生物技术制药

一、概述

1、生物药物

生物药物是指运用生物学、医学、生物化学等的研究成果，从生物体、生物组织、细胞、体液等，综合利用物理学、化学、生物化学、生物技术和药学等学科的原理和方法制造的一类用于预防、治疗和诊断的制品。

2、生物技术制药

采用现代生物技术人为地创造一些条件，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医药品。

3、生物技术药物

采用DNA重组技术、单克隆抗体技术或其它生物新技术研制的蛋白质、治疗性抗体或核酸类药物。

4、生物技术

以生命科学为基础，利用生物体（或生物组织、细胞及其组分）的特性和功能，设计构建具有预期性状的新物种或新品系，并与工程相结合，利用这样的新物种（品系）进行加工生产，为社会提供商品和服务的一个综合性技术体系。

5、生物技术的内容

基因、细胞、酶、发酵、生化、蛋白质、抗体、糖链工程和海洋生物技术。

6、生物技术的相关学科

生物学（微生物学、分子生物学、遗传学）

化学（生物化学、无机、有机、分析、物理化学）

工程学（化学工程、电子工程）

医学、药学、农学。

7、生物技术的应用

（1）、医药利用基因治疗人类疾病的技术取得了突破性进展，原来用于治疗单基因缺陷的遗传病的治疗技术，现在已快速扩展到癌症、爱滋病、乙型肝炎、心血管病，此外，诊断试剂、酶试剂、动植物医药产品、核酸类药物也取得了很大进展。

（2）、农业转基因动植物的新品种，大幅度提高产量和质量。

（3）、食品氨基酸（天冬氨酸、半胱氨酸），有机酸（苹果酸、酒石酸），做食品添加剂，香料，葡萄糖，果糖，淀粉酶。

（4）、工业农药、香料、饲料、工业酶、有机酶、皮革工业脱毛软化、丝绸脱胶、加酶洗衣粉。

（5）、环境净化利用微生物或酶处理废物和废水。

（6）、能源微生物发酵产甲烷—沼气。

二、生物技术发展简史

生物技术是人类对生物资源（微生物、动植物）的利用、改造并为人类服务的技术，它的发展已有几千年的历史，将其发展过程按技术特征可分为三个阶段。

1、传统生物技术阶段出现在公元前几千年，直到20世纪30年代，主要是酿造技术，当时人们只知道酿造技术，但不知道这些技术的内在原因，1680年出现了显微镜，人们才知道有微生物的存在，1857年用实验方法证明了酒精发酵与酵母菌有关，并最终确征为酶，到此才揭开了发酵现象的奥秘。

该阶段的产品：乳酸、酒精、丙酮、丁醇、柠檬酸、淀粉酶。该阶段生产的特点：过程简单，大多数属于兼气发酵或表面培养，生产设备要求不高，产品化学结构简单，属于初级代谢产物。

2、近代生物技术阶段20世纪40年代，第二次世界大战的爆发，急需疗效好、毒副作用小的抗细菌感染药物，出现了青霉素，产量低，产品价格昂贵，随着发酵新技术的出现，又相继发现了链霉素、红霉素、金霉素等药物。该阶段的主要产品：抗生素、维生素、甾体、氨基酸；食品工业的工业酶制剂、食用氨基酸、酵母、啤酒；化工业的酒精、丙酮、丁醇、沼气；农林业的农药；环境保护业的生物治理污染。

该阶段生物技术的特点：

（1）、产品类型多，初级（氨基酸、酶、有机酸）；次级（抗生素）；生物转化（甾体）。（2）、生物技术要

求高，纯种、无菌、通气、产品质量要求也高。（3）、生产设备规模大，500立方米，2000立方米。（4）、技术发展速度快，青霉素，200单位每毫升，8万单位每毫升，形成了交叉学科生化工程。

3、现代生物技术

标志，1953年美国Watson和英国的Crick共同提出了DNA的双螺旋结构，揭开了生命科学划时代的一页，此后，又相继出现了一系列新发现和新进展，遗传中心法则，破译遗传密码，基因重组，单克隆抗体，DNA 测序。产品见表1-1。

动植物细胞培养技术。

该阶段产品种类很多，胰岛素、干扰素、生长激素等。

该阶段生物技术的内容包括：

（1）、重组DNA技术及其它转基因技术；（2）、细胞和原生质体融合技术；（3）、酶或细胞的固定化技术；

（4）、植物脱毒和快速繁殖技术；（5）、动物细胞大量培养技术；

（6）、动物胚胎工程技术；（7）、现代发酵技术（高密度发酵、连续发酵、新型发酵技术）；

（8）、现代生物反应工程和分离工程技术；（9）、蛋白质工程技术；

（10）、海洋生物技术。

三、医药生物技术新进展

近10年是生物技术迅速发展的时期，主要有四个方面的进展。

1、基础研究不断深入

重组DNA，新基因的克隆和基因表达调控的研究全面展开，分子生物学理论和技术两大体系已基本完成，生物学中的中心法则所体现的遗传信息的转移规律奠定了遗传工程的理论基础，有关基因表达的各种研究结果又丰富和发展了中心法则，DNA测序，为对付不治之症提供了可能性。

人类基因组计划的研究目标就是要定位所有的基因和测定它们的核苷酸序列，人类基因组大约有10万个基因，30亿个核苷酸对，完成这项研究是一项空前浩大的工程，它的实施对人类了解自身和医学发展有划时代的意义。与疾病相关的基因有约5000个，一些重要的遗传病基因已被分离并测序。

3、新产品不断出现

自20世纪80年代以来，仅美国、日本开发的生物新技术新药物便达200多种，大都是重组蛋白质药物和重组DNA药物。

世界范围内，销路最好的生物技术药物，临床应用时间比较长，疗效比较好，毒副作用比较小，干扰素，抗病毒、抗癌，有种属特异性，动物干扰素对人无效，最初收集大量血液，提取白血球再与诱导物作用来生产，现在用基因重组技术把干扰素基因插入大肠杆菌来生产。白介素与机体免疫功能有关，白介素-2促进淋巴细胞分化增殖。乙型肝炎疫苗，预防乙肝。集落刺激因子，可减轻化疗时副作用，可用于爱滋病、白血病。肿瘤坏死因子，可损伤癌细胞。研制更新一代的药物和更新的应用方法，集落刺激因子和白介素的基因构建到酵母细胞中，使之产生融合蛋白质，药效增强。生产方法从利用重组DNA的微生物生产转向利用动植物来生产蛋白质类药物，构建新型多价活疫苗。

3、新试剂、新技术不断出现

细胞工程及基因工程的应用产生了新的医疗技术—细胞移植和基因治疗。细胞移植用于骨髓移植，治疗白血病、淋巴病，免疫缺陷，再生障碍性贫血及放疗、化疗后的肿瘤病人，基因治疗目前仍在实验阶段，可用于遗传病、癌症、爱滋病的治疗，心脏内直接注入外来基因，两三周长出新血管，关键点是如何将有用基因引入靶组织中，并使之在合适的地方、合适的时间表达合适量的活性多肽或蛋白质。

生物试剂的开发，单克隆抗体，专一性强，由鼠源性转向人源性，应用：基础研究，诊断，体内显像定位，食品和环境检测，体内治疗和导向治疗。工业上利用单抗进行亲和层析高效纯化天然基因工程基因，单抗可与放射性核素、酶、荧光素标记技术相结合，用于检测和治疗。病毒、细菌、寄生虫和某些肿瘤的诊断，免疫学，激素、酶和环境污染因子的检测，显像定位，单抗与抗癌药物偶合后，减少副作用，加大药量。

4、新型生物反应器和新分离技术不断出现

传统：搅拌式生物反应器

改进：塑料袋、填充床、气升式、流化床、固定床、袋式、膜式、中空纤维、固定化培养。

搅拌形状改进：浆式、棒式、船帆式、笼式通气。1000升。

四、我国的医药生物技术

我国起步晚，20世纪80年代初，把生物技术定为科技和产业发展的重要新领域之一，85年制定了生物技术发展政策，89年制定了90—2000年和2020年发展纲要。

20世纪70年代，起步时是固定化酶的研究，固定化细胞，80年代初期，开发研究乙型肝炎基因工程疫苗，基因工程干扰素，国内投入大量资金建立30个生物技术领域国家重点实验室，可生产活性多肽类药物、干扰素、白介素、心钠素等多种生物药物。

五、医药生物技术发展展望

20世纪生物技术是科研阶段，产业初期。

21世纪将进入大规模产业化，研究成果转变成产品。

三大类药物：生物、化学、中药。

发展比较迅速的医药生物技术有四个领域：

1、利用新发现的人类基因，开发新型药剂

完成人类基因组计划会发现许多新基因，而且很多与疾病有关或直接参与疾病的形成，找到了目的基因—也就是需要修复的基因可以帮助我们利用基因工程来寻找新药或基因治疗的方法，21世纪50%-70%的新药来自基因工程的研究。

2、新型疫苗的研制

疫苗在许多疾病的预防、治疗中起着其他药物无法代替的作用，现在正在进行爱滋病及20多种基因型癌症疫苗的研制，用于防治癌症、爱滋病、关节炎、贫血、骨质疏松、百日咳、乙肝等疾病。

3、基因工程活性肽

淋巴因子，生长因子，激素，酶，都属于活性多肽。

由两条以上肽链组成，很强的生物活性，常以微量存在于人体（基因工程方法生产）应用：

（1）在体外和离体研究中作为细胞培养补充剂（2）基础研究对象（3）作为研究其他现象（免疫）的一种辅助剂（4）诊断剂（5）生物治疗的研究开发脑啡肽、胃肠肽。

4、其他

疾病早期诊断，PCR，单克隆抗体转基因材料外源基因在植物中表达，脑啡肽，干扰素，生长激素，转血红蛋白基因的烟草植物生产人造血浆。

一、生物药物的来源

1、生物药物的定义

生物药物是指运用生物学、医学、生物化学等的研究成果，从生物体、生物组织、细胞、体液等，综合利用物理学、化学、生物化学、生物技术和药学等学科的原理和方法制造的一类用于预防、治疗和诊断的制品。

2、生物药物的原料来源

天然的生物材料：人体、动植物、微生物和各种海洋生物。

随着生物技术的发展，有目的人工制得的生物原料成为当前生物制药原料的重要来源，如用基因工程技术制得的微生物或细胞。

生物药物原料的选择、预处理与保存方法。

（1）、原料选择原则有效成分含量高，原料新鲜，来源丰富、易得，产地较近，原料中杂质含量少，成本低。（2）、预处理与保存预处理：就地采集后去除结缔组织、脂肪组织等不用的成分，将有用成分保鲜处理，收集微生物原料时，要及时将菌体与培养液分开，进行保鲜处理。

保存方法：冷冻法，适用于所有生物原料，-40℃；有机溶剂脱水法，丙酮，适用于原料少、价值高，有机溶剂对原料生物活性无影响；防腐剂保鲜，常用乙醇、苯酚等，适用于液体原料，如发酵液、提取液。

二、生物药物的特性

1、药理学特性

（1）、治疗的针对性强细胞色素c用于治疗组织缺氧所引起的一系列疾病。

（2）、药理活性高注射用的纯ATP可以直接供给机体能量。

（3）、毒副作用小、营养价值高蛋白质、核酸、糖类、脂类等生物药物本身就直接取自体内。

（4）、生理副作用时有发生生物体之间的种属差异或同种生物体之间的个体差异都很大，所以用药时会发生免疫反应和过敏反应。

2、生产、制备中的特殊性

（1）、原料中的有效物质含量低激素、酶在体内含量极低。

（2）、稳定性差生物药物的分子结构中具有特定的活性部位，该部位有严格的空间结构，一旦结构破坏，生物活性也就随着消失。酶，很多理化因素使其失活。

（3）、易腐败生物药物营养价值高，易染菌、腐败。生产过程中应低温、无菌。

（4）、注射用药有特殊要求生物药物易被肠道中的酶所分解所以多采用注射给药，注射药比口服药要求更严格，均一性、安全性、稳定性、有效性。理化性质、检验方法、剂型、剂量、处方、储存方式。

3、检验上的特殊性

由于生物药物具有生理功能，因此生物药物不仅要有理化检验指标，更要有生物活性检验指标。

第一节概述

生物技术的核心是基因工程，基因工程技术最成功的成就是用于生物治疗的新型生物药物的研制。之前，许多在疾病诊断、治疗和预防中有重要价值的内源性生理活性物质（激素、细胞因子、神经多肽、调节蛋白、酶类、凝血因子等）以及某些疫苗，由于材料来源困难或制造技术问题而无法研制出产品，即使应用传统技术从动物器官中提取出来，也因为造价太高而使患者负担不起。而应用基因工程技术就可以从根本上解决上述问题，它的应用使人们在解决癌症、心血管疾病和内分泌疾病等方面中取得明显效果，它为上述疾病的预防、治疗和诊断提供了新型疫苗、新型药物和新型诊断试剂。

利用基因工程生产的药物主要是医用活性蛋白和多肽：免疫性蛋白，各种抗原和单克隆抗体；细胞因子，干扰素、白介素、生长因子；激素，胰岛素、生长激素；酶类，尿激酶、链激酶超氧化物歧化酶。

利用基因工程技术生产药物的优点：1、大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽，为临床使用提供有效的保障；2、可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围；3、可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；4、内源生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除；5、可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。

第二节基因工程药物生产的基本过程

基因工程技术就是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌，实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。

基因工程药物制造的主要程序是：目的基因的克隆；构建DNA重组体；将DNA重组体转入宿主菌构建工程菌；工程菌的发酵；外源基因表达产物的分离纯化；产品的检验等。

通常将基因工程药物的生产分为上游和下游技术。上游阶段是研究开发必不可少的基础，它主要是分离目的基因，构建工程菌，主要在实验室完成。下游阶段是从工程菌的大规模培养到产品的分离纯化、质量控制，该阶段是将实验室成果产业化、商品化。

制备基因工程药物的一般程序：

获得目的基因组建重组质粒构建基因工程菌

培养工程菌产物分离纯化除菌过滤半成品检定成品检定包装

基因的表达系统有原核生物系统和真核生物生物系统。选择表达系统主要考虑的是保证表达的蛋白质的功能，其次是表达量的多少和分离纯化的难易。

下游下工技术主要包括工程菌大规模培养最佳参数的确定、新型生物反应器的研制、高效分离介质及装置的开发、分离纯化的优化控制、高纯度产品的制备技术、生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造、电子计算机的优化控制等。

