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基因工程复习重点

绪论

1.理论上的三大发现：

（1）1944年，美国微生物学家Avery证明基因就是DNA分子，提出DNA是遗传信息的载体。（2）1953年，美国科学家Watson 和英国科学家Crick提出DNA Double Helix model。1958年，Meselson 和Stahl证明DNA半保留复制。（3）1968年，Nirenberg、Holley和Khorana解读了遗传密码及其在蛋白质合成方面的技能而分享诺贝尔生理医学奖。

2.技术上的三大发现:

（1）限制性核酸内切酶的发现（1962年Arber ）

（2）DNA连接酶的发现（1967Gellert）

（3）基因工程载体的发现

3.基因工程研究的内容：

(1)从生物有机体复杂的基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。

(2)在体外，将带有目的基因的DNA片段连接到能够自我复制并具有选择标记的载体分子上，形成重组DNA分子。

(3)将重组DNA分子引入到受体细胞(亦称宿主细胞或寄主细胞)。

(4)带有重组体的细胞扩增，获得大量的细胞繁殖群体(菌落)。

(5)从大量的细胞繁殖菌落中，筛选出具有重组DNA分子的细胞克隆。

(6)将选出的细胞克隆的目的基因进行进一步研究分析；

(7)将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。

第二章基因克隆所需的工具酶

一、限制性内切酶

1．限制性核酸内切酶:是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。

限制作用：是指一定类型的细菌可以通过限制性酶的作用，破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制

修饰作用：生物细胞(如宿主)自身的DNA分子合成后，通过修饰酶的作用：在碱基中特定的位置上发生了甲基化而得到了修饰，可免遭自身限制性酶的破坏。

2．核酸内切限制酶的类型：I型、II型、III型

3．核酸内切限制酶的命名法由H．O．Smith和D．Nathans(1973)提议的命名系统

4.Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性：

a. 在DNA分子双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子产生链的断裂；

b. 2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的；

c.??? 因此，断裂的结果形成的DNA片段，也往往具有互补的单链延伸末端。

一、识别位点：绝大多数的II型核酸内切限制酶，都能够识别由4～8个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。我们称这样的序列为核酸内切限制酶的识别序列。切割位点都具有相同的双重旋转对称的结构形式（回文结构）。

二、切割类型：

（1）两条链上的断裂位置是交错地、但又是对称地围绕着一个对称轴排列，这种形式的断裂结果形成具有粘性末端的DNA片段；（2）两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心，这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片段。

三、产生的末端特征：

1、粘性末端：是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。（平末端的DNA片段则不易于重新环化。）

2、同裂酶：有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶序列，这类酶特称为同裂酶。

3、同尾酶：与同裂酶对应的一类限制性内切酶,它们虽然来源不同，识别的靶序列也各不相同,但都能产生相同的粘性末端,特称为同尾酶。

4、由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点，特称之为“杂种位点”。

四．影响核酸内切限制酶活性的因素：

(1) DNA的纯度。

提高核酸内切酶对低纯度DNA的反应效率，一般采用如下三种方法：

①增加核酸内切限制酶的用量，平均每微克底物DNA可高达10单位甚至更多些。

②扩大酶催化反应的体积，以使潜在的抑制因素被相应地稀释。

③延长酶催化反应的保温时间。

(2) DNA的甲基化程度：核酸内切限制酶是原核生物限制—修饰体系的组成部分，因此识别序列中特定核苷酸的甲基化作用，便会强烈地影响酶的活性。为避免产生这样的问题，在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大肠杆菌菌株制备质粒DNA。

(3) 酶切消化反应的温度：大多数核酸内切限制酶的标准反应温度都是37℃。消化反应的温度低于或高于最适温度，都会影响核酸内切限制酶的活性，甚至最终导致完全失活。

(4) DNA的分子结构

(5) 核酸内切限制酶的缓冲液：核酸内切酶的标准缓冲液的组份包括：氯化镁、氯化纳或氯化钾、Tris-HCl,?-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白（BSA）等。酶活性的正常发挥，是绝对地需要二价的阳离子，通常是Mg2+。pH=7．4时，最佳

1、星号活性：EcoRI限制酶的这种特殊的识别能力，通常叫做星号活性，以EcoRI*表示。

二．DNA连接酶

1、种类：

①、T4噬菌体DNA连接酶：可连接1，两个带有互补粘性末端的双链DNA分子

2，两个带有平末端的DNA双链DNA分子

3，一条链带有切口的DNA分子

4，RNA：DNA杂合体中RNA链上的切口，也可将RNA末端与DNA链连，底物广泛。

②、大肠杆菌DNA连接酶

1.底物是一条链带有切口的双链DNA分子

2.具有同源互补粘性末端的不同DNA片段

3.几乎不能催化两个平末端的不同DNA片段

4.底物要求严格，假阳性背景底

4、携带特殊的遗传标记

6、受体细胞应具备的条件：限制性缺陷型、重组整合缺陷型、具有较高的转化效率、具有与载体选择标记互补的表型、感染寄生缺陷型

三、DNA聚合酶

1、DNA聚合酶I是一个多功能酶，它包括三种不同的酶活力：

(1) 5’---->3，聚合酶活性：催化单核苷酸结合到DNA模板的3，一OH末端，以ssDNA作模板，沿引物的3，一OH方向按模板顺序从5，一3’延伸。

(2) 5，----> 3，外切酶活性：E．co1i DNA 聚合酶1也能从游离的5，末端降解dsDNA成为单核苷酸。

(3) 3，----> 5，外切酶活性：DNA聚合酶I还能从游离的3，OH末端降解dsDNA或ssDNA成为单核苷酸。

缺口转移：指在DNA分子的单链缺口上，DNA聚合酶I的5’--->3，核酸外切酶活性和聚合作用可以同时发生。当外切酶活性从缺口的5，一侧移去一个核苷酸之后，聚合作用就会在缺口的3，一侧补上一个新的核苷酸。但由于PolI不能够在3，—OH和5，—P之间形成一个键，因此随着反应的进行，5，一侧的核苷酸不断地被移去，3，一侧的核苷酸又按序地增补，于是缺口便沿着DNA分子按合成的方向移动。这种移动特称为缺口转移。

2 ．Klenow片段

Klenow聚合酶的主要用途：标记DNA末端。

１）修补经限制酶消化的DNA所形成的3隐蔽末端；

２）标记DNA片段的末端；

3. T4DNA聚合酶

T4DNA聚合酶，是从T4噬菌体感染的大肠杆菌培养物中纯化出来的一种特殊的DNA聚合酶。具有两种酶催活性，即5，--->3，的聚合酶活性和3，--->5，的核酸外切酶活性。

4.TaqDNA 聚合酶

从极度嗜热菌提出。具有5’3’聚合酶活性和3’5’外切酶活性。主要用于PCR扩增。

四、逆转录酶

1、又称RNA依赖的DNA聚合酶。这是一种有效的转录RNA成为DNA的酶。产物DNA又称cDNA

2、逆转录酶的主要用途是转录mRNA成为cDNA制备基因片段。另外，它也可用ssDNA或RNA做模板制作制备，杂交探针。

3、逆转录酶的酶活性：

(1) RNA依赖的DNA聚合酶以RNA链为模板，以带3，一OH末端的DNA片段为引物，沿5，--->3，方向合成DNA链。

(2) DNA依赖的DNA聚合酶以ssDNA为模板，以带有3’一OH末端的DNA片段为引物，从5’--->3’方向合成DNA链。

(3)外切RNA酶活性底物是RNA—DNA杂交分子中的RNA链，有两种活性形式。从RNA链5’末端外切的称5’--->3’外切RNA酶，从RNA链3’末端外切的称3，--->5，外切RNA酶H。

第三章基因克隆载体

1、载体：指携带外源基因进入受体细胞的这种工具。（载体的本质是DNA）

2、基因工程中所用的载体：(1)?? 质粒(Plasmid)，主要指人工构建的质粒。(2)噬菌体且的衍生物。(3)cosmid(柯斯质粒)。(4)单链DNA 噬菌体M13。（5）动物病毒。

3、作为基因工程用的载体，以下三方面是它们共有的特性和基本要求：

(1)在宿主细胞中能独立自主的复制，即本身是复制子。

(2)容易从宿主细胞中分离纯化。

(3)载体DNA分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域，插在其中的外源基因可以象载体的正常组分一样进行复制和扩增。

