二天 16)将玻片置于SSC中2次,每次5分钟以去除封片; 17)PBS清洗3分钟; 18)RNA酶A溶液中(或0.1-1ng/mlPBS中),37℃孵育30分钟; 19)PBS清洗5分钟; 20)室温,2×SSC清洗10分钟; 21)37℃,1×SSC清洗10分钟; 22)37℃,0.5×SSC清洗10分钟; 23)缓冲液A孵育10分钟; 24)缓冲液A(1%正常绵羊血清和0.03%三重氢核X-100)孵育30分钟; 25)加入抗地高辛抗体(1/200的上述缓冲液,来自Boehringer Mannheim),37℃孵育3 小时; 26)缓冲液A清洗2次,每次10分钟; 27)缓冲液B清洗2次,每次5分钟; 28)制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟,显微镜下进行观察,如果背景尚佳,显色时间可延长到16小时;29)停止缓冲液B的反应,用水进行简单的清洗; 30)固红,脱水以及封片进行核的复染。 2、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNA杂交第一天 1)二甲苯于37℃脱蜡2次,每次15分钟; 2)无水乙醇浸泡2次,每次5分钟; 3) 95%乙醇浸泡2次,每次5分钟; 4) PBS清洗5分钟; 5) 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟; 6) PBS清洗5分钟; 7)加入胃蛋白酶25ul/ml,37℃孵育10分钟; 8) PBS清洗2次,每次5分钟; 9) 0.2N的HCl孵育30分钟; 10)PBS清洗2次,每次5分钟; 11)0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟;

Southern 印迹杂交实验报告

Southern 印迹杂交实验报告 姓名:陆叶学号:14211020062 专业:公共卫生 实验时间:12.18;12.25 带教老师:潘銮凤 【实验目的】 学习核酸杂交的基本过程和操作 【实验原理】 将待检测的DNA分子用或不用限制性内切酶消化后,通过琼脂糖凝胶电泳进行分离,继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上,固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应,检测靶DNA片段中是否存在与探针同源的序列。如果待检物中含有与探针互补的序列,则二者通过碱基互补的原理进行结合,游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测,从而显示出待检的片段及其相对大小。 用途:检测样品中的DNA及其含量,了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。【实验步骤】 1、基因组DNA的限制性内切酶酶切 取1个1.5ml离心管按下列量依次加入基因组DNA、10X酶缓冲液,酶,做好标记。老师给的HL60基因组DNA 10μg(7.6μL);10×Buffer E(10.4μL);EcoR I(10 u/μL)(2μL)。总体积20μL。37℃保温1.5小时。 2、1%琼脂糖电泳 先制备凝胶,称取1.2 g Agarose放入三角烧瓶中,加入60 mL TAE溶液,微波炉中加热令其完全溶解,稍作冷却后加入GelRed核酸染液6μL(稀释10,000倍)。浇板,水平放置,待凝。胶凝后按照以下顺序加样。两组共用一块凝胶,共7个样。 ①基因组DNA10 20μl (自己的) ②基因组DNA10 μg(老师的) ③酶切样品 ④阳性对照(c-myc 4.7 kb线性片段,30pg/μl, 10μl) ⑤酶切样品 ⑥基因组DNA10 μg (老师的) ⑦基因组DNA10 20μl (自己的) 插上电源,负极在样品槽一边,DNA将向阳极跑,80V电泳2小时左右,直到溴酚蓝染料跑到接近凝胶尾部,在电泳期间做好胶变性和转移准备。 3、变性 切胶,2—6孔,宽4.5cm,长7cm(从顶部开始,可用尼龙膜保护纸作为标尺) ①将凝胶浸在5倍体积的胶变性液中, 慢慢摇动20分钟。 ②ddH2O洗2次。 ③在胶中和液中慢慢摇动15分钟。 4、转移 ①在搪瓷盘中加入300 ml 10×SSC,放上培养皿和小玻璃板。 ②将3张长滤纸浸湿,逐张放在玻璃板上,用移液管的滚动,赶走气泡。 ③切除多余凝胶,小心地将凝胶放在滤纸上(加样孔面向下),赶走滤纸与胶之间的气泡。 ④再将与胶大小相同的尼龙膜(浸湿)放在胶上,同样不能有气泡,然后放上三张浸湿的 滤纸,赶走气泡。 ⑤紧贴凝胶四周各放一张X光片。 ⑥小心蒙上一张比搪瓷盘大的保鲜膜。保鲜膜要紧贴滤纸,但不能让滤纸移动。