第三节目的基因的获得

对于原核生物，其基因总量不大，可以选用合适的限制性核酸内切酶切下目的基因，而对于真核生物不能进行直接分离。真核细胞中基因总量较大，从染色体中直接分离纯化目的基因极为困难，另外，真核基因一般都有内含子，如果以原核细胞作为表达系统，即使分离出真核基因，由于原核细胞缺乏mRNA 转录后的加工系统，真核基因转录的mRNA 也不能被加工、拼接成为成熟的mRNA ，因此不能直接克隆真核基因。克隆真核基因常用的方法有逆转录法和和学合成法。

一、逆转录法

逆转录法就是先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成互补DNA，然后进行互补DNA的克隆表达。从产生该蛋白质的真核细胞中提取mRNA，以其为模板，在逆转录酶的作用下，反转录合成该蛋白质mRNA的互补DNA，再以互补DNA为模板，在逆转录酶或DNA聚合酶作用下，最终合成编码该蛋白质的双链DNA序列，该序列不含内含子。

1、mRNA的纯化

细胞内含有三种RNA，mRNA占RNA总量的2%-5%，相对分子量大小不一致，分离也有很大的困难，但是mRNA的3’末端常含有一多聚腺苷酸组成的末端，长达20-250个腺苷酸，足以吸附于寡聚胸苷酸-纤维素上，从而可以用亲和层析法将mRNA从细胞总RNA上分离出来，可得到纯度较高的mRNA。

2、互补DNA第一链的合成

mRNA的3’末端常含有一多聚腺苷酸序列，可用寡聚脱氧胸苷酸为引物，在逆转录酶的催化下，开始互补DNA的合成。在合成反应体系中加入一种放射性标记的dNTP，在反应中以及反应后可通过测定放射性标记的dNTP掺入量，计算出互补DNA的合成效率，在凝胶电泳后，进行放射自显影分析产物的分子大小，探索最佳反应条件。

3、互补DNA第二条链的合成

先用碱解或核酸酶酶解的方法除去互补DNA-mRNA杂交链中的mRNA链，然后以互补DNA第一链为模板合成第二链，并用核酸酶S1专一性切除单链DNA。

4、互补DNA克隆

载体有两种质粒和噬菌体，根据重组后插入的互补DNA是否能够表达、能否经转录和翻译合成蛋白质，又将载体分为表达型载体和非表达型载体。互补DNA插入片段小于10千碱基对，可选用质粒载体，如大于10千碱基对则选用噬菌体作为载体。

二、化学合成法

较小的蛋白质或多肽的编码基因可以采用人工化学合成法合成，其先决条件是已知目的基因的核苷酸序列，或已知蛋白质的氨基酸序列，按相应的密码子推导出DNA的碱基序列。用化学方法合成目的基因不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘末端的DNA双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火使连接成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。

人工化学合成的限制：1、不能合成太长的基因，50-60个碱基对；2、人工合成碱基对时，遗传密码的简并会为选择密码子带来很大的困难；3、费用较高。

第四节基因表达

基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。进行基因表达，我们所关心的是目的基因的表达产量、表达产物的稳定性，产物的生物学活性和表达产物的分离纯化。

一、宿主细胞的选择

宿主细胞应满足以下要求：1、容易获得较高浓度的细胞；2、能利用廉价易得的原料；3、不致病、不产生内毒素；4、发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态；5、容易进行代谢调控；6、容易进行DNA 重组技术操作；7、产物的产量、产率高，产物容易提取。

宿主细胞的种类及特点

宿主可分为两大类：

原核细胞—大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌；

真核细胞—酵母菌、丝状真菌、哺乳动物细胞。

1、原核细胞

（1）、大肠杆菌

生长迅速、对其研究比较深入，所以常用，特点：表达基因工程产物的形式多种多样，有细胞内不溶性表达（包含体）、胞内可溶性表达、细胞周质表达等，极少数还可以分泌到细胞外表达。

限制：没有信号肽，所以产品多为细胞内产物，提取时需破碎细胞，这样细胞质内其他蛋白质也释放出来，造成提取困难，由于分泌力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物必须在下游处理过程中经过变性和复性处理才能恢复其生物活性。

（2）、枯草芽孢杆菌

分泌能力强可将蛋白质产物直接分泌到培养液中，不形成包含体，但该菌也不能使蛋白质产物糖基化，另外由于它有很强的胞外蛋白酶，会对产物进行降解。

（3）、链霉菌

主要特点：不致病、使用安全、分泌能力强、可将表达产物直接分泌到培养液中，具有糖基化能力。

2、真核细胞

（1）、酵母

特点：是研究基因表达调控最有效的单细胞真核微生物，基因组小，仅为大肠杆菌的4倍，世代时间短，有单倍体、双倍体两种形式。繁殖迅速、可以廉价地大规模培养，没有毒性。能将表达产物直接分泌到胞外，表达产物能糖基化。

（2）、丝状真菌

特点：有很强的蛋白质分泌能力，能正确进行翻译后加工，而且糖基化方式与高等真核生物相似。

（3）、哺乳动物细胞

特点：产物可分泌到胞外，细胞培养液成分完全可控制，使产物纯化较容易，表达产物能糖基化，接近或类似与天然产物；动物细胞生产慢，生产率低，培养条件苛刻，费用高，培养液浓度较稀。

综上所述，目前使用最广泛的宿主仍然是大肠杆菌和酿酒酵母。因为对它们的遗传背景研究得比较清楚，建立了许多适合于它们的克隆载体和DNA导入方式，并且许多外源在这两种宿主菌中得到表达成功。

二、大肠杆菌中的基因表达

1、载体

根据真核基因在原核细胞中表达的特点，表达载体应具备下列条件：（1）、载体能够独立复制，有复制起点，有严紧型和松弛型，严紧型伴随宿主染色体的复制而复制，在宿主细胞中拷贝少（1-3）；松弛型的复制可不依赖与宿主细胞，在宿主细胞中拷贝多达3000个。（2）、应有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，利于外源基因的克隆、鉴定和筛选。（3）、应具有很强的启动子，能为达成杆菌的RNA聚合酶所识别。（4）、应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。（5）、应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关的基因，同时很强的终止子所产生的mRNA较为稳定。（6）、所产生的mRNA必须有翻译的其始信号。

2、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素

外源基因在宿主中的表达受许多因素影响的，所以在建立表达体系时要综合考虑各种因素的作用，建立一个合适的表达体系，从而使外源基因得到最大的表达量，获得最多的表达产物。

（1）、外源基因的拷贝数

外源基因是克隆到载体上的，所以载体在宿主中的拷贝数就直接与外源基因的表达相关，应将外源基因克隆到高拷贝的质粒载体上，这对于提高外源基因的总体表达水平非常有利。

（2）、外源基因的表达效率

启动子的强度—在转录水平上直接影响基因的表达、核糖体结合位点的有效性、SD序列和起始ATG的间距、密码子的组成等都会不同程度地影响外源基因的表达。

（3）、表达产物的稳定性

表达的外源基因，其产物会受到宿主细胞内降解该蛋白质的酶的作用，使得实际产量很低。可采用下列方法来提高表达产物的稳定性：组建融合基因，产生融合蛋白；利用大肠杆菌的信号肽或某些真核多肽中自身的信号肽，把真核基因产物运输到胞浆周质的空隙中，而使外源蛋白不易被酶降解；采用位点特异性突变的方法，改变真核蛋白二硫键的位置，从而增加蛋白质的稳定性；选用蛋白酶缺陷型大肠杆菌为宿主细胞。

（4）、细胞的代谢负荷

外源基因在宿主细胞内的大量表达，必然会影响宿主细胞正常的生长代谢，有些产物对宿主还会有毒害作用，将细胞杀死，为了减轻宿主细胞的代谢负荷，同时还得提高外源基因的表达水平，可以采取当宿主细胞大量生长时，抑制外源基因的表达。即将细胞的生长和外源基因的表达分成两个阶段，使表达产物不会影响细胞的正常生长，当宿主细胞的生物量达到饱和时，再进行基因产物的诱导合成，以减低宿主细胞的代谢负荷；另外，将宿主细胞的生长与重组质粒的复制分开，当宿主细胞迅速生长时，抑制重组质粒的复制，当细胞生长量累积到一定水平后，再诱导细胞中重组质粒的复制，增加质粒拷贝数。

（5）、工程菌的培养条件

优化培养条件使外源基因大量表达。

3、真核基因在大肠杆菌中的表达形式

三种：融合蛋白、非融合蛋白、分泌型。

（1）、融合蛋白

融合蛋白的氨基端是原核序列，羧基端是真核序列，这样的蛋白质是由一条短的原核多肽和真核蛋白结合在一起的。

优点：基因操作简便、蛋白质在菌体内比较稳定、不易被细菌酶类所降解、容易实现高效表达。

缺点：只能做抗原作用，原核多肽序列可能会影响真核蛋白的免疫原性。可再切割成两个多肽链。

（2）、非融合蛋白

表达非融合蛋白的操纵子必须改建成：细菌或噬菌体的启动子—细菌的核糖体结合位点—真核基因的起始密码子—结构基因—终止密码。要求核糖体结合位点序列与翻译起始密码之间的距离要合适，稍有不适就会影响表达效率。

优点：能够较好地保持原来的蛋白活性；

缺点：容易被蛋白酶破坏，氨基末端常常带有甲硫氨酸，在人体内用药时可能会引起人体免疫反应。（3）、分泌型

将外源基因接到信号肽之后，使之在胞质内有效地转录和翻译，当表达的蛋白质进入细胞外膜和细胞内膜之间的周质后时，被信号肽酶识别切割，从而释放出有生物活性的外源基因表达产物。

特点：一些可被细胞内蛋白酶所降解的蛋白质在周质中是稳定的；由于有些蛋白质能按一定的方式折叠，所以在细胞内表达时无活性的蛋白质分泌表达时却具有活性；蛋白质信号肽和编码序列之间能被切割，因而分泌后的蛋白质产物不含起始密码所编码的甲硫氨酸。产量不高，信号肽不被切割或不在特定位置上切割。

三、酵母中的基因表达

1、载体

酵母载体是可以携带外源基因在在酵母细胞内保存和复制，并随酵母分裂传递到子代细胞的DNA或RNA单

位。

从大肠杆菌中制备质粒要比从酵母中容易得多，因此酵母质粒的加工和制备大部分是通过大肠杆菌进行的，只有在最后阶段在转入酵母中。

酵母载体有两类：普通表达载体和精确表达载体。

普通表达载体，只能方便地引入外源基因并进行表达，对表达产物的组成，特别是对其氮末端氨基酸是否有增减并无严格要求。

精确表达载体，要求在启动子或前导肽编码序列的适当部位有内切酶位点，以利于接入外源基因，并使它在表达和加工后氮末端氨基酸序列与天然产物相同，既无多余的氨基酸，也无缺失的氨基酸。

2、影响目的基因在酵母菌中表达的因素

（1）、外源基因的拷贝数

拷贝数要适当，高拷贝数的质粒载体可使外源基因高效表达，但会引起细胞生长量的降低，单拷贝的质粒载体对细胞的最大生长没有影响，能达到较高效的表达。

（2）、外源基因的表达效率

与启动子、分泌信号、终止序列有关。要使外源基因在酵母中表达必须将外源基因克隆到酵母军表达载体的启动子和终止子之间，构成表达框架。分泌信号包括信号肽部分以及前导肽部分的编码序列，它帮助后面的表达产物分泌出酵母细胞，并在适当的部位由胞内蛋白酶加工切断表达产物与前导肽之间的肽键，产生正确的表达产物。终止序列保证了转录产物在适当的部位终止和加上多聚腺苷酸尾巴，这样形成的mRNA 可能比较稳定并被有效地翻译。

（3）、外源蛋白的糖基化

外源蛋白在分泌过程中发生糖基化。

（4）、宿主菌株的影响

宿主菌株应具备下列要求：菌体生长力强；菌体内源蛋白酶要较弱；菌体性能稳定；分泌能力强。

四、动物细胞中的基因表达

动物细胞表达的特点：产物可分泌到细胞外，培养液成分可人工调控，产物纯化比较容易，产物是糖基化的，接近或类似于天然产物；但动物细胞生长慢，单位体积生产率低，培养条件苛刻，费用高，培养液浓度较小。

第五节基因工程菌的稳定性

基因工程菌在传代过程中经常出现质粒不稳定的现象，有分裂不稳定和结构不稳定，分裂不稳定是指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象；质粒结构不稳定是指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。

一、质粒不稳定产生的原因

常见的是分裂不稳定，与两个因素有关：含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；这两种菌的比生长速率差异的大小。含低拷贝质粒的工程菌产生不含质粒子代菌的频率较大，增加工程菌中的质粒拷贝数能提高质粒的稳定性。含高拷贝质粒的工程菌产生不含质粒子代菌的频率较低，但是大量外源质粒的存在使含质粒菌的生长速率明显低于不含质粒菌，而不含质粒菌一旦产生，能较快地取代含质粒菌而成为优势菌，因而对这类菌进一步提高质粒拷贝数反而会增加含质粒菌的生长负势。

质粒稳定性的分析方法：将工程菌培养液样品适当稀释，均匀涂布于不含抗性标记抗生素的平板培养基上，培养10-12小时，然后随机挑出100个菌落接种到含抗性标记抗生素的平板上，培养10-12小时，统计长出的菌落数，每一样品应取3次重复的结果，计算出比值，该比值反映了质粒的稳定性。

二、提高质粒稳定性的方法

采用两阶段法，第一阶段先使菌体生长至一定密度，第二阶段诱导外源基因的表达。在培养基中加入选择性压力如抗生素等，以抑制质粒丢失菌的生长。适当的操作方式也可使工程菌生长速率具有优势，调控温度、pH、培养基组分、溶解氧，通过间歇供氧和改变稀释速率都可以提高质粒的稳定性。

第七节基因工程菌发酵

基因工程菌的培养过程主要包括：1、通过摇瓶操作了解工程菌生长的基础条件，分析表达产物的合成、积累对受体细胞的影响；2、通过培养罐操作确定培养参数和控制的方案以及顺序。

一、基因工程菌的培养方式

1、补料分批培养

将种子接入反应器中后，培养一段时间，然后间歇或连续补加新鲜培养基，使菌体进一步生长。为保持基因工程菌生长所需的良好环境，延长对数生长期，获得高密度菌体，通常把溶氧控制和补料措施结合起来，根据生长规律来调节补料速率。

2、连续培养

将种子接入反应器后，培养一段时间，到一定菌浓，开动蠕动泵，同时进料和出料，控制一定稀释速率，由于基因工程菌不稳定，可将生长阶段和基因表达阶段分开，进行两阶段连续培养，关键的控制参数是诱导水平、稀释率、细胞比生长速率。

3、透析培养

利用膜的半透性使代谢产物和培养基分离，通过去除培养液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响。