一、质粒载体

1、质粒：是染色体以外能自主复制的双链闭合环状DNA分子，它广泛存在于细菌细胞中。在霉菌、蓝藻、酵母和不少动植物细胞中也发现有质粒存在。

2、F质粒：又叫F因子或性质粒(sex plasmid)。F因子是雄性决定因子，所以F+细胞又叫雄性细胞，与此相应的F—细胞则叫做雌性细胞。

3、R质粒：也称抗药性因子。R质粒编码一种或数种抗菌素抗性基因，此种抗性通常能转移到缺乏该质粒的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力

4、Col质粒：此类质粒编码有控制大肠杆菌素合成的基因，即所谓产生大肠杆菌素因子。大肠杆菌素是一种毒性蛋白，它可以使不带Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死。

5、在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能在同一宿主细胞中稳定地共存，这一现象称为质粒的不亲和性，也称不相容性。

6、质粒载体的基本条件

(1) 能自主复制，即本身是复制子

(2) 具有一种或多种限制酶的单一切割位点，并在此位点中插入外源基因片段，不影响本身的复制功能；

(3) 在基因组中有1—2个筛选标记，为寄主细胞提供易于检测的表型特征。

(4) 分子量要小，多拷贝，易于操作。

7、载体的功能：运送外源基因高效转入受体细胞、为外源基因提供复制能力或整合能力、为外源基因的扩增或表达提供必要的条件

8、载体应具备的条件（共有特性）：(1) 在宿主细胞中能独立和稳定的自我复制，即本身是复制子。(2) 具有合适的限制性内切酶位点。

(3) 具有合适的选择标记基因，来筛选重组体DNA

9、质粒：是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。（质粒常见于原核细菌和真菌中，绝大多数的质粒是DNA型的）

绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，

质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制，

10、根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为：严紧型松弛型复制控制的质粒、松弛型复制控制的质粒

11、质粒的基本特性：1、质粒的自主复制性2、质粒的不相容性3、质粒的可转移性

12、革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：接合型质粒（能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞《结合作用》）、非接合型质粒（不能在天然条件下独立地发生接合作用）

13、实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA：1、氯化铯密度梯度离心法2、沸水浴法3、碱溶法

14、按照基因组的结构，可将动植物病毒分成四大类：单链DNA病毒、双链DNA病毒、单链RNA病毒、双链RNA病毒

15、考斯质粒：是一类人工构建的含有l-DNA cos序列和质粒复制子的特殊类型的载体。

16、考斯质粒载体的特点：

*能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞

*能像质粒那样在受体细胞中自主复制

*重组操作简便，筛选容易

*装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范围

*不能体内包装，不裂解受体细胞

二、各种基因工程受体

1、大肠杆菌载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳定产结构复杂、种类繁多的内毒素，适用于外源DNA的扩增和

克隆、原核生物基因的高效表达、基因文库的构建，是DNA重组实验和基因工程的主要受体菌。

2、枯草杆菌蛋白质分泌机制健全，生长迅速，培养简单，不产内毒素遗传欠稳定，载体受体系统欠完备，适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌。

3、酵母菌具有真核生物的特征，，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定内源性蛋白产物种类繁多且含量高，适用于外源DNA的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是DNA重组实验和基因工程重要的真核性受体菌。

4、昆虫细胞（家蚕）具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较快，培养成本低廉，遗传稳定DNA重组操作系统欠完善，适用于真核生物基因的高效表达

5、哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞CHO）与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，具有合适的糖基化修饰系统细胞培养条件苛刻，生长缓慢，适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生产，是DNA重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体

6、植物细胞（拟南芥、烟草）农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细胞培养简单且成本低廉，具有光合作用遗传操作繁琐，适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的生产，农作物品质的改良

三、实验室常用的基因工程受体

1、大肠杆菌：用于接受质粒：C600、W3110、HB101、JM83、JM101（Aps、Tcs、Cms）用于接受l-DNA：LE39

2、ED8654

2、酵母菌毕赤酵母、啤酒酵母

3、哺乳动物细胞CHO

第四章目的基因的分离克隆

一、目的基因的获取：化学合成法、cDNA文库、基因组DNA文库、聚合酶链式反应

二、基因克隆，主要包括以下几个过程：

1.DNA片段的分离、纯化，即目的基因的制备；

2.外源DNA片段与载体DNA分子的体外连接；

3.人工构建的重组体向寄主细胞内的转移；

4.重组克隆的筛选和鉴定。

三、化学法合成目的基因适用于已知核苷酸序列的、分子量较小的目的基因的制备

1、聚合酶链式反应（PCR)：是利用单链寡核苷酸引物对特异DNA片段进行体外快速扩增的一种方法。

2、PCR基本技术的三步：

（1）变性：即双链DNA在94℃下通过热变性使其双链间氢键断裂而解离成单链。

（2）退火：即当变性温度突然降至引物Tm值以下时，引物与模板DNA互补序列杂交。

（3）延伸：即在DNA聚合酶、4种脱氧核糖核苷酸、底物及Mg2+存在的条件下，DNA聚合酶依赖其5，→3，的聚合酶活力，以引物为起始，互补的DNA链为模板，使引物序列得以延伸，形成模板DNA的互补链。

PCR产物的大小则取决于两引物退火位点5’端之间的距离。

3、PCR反应体系：（1）DNA模板（2）引物(3)．脱氧核苷三磷酸(4). 耐热性聚合酶

4、设计引物时应注意以下几个因素：

（1）应选择在进化过程中可能保守的区域及不被内含子间隔的区域(如进行目的基因的cDNA克隆时)；

（2）应选择密码子简并少的氨基酸序列，如选择只有一个密码子的色氨酸而非6个密码子的丝氨酸；

5、PCR反应条件的选择：（1）变性（2）退火（3）延伸

为满足实验的需要所采用的PCR条件是：94℃初变性5 min，94℃30 s、55℃30 s、72℃1 min，25—30个循环，72C保温10min 后，4℃下停止反应。

6、在PCR反应中由于反应体系或条件的不适常会出现两种极端的现象，一种是非特异性扩增严重，产生许多不确定的产物甚至无目的条带；另一种是扩增不到任何产物。这时需要通过改变模板浓度、引物用量、dNTP浓度、Mg2+浓度、缓冲液pH值等加以优化。其中尤以Mg2+浓度最为重要，其直接影响着引物退火的特异性、产物特异性以及酶的催化能力和准确性，Mg2+的最佳有效浓度为1．5mmol／L，但也随模板和引物的不同而有所改变，可从0．5 mmol／L到10 mmol／L。在Tm值允许的范围内，适当提高反应的退火温度可使PCR产物的特异性增强。

四、PCR技术在基因克隆方面的应用

（1）目的基因的直接克隆，（2）通过RT-PCR进行cDNA的克隆；（3）制备DNA探针，进行分子检测等。

利用PCR技术，只需增加一步逆转录反应，便可从少数的mRNA构建cDNA文库。以mRNA为模板，以oligo(dT)为引物，在依赖于RNA的DNA聚合酶催化下体外合成cDNA第一链之后，可通过PCR扩增此链。

1、RT-PCR：是指以mRNA在反转录酶作用下合成的cDNA第一链为模板的PCR。

2、目前常用的反转录酶主要有两种：一种是来源于禽成髓细胞性白血病病毒的AMV反转录酶，另一类是来源于莫洛尼鼠白血病病毒的MMLV反转录酶。

3、cDNA末端的快速克隆(RACE技术)：是一种通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，是以mRNA为模板反转录成cDNA第一链后用PCR技术扩增出某个特异位点到3，或5，端之间未知序列的方法。

4、RACE原理：

①利用特异性引物对mRNA进行反转录形成cDNA第一链；

②以RNaseH分解掉cDNA—RNA杂交体中RNA；

③在T4RNA连接酶的作用下将单链cDNA环化或首尾相连物；

④用两对基因特异性引物：A1、S1及A2、S2分别进行二次PCR扩增得到所需目的片段

5、反向PCR：PCR通常用于扩增位于两寡核苷酸引物之间的DNA区段，但是经特殊设计的PCR也可用来扩增那些位于已知序列外侧的序列，这就是反向PCR

6、2. PCR操作步骤：（1）反应体系的准备(20ul体积) (2) PCR程序（3）电泳检测

五、基因文库技术分离目的基因

1、文库：是指一种全体的集合。

2、基因文库：则是指某一种生物类型全部基因的集合。这种集合是以重组体形式出现。

全部DNA片段克隆的集合体即为该生物的基因文库

3、基因文库构建包括以下基本程序：①DNA提取及片段化，或是cDNA的合成。②载体的选择及制备。③DNA片段或cDNA与载体连接。④重组体转化宿主细胞。⑤转化细胞的筛选。