原位杂交的方法

原位杂交 1 探针的设计与合成 1)根据实验室已有的p8基因cDNA全长序列,用premier primer5.0设计引物p81和p82, 以卤虫cDNA为模板,PCR扩增得到346bp的产物,用Takara胶回收试剂盒回收纯化。引物编号引物序列长度 p81 TGCGGACGAAACAGGAAG 18 bp p82 GCTCAAACAGTGA TGCCAGT 20 bp 2)目的片段克隆 a. 在无菌离心管中加入连接载体的各种成分,载体与片段的摩尔比控制在1:3-1:8,根据凝胶电泳检测后的浓度及载体与片段分子大小来计算摩尔比。加入成分及比例如下: 目的PCR片段 5 μl pGM-T载体(约50ng/uL) 1 μl 10×T4 DNA Ligation Buffer 1 μl T4 DNA Ligase(3U/uL) 1 μl 无菌去离子水 3 μl 总体积10 μl b. 轻轻弹动离心管以混合内容物,短暂离心。置于PCR仪中16℃过夜连接,反应结束后将离心管置于冰上。 c. 向铺好的含有氨苄青霉素的固体平板表面加入16 μl的IPTG(50mg/ml)、40 μl的X-gal (20mg/ml),使用无菌的弯头玻璃棒将其均匀的涂开,避光置于37℃培养箱1-3小时,使溶解X-gal的二甲基甲酰挥发干净。 d. 将10 μl的连接产物加到100 μl DH5 感受态细胞中,轻弹混匀,冰浴半小时,将离心管置于42℃水浴90秒,取出管后立即置于冰浴上放置2-3分钟,其间不要摇动离心管。向离心管加入500 μl 37℃预热的LB(不含抗生素)培养基,150rpm摇床37℃振荡培养45分钟。目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达,使菌体复苏。将菌液于4000g下离心10分钟,去掉上清,加入100 μl培养液重溶并加入到配制好的LB固体培养基上,用无菌的弯头玻璃棒轻轻将细胞均匀涂开。待平板表面干燥后,倒置平板,37℃培养12-16小时。 e. 挑取白色菌落直接进行PCR检测,筛选转化子。 f. 将转化子接种于LB液体培养基中培养24小时,吸取1mL菌液送至大连宝生物公司进行序列测序。 3)重组质粒的线性化 取6 μl以测序的重组质粒,选取NcoI内切酶37℃酶切4h。酶切反应体系为20 μl: 质粒 6 μl 10xK Buffer 2 μl NcoI酶 1 μl 0.1% BSA 2 μl 灭菌水9 μl 终体积20 μl 取酶切前后的质粒各4 μl,经1%琼脂糖电泳检测,确认酶切完全,将酶切产物用Takara胶回收试剂盒回收纯化,作为探针合成的模板。 4)探针合成 按罗氏DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)试剂盒使用指南,标记反义RNA探针。 使用的所有试剂和器皿均经去RNase处理,合成方法如下:先准备反应体系。冰上向RNase-Free的微离心管中顺序加入下列试剂:

初中生物实验操作步骤

实验名称:观察植物细胞 1、用洁净的纱布把载玻片和盖玻片擦拭干净 2、把载玻片放在试验台上,用滴管在载玻片的中央滴一滴清水。 3、①用镊子从洋葱鳞片叶内侧撕取一小块透明薄膜内表皮。②把撕下的内表皮浸入载玻片的水滴中,用镊子把它展平。 4、用镊子夹起盖玻片,使它的一边先接触载玻片上的水滴,然后缓缓地放下,盖在要观察的材料上。 5、把一滴稀碘液滴在盖玻片的一侧。染 6、用吸水纸从盖玻片的另一侧吸引,使染液浸润标本的全部。 观察人的口腔上皮细胞 1、用干净的纱布把载玻片和盖玻片擦拭干净。 2、把载玻片放在实验台上,用滴管在载玻片的中央滴一滴生理盐水 3、用凉开水把口漱净。用消毒牙签从口腔侧壁处轻轻刮几下,牙签上就附着了一些碎屑。把牙签放在载玻片的生理盐水滴中均匀地涂抹几下。 4、用镊子夹起盖玻片,使它的一侧先接触载玻片上的液滴,然后缓缓放平。 5、在盖玻片的一侧滴加稀碘液(染),另一侧用吸水纸吸引,使染液浸润到标本的全部。 观察鸡卵的结构 1.取一个鸡卵,观察其外部形态。(放大镜,气孔) 2.将鸡卵的钝段轻轻敲出裂纹,将碎裂的卵壳连同紧贴壳的膜除去,观察鸡卵的气室。(镊子,卵壳,外卵壳膜和气室) 3.用剪刀将气室下的内卵壳膜剪破。(剪刀) 4.将卵壳膜内的卵白和卵黄转移到培养皿中,卵黄完整。(培养皿) 5.观察鸡卵的结构。若未见胚盘,可用镊子夹起细系带把卵黄轻轻翻转。 观察种子的结构 1.观察菜豆种子的结构 ⑴取一粒浸软的菜豆种子,观察它的外形[来源:学|科|网Z|X|X|K] ⑵剥去种子最外面的一层薄皮-------种皮,分开合拢着的两片子叶。 ⑶用放大镜仔细观察子叶.胚根.胚轴和胚芽,看看它们各有什么特点? 2观察玉米种子的结构 ⑵一粒浸软的玉米种子,观察它的外形。 ⑵用刀片将这粒种子从中央纵向剖开。 剖面上滴一滴碘液,在用放大镜仔细观察被碘液染成蓝色的胚乳以及未被染成蓝色的果皮和种皮,胚芽,胚根,胚轴和子叶,看看它们各有什么特点? 测定某种食物中的能量 1.取一只锥形瓶(50毫升),量筒量取30毫升水注入其中,再将它固定在铁架台上。 2.再锥形瓶里放入一支温度计(温度计下端要浸入水中,但不要接触锥形瓶的瓶底) 3.参照右图安装好试验装置,并测定水温。 4.称出一粒干燥花生种子的质量,将这粒种子放倒火焰上点燃, 5.将刚刚燃烧的花生种子尽快放倒锥形瓶底部。待这粒花生种子完全燃烧后,测量水温。 6.计算:Q=CM△T=30×4.2×(t2-t1)(把测量的温度代入,得出数据)

原位杂交实验操作步骤

原位杂交实验操作步骤 撰写人:范为民 一、实验原理 原位杂交是指借助于核酸分子杂交的方法,在显微镜水平检测和定位特异的核苷酸片段。现在原位杂交已经成为在分子水平研究肿瘤和遗传性疾病的发生,发展和调控等根本性问题的有力工具。 二、试剂盒 本实验室常用的原位杂交试剂盒是博士德公司生产的敏感加强型原位杂交检测试剂盒,此试剂盒分为两种,一种为过氧化物酶(POD)检测(MK1030型),一种为碱性磷酸酶(AP)检测系统(MK1032型),用于mRNA的杂交。过氧化物酶(POD)检测的最终信号为棕黄色,而碱性磷酸酶(AP)检测的信号为紫色,因后者信号比较突出,所以一般采用后一种检测方法。两种检测方法的实验步骤相差不多,所用洗脱缓冲液也大同小异。用于杂交的探针也可以分为两种,一种是DNA探针,即是用DNA与组织中的mRNA杂交,另一种是RNA 探针,即用RNA与组织中的mRNA杂交。DNA探针处理操作简单,但杂交信号一般不如RNA探针强烈,所以条件允许的话一般采用RNA探针。下面先介绍碱性磷酸酶(AP)检测试剂盒,采用RNA作为探针的操作步骤。 三、实验步骤 原位杂交实验主要包括三大部分,即组织冰冻切片、RNA探针标记、原位杂交三部分。 (一)组织冰冻切片 1. 实验准备 (1)原位杂交专用载玻片:用多聚赖氨酸处理后的载玻片,使切片紧密粘附在玻片上,可以用于后面的洗脱。一般一张载玻片上可以贴至多十张切片(可以是不同组织的切片),所以需要玻片的数目需要根据实验的要求而定。这种专用载玻片可以从中杉金桥公司购买,目前价格是每片2.2元,玻片有一面的一端是毛玻璃,用于标记组织名称等,切片应该贴在此面,切勿贴到反面。 (2)缓冲液配备 1.1器具准备 剪刀、镊子各三把,开壳钳一把,100ml量筒一个,磁力搅拌子一个;100ml试剂瓶一个,250ml试剂瓶三个。以上器具均洗净后置于180摄氏度以上烘烤6小时以上。铅笔、显微镜、冰、吸水纸、一次性塑料手套等。 1.2 溶液配制 0.1M PB缓冲液:Na2HPO4?12H2O 5.8021g,NaH2PO4?2 H2O 0.5928 g,加入200ml ddH2O溶解于之前准备的250ml试剂瓶中,再加入200ūl DEPC,充分摇匀后过夜,高压灭菌。以上溶液配制两份,其中一份瓶中放入磁力搅拌子。