4、固定化培养

基因工程菌固定化后，质粒的稳定性大大提高。便于进行连续培养，特别是对于分泌型菌更为有利。

二、基因工程菌的发酵工艺

基因工程菌培养目的是为了使外源基因大量表达，尽可能减少宿主细胞本身蛋白的污染，外源基因的高效表达，不仅涉及宿主、载体和克隆基因之间的相互关系，而且也其所处的环境也密切相关。不同的发酵条件，代谢途径也不相同，对下游的纯化工艺就会造成不同的影响。

1、培养基的影响

培养基的组成既要提高工程菌的生长速率，又要保持重组质粒的稳定性，使外源基因能够高效表达。

使用不同的碳源对菌体生长和外源基因的表达有较大的影响，如葡萄糖做碳源菌体产生的副产物较多，甘油做碳源菌体得率较大。

酪蛋白水解物做氮源有利于产物的合成与分泌。

无机磷在许多初级代谢的酶促反应中是一个效应因子，在低磷浓度下，尽管最大菌浓较低，但产物产率和产物浓度都较高。启动子只有在低磷酸盐时才被启动。

2、接种量的影响

接种量的大小影响发酵的产量和发酵周期，量小，延长菌体延迟期，不利于外源基因的表达；量大，有利于对基质的利用，可以缩短生长延迟期，并使产生菌能迅速占领整个培养环境，减少污染机会，但会使菌体生长过快，代谢产物累积过多，反而会抑制后期菌体的生长。

3、温度的影响

温度对基因表达的调控作用可发生在复制、转录、翻译或小分子调节分子的合成上。复制，可通过控制复制来改变基因拷贝数，影响基因的表达；转录，可通过影响RNA聚合酶的作用或修饰RNA聚合酶，来调控基因表达。酶促反应。

4、溶解氧的影响

菌体在大量扩增过程中，进行耗氧的氧化分解代谢，采用调节搅拌转速的方法可以改善培养过程中的氧供给，提高活菌产量。在发酵前期采用较低转速，即可满足菌体生长，在培养后期，提高搅拌转速才能满足菌体继续生长的要求。这样既节约能源又可满足各个不同阶段菌体生长的要求。

5、诱导时机的影响

一般在对数生长期或对数生长期后期升温诱导表达，对数生长期，细胞快速繁殖，直到细胞密度达到109个每毫升为止，这时菌群数目倍增，对营养和氧的需求量急增，营养和氧成了菌群旺盛代谢的限制因素。

6、pH的影响

两阶段培养工艺，培养前期着重于优化工程菌的最佳生长条件，培养后期着重于优化外源基因的表达，生长最佳期pH6.8-7.4，外源蛋白表达时pH 6.0-6.5。

第九节基因工程药物的质量控制

基因工程药物的特点：用活细胞作为表达体系，所获得的蛋白质产品往往相对分子量较大，并有复杂的结构，许多药物是参与一些生理功能精密调节所必需的蛋白质，所以任何药物在性质或剂量上的偏差，都可能造成严重的后果，从原料开始每一步都要进行严格的控制。

一、原料的质量控制

原料的质量控制是为了保证编码药品的DNA序列的正确性，以及产品质量的安全性和一致性。

根据质量控制的要求，应了解下列特征：目的基因的来源、克隆的经过、并用限制性内切酶酶切图谱和核苷酸序列等予以确证、应提供表达载体的名称、结构、遗传特性及其各组分（复制子、启动子）的来源与功能、构建中所用位点的酶切图谱、抗生素抗性标志物、提供宿主细胞的名称、来源、传代历史、检定结果及其生物学特性，需阐明载体引入宿主细胞的方法及载体在宿主细胞内的状态，如是否整合到染色体上及在其中的拷贝数，并证明宿主细胞与载体结合后遗传稳定性，提供插入基因与表达载体俩侧端控制区内的核苷酸序列，详细叙述在生产过程中，启动与控制克隆基因在宿主细胞表达的方法与水平等。

二、培养过程的质量控制

储存中，要求种子克隆纯而稳定；培养中，工程菌所含的质粒稳定，始终无突变；在重复生产发酵中，表达稳定；始终能排除外源微生物的污染。

生产基因工程产品应有种子批系统，并证明种子批不含致癌因子，无细菌、病毒、真菌和支原体等污染，并由原始种子批建立生产用工作细胞库。原始种子批需确证克隆基因DNA序列，详细叙述种子批来源、方式、保存以预计使用期，保存与复苏的方法和材料，并控制微生物污染；提供培养生产浓度与产量恒定性数据，依据宿主细胞-载体系统稳定性，确定在高允许传代数；培养过程中，应测定被表达基因分子的完整性及宿主细胞长期培养后的基因型特征；依宿主细胞-载体稳定性与产品恒定性，规定持续培养时间，并定期评价细胞系统和产品。

三、纯化工艺过程的质量控制

要有足够的生理和生物学试验数据，确证提纯分子批间保持一致性；外源蛋白质、DNA与热源质都在规定的限度以下。

在精制过程中能清除宿主细胞蛋白质、核酸、糖类、病毒、培养基成分及精制工序本身引入的化学物质。

四、目标产品的质量控制

药物质量控制包括以下要求：产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性、一致性。利用多学科的技术生物化学、免疫学、微生物学、细胞生物学和分子生物学。

1、产品的鉴别

肽图分析：用酶法和化学方法降解目的蛋白，对生成的肽段进行分离分析，检测蛋白质一级结构中细微变化的最有效方法。灵敏、高效。高效液相色谱和毛细管电泳。

氨基酸成分分析：小于50个氨基酸分析结果较可靠。

部分氨基酸序列分析：氨基端15个氨基酸。

重组蛋白质的浓度测定和相对分子量测定：浓度，凯氏定氮法、双缩脲法、染料结合比色法、福林-酚法和紫外光谱法。分子量，凝胶过滤法（完整）和SDS-PAGE法（亚基）。

蛋白质二硫键分析：维持蛋白质一级结构的重要共价键。

2、纯度分析

包括目的蛋白质含量测定和杂质限量分析。

（1）、目的蛋白，根据理化性质和生物学特性。常用还原性及非还原性SDS-PAGE、等电聚焦、各种高效液相、毛细管电泳等。应用两种以上方法。

（2）杂质，包括蛋白质和非蛋白质杂质。蛋白类，宿主细胞蛋白，采用免疫方法和电泳相结合；非蛋白类，病毒、细菌等微生物、热源质、内毒素、致敏原及DNA。利用微生物学方法检测无菌。热源质检测用家兔注射。

3、生物活性测定

需要动物体内实验和通过细胞培养进行体外效价测定。重组蛋白质是一种抗原，可用放射免疫分析法或酶标法测定其免疫学活性。体内生物学活性的测定要根据目的产物的生物学特性建立适合的生物学模型，体外生物活性测定有细胞计数法等。

4、稳定性考察

是评价药品要效性按安全性的重要指标，也是确定药品储藏条件和使用期限的主要依据。对温度、氧化、光照、离子浓度和机械剪切等环境因素都很敏感。

5、产品一致性的保证

生产周期长，影响因素多，必须对每一步都进行严格的控制。

五、产品的保存

目的产物受多种因素的影响而失活，保存时要防止变性、降解、保护活性中心。

1、液态保存

低温保存：对热敏感。

在稳定pH条件下保存：防止变性。

高浓度保存：高浓度时比较稳定。

加保护剂保存：糖类、脂肪类、蛋白质类、多元醇、有机溶剂等。有些需要加盐，加2-巯基乙醇在真空或惰性气体中保存。

2、固体保存

固体蛋白质比液体稳定，在室温或冰箱中保存比较稳定，长期保存最好制成干粉或结晶。

六、基因工程在抗生素生产中的应用

1、提高抗生素产量

工业使用的抗生素产生菌都是通过物理或化学方法诱变后得到的，如果利用基因工程技术有目的地定向改造基因，提高基因的表达水平以改造菌种的生产能力效果会更好。可进行以下几方面的工作。

（1）、将产生菌基因随即克隆到原株直接筛选高产菌

在克隆菌株中，增加某一与产量有关的基因剂量，使产量得到提高。

（2）、增加参与生物合成限速阶段基因的拷贝数

抗生素生物合成途径中的某个阶段可能是整个合成中的限速阶段，识别位于合成途径中的限速瓶颈，并设法导入能提高这个阶段酶系的基因拷贝数，如果增加的中间产物不对合成途径中某个步骤产生反馈抑制，就有可能增加最终抗生素的产量。

（3）、通过调节基因的作用

调节基因的作用可增加或降低抗生素的产量，正调节基因可能通过一些正调控机制对结构基因进行正向调节，加速抗生素的产生，负调节基因可能通过一些负调控机制对结构基因进行负向调节，降低抗生素的产量，因此，增加正调节基因或降低副调节基因的作用，可增加抗生素的产量。

（4）、增加抗性基因

抗性基因可通过其产物灭活胞内或胞外的抗生素，保护自身免受所产生的抗生素的杀灭作用，有些抗性基因的产物还直接参与抗生素的合成，抗性基因经常和生物合成基因连锁，而且它们的转录有可能也是紧密相连的，是激活生物合成基因进行转录的必须成分。抗性基因必须首先进行转录，建立抗性后，生物合成基因的转录才能进行。抗生素的产生与菌种对其自身抗生素的抗性密切相关。抗生素的生产水平是由抗生素生物合成酶和对自身抗性的酶所共同确定，这就为通过提高菌种自身抗性水平来改良菌种，提高抗生素产量提供了依据。

2、改善抗生素组分

许多抗生素产生菌可产生多组分抗生素，由于这些组分的化学结构和性质非常相似，而其生物活性有时却相差很大，这给有效组分的发酵、提取和精制带来了很大不便。随着对抗生素生物合成途径和深入了解及基因重组技术的不断发展，应用基因工程技术可以定向地改造抗生素产生菌，获得只产生有效组分的菌种。

3、改进抗生素生产工艺

抗生素的合成一般对氧的供应较为敏感，不能大量供氧往往是高产发酵的限制因素。为了使细胞处于有氧呼吸状态，传统方法是：改变最适操作条件；降低细胞生长速率；培养密度。提高供氧水平只能从设备和操作角度考虑，提高溶氧水平或气液传质系数，提高发酵罐中无菌空气的通入量，并采用各种搅拌装置，使空气分散，满足菌体生长的要求。空气的压缩、冷却或过滤、搅拌都要消耗大量的能源，结果并不理想。进入液相的氧分子需要穿过几层膜才能到达菌体，进入菌体后，还要经物理扩散才能到达产生能量的呼吸细胞器。如在菌体内导入与氧有亲和力的血红蛋白，呼吸细胞就能容易的获得足够的氧，降低细胞对氧的敏感程度，利用它改善发酵过程中溶氧的控制程度。利用基因重组技术克隆血红蛋白基因到抗生素产生菌中，在细胞中表达血红蛋白，可以从提高细胞自身代谢功能入手解决溶氧供求矛盾。

4、产生杂合抗生素

不同抗生素合成基因重组；生物合成途径中某个酶基因的突变；在生物合成途径中引入一个酶基因；利用底物特异性不强的酶催化形成新产物。

基因工程抗体的类型有1.人-鼠嵌合抗体；2.改形抗体；3.小分子抗体；4.双功能抗体；5.抗体融合蛋白

第二节动物细胞的形态和生理特点

一、动物细胞的形态

动物细胞属于真核细胞，结构复杂，分化精确，不同细胞执行不同的功能，例如神经细胞具有很长的分支，很多的纤维，以便接受和传递刺激，红细胞呈扁圆盘状，增大其接触面等。但细胞在离体培养时形态会发生变化，根据不同的需要将离体培养的细胞分为两类：贴壁依赖型和贴壁非依赖型，或贴壁细胞和悬浮细胞。

1、贴壁细胞

生长时必须要有给以贴附的支持物表面，细胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长和繁殖，细胞在表面上生长时有两种形态，成纤维样细胞型和上皮样细胞型。

成纤维样细胞型主要来源于中胚层组织细胞心肌细胞、平滑肌细胞成骨细胞等，上皮样细胞型主要来源于外胚层和内胚层组织细胞，皮肤细胞、肠管上皮细胞，在培养过程中，随着培养条件的变化细胞形态也会发生改变。

2、悬浮细胞

生长不依赖支持物表面，在培养液中悬浮生长，如淋巴细胞等。

3、兼性贴壁细胞

根据生长条件的不同可贴壁也可悬浮生长，中国地鼠卵巢细胞。

第三节生产用动物细胞的要求和获得

一、要求

最初要求生产用动物细胞必须是原代细胞，以后放宽至二倍体细胞即可，即使是经过多次传代也可用，但是非二倍体细胞是绝对禁止使用的，因为担心异倍体细胞的核酸会影响到人的正常染色体，有致癌的危险，由于二倍体细胞传代不会超过50代，所以使用受到限制。后来发现异倍体也可使用，并未对机体产生影响，并且可无限使用，对工业生产带来了极大的方便。

二、获得

原代细胞、已建立的二倍体细胞系及可无限传代的转化细胞系。

1、原代细胞

直接取自动物组织、器官，经过粉碎、消化后获得的细胞悬液。需大量动物，费钱费劳力。

2、二倍体细胞

原代细胞经过传代、筛选和克隆，从而从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。特点：二倍体；有明显的贴壁和接触抑制特性；有限的增殖能力；无致瘤性。

3、转化细胞系

通过转化形成，变成了异倍体，有无限增殖能力。转化可自发，在传代过程中自己转变成可无限增殖的细胞；也可人为转化，采用某些试剂处理，或从动物的肿瘤组织中建立的细胞系。优点：无限传代、倍增时间短、对培养条件和生长因子的要求低，适合于大规模工业化生产。

三、常用生产用动物细胞的特性

WI-38：人二倍体细胞系，成纤维细胞，能产生胶原，倍增时间为24小时，有限寿命50代，用于制备疫苗。MRC-5：人二倍体细胞系，成纤维细胞，有限寿命42-46代，用于制备疫苗。

CHO-K1：从中国地鼠卵巢中分离的上皮样细胞，用于构建工程菌。

BHK-21：从地鼠幼鼠的肾脏中分离。成纤维样细胞，用于构建工程菌，可生产疫苗。

Vero：从非洲绿猴肾中分离，贴壁依赖的成纤维细胞，用于制备疫苗。

Namalwa：从淋巴瘤病人分离，生产干扰素。

SP2/0-Ag14：从抗羊红细胞活性的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞系融合获得，生产单克隆抗体。