4、基因文库的类别：基因组文库和cDNA文库。

5、基因组文库：是指将某生物的全部基因组DNA切割成一定长度的DNA片段克隆到某种载体上而形成的集合。

6、cDNA文库：是指某生物某一发育时期所转录的mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。

7、基因组文库与cDNA文库的区别在于cDNA文库是有时效性的。

8、从基因文库的功能上看可分为克隆文库及表达文库。

9、克隆文库：由克隆载体构建。载体中具复制子、多克隆位点及选择标记，可通过细菌培养使克隆片断大量增殖。

10、表达文库是用表达载体构建。载体中除上述元件外，还具有控制基因表达的序列(如启动子、SD序列、ATG、终止子等)，可在宿主细胞中表达出克隆片段的编码产物。

11、表达载体又有融合蛋白表达载体及天然蛋白表达载体之分。

12、人工染色体载体是利用真核生物染色体或原核生物基因组的功能元件构建的能克隆大于50kbDNA片段的人工载体。

13、核基因组文库构建主要使用λ噬菌体载体或粘粒载体。

14、随机文库指代表基因组各部分DNA的摩尔数相等的文库。对于随机文库:

N = ln(1-P) ；ln（1-x/y）

N：克隆数目P：设定的概率值(如：0．99，表示在片段随机分布时，从文库中找到任一序列的概率不低于0．99) x：插入片段平均大小(15～20kb) y：基因组的大小(以kb计)

15、应用于cDNA文库构建可产生以下效果：

①能够从极其有限的起始材料中构建cDNA文库

②可以以总RNA为模板合成cDNA，无需mRNA的纯化，不仅简化操作，而且避免了低丰度信息分子的丢失。

③能够提高cDNA文库的完整性，获得那些低水平表达的基因的cDNA克隆。

16、常见人工染色体：酵母人工染色体、细菌人工染色体、P1噬菌体及其衍生人工染色体、可转化人工染色体、哺乳动物人工染色体、人类人工染色体、植物人工染色体、

17、线状染色体自我复制、分离和传递至少依赖于染色体上3个关键序列：

(1) 自主复制DNA序列(，ARS) ARS的生物功能是确保染色体在细胞周期中能够自我复制，维持染色体在细胞世代传递中的连续性。

(2) 着丝粒DNA序列(CEN) 着丝粒确保复制了的染色体能够平均分配到子细胞中。

(3) 端粒DNA序列(TEL) 端粒的功能是与端粒酶结合，完成染色体末端复制。

18、mRNA差别显示技术是对组织特异性表达基因进行分离的一种快速并行之有效的方法之一。mRNA差别显示技术也称为差示反转录PCR，简称为DDRT-PCR。它是将mRNA反转录技术与PCR技术相互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术。

19、共有12种oligo(dT)12MN引物，用这12种引物分别对同一总RNA样品进行cDNA合成，即进行12次不同的反转录反应，每一种3，端锚定引物，都能够把总mRNA群体的1／12分子反转录成mRNA-cDNA杂交分子。这样可以将整个mRNA群体在cDNA水平上，分成大致相等但序列结构不同的12份亚群体。这一过程叫做差异显示反转录，即DDRT。还需要另外一种由10个核苷酸组成的5’端随机引物。这种5，随机引物可以同特定细胞类型的总mRNA群体中的一部分分子发生杂交作用，而且杂交部位是随机地分布在距每条新合成的cDNA链3，端的不同位置上。

20、mRNA差别显示技术的优点：简便性、灵敏度高、可重复性较好

第五章、重组体的构建、转化及鉴定

一、质粒DNA的分离纯化

1.细菌培养物的生长

2.细菌的收集和裂解：

a.离心收集菌体

b.将沉淀溶于蔗糖-Tris-EDTA缓冲液，震荡。裂解细胞方法很多，共同步骤加溶菌酶和EDTA，破坏胞壁和膜。

c.加入SDS一类去污剂溶解球形，温和溶菌。

d.离心，使质粒DNA分子与细胞碎片分开。

e.大质粒和小质粒

3.质粒DNA的分离与纯化

a.离心后得到含质粒DNA上清液，用异丙醇沉淀得到粗品。

b.纯化的方法（1）聚乙二醇（2）氯化铯密度梯度离心

4、氯化铯密度梯度离心法：用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁，加CsCl和溴化乙锭，超速离心过夜，在紫外灯下吸取cccDNA，稀释沉淀cccDNA

5、沸水浴法：用含有EDTA和Triton X-100的缓冲液悬浮菌体，加溶菌酶裂解细菌细胞壁

，沸水浴40秒钟，离心，用无菌牙签挑去沉淀物，乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA

6、外源DNA片段同载体分子连接的方法，即DNA分子体外重组技术，主要是依赖于核酸内切限制酶和DNA连接酶的作用

7、在选择外源DNA同载体分子连接反应程序时，需要考虑到下列三个因素：（1）实验步骤要尽可能地简单易行，(2) 连接形成的“接点”序列，应能被一定的核酸内切限制酶重新切割，以便回收插入的外源DNA片段，(3) 对转录和转译过程中密码结构的阅读不发生干扰。

8、将外源重组体分子导入受体细胞的途径，包括转化、转染、显微注射和电穿孔等多种不同的方式。转染和转化主要适用于细菌一类的原核细胞和酵母这样的低等真核细胞，而显微注射和电穿孔则主要应用于高等动植物的真核细胞。

9、转化：严格地说是指感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达质粒载体DNA分子的生命过程。

10、转染：则是专指感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达噬菌体DNA分子的生命过程。

11、常用5种方法来鉴定含重组质粒的细菌菌落：

1.PCR﹑DNA测序鉴定。

2. 小规模制备质粒DNA进行限制酶切分析。

3. a—互补。

4. 抗性的插入失活。

5. 杂交筛选。

12、核酸分子杂交技术：带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。

13、如果彼此退火的核酸来自不同的生物有机体，那么如此形成的双链分子就叫做杂种核酸分子。能够杂交形成杂种分子的不同来源的DNA分子，其亲缘关系较为密切；反之，其亲缘关系则比较疏远。

14、DNA／DNA的杂交作用，可以用来检测特定生物有机体之间是否存在着亲缘关系。

15、杂交筛选的两个不同的步骤：

第一，将核酸样品转移到固体支持物滤膜上，这个过程称为核酸印迹转移，主要的有电泳凝胶核酸印迹法。第二，是将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。

16、印迹杂交：使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段称之为印记杂交技术。

17、northern RNA吸印杂交技术：将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其它化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。

18、Western蛋白质杂交技术：将蛋白质从电泳凝胶中转移并结合到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射同位素125I标记的特定蛋白质之抗体进行反应。

第六章克隆基因的表达

1、原核生物基因表达的特点：

①原核生物只有一种RNA聚合酶识别原核细胞的启动子，催化所有RNA的合成。

②原核生物的表达是以操纵子为单位的。

③由于原核生物无核膜，所以转录与翻译是偶联的，也是连续进行的。

④原核基因一般不含有内含子(intron)，在原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。

⑤原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对基因产物的直接控制要慢。

⑥在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，含有一个翻译起始密码子及同16S核糖体RNA 3’末端碱基互补的序列，即SD序列，而真核基因则缺乏此序列。

2、调控区主要分为三个部分：操纵子、启动子及其他有调控功能的部位。

3、RNA合成的控制有两种方式，一是起始控制(启动子控制)，二是终止控制(衰减子控制)。

4、将外源基因在原核细胞中表达，必须满足以下条件：

①通过表达载体将外源基因导人宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白；

②外源基因不能带有间隔顺序(内含子)，因而必须用cDNA或全化学合成基因，而不能用基因组DNA；

③必须利用原核细胞的强启动子和S-D序列等调控元件控制外源基因的表达；

④外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框架；

⑤利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。

5、基因表达的调控序列主要涉及启动子、S-D序列、终止子、衰减子等序列。

6、启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列，没有启动子，基因就不能转录。

7、启动子有两个保守区：（1）Pribnow盒（TATA盒或—10区）（2）—35区

8、通常使用的可调控的强启动子有lac (乳糖启动子)、trp (色氨酸启动子)、PL和PR(λ噬菌体的左向和右向启动子)以及tac（乳糖和色氨酸的杂合启动子)等。