生物实验操作步骤

生物 一、A类实验操作练习题 1.用显微镜观察洋葱鳞片叶表皮细胞 实验器材及设置:显微镜、载玻片、盖玻片、吸水纸、纱布、滴管、单面刀片、镊子、清水、稀碘液、解剖针、小块木板、洋葱鳞片叶、擦镜纸(备用)。 [附]显微镜状态:目镜已安装好,最大光圈对准通光孔,转换器上两个物镜位于通光孔两侧,呈外八字形,镜筒降到最低处。 实验要求:(1)制作洋葱鳞片叶表皮细胞临时装片; (2)用显微镜观察洋葱鳞片叶表皮细胞。 方法步骤: (一)、制作洋葱鳞片叶表皮细胞临时装片 1. 准备用洁净的纱布把载玻片和盖玻片擦拭干净;用滴管在载玻片中央滴1-2滴清水。 2. 取材用刀片切取一块洋葱鳞片叶(大约0.5cm2),用镊子撕取洋葱鳞片叶的内表皮;把撕取的表皮浸入载玻片上的水滴中,并展平。 3.盖盖玻片用镊子夹起盖玻片,使它的一边先接触载玻片上

的水滴,然后缓缓地放下,盖在要观察的材料上。 4.染色把一滴碘液滴在盖玻片的一侧,用吸水纸从盖玻片的另一侧吸引,使染液浸润标本全部。 (二)、用显微镜观察洋葱鳞片叶表皮细胞 1.取镜与安放一手握镜臂,一手托镜座,把显微镜放在实验台中央略偏左,距实验台边缘约7cm。 2.对光上升镜筒,转动转换器,使低倍物镜对准通光孔;一只眼注视目镜,另一只眼睁开,同时转动反光镜,使视野明亮。 3.安放玻片将玻片轻放载物台上,标本正对通光孔的中心,用压片夹压住玻片的两端。 4.调焦双手转动粗准焦螺旋,使镜筒缓缓下降,同时眼睛从侧面看着物镜下降,直到物镜接近玻片;一只眼注视目镜,同时转动粗准焦螺旋,使镜筒缓缓上升至视野中出现物像,微调细准焦螺旋使物像清晰。 5.观察移动玻片,将物像移到视野中央,在低倍镜下观察洋葱鳞片叶表皮细胞。 2.用显微镜观察人的口腔上皮细胞 实验器材及设置:显微镜、载玻片、盖玻片、吸水纸、纱布、滴

SouthernBlot印记杂交常见问题解析

Southern Blot印记杂交常见问题解析 1、针对不同的实验材料,southern杂交实验难度有差异么?答:不同的实验材料,在进行试验过程中难度差异很大,例如玉米、 小麦、葡萄的Southern杂交检测难度要比普通的材料要大。 (1)、物种本身的基因组较大(例如小麦),检测操作难度大 (2)、材料本身含有高糖多酚(例如葡萄)严重影响酶切操作 (3)、物种品系复杂(例如玉米),在基因组信息研究层面还不透彻。 2、核酸质量对southern杂交实验的影响 答:核酸质量对实验的影响是直接的,既要求客户提供的总量足够——实验消耗(上样量),又要求保证质量——按要求准备材料。 上样量指的是基因组DNA酶切消化后,回收后的DNA片段的量。根据 不同物种的基因组大小不同,上样量也有所区别。基因组越大,上样 量越多。例如,拟南芥大概需要3ug ,酵母3ug,人8ug,小麦15ug。酶切消化之后不能直接上样,需要回收纯化。回收会有损失,最多能 损失一半,所以需要客户提供足够量的样品,一般要求至少20 ug的 基因组DNA。(以上上样量均为一个泳道) DNA 样品一般对 OD 值和浓度有如下要求:OD260/280=1.8~2.0, OD260/230>2.0,浓度≥100 ng/ul 。同时,需要对 DNA 样品进行琼 脂糖凝胶电泳,电泳结果显示该 DNA 样品无蛋白质和 RNA 等物质污染,无降解弥散,条带清晰。(如图所示)

3、探针设计是怎么回事,有哪些原则? 答:探针就是与待测目的基因序列同源的一段地高辛标记的DNA序列,可以和酶切后的基因组片段特异性的结合。探针设计有如下几个原则: (1)、长度适中。探针的片段长度一般控制在300-1000bp,探针太长时会导致非特异性结合的概率增加,探针太短时,探针结合的地高辛标 记物太少,会导致发光信号减弱。 (2)、特异性强。最佳的探针序列是仅与目的基因同源,与整个基因组 序列的同源片段低于30%。 (3)、ATGC含量均匀,无发卡结构和高度重复序列。

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