四、基因工程细胞的构建和筛选

生产中常采用融合细胞或基因工程构建的工程菌

1、真核细胞基因表达载体的构建

常用病毒或质粒载体，用杆状病毒作载体的优点：该病毒基因是双链的容易进行重组；插入7-8千碱基对不影响正常病毒的形成；可用外源基因更换部分病毒基因，仍具有感染力；有很强的启动子；用光学显微镜可见，容易挑选阳性克隆；可直接表达外源基因。

构建穿梭质粒载体的基本成分：允许载体在细胞内扩增的质粒序列；含有能使基因转录表达调控元件；能用以筛选出外源基因已整合的选择标记；有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统。

2、基因载体的导入和高效表达工程细胞的筛选

融合法、化学法、物理法、病毒法。最常用磷酸钙沉淀和电穿孔法。

磷酸钙沉淀法，将溶解的DNA加在磷酸氢二钠溶液中，再逐渐加入氯化钙溶液，当磷酸氢二钠和氯化钙形成磷酸钙沉淀时，DNA被包裹在当中，形成DNA-磷酸钙共沉淀。当沉淀物与细胞表面接触时，通过细胞吞噬作用将DNA导入其中。优点是方法简单、可进行共转化，可将不含选择性标记的DNA和含选择性标记的DNA放在一起进行形成混合的共沉淀物，一起导入细胞。

电穿孔法，借助电穿孔仪产生的高压脉冲电场，使细胞膜出现瞬时可逆性的小孔，外源DNA即可进入细胞。转化效率较高，但进入的DNA拷贝数较低。

依靠构建载体内的选择性标记采用相应的筛选系统：HAT、GPT、G418、MTX筛选相应的转化细胞；对选出的细胞要进行克隆和亚克隆使其纯化。

五、细胞库的建立

除原代细胞外，其他细胞株、细胞系，包括二倍体、转化细胞、融合细胞和工程细胞都需建立细胞库保存。用于生产的工程细胞必须建立两个细胞库，原始细胞库和生产用细胞库。原始细胞库应有详细档案：1、该细胞系的历史：来源、动物的年龄和性别、细胞分离的方法和所用的培养材料。2、该细胞的特性：形态、生长特性。3、对各种有害因子的检查结果，细菌、真菌、支原体和各种病毒。

生产用细胞库的细胞来源与原始细胞库，然后经扩增达一定数量后，再分装形成细胞库。

第四节动物细胞的培养条件和培养基

一、动物细胞在体外培养所需条件

1、所有的与细胞接触的设备、器材和溶液都必须保持绝对无菌，避免污染；

2、必须有足够的营养保证，绝对不可有有害的物质，避免有害离子；

3、保证有食量的氧气供应；

4、需随时清除细胞代谢中的有害产物；

5、有良好的适于生存的外界环境，渗透压、离子浓度和酸度；

6、及时分种，保持合适的细胞密度。

二、动物培养基的种类和组成

天然、合成和无血清培养基。

1、天然培养基：血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸液、羊水、腹水。

2、合成培养基：组成稳定可、大量生产供应。成分为氨基酸（细胞合成蛋白质的原料）、维生素（维持细胞生命活动的低分子活性物质，形成酶的辅基或辅酶）、糖类（碳源）、无机盐（保持细胞的渗透压并参与代谢）、其他（前体和氧化还原剂）。合成培养基中除了各种营养成分外，还需添加5%-10%的小牛血清。

3、无血清培养基

无血清培养基在天然或合成培养基的基础上添加激素、生长因子、结合蛋白、贴附和伸展因子及其他元素。无血清培养基优点：提高了细胞培养的可重复性，避免了血清差异所带来的细胞差异；减少了由血清带来的病毒、真菌和支原体等微生物污染的危险；供应充足、稳定；细胞产品易于纯化；避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性；减少了血清中蛋白对某些生物测定的干扰，便于结果分析。

添加小牛血清的作用：1、提供有利于细胞生长增殖所需的各种生长因子和激素；2、提供有利于细胞贴壁所需的贴附因子和伸展因子；3、提供可识别金属、激素、维生素和脂类的结合蛋白；4、提供细胞生长所必需的脂肪酸和微量元素。

第五节动物细胞培养方式和操作方式

一、动物细胞的大规模培养方法

根据培养细胞可分为原代细胞培养和传代细胞培养；根据培养容器和方式可分为，静止培养、旋转培养、搅拌培养、微载体培养、中空纤维培养、固定床和流化床培养；实际生产可分为悬浮培养、贴壁培养和贴壁-悬浮培养。

1、悬浮培养

优点：操作简单、培养条件均一、传质和传氧比较好，容易扩大培养规模，可借鉴细菌发酵的经验。缺点：体积小，较难采用灌流培养。常用反应器为搅拌和气升式。

2、贴壁培养

优点：适用的细胞种类多，较容易采用灌流培养，达到高密度细胞。缺点：操作比较复杂，需要合适的贴附材料和足够的面积，培养条件不易均一，传质和传氧较差。

3、贴壁-悬浮培养

（1）微载体培养，优点：可创造相当大的贴附面积，载体体积较小，比重较轻，在轻度搅拌下即可携带细胞自由地悬浮在培养基内，发挥悬浮培养的特长。

（2）包埋和微曩培养，包埋或包裹在凝胶载体和微曩内的细胞可获得保护，避免了剪切力的损害；可以获得较高的细胞密度；通过控制微曩膜的孔径可使产品浓缩在微曩内有利于下游处理；可采用多种生物反应器进行大规模培养

（3）结团培养，利用细胞本身作为基质，相互贴附后，在用悬浮的方法进行培养。优点是操作简单、节省微载体用量。

第八节动物细胞制药的前景

一、提高产量、降低成本和改进质量方面的研究

提高产量即提高细胞表达的水平，选用合适的载体和表达方式。

降低成本需要改进培养基配方，尽可能采用廉价原料，同时还应从改变细胞代谢途径着手。

改进质量主要是糖基化质量问题，选用合适宿主、改变细胞的某些酶基因、改进控制培养条件使产物正确糖基化。

二、转基因动物的研究

产量高、成本低、产品质量与天然基本一样。转基因技术的开发研究，安全性的考察。

三、组织工程的研究

组织工程是通过对细胞的大量培养，并用细胞直接作为一种治疗手段用与临床，或用培养的细胞进一步加工构成一种组织，如皮肤、肝脏、胰腺等用于临床治疗。

第一节概述

人们利用植物作为药物已有几千年的历史了，尤其是我国对中草药的应用。近年来，随着对植物药物的重视程度的不断提高，人们力图从植物中寻找高效、低毒和廉价的药物，以攻克许多危害人类健康的疾病，癌症、爱滋病等。

高等植物的次生代谢产物是丰富多样的，在医药、食品、化工和农业等许多领域作为原料已得到应用。我们所利用的植物代谢产物多为混合物，所以掌握其比例很关键，对于单一成分的活性物质，人们企图通过化学合成的方法来制备，但由于收率低、费用高、化学合成困难并且需要进行异构体的拆分，使得合成难以进行，目前，植物仍然是多种活性化合物的最丰富的来源。由于植物的生长周期长，代谢成分复杂等因素的限制，利用植物获得大量活性物质也受到影响，现在，通过植物细胞的大量培养可以解决这一问题。现阶段植物细胞的培养技术还很不完善，成本较高，今后如何提高单位培养基中有用物质的产量、降低目的产物的生产成本就成为利用植物细胞培养技术生产天然药物并实现工业化生产的关键所在。包括改进培养条件、筛选高产细胞株、研制适合于植物细胞大量培养的新型生物反应器。

一、基本概念

1、植物组织和细胞培养

植物组织和细胞培养是指在无菌和人工控制的营养（培养基）及环境条件（光照、温度）下，研究植物的细胞、组织和器官以及控制其生长发育的技术。

植物无菌培养包括：幼苗及较大植株的培养（植物培养）；从植物体各种器官的外植体增殖而形成的愈伤组织的培养（愈伤组织培养）；能够保持较好分散性的离体细胞或较小细胞团的液体培养（悬浮培养）；离体器官的培养（器官培养）；未成熟或成熟的胚胎的离体培养（胚胎培养）。

2、悬浮培养

在液体培养基中，能够保持良好分散性的细胞和小的细胞聚集体的培养。组织化水平较低。

3、细胞培养

利用单个细胞进行液体或固体培养，诱导其增殖及分化。目的是为了得到单细胞无性繁殖系。

4、分生组织培养

又称生长锥培养，在人工培养基上培养茎端分生组织细胞。

5、外植体

用于植物组织（细胞）培养的器官或组织（的切段），植物的个部位如根、茎、叶、花、果、穗、胚珠、胚乳、花药和花粉等均可作为外植体进行组织培养。

6、器官形成

是指在组织培养或悬浮培养物中芽、根或花等器官的分化与形成。或者在先形成的小根基部迅速形成愈伤组织，然后再形成芽；或者在不同部位分别形成芽和根之后，再形成锥管组织而将二者连成一个轴，最后形成小植株。

7、无性繁殖

又叫克隆，指使用母体培养物反复进行继代培养时，通过同种外植体而获得越来越多的无性繁殖后代。8、突变体

细胞本身发生遗传变异或应用诱变处理发生的遗传变异所得的新细胞。

9、继代培养

由最初的外植体上切下的新增殖的组织，培养一代称为“第一代培养”，连续多代的培养就称为继代培养。

10、次级代谢和次级代谢产物

除了核酸、核苷、核苷酸、氨基酸、蛋白质及糖类以外，具有如下特征的成分成为次级代谢产物：有明显的分类学区域界限；其合成需在一定的条件下才能发生；缺乏明确的生理功能；是生命的多余成分。

定义：次级代谢作用是特殊蛋白质内源化合物的合成、代谢及分解作用的综合体现。生物碱、黄酮体、萜类、有机酸、木质素等。

三、细胞后含物和生理活性物质

细胞中除含有生命物质原生质体外，还有许多非生命物质，细胞的代谢产物，一类是后含物，储藏物质或废弃物质，分布于液泡内，糖类、盐类、生物碱、苷、有机酸、挥发油等，另一类是生理活性物质，对细胞内生化代谢和生理活动起着调节作用。

1、细胞后含物

生物碱，含氮有机化合物，中药含有多种生物碱，麻黄碱，咖啡，阿托品，奎宁，黄连素。

糖苷类，某些化合物和糖竟糖苷键结合而成，对疾病有很好的治疗作用。

挥发油，具有芳香气味，薄荷油、丁香油和桉油。

有机酸，糖类代谢的中间产物，苹果酸、柠檬酸、水杨酸、酒石酸。

2、生理活性物质

对细胞内生化反应和生理活动起调节作用。

酶类，生物催化剂；

维生素，参与酶的形成，对生长、呼吸、物质代谢有调节作用；

植物激素，调节代谢；

抗生素和植物杀菌素，杀死和抑制某些微生物生长的物质。

四、植物培养细胞的生理特性

植物细胞重量的增加主要在对数期，次级代谢产物的累积主要在稳定期。植物细胞多以非均相集合体的细胞团形式存在，细胞团产生的原因有：细胞分裂之后没有进行细胞分离；在间歇培养过程中细胞处于对数生长后期时，开始分泌粘多糖和蛋白质，或以其他方式形成粘性表面，从而形成细胞团。外骨架相当脆弱，表现为抗张力强度大，抗剪切力能力小。

所有植物细胞都是好气的，但培养时不需要很高的气液传质速率，而是要控制氧量，以保持较低的溶氧水平。

泡沫性质不同于发酵，气泡大，黏度也大，通常要采用化学或机械方法加以控制。

培养过程中可能会黏附于反应器壁上，电极或挡板上。

第三节植物细胞培养的基本技术

一、植物材料的准备

用于植物组织培养的外植体必须无菌，如果含有其他微生物，在培养基中，其他微生物会大量迅速繁殖从而影响植物组织的培养。

常用表面灭菌试剂的特点是灭菌后易于除去或容易分解的试剂，根据所处理材料对灭菌试剂的敏感性选择适当的处理时间。常用灭菌试剂有次氯酸钙、次氯酸钠和氯化汞。

二、培养基及其组成

植物离体器官、组织或细胞的无菌土壤，营养成分可调控。

植物细胞或组织培养基常含有无机盐、碳源、有机氮源、植物生长激素、维生素等成分。

一、酶的特性

酶是生物催化剂，大多数酶的本质是蛋白质，有些酶是核酸。酶作为生物催化剂的，除具有一般催化剂的特性：加快反应速度、降低反应活化能、不改变反应平衡点、反应前后无数量和性质变化等外，还具有独自的特点：催化效率高、专一性强、反应条件温和、催化活性易受调节和控制。酶由国际酶学委员会分为六大类：氧化还原酶类、转移酶类、水解酶类、裂合酶类、异构酶类、合成酶类。

一、酶的来源

普遍存在于生物体中，可直接从生物体中分离。化学合成方法目前还不成熟。早期是以动植物为原料进行提取，由于动植物生长周期长、来源有限、受地理、气候和季节等因素的影响，不适于大规模生产，利用微生物来生产酶制品是一个更好的选择，优点是：1、微生物种类繁多，动植物体内的酶在微生物中几乎都可以找到；2、繁殖快、生产周期短、培养简便、并可以通过控制培养条件来提高产量；3、微生物具有较强的适应性，通过各种遗传变异手段能培育出新的高产菌株。

二、酶的生产菌

1、对菌种的要求

产酶量高，酶的性能符合使用要求，最好是胞外酶；不是致病菌、在系统发育上与病源体无关，不产生毒素；稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体；能利用廉价原料，发酵周期短，易于培养。

2、生产菌来源

菌种保藏机构、有关研究部门，从自然界中分离筛选，土壤、深海、温泉、火山、森林都是菌种采集地，筛选包括菌样采集、菌种分离、初筛、纯化、复筛、生产性能鉴定。生产菌的改良，基因突变、基因转移、基因克隆。