9、S-D序列与起始密码子之间的距离，是影响mRNA转译成蛋白质的主要因素之一。

10、终止子：在一个基因的3’端或是一个操纵子的3’端往往还有一特定的核苷酸序列，它有终止转录的功能，这一DNA序列称为转录终止子

11、衰减子：是指在某些前导序列中带有控制蛋白质合成速率的调节区。

12、前导序列：指位于编码区之前的不转译的mRNA区段。

13、在原核细胞中表达外源基因时，可产生融合型和非融合型两种表达蛋白。

14、非融合蛋白：不与细菌的任何蛋白或多肽融合在一起的表达蛋白。

15、融合蛋白：是指蛋白质的N末端由原核DNA序列或其他DNA序列编码，C端由真核DNA的完整序列编码。

16、影响克隆基因的表达效率的因素：启动子的强度、DNA转录起始序列、密码子的选择、mRNA分子的二级结构、转录的终止、质粒的拷贝数以及质粒的稳定性和寄主细胞的生理特征等

17、提高翻译水平常用的途径：

(1) 调整S-D序列与AUG间的距离S-D序列距AUG为7个核苷酸时最合适

(2) 用点突变的方法改变某些碱基

(3) 增加mRNA的稳定性

18、减轻细胞的代谢负荷常用的方法有：

（1）诱导表达使细菌的生长与外源基因的表达分开。（一般采用温度诱导或药物诱导）

(2) 表达载体的诱导复制

19、提高表达蛋白的稳定性，防止其降解的方法：(1) 克隆一段原核序列，表达融合蛋白

(2) 采用某种突变菌株(3) 表达分泌蛋白

20、蛋白质能够在大肠杆菌中进行分泌，至少要具备3个要素：

①有一段信号肽；

②在成熟蛋白质内有适当的与分泌相关的氨基酸序列；

③细胞内有相应的转运机制。

二、外源基因在真核细胞中的表达

1、根据质粒和复制方式不同，把它们分为整合型(YIp)、复制型(YRp)、附加体型(YEp)

2、以上3种类型载体的共同特点是：①能在大肠杆菌中克隆②含有在酵母细胞中便于选择的遗传标记③含有合适的限制酶切割位点，以便外源基因的插入。

3、穿梭载体：可以在两种截然不同的生物细胞中复制的载体。

4、Ti质粒存在于能够引起植物形成冠瘿瘤的土壤农癌杆菌中。这种肿瘤的形成是由Ti质粒决定的，故称为诱导肿瘤的质粒，简称Ti 质粒。

5、外源基因导入真核细胞的方法：

(1) 利用酵母的原生质球进行转化(2) 利用Li+盐进行转化

6、植物细胞的转化及其他基因转移方法：(1) 叶盘法（双子叶植物基因导人的主要手段）

(2)电击法（以原生质粒为受体细胞）(3) 基因枪法

7、哺乳动物细胞基因导入方法：（1）磷酸钙沉淀法(2) 脂质体载体法(3) 显微注射法

(4) DEAE葡聚糖转染技术

8、DEAE-dextran转染主要有两种不同的方法。

第一是先使DNA直接同DEAE-dextran混合，形成DNA/DEAE-dextran复合物后，再用来处理细胞；第二是受体细胞先用DEAE-dextran 溶液预处理，然后再用来与转染的DNA接触。

9、重组体克隆检测法，包括使用特异性探针的核酸杂交法、免疫化学法、遗传检测法和物理检测法等。

一、遗传检测法：

1．根据载体表型特征选择重组体分子的直接选择法：

(1) 抗药性标记插入失活选择法(2) β—半乳糖苷酶显色反应选择法

2．根据插入序列的表型特征选择重组体分子的直接选择法

原理是，转化进来的外源DNA编码的基因，能够对大肠杆菌寄主菌株所具有的突变发生体内抑制或互补效应从而使被转化的寄主细胞表现出外源基因编码的表型特征。

二、物理检测法：凝胶电泳检测法和R—环检测法两种。

三、核酸杂交筛选法：1．原位杂交 2. Southern印迹杂交 3. Northern杂交

四、免疫化学检测法：1、放射性抗体测定法2、免疫沉淀测定法

五、DNA—蛋白质筛选法：是专门设计用来检测同DNA特异性结合的蛋白质因子的一种方法。现在这种方法已成功地用于筛选并分离表达融合蛋白质的克隆。

第七章重组体的筛选与检测

1、重组体的筛选与检测的方法：

遗传学检测法、物理检测法、核酸杂交筛选法、免疫化学检测法、DNA-蛋白筛选法

2、遗传学检测法分为：抗药性筛选法、营养缺陷型筛选法、显色筛选法、

3、物理检测法：限制性酶切图谱法

4、核酸杂交筛选法：菌落噬菌斑原位杂交法

5、外源基因产物检测：蛋白质生物功能测定法

6、免疫化学筛选法：放射性抗体检测法（标记放射性元素）、免疫沉淀检测法（抗原与抗体高度专一结合结合）、Western 印迹分析法

7、DNA-蛋白质筛选法：蛋白质生物功能测定法、蛋白质生物结构鉴定法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法

第八章、RACE法分离目的基因

一、RACE即cDNA 末端的快速克隆，是由80年代方法是以mRNA为模板反转录成cDNA第一链后，用PCR技术得到从基因内部某个特定位点到到3'或5' 端之间未知序列的方法。

二、基本原理

1、3'-RACE 特异性引物设计：GSP1 、GSP2

2、5'-RACE

3、5'和3 '序列的电子合并去掉5 '和3 '重复序列，把5 '和3 '序列进行合并。

4、SMART RACE

SMART技术是利用PowerScript反转录酶的末端转移酶活性，当反转录到mRNA的5'末端时，会自动在新合成的第一链cDNA末端加上3-5个“C”碱基，SMART Oligo的3'端具有几个“G”碱基与之互补配对，从而得到一个反转录的延伸模板，接下来反转录酶以SMART Oligo作为新的模板，继续cDNA合成至SMART Oligo的末端。得到的单链cDNA具有完整的模板RNA的5’末端，同时还具有一段与SMART Oligo序列互补的SMART接头。SMART接头与GSP分别作为PCR引物，通过PCR合成大量的双链cDNA。

4、优点：

A.操作简便:相当于普通的RT-PCR. 两步即可完成不需要额外的cDNA抽提纯化或者沉淀，或者额外的酶反应.

B.大大提高了获得全长cDNA的几率:逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA，在到达mRNA的5'末端时碰到真核mRNA特有的“帽子结构”，即甲基化的G时会连续在合成的cDNA末端加上几个C ,由于有5 '帽子结构的mRNA才能利用这个反应得到能扩增的cDNA，因此扩增得到的cDNA就是全长cDNA。

C.可以从非常少量的样品中得到大量的高质量的cDNA ,只需要少至25ng 的mRNA或者50ng的总RNA就可以得到高质量、高产量的cDNA.产物可以应用于直接扩增基因、构建cDNA文库、已知序列扩全长cDNA（RACE)，和用于芯片检测的cDNA探针的扩增等.

5.环化5'RACE法（TaKaRa公司试剂盒）

二.方法

1.RNA的提取

高质量的RNA是实验成功的保证。电泳检测和保存时注意事项。

2.反应体系

反转录、两轮PCR反应体系按试剂盒说明书进行即可。第一轮PCR产物一般经稀释后作为第二轮PCR反应的模板。

3.电泳回收、连接测序

有多条带产生，回收时在合理的范围内尽量全部回收。

生物选修3专题1 基因工程知识点复习学案

专题1 基因工程基因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过________________________，赋予生物以 _____________________，创造出______________________________________。基因工程是在____________上进行设计和施工的，又叫做__________________。 1. （1 （2 （3 2. (1)两种DNA ②区别：E· (2)与DNA 酸二酯键。 3. （1 （2 _____________________的双链___________DNA （3）其它载体： _________________________________ (二)基因工程的基本操作程序第一步：__________________________ 1.目的基因是指： ______________________________________________________ 。 2.目的基因可采取_______________-获得，也可以用_____________________。人工合成目的基因的常用方法有________________和_________________。 3.PCR技术扩增目的基因（1）原理：_____________________ 将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是________________，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是 _______________。此方法的受体细胞多是 ____________。将目的基因导入微生物细胞：★原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，最常用的原核细胞是 ____________，其转化方法是：先用 ________处理细

扬州大学基因工程期末试题复习要点整理

基因工程期末试题复习要点整理基因工程是70年代出现的一门科学，是生物学最具生命力和最引人注目的前沿科学之一，是现代生物技术的代表，是生命科学类专业中的一门重要的专业课。本课程主要介绍基因工程概述、重组DNA基本技术及原理、基因克隆、基因的分离及鉴定、基因工程的表达系统、基因工程的应用等。通过本课程的学习，使学生掌握基因工程技术的基本原理和了解该技术在动物、植物和微生物等方面的应用，为今后从事生物学教学、生物技术研究和产品开发，或进一步的研究生学习科研打下坚实的理论及专业基础。扬州大学试题纸一、名词解释：共10题，每题2分，共20分。 1. 基因: 是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。 2. 定位克隆: 获取基因在染色体上的位置信息，然后采用各种方法对该基因进行定位和克隆 3. 融合基因: 是指应用DNA体外重组技术构建的一类具有来自两个或两个以上的不同基因核苷酸序列的新型基因。 4. 转化子: 导入外源DNA后获得了新遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞，又称重组体。 5. 人工接头：是人工合成的具有一个或数个特定限制性内切酶识别和切割序列的双股平端DNA短序列。 6. RT-PCR: 是指以mRNA在反转录酶作用下合成cDNA第一链为模板进行的PCR。 7. ORF : 起始于AUG、止于UAA、UGA、UAG的连续的密码子区域，是潜在的编码区。 8. MCS: 指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制核酸内切酶的酶切位点的DNA片段。 9. gene targeting : 基因工程中利用活细胞染色体DNA可与外源DNA的同源性DNA序列发生重组的性质，来进行定点修饰改造染色体上某一目的基因的技术 10. 5’RACE: 是一种通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，是以mRNA为模板反转录成cDNA第一链后用PCR技术扩增出某个特异位点到5’端之间未知序列的方法。四、简答题：共4题，共20分。 1．简述获得目的基因常用的几种方法。（5分）

基因工程简答题总结

基因工程原理复习题思考题 5、简单叙述同尾酶和同裂酶的差别。同尾酶：来源不同，识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端，连接后不能被相关的酶同时切割。同裂酶：识别序列相同，切割位点有些相同，有些不同。分完全同裂酶和不完全同裂酶（PS：完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。） 6、连接酶主要有哪些类型？有何异同点？影响连接酶连接效果的因素主要有哪些？类型：DNA连接酶和RNA连接酶异同点：相同点：都能以DNA为模板，从5'向3'进行核苷酸或脱氧核苷酸的聚合反应。不同点：DNA聚合酶识别脱氧核糖核苷酸，在DNA复制中起作用；而RNA聚合酶聚合的是核糖核苷酸，在转录中起作用。 7、试分析提高平端DNA连接效率的可能方法。（传说中的网上答案） 1、低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好。 2、在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。这样可避免载体自连，应该可以大大提高平端连接的效率。 3、足够多的载体和插入片段是最重要的。 4、平端的连接对于离子浓度很敏感 5、尽可能缩小连接反应的体积 6、建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14度好 8、基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些？ 1）大肠杆菌DNA聚合酶 2）Klenow fragment 3）T7 DNA聚合酶 4）T4 DNA聚合酶 5）修饰过的T7 DNA聚合酶 6）逆转录酶 7）Taq DNA聚合酶第四章基因克隆的载体系统 1、作为基因工程载体，其应具备哪些条件？具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）；具有合适的筛选标记；具有较高的外源DNA的载装能力；具有多克隆位点（MCS）；具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。 3、载体的类型主要有哪些？在基因工程操作中如何选择载体？基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三大类。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。 4、质粒转化原理，影响转化率的因素有哪些？

基因工程知识点总结归纳(更新版)

基因工程绪论 1、克隆（clone）：作名词：含有目的基因的重组DNA分子或含有重组分子的无性繁殖。作动词：基因的分离和重组的过程。 2、基因工程（gene engineering）：体外将目的基因插入病毒、质粒、或其他载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原先没有这些基因的宿主细胞内，且能稳定的遗传。供体、受体和载体是基因工程的三大要素。 3、基因工程诞生的基础三大理论基础：40年代发现了生物的遗传物质是DNA；50年代弄清楚DNA 的双螺旋结构和半保留复制机理；60年代确定遗传信息的遗传方式。以密码方式每三个核苷酸组成一个密码子代表一个氨基酸。三大技术基础：限制性内切酶的发现；DNA连接酶的发现；载体的发现 3、基因工程的技术路线：切：DNA片段的获得；接：DNA片段与载体的连接；转：外源DNA片段进出受体细胞；选：选择基因；表达：目的基因的表达；基因工程的工具酶 1、限制性内切酶（restriction enzymes）：主要是从原核生物中分离纯化出来的，是一类能识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。 2、限制酶的命名：属名（斜体）+种名+株系+序数 3、II型限制性内切酶识别特定序列并在特定位点切割 4、同裂酶：来源不同，其识别位点与切割位点均相同的限制酶。 5、同尾酶：来源不同，识别的靶序列不同，但产生相同的黏性末端的酶形成的新位点不能被原来的酶识别。 6、限制性内切酶的活性：在适当反应条件下，1小时内完全酶解1ug特定的DNA 底物，所需要的限制性内切酶的量为1个酶活力单位。 7、星号活性：改变反应条件，导致限制酶的专一性和酶活力的改变。 8、DNA连接酶的特点：具有双链特异性，不能连接两条单链DNA分子或闭合单链DNA，连接反应是吸能反应，最适反应温度是4至15度，最常用的是T4连接酶。 9、S1核酸酶：特异性降解单链DNA或RNA。

高中生物选修三基因工程知识点

高中生物选修三基因工程知识点基因工程：是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。（一）基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。 2.“分子缝合针”——DNA连接酶（1）两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较： ①相同点：都缝合磷酸二酯键。 ②区别：E·coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。（2）与DNA聚合酶作用的异同：

（2）目的：获取大量的目的基因（3）原理：DNA双链复制（4）过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链为单链；第二步：冷却到55～60℃，引物与两条单链DNA结合；第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始进行互补链的合成。（5）特点：指数(2^n)形式扩增第二步：基因表达载体的构建(核心) 1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。 2.组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因（1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA 聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。（2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。（3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。第三步：将目的基因导入受体细胞 1.转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 2.常用的转化方法：

专题一、基因工程知识点归纳

专题一基因工程一【高考目标定位】 1、专题重点：DNA重组技术所需的三种基本工具；基因工程的基本操作程序四个步骤；基因工程在农业和医疗等面的应用；蛋白质工程的原理。 2、专题难点：基因工程载体需要具备的条件；从基因文库中获取目的基因；利用PCR技术扩增目的基因；基因治疗；蛋白质工程的原理。二【课时安排】2课时三【考纲知识梳理】第1节DNA重组技术的基本工具教材梳理：知识点一基因工程的概念：基因工程是指按照人们的愿望，进行格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。注意：对本概念应从以下几个面理解：知识点二基因工程的基本工具 1.限制性核酸切酶——“分子手术刀” （1）限制性切酶的来源：主要是从原核生物中分离纯化来的。（2）限制性切酶的作用：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并能将每一条链上特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键切开。（3）限制性切酶的切割式及结果：①在中心轴线两侧将DNA切开，切口是黏性末端。②沿着中心轴线切开DNA，切口是平末端。 2.DNA连接酶——“分子缝合针” （1）来源：大肠杆菌、T4噬菌体（2）DNA连接酶的种类：E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。（3）作用及作用部位：E.coliDNA连接酶作用于黏性末端被切开的磷酸