三、提高药用酶产量的措施

1、添加诱导物

对于诱导酶的发酵生产，在发酵培养基中添加适当的诱导物，可使产酶量显著提高。乳糖诱导β-半乳糖苷酶，纤维二糖诱导纤维素酶。

诱导物可分为三种：酶的作用底物、酶的反应产物、酶的底物类似物。

2、控制阻遏物浓度

有些酶的合成受到阻遏物的阻遏作用，应设法解除阻遏作用来提高酶的产量。

3、添加表面活性剂

可分为离子型和非离子型，离子型对细胞有毒害作用，只能使用非离子型，可聚集在细胞膜上，增加细胞通透性，有利于酶的分泌，可增加酶的产量。

4、添加刺激剂

在植物细胞培养生产次级代谢产物的过程中，添加某些刺激剂可显著提高次级代谢的物的产量。真菌的细胞壁碎片或其有效成分、微生物胞外酶以及一些小分子物质。

5、添加产酶促进剂

植酸钙镁可是霉菌蛋白酶和橘青霉磷酸二酯酶的产量提高1-20倍。

第三节酶和细胞的固定化

使用纯酶的缺点：只能使用一次，成本高，产品分离困难；酶溶液很不稳定，容易变性和失活。

固定化酶的优点：性能稳定；可反复使用，降低了成本，易与产品分离，简化下游操作。

一、固定化酶的制备

1、定义限制或固定于特定空间位置的酶，即经物理化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。

2、特点（1）、可以多次使用，而且在多数情况下，酶的稳定性提高；（2）、反映后，酶与底物和产物易于分开，产物中无残留酶，易于纯化，产品质量高；（3）、反映条件易于控制，可实现转化反应的连续化和自动控制；（4）、酶的利用效率高，单位酶催化的底物量增加，用酶量减少；（5）、比水溶性酶更适合于多酶反应。

3、酶和细胞的固定化方法载体结合法：物理吸附法、离子结合法、共价结合法；

交联法包埋法：网格型、微囊型

二、固定化细胞

1、定义

将细胞限制或定位于特定空间位置的方法。

2、特点

无需进行酶的分离纯化；细胞保持酶的原始状态，固定化工程中酶的回收率高；固定化酶比细胞内酶稳定性高；细胞内酶的辅因子可自动再生；细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应；抗污染能力强。

第六节酶工程研究进展

包括酶的修饰、酶的人工模拟、有机相的酶反应和基因工程酶的构建。

一、酶的化学修饰

1、目的和意义

天然酶的缺陷：易于变性失活（酸、碱、有机溶剂、热）；容易受产物和抑制剂的抑制；工业反应要求的酸度和温度并不总是在酶反应的最适酸度和温度范围内；底物不溶于水，或酶的米式常数过高；酶做为药物在体内的半衰期较短等因素限制了酶制剂的应用。

酶的化学修饰：对酶在分子水平上用化学方法进行改造，即在体外将酶分子通过人工方法与一些化学基团，特别是具有生物相容性的大分子进行共价连接，从而改变酶分子的酶学性质的技术。

目的：提高酶的稳定性、降低或消除酶分子的免疫原性（医药）。

意义:扩大了酶制剂的应用范围，同时化学修饰法也是研究酶的活性中心性质的重要手段。

2、常用化学修饰剂

要求：较大相对分子量；良好的生物相容性和水容性；分子表面有较多的反应活性基团；修饰后酶的半衰期较长。

常用修饰剂：糖及糖的衍生物，右旋糖苷、右旋糖苷硫酸酯，糖肽，葡聚糖凝胶，聚乳；高分子多聚物，聚乙二醇，聚乙烯醇；生物大分子，肝素，血浆蛋白质，聚氨基酸；双功能试剂，戊二醛，二胺；其他，固定化酶载体，糖基化试剂，甲基化试剂，乙基化试剂和小分子有机化合物。

3、修饰方法

（1）、修饰酶的功能基团，酶分子中可解离的基团如氨基、羟基、羧基、巯基等都可以修饰。如脱氨基可消除酶分子表面氨基酸的电荷；通过碳二亚胺反应，可以改变侧链羧基的性质；通过酰化反应可改变侧链羟基的性质。

（2）、酶分子内或分子间进行交联，应用某些双功能试剂可将酶蛋白分子之间、亚基之间或分子内部不同肽链部分进行共价交联。

（3）修饰酶的辅因子，可将辅因子共价结合在酶分子上，或引入新的或修饰过的具有强反应性的辅因子。（4）、酶与高分子化合物结合，蛋白质或多糖结合后可提高稳定性。

4、修饰酶的特性

稳定性提高、抗各类失活因子的能力提高、抗原性消除、体内半衰期延长、最适酸度改变、酶化学性质改变，对组织分布能力改变。

5、前景

酶分子经过化学修饰后，并不是所有的缺点都可以克服了，并且修饰的结果难以预测，今后，应选用更多的、合适的修饰方法，如使用基因工程法、蛋白质工程法、人工模拟法和某些物理修饰法等，使酶的性质进一步改善。

二、人工模拟法

根据酶的作用原理，用人工的方法合成的具有活性中心和催化作用的非蛋白质结构的化合物。

模拟酶—环糊精有几个D-(+)-吡喃葡萄糖残基通过α-1，4糖苷键连接而成。每个葡萄糖残基呈现椅式构象，整个分子类似环柱形分子，由于环糊精分子空穴边缘有许多羟基，能溶于水，空穴内基本是疏水的。环糊精催化的特点是：参与反应的底物分子先被环糊精分子包接，再于其发生反应，与酶促反应十分相似，已模拟了转氨酶、核糖核酸酶、碳酸苷酶等。

分子印迹制备对某一特定分子具有选择性的聚合物的过程，该特定分子称为印迹分子或模板。

分子印迹的过程：1、选定印迹分子和功能单位，让它们之间发生互补作用，形成印迹分子功能单位复合物。

2、用交联剂在印迹分子功能单位复合物周围发生聚合反应，形成交联的聚合物。

3、从聚合物中除去印迹分子，得到对印迹分子具有选择性的聚合物。

印迹方法：共价分子印迹和非共价分子印迹。非共价分子印迹首先是印迹分子与功能单位相混合，二者以非共价键发生反应，然后功能单位与交联剂发生共聚合，形成高交联的刚性聚合物，最后使印迹分子从聚合物上脱离，并留下一个在形状和功能基团位置上与印迹分子相互补的识别部位。共价分子印迹印迹分子与功能基团形成共价键，在与交联剂发生共聚合后，用化学方法将印迹分子从这个高度交联的聚合物上除去。

应用范围：分子印迹聚合物可作为剪裁分离物质的材料；在酶技术和有机合成中，可作为模拟抗体、模拟酶或具有催化活性的聚合物；在生物传感器的构建中作为传感器。

三、有机相的酶反应

1、有机相酶反应的优点

增加疏水性底物或产物的溶解度；热力学平衡向合成方向移动；可抑制有水参与的副反应；酶不溶于有机溶剂，易于回收在利用；容易从低沸点的溶剂中分离纯化产物；酶的热稳定性提高，酸度适用范围扩大；无微生物污染；能测定某些在水介质中不能测定的常数；固定化酶方法简单，可以只沉淀在载体表面。

2、有机相酶反应的溶剂体系水-水溶性溶剂均相体系；水-水不溶性溶剂两相体系；反相胶团体系，单相有机溶剂体系。

3、有机相的酶工程在有机相中，天然酶容易变性而失活、分散性差、容易聚结成团。固定化酶，酶的化学修饰和秒面活性剂包埋。

四、基因工程酶的构建

1、酶基因的克隆和表达

重组DNA技术克隆各种天然酶的基因，在微生物中表达，筛选出高产菌株，可以通过发酵大量生产所需要的酶。

2、酶基因的遗传修饰

认为地将酶基因中个别核苷酸加以修饰或更换，从而改变酶蛋白分子中某个或几个氨基酸，不仅改变酶的结构，而且改变拜的催化活力，专一性及稳定性。

五、基因工程疫苗

传统疫苗主要是灭活疫苗和减毒疫苗,在制备使用安全性方面存在一定的缺陷,通过基因工程技术删除致病基因,同时保留病原引发免疫反应的能力.

基因工程疫苗的最大优越性是保证了疫苗接种对象和生产疫苗人员的安全性.

微生物在其生命活动过程中会产生种类繁多的小分子代谢产物，这些代谢产物一般可以分为两类：初级代谢产物和次级代谢产物

初级代谢产物一般属于能量代谢或分解代谢的产物。

次级代谢产物是在微生物细胞分化过程中产生的，对细胞生长并不具有明显的作用。但是具有重要的工业应用价值。

抗生素、色素、蛋白质抑制剂及毒素等都是次级代谢产物，近年来还发现具有特殊生理活性的次级代谢产物，如免疫调节剂，具有临床药理活性的物质以及农用和动物饲料业用的生物活性物质。

在次级代谢产物中，最重要的是抗生素,另外是氨基酸。

目前已经报道的抗生素已经超过一万种，现在每年的增加数量数以百计。应用的抗生素种类大概在200种左右。

抗生素除了对细菌临床有强大的杀灭抑止作用外，在对抗肿瘤、原虫、植物病害等方面也有优异的表现。能够产生抗生素的微生物包括细菌、放线菌、丝状真菌等。

一、抗生素

1、抗生素的概念

某些生物（主要是细菌、放线菌、真菌等微生物）在其生命活动过程中产生的，能够在低微浓度下选择性杀灭他种生物或抑制其机能的化学物质。主要由微生物发酵得到。也可以通过合成或半合成方式生产。5、抗生素耐药机制

（1）产生抗感染药的灭活酶

β-内酰胺酶该酶是多种不同类型以β-内酰胺类为底物的降解酶。依其主要水解对象可分为青霉素酶、头孢菌素酶、广谱酶和超广谱酶4类。氯霉素乙酰转移酶或硝基还原酶可使氯霉素转化为无活性的衍生物。氨基糖苷类钝化酶主要有磷酸转移酶、乙酰转移酶和核苷转移酶等。

（2）阻止药物进入菌体抵达靶位

细菌细胞外膜通透性孔蛋白改变或缺失，使药物流入速度减慢，耐药性增强。

（3）改变或产生新作用靶部位、靶酶或靶蛋白

（4）感染病灶中氧化还原电势和pH与药物的关系

当感染灶中处于低氧或无氧状态时，pH降低，氧化还原电势-降低，氨基糖苷类在无氧情况下即无活性。pH<6时，大环内酯类、亚胺培南等抗菌活性均受到抑制。

（5）增加药物主动外排

细菌耐药性以质粒介导为主，某些细菌可具有一种以上耐药机制，其中细菌对抗感染药通透性的改变及产生灭活酶是最常见的。

细菌素

细菌素（Bacteriocin）是一种蛋白类抗菌物质。具有高效、无毒、耐酸、耐高温、无残留、无抗药性，其分子量小、含修饰氨基酸、结构复杂等特点，被认为是分子遗传及基因工程、蛋白质工程和食品添加剂、化妆品等领域抑制病原菌和调节肠道菌群的好材料。

细菌素是由某些细菌在代谢过程中通过核糖体合成产生的一类具有抑菌生物活性的蛋白质或多肽。其抑菌范围不止局限于同类型菌，产生菌对细菌素有自身免疫性。其中有些作为发酵菌种的细菌素对动物无毒副作用，无抗原性，其抑菌范围广，可以杀死或抑制食物中一些致腐菌和病原菌，并有一定的热稳定性，既能延长食品的保质期，又不会破坏食品的风味与组织状态。

细菌素与抗生素的区别

细菌素与抗生素都是由微生物产生，用量都很小，都具有一定的抗菌谱，能较强地抑制甚至杀死其他微生物。

细菌素和抗生素的区别:抗生素是某些微生物通过酶促反应将初级代谢物转变为结构性的次级代谢物，而细菌素则需要通过核糖体来合成，是真正的蛋白质类物质。细菌素与抗生素的根本差别是：大部分细菌素只对近缘关系的细菌有损害作用。

细菌素作为饲料添加剂，可以防止致病菌对动物肠道的危害.细菌素不仅具有与抗生素饲料添加剂相似的有益作用，而且无毒、无副作用、无残留、无抗药性，同时也不污染环境，所以细菌素将会在饲料中得到广泛应用。

细菌素作为饲料添加剂具有两个方面的作用：一是防止饲料本身被沙门氏菌等致病菌污染。二是防治致病菌对动物肠道的影响。

生物技术制药复习资料

第二章生物药物概论 一、生物药物生产原料选择的主要原则、生物药物的特性及种类。 主要原则：有效成分含量高，原料新鲜；来源丰富，易得；原料产地较近；杂质含量少；原料成本低；易提取。 特性：（1）药理学特性：治疗的针对性强；药理学活性高；毒副作用小，营养价值高；生理副作用常有发生。 （2）生产、制备中的特殊性：原料中的有效物质含量低；稳定性差；易腐败；注射用药有特殊要求。 （3）检验上的特殊性：要有理化检验指标，和生物活性检验指标。 分类： 按药物化学本质和化学特性分类：（1）氨基酸及基衍生物类（2）多肽和蛋白质类（3）酶和辅酶类（4）核酸及其降解物和衍生物类（5）糖类（6）脂类（7）细胞生长因子类（8）生物制品类（9）小动物制剂（10）动物器官或组织制剂。 按原料来源分类：（1）人体组织（2）动物组织（3）植物组织（4）微生物（5）海洋生物来源的药物。 按生理功能和用途分类：（1）治疗药物（2）预防药物（3）诊断药物（4）其他。 二、生物药物提取分离制备方法的工艺过程。在对生物药物进行提取操作时，选择提取试剂需注意的问题。 工艺流程：1、生物药物原料的选择、预处理与保存（保存方法： 冷冻法，-40℃；②有机溶剂脱水法；③防腐剂保鲜，多用于液体）。 2、生物药物的提取：（1）生物组织与细胞破碎：磨切法，压力法，反复冻融法，超声波震荡破碎法，自溶法，酶溶法（2）选择合适的溶剂进行提取（考虑提取剂的用量、提取时间、提取次数，注意温度、变性剂等因素）。 3、生物药物的分离纯化：（1）蛋白质类药物的分离纯化：沉淀法，亲和层析法，疏水层析法（2）核酸类药物的分离纯化：提取法，发酵法（3）糖类：沉淀法，离子交换层析法（4）脂类：沉淀法，吸附层析法，离子交换层析法（5）氨基酸类：沉淀法，吸附法，离子交换法。 试剂的选择：1、对所需要提取的活性成分溶出度较高，对杂质较低。2、不破坏活性成分。 3、利于后续预处理。 4、对环境影响较小，有利于回收和处理。 5、对设备要求不高。 6、成本较低。 7、最好对人体无害。 第三章基因工程制药 一、基因工程制药的主要工艺过程。 获得目的基因→组建重组质粒→构建基因工程菌（或细胞）→培养工程菌→产物的分离纯化→质量控制→产品检验包装 二、什么是目的基因？有几种获取方法？用于构建基因工程菌的目的基因应该达到什么要求？ 目的基因既是人们所需要的特定基因，一般也是接受目的基因的细胞或个体原本没有的基因。 获取方法：（1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因文库，从中调用目的基因；（2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段；（3）利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段（4）化学合成法；⑸逆转录（RT）-PCR法合成cDNA。 基本要求:不含多余干扰成分，纯度高；片段大小适合重组操作；结构、序列正确，达到一定数量。