二酯键，T4DNA连接酶作用于黏性末端和平末端被切开的磷酸二酯键。注意：比较有关的DNA酶（1）DNA水解酶：能够将DNA水解成四种脱氧核苷酸，彻底水解成膦酸、脱氧核糖和含氮碱基（2）DNA解旋酶：能够将DNA或DNA的某一段解成两条长链，作用的部位是碱基和碱基之间的氢键。注意：使DNA解成两条长链的法除用解旋酶以外，在适当的高温（如94℃）、重金属盐的作用下，也可使DNA 解旋。（3）DNA聚合酶：能将单个的核苷酸通过磷酸二酯键连接成DNA长链。（4）DNA连接酶：是通过磷酸二酯键连接双链DNA的缺口。注意比较DNA聚合酶和DNA连接酶的异同点。 3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” （1）分子运载车的种类：①质粒：常存在于原核细胞和酵母菌中，是一种分子质量较小的环状的裸露的DNA分子，独立于拟核之外。②病毒：常用的病毒有噬菌体、动植物病毒等。（2）运载体作用：①是用它做运载工具，将目的基因转运到宿主细胞中去。②是利用它在受体细胞对目的基因进行大量复制。（3）作为运载体必须具备的条件：①在宿主细胞中保存下来并大量复制②有多个限制性切酶切点③有一定的标记基因，便于筛选。思维探究：知识点3、4、5主要是介绍DNA重组技术的三种基本工具及其作用。限制酶──“分子手术刀”，主要是介绍限制酶的作用，切割后产生的结果。在这部分容学习时，应关心的问题之一是：限制酶从哪里寻找？我们可以联想从前学过的容──噬菌体侵染细菌的实验，进而认识细菌等单细胞生物容易受到自然界外源DNA的入侵。那么这类原核生物之所以长期进化而不绝灭，有保护机制？进而联想到可能是有什么酶来切割外源DNA，而使之失效，达到保护自身的目的”。这样就对“限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来”的认识提高了一个层次。基因进入受体细胞的载体──“分子运输车”的学习容，不能仅仅着眼于记住这几个条件，而应该深入思考每一个条件的涵，通过深思熟虑，才能真正明确为什么要有这些条件才能充当载体。教材拓展：拓展点一限制酶所识别序列的特点限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱

基因工程期末考试重点知识整理

基因工程第一章基因工程概述 1、基因工程的概念(基因工程基本技术路线PPT) 基因工程（Gene Engineering）,是指在基因水平上的遗传工程,它是用人为方法将大分子(DNA)提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源遗传物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得新物种的一种崭新的育种技术. 2、基因工程的历史基因工程准备阶段：1972，第一个重组DNA分子的构建，构建人：Paul Berg及其同事PPT 基因工程诞生：1973，Cohen & Boyer首次完成重组质粒DNA对大肠杆菌的转化基因工程发展阶段的几个重要事件：一系列新的基因工程操作技术的出现；各种表达克隆载体的成功构建；一系列转基因菌株、转基因植物、转基因动物等的出现 3、基因工程的内容（P9） 4、基因克隆的通用策略（P12）(基因组文库(鸟枪法)+分子杂交筛选) 第二章分子克隆工具酶 5、限制性核酸内切酶的概念、特点、命名、分类(问答) 概念：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶，主要存在于细菌体内特点（参加PPT）命名：依次取宿主属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后加上序号。

如：从Haemophilus influenze Rd中提取到的第三种限制型核酸内切酶被命名为Hind Ⅲ，Hin指来源于流感嗜血杆菌，d表示来菌株Rd，Ⅲ表示序号。分类：依据酶的亚单位组成、识别序列的种类以及是否需要辅助因子可分为：Ⅰ型酶、Ⅱ型（Ⅱs型）酶和Ⅲ型酶。真核细胞中有4中DNA聚合酶：α，β，γ，线粒体DNA聚合酶原核生物中3中DNA聚合酶：Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ 6、几个基本概念粘性末端：两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置是交错的，对称地分布在识别序列中心位置两侧，这样形成的DNA片段末端称为~。平末端：两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置处在识别序列的对称结构中心，这样切割的结果产生的DNA片段末端是平齐的，称之为~。同裂酶：一些来源不同的限制性核酸内切酶具有相同的识别序列。如：BamHI和BstI均可识别GGATCC。同尾酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不同，但是切割DNA分子产生相同的DNA末端。如：TaqI：TCGA；ClaI：A TCGA T；AccI：GTCGAC 星星活性：某些限制性核酸内切酶在特定条件下，可以在不是原来的识别序列处切割DNA，这种现象称为Star活性。 DNA物理图谱：（多为质粒图谱）

基因工程期末复习总结

一、单选 1、第一个实现DNA重组的实验:1972年，美国斯坦福大学医学中心的P.Berg在世界上第一次成功地实现了DNA的体外重组。 2、第一次实现重组体转化成功的实验：1973年，科恩（Coher）和博耶（Boyer）建立的基因工程基本模式。 3、基因工程研究的主要内容：切接转增检。 4、基因工程研究的基本要素：基因、工具酶、载体、受体细胞。 5、DNA在生物体内的存在状态：染色体DNA、病毒DNA（噬菌体DNA）、质粒DNA、线粒体DNA和叶绿体DNA，有的以线型存在，有的以环状存在。 6、天然DNA提取的步骤：生物材料的准备、裂解细胞、分离抽提DNA。 7、DNA的分离抽提法：酚-氯仿抽提法（常用、经典）。 8、DNA的保存：温度越低越好，同等条件下，温度越低越不容易降解。 9、为了消除在制备RNA过程中RNA酶的污染，应用0.1% DEPC处理过的水配制试剂。 10、人工合成DNA片段的方法有化学合成法和聚合酶链式反应扩增法。 11、紫外分光光度法检测核酸样品的纯度（常用），纯净的核酸溶液的0D260/OD280值应为 1.7~2.0，0D260/OD230值应大于 2.0，如果0D260/OD280小于1.7，可能有蛋白质污染，如果0D260/OD280大于2.0

或0D260/OD230小于2.0时，核酸溶液中可能存在其他干扰物质。12、工具酶就其用途而言可分为三大类：限制性内切酶、连接酶和修饰酶。 13、 14、通常提到的限制性核酸内切酶主要指Ⅱ类酶而言，限制性核酸内切酶的命名：属名+种名。例如：B acillus am ylolique faciens H、 H aemophilus in fluenzae dⅠ→Bam H、Hind 15、限制性内切核酸酶的本质：细菌细胞的限制—修饰系统。 17、常用的酶切方法：单酶切、双酶切和部分酶切。

基因工程复习要点

一名词解释： 1基因：是遗传信息的基本单位，携带着某种蛋白质或的遗传信息。从化学本质上看，基因是一段携带特定遗传信息的脱氧核糖核苷酸()序列，是构成巨大遗传单位染色体的组成部分。 2基因工程：按照人们的愿望，进行严密的设计，利用体外重组和转基因等生物技术，有目的地改造生物性状使之具有满足人们特定需求的能力。最突出的优点：打破了常规育种难以突破的物种之间的界限，使不同的物种之间可以进行遗传信息的重组和转移。 3 ：熔点温度或者解链温度，是变性进行到一半时的温度 4同裂酶：有时，一些限制性内切酶虽然来源不同，但是识别序列相同，这样的酶称为同裂酶（同切酶或异源同工酶）。此种酶切割位点可同可不同。 5 技术：是一种在体外快速扩增特定基因或序列的方法，即聚合酶链式反应技术。（已知的短片段1以内） 6质粒不相容性：不同质粒有的可共存于同一细胞中，但有的不行。不能同寓于一个细胞中的不同质粒称为不相容性质粒。 7转录单元：始于启动子，止于终止子，中间是一段转录区，转录为单链的一段序列 8杂种位点：：由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点。一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。 9基因表达：基因通过的转录和的转译等过程，将其所携带的遗传信息转变成蛋白质(或转录本)的过程。 10基因组文库：某一特定生物的很多克隆的集合，其中克隆数足够大以覆盖每一个基因。 11 ：开放阅读框，以起始密码子开始终止密码子结束的一串三联体核苷酸序列。起始密码子：终止密码子： 12克隆：动词：是指从一个共同祖先经无性繁殖得到的一群遗传上同一的分子、细胞或个体所组成的特殊生命群体；名词：指从同一个祖先产生这类同一的分子群体、细胞群体或个体群体的过程。 13蛋白质印迹杂交技术：将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。 14同尾酶：指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。二选择题： 1焦磷酸测序中没用到以下什么酶；（聚合酶( )、硫酸化酶( ).荧光素酶(1)和三磷酸腺苷双磷酸酶()4种酶都有） 2克隆基因常用强效载体，哪种不适用于大肠杆菌，选； 3质粒克隆载体非必需元件，选融合标签； 4外源基因在下列哪种中表达最完善（哺乳动物细胞）； 5一个完整的转录单位不包括（复制起始位点）。三简答题： 1简要勾勒一副原核表达载体图。（重点是要包括原核表达载体的６个要素：启动子、核糖

基因工程期末复习总结.docx

一、单选 1、第一个实现DNA重组的实验：1972年，美国斯坦福大学医学中心的P.Berg在世界上第一次成功地实现了DNA的体外重组。 2、第一次实现重组体转化成功的实验：1973年，科恩（Coher）和博耶（Boyer）建立的基因工程基本模式。 3、基因工程研究的主要内容：切接转增检。 4、基因工程研究的基本要素：基因、工具酶、载体、受体细胞。 5、DNA在生物体内的存在状态：染色体DNA、病毒DNA （噬菌体DNA）、质粒DNA、线粒体DNA利叶绿体DNA,有的以线型存在，有的以环状存在。 6、天然DNA提取的步骤：生物材料的准备、裂解细胞、分离抽提 DNAo 7、DNA的分离抽提法：酚■氯仿抽提法（常用、经典）。 8、DNA的保存：温度越低越好，同等条件下，温度越低越不容易降解。 9、为了消除在制备RNA过程中RNA酶的污染，应用0.1% DEPC处理过的水配制试剂。 10、人工合成DNA片段的方法有化学合成法和聚合酶链式反应扩增法。口、紫外分光光度法检测核酸样品的纯度（常用），纯净的核酸溶液的 OD260/OD280值应为1.7-2.0, OD260/OD230值应大于2.0,如果OD260/OD280小于1.7,可能有蛋白质污染，如果OD260/OD280大于2.0

或OD260/OD23O小于2.0时，核酸溶液中可能存在其他干扰物质。 12、工具酶就其用途而言可分为三大类：限制性内切酶、连接酶和修饰酶。基因工程屮最常用的工具酶 14、通常提到的限制性核酸内切酶主要指II类酶而言，限制性核酸内切酶的命名：属名+种名。例如：Bacillus amylolique faciens H、Haemophilus influenzae d Bam H> Hind I o“属种株序” 15、限制性内切核酸酶的本质：细菌细胞的限制一修饰系统。 16、限制性内切核酸酶的作用机制识别双链DNA中特定的核昔酸 17、常用的酶切方法：单酶切、双酶切和部分酶切。

基因工程期末考试重点知识整理教学文案

基因工程期末考试重点知识整理

基因工程第一章基因工程概述 1、基因工程的概念(基因工程基本技术路线PPT) 基因工程（Gene Engineering）,是指在基因水平上的遗传工程,它是用人为方法将大分子(DNA)提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源遗传物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得新物种的一种崭新的育种技术. 2、基因工程的历史基因工程准备阶段：1972，第一个重组DNA分子的构建，构建人：Paul Berg 及其同事PPT 基因工程诞生：1973，Cohen & Boyer首次完成重组质粒DNA对大肠杆菌的转化基因工程发展阶段的几个重要事件：一系列新的基因工程操作技术的出现；各种表达克隆载体的成功构建；一系列转基因菌株、转基因植物、转基因动物等的出现 3、基因工程的内容（P9） 4、基因克隆的通用策略（P12）(基因组文库(鸟枪法)+分子杂交筛选)

第二章分子克隆工具酶 5、限制性核酸内切酶的概念、特点、命名、分类(问答) 概念：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶，主要存在于细菌体内特点（参加PPT）命名：依次取宿主属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后加上序号。如：从Haemophilus influenze Rd中提取到的第三种限制型核酸内切酶被命名为Hind Ⅲ，Hin指来源于流感嗜血杆菌，d表示来菌株Rd，Ⅲ表示序号。分类：依据酶的亚单位组成、识别序列的种类以及是否需要辅助因子可分为：Ⅰ型酶、Ⅱ型（Ⅱs型）酶和Ⅲ型酶。真核细胞中有4中DNA聚合酶：α，β，γ，线粒体DNA聚合酶原核生物中3中DNA聚合酶：Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ

基因工程复习要点

一 1.载体的功能 1.运送外源基因高效转入受体细胞 2.为外源基因提供复制能力或整合能力 3.为外源基因的扩增或表达提供必要的条件 2.基因工程学科建立的理论和技术发明 1.三大理论：DNA是遗传物质、1953年提出DNA的双螺旋结构、提出中心法则和遗传密码 2.三大技术：工具酶的发现、载体的发现、逆转录酶的发现 3.质粒的特点质粒是一类存在于细菌和真菌细胞中能独立于染色体DNA而自主复制的共价、闭合、环状DNA分子，也称cccDNA.通常在1~100范围内。自主复制性、可扩增性、可转移性、不相容性 4.描述PBR322质粒筛选过程 PBR322质粒有两个标记基因，氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因。若在康四环素抗性基因上插入外源DNA,则 1.先将转化液涂布在含有氨苄青霉素的平板上，未长的菌落是未导入质粒的菌落 2.再将上述平板上存活的菌落影印到含有四环素平板上，在四环素上不长但在氨苄青霉素上长的转化子即为重组子。 5.简述PUC系列质粒筛选重组子的过程 PUC是在PBR322质粒上改造的若在lacZ’标记基因上插入外源DNA，则将转化液涂布在含有Amp的平板上，蓝色菌落为非重组子，白色菌落为重组子，没长的未导入质粒。 6.基因工程操作的基本流程 1.离：从供体细胞中分离出基因组DNA 2.切、连：用限制性核酸内切酶分别将外源DNA和载体分开,用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段接到载体分子上，构成重组DNA分子 3.转、增：将重组DNA导入受体细胞，段时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中 4.筛：筛选经转化处理的细胞，获得外源基因高效稳定的基因工程菌或细胞 5.表达：筛选好的菌或细胞导入到受体中使其高效稳定表达 7.为什么说逆转录酶的发现对基因工程学科的建立至关重要 1.对分子生物学的中心法则进行修正和补充 2.使真核基因的制备成为可能可将mRNA反转录形成DNA用于获得目的基因 3.在致癌病毒的研究中发现癌基因，为肿瘤发病机理的研究提供有价值线索 8.蓝白斑筛选是一种基因工程常用的重组菌筛选方法。野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色

专题1基因工程知识点梳理(含教材答案)

专题1 基因工程 ※基因工程的概念：基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 ﹡原理：基因重组 ﹡目的：创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 ﹡意义：能够打破生物种属的界限（即打破生殖隔离，克服远源杂交不亲和的障碍），在分子水平上定向改变生物的遗传特性。 ﹡操作水平：DNA分子水平【思考】：（1）基因工程的物质基础是：所有生物的DNA均由四种脱氧核苷酸组成。（2）基因工程的结构基础是：所有生物的DNA均为双螺旋结构。（3）一种生物的DNA上的基因之所以能在其他生物体内得以进行相同的表达，是因为它们共用一套遗传密码子。一、基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端（回文结构特点）。 ①在中心轴线两侧将DNA切开，切口是黏性末端。 ②沿着中心轴线切开DNA，切口是平末端。 2.“分子缝合针”——DNA连接酶

（1）分类：根据酶的来源不同，可分为E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶两类（2）功能：恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 ★两种DNA连接酶(E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶)的比较： ①相同点：都缝合磷酸二酯键 ②区别：E．coIiDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能使黏性末端之间连接； T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端之间的效率较低。 (3)与DNA聚合酶作用的异同: DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。（4）与DNA分子相关的酶