(完整版)生物技术制药考试题复习

一：选择题 1、酶的主要来源是( C) A、生物体中分离纯化 B、化学合成 C、微生物生产 D、动/ 植物细胞与 组织培养 2、所谓“第三代生物技术”是指(A) A、海洋生物技术 B、细胞融合技术 C、单克隆技术 D、干细胞技术 3、菌体生长所需能量与菌体有氧代谢所能提供的能量在什么情况下，菌体往往会产生代谢副产物乙酸：(A) A、大于 B、等于 C、小于 D、无关 4、促红细胞生长素( EPO)基因能在大肠杆菌中表达，但却不能用大肠杆菌的基因工程菌生产人的促红细胞生长素，这是因为：( E) A、人的促红细胞生长素对大肠杆菌有毒性作用 B、人促红细胞生长素基因在大肠杆菌中极不稳定 C、大肠杆菌内毒素与人的促红细胞生长素特异性结合并使其灭活 D、人的促红细胞生长素对大肠杆菌蛋白水解酶极为敏感 E、大肠杆菌不能使人的促红细胞生长素糖基化 5、目前基因治疗最常用的载体是：(B) A、腺病毒 B、反转录病毒 C、腺相关病毒 D、痘苗病毒 E、疱疹病毒 6、cDNA第一链合成所需的引物是：( D) A、Poly A B、Poly C C、Poly G D、Poly T E、发夹结构 7、为了减轻工程菌的代谢负荷，提高外源基因的表达水平，可以采取的措施有：(A) A将宿主细胞生长和外源基因的表达分成两个阶段 B、在宿主细胞快速生长的同时诱导基因表达 C、当宿主细胞快速生长时抑制重组质粒的表达 D、当宿主细胞快速生长时诱导重组质粒的复制 8、基因工程制药在选择基因表达系统时，首先应考虑的是：(A) A、表达产 物的功能B、表达产物的产量 C.表达产物的稳定性 D.表达产物分离纯化的难易 9、疫苗出产前需进行理化鉴定、效力鉴定和(安全性鉴定)。 10、基因工程药物的化学本质属于：(C) A. 糖类 B.脂类 C.蛋白质和多肽类 D.氨基酸类 11、用聚二乙醇( PEG)诱导细胞融合时，下列错误的是：(C) A、PEG的相 对分子量大，促进融合率高B、PEG的浓度高，促进融合率高C、PEG 的相对分子量小，促进融合率高D、PEG的最佳相对分子量为 4000 12、以大肠杆菌为目的基因的表达体系，下列正确的是：(C) A、表达产物 为糖基化蛋白质B、表达产物存在的部位是在菌体内 C、容易培养，产物提纯简单 D 、表达产物为天然产物 13、人类第一个基因工程药物是：(A) A、人胰岛素 B、重组链激酶 C、促红细胞生成素 D、乙型肝炎疫苗 14、下列不属于加工改造后的抗体是：(C) A、人-鼠嵌合抗体 B、单链抗体C 、鼠源性单克隆抗体D、单域抗体 15、动物细胞培养的条件中，不正确的是：(D)

生物技术制药试题及重点

第一章绪论 填空题 1. 生物技术制药的特征 _高技术、高投入、高风险、高收益、长周期。 2. 生物药物广泛应用于医学各领域，按功能用途可分为三类，分别是_治疗药物、预防药物、诊断药物。 3. 现代生物药物已形成四大类型：一是应用DNA重组技术制造的基因重组多肽、蛋白 质类治疗剂；二是基因药物_______________ ；三是来自动物植物和微生物的天然生物药 物；四是合成与部分合成的生物药物； 4. 生物技术的发展按其技术特征来看，可分为 三个不同的发展阶段，传统生物技术阶段；近代生物技术阶段；现代生物技术阶段。 5. 生物技术所含的主要技术范畴有基因工程; 细胞工程；酶工程；发酵工程；蛋白质核酸工程和生化工程； 选择题 1?生物技术的核心和关键是（A ） A细胞工程B蛋白质工程C酶工程D 基因工程 2. 第三代生物技术（A ）的出现，大大扩大了现在生物技术的研究范围 A基因工程技术B蛋白质工程技术C海 洋生物技术D细胞工程技术 3. 下列哪个产品不是用生物技术生产的（D）A青霉素B淀粉酶C乙醇D氯化钠 4. 下列哪组描述（A ）符合是生物技术制 药的特征 A高技术、高投入、高风险、高收益、长周期B 高技术、高投入、低风险、高收益、长周期 C高技术、低投入、高风险、高收益、长周期 D高技术、高投入、高风险、低收益、短周期 5. 我国科学家承担了人类基因组计划（C ）的测序工作 A10% B5% C 1% D 7% 名词解释 （2）近代生物技术阶段的技术特征是微生物 发酵技术，所得产品的类型多，不但有菌体的初 级代谢产物、次级代谢产物，还有生物转化和酶 反应等的产品，生产技术要求高、规模巨大，技 术发展速度快。代表产品有青霉素，链霉素，红 霉素等抗生素，氨基酸，工业酶制剂等。 （3）现代生物技术阶段的技术特征是DNA 重 组技术。所得的产品结构复杂，治疗针对性强， 疗效高，不足之处是稳定性差，分离 纯化工艺更复杂。代表产品有胰岛素，干扰素和 疫苗等。 3. 生物技术在制药中有那些应用？ 生物技术应用于制药工业可大量生产廉价的防治 人类重大疾病及疑难症的新型药物，具体体现在 以下几个方面： （1）基因工程制药，利用基因工程技术可生 产岀具有生理活性的肽类和蛋白质类药物，基因 工程疫苗和抗体，还可建立更有效的药物筛选模 型，改良现有发酵菌种，改进生产工艺，提供更 准确的诊断技术和更有效的治疗技术等。随着基 因技术的发展，应用前景会更广阔。 （2）细胞工程和酶工程制药 该技术的发展为现代制药技术提供了更强大的技 术手段，使人类可控制或干预生物体初次生代谢 产物和生物转化等过程，使动植物能更有效的满 足人类健康方面的需求。 （3）发酵工程制药 发酵工程制药的发展主要体现在对传统工艺的改 进，新药的研制和高效菌株的筛选和改造等。 第二章基因工程制药 填空题 1. 基因工 程药物制造的主要步骤是：目的 基因的获得；构建DNA重组体;构建工程菌；目 的基因的表达；产物的分离纯化; 产品的检 验。 1. 生物技术制药 采用现代生物技术可以人为的创 造一些条件，借助某些微生物、 植物或动物来生产所需的医学药 品，称为生物技术制药。 2. 生物技术药物 一般说来，采用DNA重组技术 或其它生物新技术研制的蛋白 质或核酸来药物称为生物技术药 物。 3. 生物药物 生物技术药物是重组产品概念在 医药领域的扩大应用，并与天然 药物、微生物药物、海洋药物和 生物制品一起归类为生物生物药 物。 简答题 1.生物技术药物的特性是什 么？ 生物技术药物的特征是： （1）分子结构复杂 （2）具有种属差异特异性 （3）治疗针对性强、疗效高 （4）稳定性差 （5）免疫原性 （6）基因稳定性 （7）体内半衰期短 （8）受体效应 （9）多效应和网络效应 （10）检验特殊性 2.简述生物技术发展的不同阶段 的技术特征和代表产品？ （1）传统生物技术的技术特征 是酿造技术，所得产品的结构较 为简单，属于微生物的初级代谢 产物。代表产品如酒、醋、乙 醇，乳酸，柠檬酸等。

生物技术制药

1. 生物技术制药：采用现代生物技术人为地创造一些条件， 借助某 些微生物、植物或动物来生产所需 的医药品。 2. 抗体：能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。 3.疫苗：是指将病原微生物(细菌、病毒、真菌、立克次氏体、支 原体、衣原体等)及其代谢产物，经过人工减毒、灭火或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的免疫制剂。 4.反义核酸：包括反义DNA分子，或由部分RNA和部分DNA形成的RNA-DNA 嵌合分子，以及经高度化学修饰的寡聚核酸类似物。 5.载体分为：质粒载体和λ噬菌体载体。①质粒载体涉及三个要素：复制子、选择标记、多克隆位点、几种质粒载体（克隆载体、表达载体、突变载体、报告载体）②λ噬菌体载体：常用于构建基因组文库和cDNA 文库。λ噬菌体载体通常分为插入型载体和置换型载体，插入型载体是指载体中一个酶切位点用于外源DNA的插入，置换型载体是指外源DNA通过置换载体上非必需序列插入载体。 6.目的基因常用的制备方法：化学合成法、PCR法、基因文库法、cDNA 文库法。 7.基因工程药物制造程序：获得目的基因→构建基因工程菌→工程菌大规模培养→产物分离纯化→除菌过滤→半成品检测→成品加工→成品检测。 8.基因工程菌的培养过程:（1）摇瓶操作：了解工程菌生长的基础条件（温度、pH、培养基组分及C/N），分析表达产物的合成、积累对受体细胞的影响。（2）培养罐操作：确定培养参数、控制方案及顺序。基因工程菌的培养方式:（1）补料分批培养：将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间后，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方式。（2)连续培养： 将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至一定浓度后,开动进料和出料的蠕动泵，以控制一定稀释率进行不间断的培养。 两阶段连续培养，控制和优化诱导水平、 稀释率、细胞比生长速率。（3）透析培养：利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离，通过去除培养液中的代谢产物来解除其生产菌的不利影响。（4）固定化培养：维持质粒稳定性(5）分批培养:DO-Stat 法： 调节搅拌转速和通气速率控制溶氧在 20%，补料的流加速率是关键。Balanced DO-Stat 法： 控制溶氧、搅拌转速、糖的流加速率，使乙酸维持在低浓度。 控制菌体比生长速率的方法：在最优表达水平获得高密度、高表达。9.基因工程菌发酵工艺的影响因素:（1）培养基的影响（2）接种量的影响（3）温度的影响（4）溶解氧的影响（5）诱导时机的影响（温度、氧、营养）（6）pH的影响（细胞生长期、外蛋白表达期）（7）诱

2018年生物技术制药习题及答案

2018年生物技术制药习题及答案 一、选择填空题 1. 酶的主要来源是什么? 微生物生产。 2. 第三代生物技术是什么? 基因组时代。 3. 基因治疗最常用的载体是什么? 质粒载体和λ噬菌体载体。 4. 促红细胞生长素基因可在大肠杆菌中表达。但不能用大肠杆菌工程菌生产人的促红细胞生产素为什么? 因为大肠杆菌不能使人的促红细胞生长素糖基化, 人的促红细胞生长素对大肠杆菌有毒性作用。 5. 菌体生存所需能量已菌有氧代谢所需能量在什么情况下产生代谢产物乙酸?

菌体生长所需能量 (大于) 菌体有氧代谢所能提供的能量时, 菌体往往会产生代谢副产物乙酸。 6.cDNA 第一链所合成所需的引物是什么? cDNA 第一条链合成所需引物为 PolyT 。 7. 基因工程制药在选择基因表达系统时首先考虑什么? 表达产物的功能。 8. 为了减轻工程菌代谢负荷,提高外源基因表达水平可采取什么措施? 将宿主细胞生长和外源基因的表达分成两个阶段。 9. 根据中国生物制品规定要求,疫苗出厂需要经过哪些检验? 理化检定、安全检定、效力检定。 10. 基因工程药物化学本质是什么? 蛋白质。

11.PEG 诱导细胞融合? PEG 可能与可能与临近膜的水分相结合, 使细胞之间只有微笑空间的水分被 PEG 取代, 从而降低了细胞表面的极性,导致双脂层的不稳定,使细胞膜发生融合。 12. 以大肠杆菌为目的基因表达系统的表达产物,产物位置是什么? 胞内、周质、胞外。 13. 人类第一个基因工程药物是什么? 重组胰岛素。 14. 动物细胞培养的条件是什么? 温度 :哺乳类 37昆虫 25~28, ph7.2~7.4,通氧量:使 co2培养箱,不同动物比例不同。防止污染, 基本营养物质:三大营养物质维生素, 激素, 促细胞生长因子, 渗透压:大多数 260~320。 15. 不属于加工改造抗体的是什么? 单域抗体。 16. 第三代抗体是什么?

生物技术制药要点

生物技术制药要点概括 1.现代生物技术发展大事记： 年代主要发现和进展 1953 Watson和Crick阐明了DNA的双螺旋结构 1958 分离得到DNA聚合酶I，并在试管内制得人工DNA 1960 发现mRNA，并阐明了mRNA在蛋白质合成中的作用 1966 破译遗传密码 1967 分离得到DNA连接酶 1970 分离出第一个限制性内切酶 1971 第一次用限制性内切酶和连接酶获得重组DNA 1972 合成了完整了tRNA基因 1974 Boyer和Cohen建立了DNA重组技术 1975 Kohler和Milstein建立了单克隆抗体技术 1976 DNA测序技术诞生 1978 Genentech公司在大肠杆菌中表达出胰岛素 1981 第一个单克隆抗体诊断试剂盒在美国被批准使用 1981 第一台商业化生产DNA自动测序仪诞生 1982 用DNA重组技术生产的第一个动物疫苗在欧洲获得批准 1983 基因工程Ti质粒用于植物转化 1988 PCR（聚合酶链式反应）技术诞生 1990 美国批准第一个体细胞基因治疗方案 1997 英国培育出世界上第一只克隆羊多莉 1998 美国批准艾滋病疫苗进行人体实验 2001 人类基因组草图完成 2003 世界上第一个正式批准的基因治疗药物重组腺病毒-p53注射液在中国上市 2008 人类将表皮细胞激活为干细胞 2.生物技术药物（biopharmaceutics）:广义是是指所有以生物质为原料只去的各种生物活性物质及其人工合成类似物、以及通过现代生物技术制的的药物，狭义指利用生物体、生物组织、细胞及其成分，综合应用化学。生物学和医药学各学科原理和技术方法制得的用于预防、诊断、治疗和康复保健的制品，而这里特指采用DNA重组技术或其他现代生物技术研制的蛋白质或核算类药物。 3.生物技术药物的四大类型：基因重组药物、基因药物、天然药物、合成的半合成的生物技术药物。 4.生物技术药物的主要特点：剂量小，活性高；分子结构复杂，分子量一般较大；稳定性较差，易失活或分解，体内半衰期短；具有种属特异性；具有免疫原性；分析检验的特殊性。 5.生物技术药物与化学药物的区别：

《生物技术制药》教案

《生物技术制药》教案 生物技术制药教案 使用专业:生物技术专业 一教学方案 1. 本课程总学时 72 学时(四年制本科生)，其中理论课讲授 54 学时，实验 课 18 学时 2. 本课程注重教学的基础性、先进性和实践性，坚持不懈地进行教学研究和改革，除课堂 教学衔接了其他的相关课程，同时还建立了实验教学体系，努力培养学生分析 问题、解 决问题和科研动手能力，使学生能够适应现代生命科学对高素质人才的需要 3. 本课程采用启发式教学并以多媒体课件辅助教学，通过学生自学、课堂教学及课后辅导 相结合的教学方式开展教学 4. 本课程实践性教学详见实验教学大纲 二课程作业与考核评价 1. 作业 1.1 预习作业:每堂课后布置课后预习作业，并要求做好预习笔记，以培养学 生的自学能力 1.2 课后作业:每堂课后布置书面作业，教师批阅后并给出参考答案，供学生进一步学习思考 1.3 课堂作业:根据需要在课堂安排一定的练习，并当堂讲评，以培养学生解 决问题与分析 问题的能力 2 考核形式与成绩评定

2.1 期末考试采用闭卷考试，占总成绩的70% 2.2 平时小测与作业以书面为主，口试为辅，占总成绩的10% 2.3 实验成绩占总成绩的20% 三教材和学习参考书 1. 教材 夏焕章,熊宗贵.生物技术制药(第2版).高等教育出版社,2006 2. 学习参考书郭勇.生物制药技术(第2版).中国轻工业出版社,2007 G 沃尔什.生物制药学(原著第2版).化学工业出版社,2006 宋航.制药工程专业实验.化学工业出版社, 2005 天津大学.制药工程专业实验指导.化学工业出版社,2005 四本课程考核方式 本课程采用百分制进行考核，其中期末考试成绩占考核分的70%;平时成绩占10%，平时成绩包括课后作业、课堂提问、考勤等;实验占20%。 生物技术教案(章节备课) 学时:2 章节第一章绪论第一讲 教学目的 1. 掌握生物技术制药的基本概念和发展简史和要求 2. 熟悉生物技术的现状和发展趋势 重点重点:生物技术制药、生物技术药物的概念和特征难点难点:生物技术药物的分类、特征 第一节生物技术的发展史,1学时, 1. 生物技术的概念 2. 生物技术的发展简史 第二节生物技术药物,1学时,

生物技术制药 第二版 课后习题(全)..

1.生物技术制药分为哪些类型？ 生物技术制药分为四大类： （1）应用重组DNA技术(包括基因工程技术、蛋白质工程技术)制造的基因重组多肽，蛋白质类治疗剂。 （2）基因药物，如基因治疗剂，基因疫苗，反义药物和核酶等 （3）来自动物、植物和微生物的天然生物药物 （4）合成与部分合成的生物药物 2．生物技术制药具有什么特征？ （1）分子结构复杂 （2）具有种属特异性 （3）治疗针对性强，疗效高 （4）稳定性差 （5）基因稳定性 （6）免疫原性 （7）体内的半衰期短 （8）受体效应 （9）多效性 （10）检验的特殊性 3.生物技术制药中有哪些应用？ 应用主要有： （1）基因工程制药：包括基因工程药物品种的开发，基因工程疫苗，基因工程抗体，基因诊断与基因治疗，应用基因工程技术建立新药的筛选模型，应用基 因工程技术改良菌种，产生新的微生物药物，基因工程技术在改进药物生产 工艺中的应用，利用转基因动植物生产蛋白质类药物 （2）细胞工程制药：包括单克隆抗体，动物细胞培养，植物细胞培养生产次生代谢产物 （3）抗体工程制药 （4）酶工程制药 （5）发酵工程制药 4.基因工程药物制造的主要程序有哪些？ 基因工程药物制造的主要步骤有： ①目的基因的克隆， ②构造DNA重组体， ③构造工程菌， ④目的基因的表达， ⑤外源基因表达产物的分离纯化产品的检验 5.影响目的的基因在大肠杆菌中表达的因素有哪些？ （1）外源基因的计量 （2）外源基因的表达效率：a、启动子的强弱 b、核糖体的结合位点 c、SD序列和起始密码的间距 d、密码子组成 （3）表达产物的稳定性 （4）细胞的代谢付荷（5）工程菌的培养条件

生物技术制药 及 名词解释

生物技术制药 第一章绪论 药学一级学科分类：药物化学、药剂学、药理学、药物分析、生药学及微生物与生化药学二级学科 ★生物技术与生物技术药物的概念 生物技术药物的分类 ?按用途分类：治疗药物、预防药物、作为诊断药物(免疫诊断试剂、酶诊断试剂、器官功能诊断药物、放射性核素诊断药物、诊断用单克隆抗体(McAb)、诊断用DNA芯片) ?按作用类型分类：细胞因子类药物、激素类药物、酶与辅酶类药物、疫苗、单克隆抗体药物、反义核酸药物、RNA干扰(RNAi)药物、基因治疗药物 ?按生化特性分类：多肽类药物、蛋白质类药物、核酸类药物、聚乙二醇(PEG)化多肽或蛋白质药物 ★生物技术药物的特性 ?理化性质特性：相对分子量大、结构复杂、稳定性差 ?药理学作用特性：活性与作用机制明确、作用针对性强、毒性低、体内半衰期短、有种属特异性、可产生免疫原性 ?生产制备特性：药物分子在原料中的含量低、原料液中长存在降解目标产物的杂质、制备工艺条件温和、分离纯化困难、产品易受有害物质污染 ?质量控制特性：质量标准内容的特殊性、制造项下的特殊规定、检定项下的特殊规定(原液、半成品及成品检定等等) 第二章基因工程制药 蛋白类药物的特点：结构确证不完全性、具有种属特异性、多功能性、免疫原性 临床前安全性评价的特殊性：蛋白类药物安全性担忧的性质和来源；受试物的纯度；相关动物的选择；给药剂量的选择；免疫原性；遗传毒性和致癌性(一般不进行常规的遗传毒性实验)；药代动力学 真核细胞表达制品的安全性问题：生产细胞DNA残留的影响、生产用血清的影响 基因工程药物稳定性研究的相关问题：药物浓度、温度、湿度和水分、氧、光照、pH 基因工程药物的缺陷：生物利用度低，半衰期短；异体蛋白具有免疫原性 基因工程菌的修饰改造方法：构建突变体、构建融合蛋白、PEG修饰(降低免疫原性、增加水溶性、延长t1/2) 基因工程制药基本环节 ?上游阶段：制备目的基因→构建重组质粒→构建工程细胞 ?下游阶段：培养工程细胞→分离纯化产物→除菌→半成品、成品检定→包装 基本工具：目的基因、各种酶(切割酶、连接酶、修饰酶等)、载体、宿主细胞 ?酶切结果：5’粘性末端、3’粘性末端、平头末端 ?1U核酸内切酶的酶活性：指在最佳反应条件下反应1小时，完全水解1mg标准DNA所需的酶量?影响限制性内切酶反应的因素： ?DNA样品的纯度： ?DNA的甲基化程度：核酸限制性内切酶不能够切割甲基化的核苷酸序列。在基因克隆中要使用甲基化酶缺陷型细菌菌株制备质粒DNA。 ?酶切反应的温度 ?DNA的分子结构 ?反应缓冲液组成 ?反应时间、反应体积等

生物技术制药课后习题答案

第一章绪论 1生物技术是以生命科学为基础，利用生物体（或生物组织、细胞及其组分）的特性和功能，设计构建有预期性状的新物种或新品系，并与工程相结合，进行加工生产，为社会提供商品和服务的一个综合性的技术体系。 2生物技术的主要内容：P1 基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程 蛋白质工程：运用基因工程全套技术改变蛋白质结构的技术。 染色体工程：探索基因在染色体上的定位，异源基因导入、染色体结构改变。 生化工程：生物反应器及产品的分离、提纯技术。 3生物技术制药采用现代生物技术人为创造条件，借助微生物、植物或动物来生产所需的医药品过程被称为 4生物技术药物采用DNA重组技术或其它生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物才能被称为 5生物药物生物技术药物与天然生化药物、微生物药物、海洋药物和生物制品一起归类为PPT复习题 第二章基因工程制药 1、简述基因工程制药的基本程序。P16 2、说明基因工程技术用于制药的三个重要意义。P15第一段第一行 3、采用哪两种方法来确定目的cDNA克隆？P18（7目的基因cDNA的分离和鉴定 ）①核酸探针杂交法 用层析法或高分辨率电泳技术(蛋白质双向电泳技术或质谱技术)分离出确定为药物的蛋白质，氨基酸测序，按照密码子对应原则合成出单链寡聚核苷酸，用做探针，与cDNA文库中的每一个克隆杂交。这个方法的关键是分离目的蛋白， ②免疫反应鉴定法（酶联免疫吸附检测） 4、说明用大肠杆菌做宿主生产基因工程药物必须克服的6个困难。 ①原核基因表达产物多为胞内产物，必须破胞分离，受胞内其它蛋白的干扰，纯化困难； ②原核基因表达产物在细胞内多为不溶性(包含体, inclusion body)，必须经过变性、复性处理以恢复药物蛋白的生物学活性，工艺复杂； ③没有翻译后的加工机制，如糖基化，应用上受到限制； ④产物的第一个氨基酸必然是甲酰甲硫氨酸，因无加工机制，常造成N-Met冗余，做为药物，容易引起免疫反应； ⑤细菌的内毒素不容易清除； ⑥细菌的蛋白酶常常把外源基因的表达产物消化； 5、用蓝藻做宿主生产基因工程药物有什么优越性？ 蓝藻：很有前途的药物基因的宿主细胞 ①有内源质粒，美国Wolk实验室已构建1200种人工质粒，可用做基因载体。 ②载体转化蓝藻不需要诱发感受态就可以做到； ③外源基因产物不形成包含体，分离与纯化工艺可以大大被简化； ④可以直接食用，等于直接口服药物 6、结合pBG-2说明选择用于E. coli 细胞宿主中的载体的6项原则。 P23 与pBV220优点类似，原则P22 7、简述基因工程菌中质粒不稳定的两个指标？P32如何计算质粒的稳定性？P33质粒稳定

生物技术制药名词解释

一、名词解释：每个概念5分，共50分 1. 生物技术制药 生物技术制药是指运用微生物学、生物学、医学、生物化学等的研究成果，从生物体、生物组织、细胞、体液等，综合利用微生物学、化学、生物化学、生物技术、药学等科学的原理和方法进行药物制造的技术。 2. 基因表达 基因表达(gene expression)是指细胞在生命过程中,把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译,转变成具有生物活性的蛋白质分子.生物体内的各种功能蛋白质和酶都是同相应的结构基因编码的。 3. 质粒的分裂不稳定 通常将质粒不稳定性分为两类:一类是结构不稳定性,也就是质粒由于碱基突变、缺失、插入等引起的遗传信息变化;另一类是分离不稳定性,指在细胞分裂过程中质粒不能分配到子代细胞中,从而使部分子代细胞不带质粒(即P-细胞)。在连续和分批培养过程中均能观察到此两类现象发生。一般情况下具有质粒的细胞(即P ＋细胞)需要合成较多的DNA、RNA和蛋白质,因此其比生长速率低于P-细胞,从而P-细胞一旦形成能较快速地生长繁殖并占据培养物中的大多数。 4. 补料分批培养 发酵培养基发酵培养基是供菌种生长、繁殖和合成产物之用。它既要使种子接种后能迅速生长，达到一定的菌丝浓度，又要使长好的菌体能迅速合成需产物。因此，发酵培养基的组成除有菌体生长所必需的元素和化合物外，还要有产物所需的特定元素、前体和促进剂等。但若因生长和生物合成产物需要的总的碳源、氮源、磷源等的浓度太高，或生长和合成两阶段各需的最佳条件要求不同时，则可考虑培养基用分批补料来加以满足。 5. 人-鼠嵌合抗体 嵌合抗体（chimeric atibody ）是最早制备成功的基因工程抗体。它是由鼠源性抗体的V 区基因与人抗体的 C 区基因拼接为嵌合基因，然后插入载体，转染骨髓瘤组织表达的抗体分子。因其减少了鼠源成分，从而降低了鼠源性抗体引起的不良反应，并有助于提高疗效。 6. 悬浮培养 非贴壁依赖性细胞的一种培养方式。细胞悬浮于培养基中生长或维持。某些贴壁依赖性细胞经过适应和选择也可用此方法培养。增加悬浮培养规模相对比较简单，只要增加体积就可以子。深度超过5mm，需要搅动培养基，超过10cm，还需要深层通入CO2和空气，以保证足够的气体交换。通过振荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮于培养液内的培养方法。 7. 贴壁培养 也称为细胞贴壁，贴壁后的细胞呈单层生长，所以此法又叫单层细胞培养。大多数哺乳动物细胞的培养必须采用这种方法。 8. 固定化酶 不溶于水的酶。是用物理的或化学的方法使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在水不溶性凝胶或半透膜的微囊体中制成的。酶固定化后一般稳定性增加，易从反应系统中分离，且易于控制，能反复多次使用。便于运输和贮存，有利于自动化生产。 9. 双功能抗体 将识别效应细胞的抗体和识别靶细胞的抗体联结在一起，制成双功能性抗体，称为双特异性抗体。如由识别肿瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞（CTL 细胞、NK 细胞、LAK 细胞）表面分子的抗体（CD3 抗体或CD16 抗体）制成的双特异性抗体，有利于免疫效应细胞发挥抗肿瘤作用。 10. 组织工程 应用生命科学与工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。 11抗体：由B细胞接受刺激后分化为浆细胞产生的能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。

生物技术制药知识点总结(1)(DOC)

生物技术制药知识点纲要 生物技术制药:采用现代生物技术，借助某些微生物、植物、动物生产药品。 生物技术药物一般来说，采用DNA重组技术或其他生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物。 生物药物：生物技术药物是重组产品概念在医药领域的扩大应用，并与天然药物.微生物药物.海洋药物和生物制品一起归类为生物药物。 生物技术：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、生化工程、蛋白质工程、抗体工程等。 基因工程是生物技术的核心和关键，是主导技术； 细胞工程是生物技术的基础；酶工程是生物技术的条件； 发酵工程是生物技术获得最终产品的手段。 生物技术：从广义角度来看，是人类对生物资源（包括微生物、植物、动物）的利用、改造并为人类服务的技术。 第三代生物技术是海洋生物技术 我国科学家承担了人类基因组计划1%的测序工作 现代生物技术包括: ⑴重组DNA技术 ⑵细胞和原生质体融合技术 ⑶酶和细胞的固定化技术 ⑷植物脱毒和快速繁殖技术 ⑸动物和植物细胞的大量培养技术 ⑹动物胚胎工程技术 ⑺现代微生物发酵技术 ⑻现代生物反应工程和分离工程技术 ⑼蛋白质工程技术⑽海洋生物技术 现代生物技术的发展趋势主要体现在下列几个方面： ①基因操作技术日新月异，不断完善。 ②新技术、新方法一经产生便迅速地通过商业渠道出售专项技术，并在市场上加以应用。 ③基因工程药物和疫苗的研究和开发突发猛进。 ④新的生物治疗制剂的产业化前景十分光明，21世纪整个医药工业将面临全面的更新改造。 ⑤转基因植物和动物取得重大突破 ⑥现代生物技术在农业上的广泛应用将给农业和畜牧业生产带来新的飞跃。 ⑦阐明生物体基因组及其编码蛋白质的结构与功能是当今生命科学发展的一个主流方向， ⑧基因治疗取得重大进展，有可能革新整个疾病的预防和治疗领域。

生物技术制药课后习题..

生物技术制药课后习题 by xx Yua n 1生物技术制药分为哪些类型？ 生物技术制药分为四大类： （1）应用重组DNA技术（包括基因工程技术、蛋白质工程技术）制造的基因重组多肽, 蛋白质类治疗剂。 （2）基因药物，如基因治疗剂，基因疫苗，反义药物和核酶等 （3）来自动物、植物和微生物的天然生物药物 4）合成与部分合成的生物药物2、生物技术制药具有什么特征? （1）分子结构复杂 （2）具有种属特异性 （3）治疗针对性强，疗效高 （4）稳定性差 （5）基因稳定性 （6）免疫原性 （7）体内的半衰期短 （8）受体效应 （9）多效性 （10）检验的特殊性 3、生物技术制药中有哪些应用？ 应用主要有： （1）基因工程制药：包括基因工程药物品种的开发，基因工程疫苗，基因工程抗体，基 因诊断与基因治疗，应用基因工程技术建立新药的筛选模型，应用基因工程技术改良菌种，产生新的微生物药物，基因工程技术在改进药物生产工艺中的应用，利用转基因动植物生产 蛋白质类药物 （2）细胞工程制药：包括单克隆抗体，动物细胞培养，植物细胞培养生产次生代谢产 物 （3）酶工程制药 （4 ） 发酵工程制药 4、基因工程药物制造的主要程序有哪些？ 基因工程药物制造的主要步骤有： 目的基因的克隆，构造DNA重组体，构造工程菌，目的基因的表达，外源基因表达产物的分离纯化产品的检验 5、影响目的的基因在大肠杆菌中表达的因素有哪些? （1）外源基因的计量 （2）外源基因的表达效率： a、启动子的强弱

b、核糖体的结合位点 c、S D序列和起始密码的间距 d、密码子组成 （3）表达产物的稳定性 （4）细胞的代谢付荷 （5）工程菌的培养条件 6、质粒不稳定分为哪两类，如何解决质粒不稳定性？ 质粒不稳定分为分裂分为分裂不稳定和结构不稳定。质粒的分裂不稳定是指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒的子代菌的现象；质粒的结构不稳定是DNA从质粒上丢失或碱基重排，缺失所致工程菌性能的改变。 提高质粒稳定性的方法如下： （1）选择合适的宿主细菌 2）选择合适的载体 （3）选择压力 （4）分阶段控制培养 （5）控制培养条件 （6）固定化 7、影响基因工程菌发酵的因素有哪些？如何控制发酵的各种参数? 影响因素： (1)培养基 (2)接种量 (3)温度 (4) 溶解氧 (5) 诱导时机的影响 (6) 诱导表达程序 (7) PH值 &什么是高密度发酵？影响高密度发酵的因素有哪些？可采取哪些方法来实现高密度发酵？ 高密度发酵：是指培养液中工程菌的菌体浓度在50gDCW/L以上，理论上的最高值可达200gDCW/L 影响因素：（1）培养基（2）溶氧浓度（3）PH（4）温度（5）代谢副产物 实现高密度发酵的方法： （1）改进发酵条件：a培养基b、建立流加式培养基c、提高供养能力 （2）构建出产乙酸能力低的工程菌宿主菌：a阻断乙酸产生的主要途径b、对碳代谢流 进行分流c、限制进入糖酵解途径的碳代谢流d、引入血红蛋白基因 （3）构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌 9、分离纯化常用的色谱分离方法有哪些？它们的原理是什么？ 方法有离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色谱、凝胶过滤色谱及高压液相色谱。 （1）离子交换色谱IEC :是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换 剂

生物技术制药重点

生物技术制药（Biotechnological Pharmaceutics）是不断引进现代生物化学、分子生物学、细胞生物学、微生物学和制剂学及现代基因工程等多学科先进技术而形成与发展起来的实用制药技术。 基因工程药物的生产分为上游和下游两个阶段：①上游阶段：主要是分离目的基因、构建工程菌(细胞)。目的基因获得后，最主要的就是目的基因的表达。选择基因表达系统主要考虑的是保证表达的蛋白质的功能，其次是表达的量和分离纯化的难易。此阶段的工作主要在实验室内完成。、 ②下游阶段：从工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质量控制。此阶段是将实验室成果产业化、商品化，主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度产品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。 基因工程药物制药的主要程序：⒈目的基因的克隆⒉构建DNA重组体⒊DNA重组体转入宿主菌⒋构建工程菌⒌工程菌发酵⒍表达产物的分离纯化⒎产品的检验等 反转录法就是分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成cDNA，然后进行cDNA克隆表达。 反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）：RT-PCR是将以RNA为模板的cDNA合成同PCR 结合在一起，该法是mRNA经反转录合成cDNA第一链，在以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始协助下，PCR扩增，特异性的合成目的cDNA链（目的基因）。 化学合成法：较小的蛋白质和多肽的编码基因可以用人工化学合成法获得。合成目的基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘性末端的DNA 双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火连接成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。 基因表达：是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程 进行基因表达研究的主要问题是目的基因的表达产量、表达产物的稳定性、产物的生物学活性和表达产物的分离纯化。因此，建立最佳的基因表达体系，是基因表达设计的关键。 表达载体必须具备的条件（1）载体能够独立的复制；（2）具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记。并且克隆位点应在启动子序列后，以使克隆的外源基因得以表达；（3）具有很强的Promoter，能为大肠杆菌的RNA聚合酶所识别；（4）具有Repressor，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录；（5）具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录无关的基因。

生物技术制药 第二版 课后思考题及答案(全)

1. 生物技术制药分为哪些类型？生物技术制药分为四大类： （1）应用重组DNA技术(包括基因工程技术、蛋白质工程技术)制造的基因重组多肽， 蛋白质类治疗剂。 （2）基因药物，如基因治疗剂，基因疫苗，反义药物和核酶等（3）来自动物、植物和微生物的天然生物药物（4）合成与部分合成的生物药物 2．生物技术制药具有什么特征？ （1）分子结构复杂（2）具有种属特异性 （3）治疗针对性强，疗效高（4）稳定性差（5）基因稳定性（6）免疫原性 （7）体内的半衰期短（8）受体效应（9）多效性 （10）检验的特殊性 3.生物技术制药中有哪些应用？应用主要有： （1）基因工程制药：包括基因工程药物品种的开发，基因工程疫苗，基因工程抗体， 基因诊断与基因治疗，应用基因工程技术建立新药的筛选模型，应用基因工程技术改良菌种，产生新的微生物药物，基因工程技术在改进药物生产工艺中的应用，利用转基因动植物生产蛋白质类药物 （2）细胞工程制药：包括单克隆抗体，动物细胞培养，植物细胞培养生产次生代谢 产物 （3）酶工程制药（4）发酵工程制药 4.基因工程药物制造的主要程序有哪些？ 基因工程药物制造的主要步骤有：目的基因的克隆，构造DNA重组体，构造工程菌，目的基因的表达，外源基因表达产物的分离纯化产品的检验 5.影响目的的基因在大肠杆菌中表达的因素有哪些？ （1）外源基因的计量 （2）外源基因的表达效率：a、启动子的强弱 b、核糖体的结合位点 c、SD序列和起始密码的间距 d、密码子组成（3）表达产物的稳定性（4）细胞的代谢付荷（5）工程菌的培养条件 6.质粒不稳定分为哪两类，如何解决质粒不稳定性？ 质粒不稳定分为分裂分为分裂不稳定和结构不稳定。质粒的分裂不稳定是指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒的子代菌的现象；质粒的结构不稳定是DNA从质粒上丢失或碱基重排，缺失所致工程菌性能的改变。提高质粒稳定性的方法如下：（1）选择合适的宿主细菌2）选择合适的载体（3）选择压力 （4）分阶段控制培养（5）控制培养条件（6）固定化 7.影响基因工程菌发酵的因素有哪些？如何控制发酵的各种参数？ 影响因素：（1）培养基（2）接种量（3）温度（4）溶解氧 （5）诱导时机的影响（6）诱导表达程序（7） PH值 8.什么是高密度发酵？影响高密度发酵的因素有哪些？可采取哪些方法来实现高密度发酵？ 高密度发酵：是指培养液中工程菌的菌体浓度在50gDCW/L以上，理论上的最高值可达200gDCW/L 影响因素：（1）培养基（2）溶氧浓度（3）PH (4)温度（5）代谢副产物实现高密度发酵的方法： （1）改进发酵条件：a、培养基 b、建立流加式培养基 c、提高供养能力 （2）构建出产乙酸能力低的工程菌宿主菌：a、阻断乙酸产生的主要途径 b、对碳代谢流进行分流 c、限制进入糖酵解途径的碳代谢流 d、引入血红蛋白基因 （3）构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌

生物技术制药期末复习提纲

生物技术制药复习提纲 生物技术所含的主要技术范畴包含有哪几个工程？ 基因工程；细胞工程；酶工程；发酵工程；蛋白质核酸工程和生化工程； 基因工程菌在传代过程中的质粒不稳定的现象主要是指哪两种不稳定？ 质粒不稳定分为分裂不稳定性和结构不稳定性 基因工程菌的培养方式有哪几种？ 分批培养；补料分批培养；连续培养；透析培养和固定化培养； 从生产实际看，动物细胞的大规模培养主要可以分为哪几种？ 悬浮培养、贴壁培养和贴壁-悬浮培养。 动物细胞培养基分为哪三类？ 天然培养基合成培养基无血清培养基 植物组织和细胞培养所用培养基种类较多，但通常都含有哪几类？。 无机盐碳源植物生长调节剂有机氮源维生素 在V区中，决定抗体分子与抗原分子发生特异性结合的关键部位称为互补决定区（CDR），而 c 区则决定了Ig分子的异种抗原性。 酶固定法中的包埋法可分为哪两种？ 网格型微囊型 发酵工业的生产水平取决于哪三个要素？ 生产菌种、发酵工艺和发酵设备 生物药物广泛应用于医学各领域，按功能用途可分为哪三类？ 治疗药物、预防药物、诊断药物

基因工程药物制造的主要步骤如何？ 目的基因的获得；构建DNA重组体；构建工程菌；目的基因的表达；产物的分离纯化；产品的检验 酶和细胞的固定化载体主要有哪三类？ 吸附载体包埋载体交联载体 单克隆抗体制备时对动物的免疫方法分为哪两种？ 体内免疫法和体外免疫法 生产用动物细胞为原代细胞、二倍体细胞系、转化细胞系以及工程细胞系。 目前工业常用的酶一般是以什么为主要来源？ 微生物 发酵工程产品开发的关键是筛选到高效菌株，一般优良菌种的选育方法主要有哪几种？ 自然选育、诱变育种和原生质体融合 . 在制备大量微生物菌体或其代谢产物时，可采用不同的发酵方式。微生物的发酵方式有哪几种？ 分批发酵、补料分批发酵、连续发酵 目的基因的获得方法有哪几种？用反转录法获得目的基因，首先必须获得什么？cDNA法获得目的基因的优点是什么？将构建好载体导入动物细胞最常用的方法是什么？ 反转录法、反转录-聚合酶链反应法和化学合成法 目的基因的mRNA 获得的目的基因编码序列无内含子，目的基因的筛选较容易 磷酸钙沉淀法电穿孔法

生物技术制药课堂重点

第一章绪论 ·生物技术（biotechnology）：是指将生物用于有价值产品的生产。 ·生物技术制药（biotechnology pharmaceutics）:用现代生物技术制造药物。 是指利用基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程、蛋白质工程等生物技术，来研究、开发和生产用于预防、治疗、诊断疾病的药物。 ·生物药物（biological drug）：从生物体中制取的各种天然活性物质及其人工合成或半合成的天然物质类似物。 ·生物技术药物（biotechnological drug）:利用现代生物技术生产的蛋白质或核酸类等生物药物。·现代生物技术的主要内容 基因工程技术 细胞工程技术 酶工程技术 发酵工程技术 ·生物技术制药的主要内容 基因工程制药 细胞工程制药 酶工程制药 发酵工程制药 ·基因工程技术：是将一种生物体的基因与载体在体外进行连接，然后转入另一种生物体内，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物。·细胞工程技术：包括细胞及转基因细胞的离体培养、繁殖、再生、融合以及细胞核、细胞器（如线粒体、叶绿体等）的移植与改建等操作技术。 ·酶工程技术：在一定生物反应装置中利用酶的催化作用，将相应的原料转化成有用物质的技术。 ·发酵工程技术：培养活细胞以

取得生物体或代谢产物的技术。（抗生素、氨基酸、维生素）·生物制药：从生物材料中提取、分离、纯化药物的过程。 第二章基因工程制药 ·基因工程制药：是指利用基因工程技术生产蛋白质或多肽类药物。 ·基因工程药物制造步骤: 上游阶段：分离目的基因，构建工程菌，目的基因的表达。 下游阶段：从工程菌的大量培养到产品的分离纯化和质量控制。 ·分离纯化的步骤：细胞分离- 细胞破碎-固液分离-浓缩与初步分离-高度纯化直至得到纯品-成品加工 ·基因重组蛋白的主要分离技术：分离、沉淀（等电点沉淀法、盐析法） 、膜分离、双水相萃取。·基因重组蛋白的主要纯化技术: 1.离子交换层析 2.亲和层析 3.凝胶过滤层析(分子量大 的先洗脱下来） 4.反相色谱和疏水色谱 ·亲和层析的主要步骤： a.配体固定化 b.亲和吸附阶段 c.洗涤阶段 d.洗脱解离阶段 e.再生阶段 ·凝胶过滤法的用途： 脱盐、分级分离、分子量的测定 ·反相色谱和疏水色谱：根据蛋白质疏水性的差异来实现分离纯化的。 ·基因工程药物的改造的目的：提高疗效降低毒副作用。 ·基因定点突变技术