基因工程制药复习提纲

名词解释 1.基因工程基因工程是值在体外合成或重组特定的DNA，再与载体连接，最后导入到宿主细胞内表达、扩增出人们需要的蛋白质，而且使这种性状可遗传给后代的技术。包括上游技术和下游技术。 2.基因工程制药基因工程制药是通过基因工程的方法生产药物，具体包括获得目的基因、构建重组质粒、构建基因工程菌、培养工程菌、产物分离纯化、产品加工检验等步骤。 3.逆转录逆转录（reverse transcription）是某些RNA病毒由逆转录酶直接利用RNA为模板合成DNA的过程。 4.CDNA以生物细胞的mRNA为模板，在逆转录酶的作用下合成cDNA的第一条链，然后在合成双链DNA，并将合成的cDNA双链重组到质粒载体或噬菌体载体上，倒入宿主细胞进行增殖。在这个过程中合成的双链DNA叫做cDNA。 5.引物引物是人工合成的单链DNA小片段，碱基顺序分别与所要扩增的模板DNA双链的 5’端相同。是PCR的起始点。 6.表达载体所谓表达载体（expression vector）是指具有宿主细胞基因表达所需的调节控制序列，能使外源基因在宿主细胞内转录和翻译的载体。 7.克隆载体克隆载体（cloning vector)是把一个有用的制药DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中进行繁殖的工具。 8.载体载体（vector），指在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。 9.报告基因载体分子上有一种特殊意义的基因序列，它们表达的目的是为了证明载体已经进入宿主细胞，并将含有外源基因的宿主细胞从其他细胞中区分并挑选出来。这种基因就是报告基因。 10.启动子启动子是位于结构基因5'端上游的DNA序列，能被RNA聚合酶识别并结合，具有转录起始的特异性 11.PCR聚合酶链式反应是一种体外放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术，它主要包括变性、退火、延伸三个过程，并且多次循环。 12.包涵体包涵体（inclusion body）是存在于细胞质中的一种不可溶的蛋白质聚集折叠而形成的晶体结构物。通常包涵体虽然具有正确的氨基酸序列，但是空间结构却是错误的。 13.蛋白表达系统蛋白表达系统是指由宿主、外源基因、载体和辅助成分组成的体系，通过这个体系实现外源基因在宿主细胞中表达的目的。 14.单克隆抗体由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，称为单克隆抗体。 15.基因工程抗体基因工程抗体就是按不同的目的和需求，对抗体基因进行加工、改造和重新装配，然后导入适当的受体细胞中表达得到的抗体分子。 16.改形抗体改性抗体（reshaped antibody,RAb）是指利用基因工程技术，将人抗体可变区（V）中互补决定簇序列改换成鼠源单抗互补决定簇。重构成既具有鼠源性单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体。 17.嵌合抗体在基因水平上将鼠源单克隆抗体可变区和人抗体恒定区连接起来并在合适的宿主细胞中表达，这种抗体叫做嵌合抗体（chimeric antibody）。 18.镶面抗体将鼠源单抗可变区中氨基酸残基改造成人源的，消除了异源性且不影响可变区的整体空间构象。 19.单链抗体单链抗体(single chain antibody fragment，scFv)，是由抗体重链可变区和轻链可变区通过15～20个氨基酸的短肽(linker)连接而成。scFv能较好地保留其对抗原的亲

基因工程知识点超全

基因工程一、基因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在二、基因工程的基本工具 1、限制性核酸内切酶-----“分子手术刀” 2、DNA连接酶-----“分子缝合针” 3、基因进入受体细胞的载体-----“分子运输车” 1．“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）（1）存在：主要存在于原核生物中。（2）特性：特异性，一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。（3）切割部位：磷酸二酯键（4）作用：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。

（5）识别序列的特点：（6）切割后末端的种类：DNA 分子经限制酶切割产生的DNA 片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端。当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA 的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制酶在它识别序列的中轴线处切开时，产生的则是平末端。

2．“分子缝合针”——DNA连接酶（1）作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成DNA分子。（2）类型相同点：都连接磷酸二酯键 3．“分子运输车”——载体 (1)载体具备的条件： ①能在受体细胞中复制并稳定保存。 ②具有一个至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。 ③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 (2)最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。 (3)其他载体：λ噬菌体的衍生物、动植物病毒。 (4)载体的作用: ①作为运载工具，将目的基因送入受体细胞。 ②在受体细胞内对目的基因进行大量复制。【解题技巧】 (1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。 (2)限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。 (3)在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。 (4)获取一个目的基因需限制酶剪切两次，共产生4个黏性末端或平末端。 (5)不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。 (6)限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便于进行检测。 (7)基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程中的载体是DNA分子，能将目的

基因工程原理练习题及答案

基因工程原理练习题及其答案一、填空题 1．基因工程是_________年代发展起来的遗传学的一个分支学科。 2．基因工程的两个基本特点是：(1)____________，(2)___________。 3．基因克隆中三个基本要点是：___________；_________和__________。 4．通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小的片段，可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点相互位置的___________。 5．限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的，第一个大写字母取自_______，第二、三两个字母取自_________，第四个字母则用___________表示。 6．部分酶切可采取的措施有：(1)____________(2)___________ (3)___________等。 7．第一个分离的限制性内切核酸酶是___________；而第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是_____________。8．限制性内切核酸酶BsuRI和HaeⅢ的来源不同，但识别的序列都是_________，它们属于_____________。 9．DNA聚合酶I的Klenow大片段是用_____________切割DNA聚合酶I得到的分子量为76kDa的大片段，具有两种酶活性：(1)____________；(2)________________的活性。 10．为了防止DNA的自身环化，可用_____________去双链DNA__________________。 11．EDTA是____________离子螯合剂。 12．测序酶是修饰了的T7 DNA聚合酶，它只有_____________酶的活性，而没有_______酶的活性。 13．切口移位(nick translation)法标记DNA的基本原理在于利用_________的_______和______的作用。 14．欲将某一具有突出单链末端的双链DNA分子转变成平末端的双链形式，通常可采用_________或_______________。15．反转录酶除了催化DNA的合成外，还具有____________的作用，可以将DNA- RNA杂种双链中的___________水解掉。 16．基因工程中有3种主要类型的载体：_______________、_____________、______________。 17．就克隆一个基因(DNA片段)来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部分：_______________、_____________、______________。另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子量。 18．一个带有质粒的细菌在有EB的培养液中培养一段时间后，一部分细胞中已测不出质粒，这种现象叫。 19．pBR322是一种改造型的质粒，它的复制子来源于，它的四环素抗性基因来自于，它的氨苄青霉素抗性基因来自于。 20．Y AC的最大容载能力是，BAC载体的最大容载能力是。 21．pSCl01是一种复制的质粒。 22．pUCl8质粒是目前使用较为广泛的载体。pUC系列的载体是通过和两种质粒改造而来。它的复制子来自，Amp 抗性基因则是来自。 23．噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：一是；二是。 24．野生型的M13不适合用作基因工程载体，主要原因是和。 25．黏粒(cosmid)是质粒—噬菌体杂合载体，它的复制子来自、COS位点序列来自，最大的克隆片段达到kb。 26．野生型的λ噬菌体DNA不宜作为基因工程载体，原因是：(1) (2) (3) 。 27．噬菌粒是由质粒和噬菌体DNA共同构成的，其中来自质粒的主要结构是，而来自噬菌体的主要结构是。 28．λ噬菌体载体由于受到包装的限制，插入外源DNA片段后，总的长度应在噬菌体基因组的的范围内。 29．在分离DNA时要使用金属离子螯合剂，如EDTA和柠檬酸钠等，其目的是。 30．用乙醇沉淀DNA时，通常要在DNA溶液中加人单价的阳离子，如NaCl和NaAc，其目的是。 31．引物在基因工程中至少有4个方面的用途：(1) (2) (3) (4) 。 32．Clark发现用Taq DNA聚合酶得到的PCR反应产物不是平末端，而是有一个突出碱基末端的双链DNA分子。根据这一发现设计了克隆PCR产物的。 33．在cDNA的合成中要用到S1核酸酶，其作用是切除在。 34．乙醇沉淀DNA的原理是。 35．假定克隆一个编码某种蛋白质的基因，必须考虑其表达的三个基本条件：

《基因工程原理》期末复习思考题教案资料

《医用基因工程》复习思考题第一章基因和基因组及基因工程的概念一、名词概念 ①移动基因(插入序列；转位子)；②断裂基因；③RNA剪辑； ④内含子(间隔序列)与表达子；⑤重叠基因；⑥重复序列；⑦假基因；⑧启动子与终止子；⑨起始位点、终止位点。二、讨论题 1.什么叫基因?何谓基因的新概念?基因的主要功能是什么? 2.一种基因一种酶的提法妥否？ 3.基因密码子三联体间是否存在着逗号？ 4.基因表达的产物中，氨基酸序列相同时，基因密码子是否一定相同？为什么？ 5.何谓转位子和转位作用?转位的后果如何? 6.基因中最小的突变单位和重组单位是什么？ 7.基因工程应包括哪些内容？何谓基因工程的四大里程碑和三大技术发明? 8.真核细胞基因组中常有内含子存在，能否在原核细胞获得表达？能，为什么？不能，为什么？第二章基因工程中常用的工具酶 1.什么是限制性核酸内切酶？ 2.什么是R/M现象？如何解释？ 3.II型核酸内切酶的基本特点有哪些？ 4.影响II型核酸内切酶活性的因素有哪些？如何克服和避免这

些不利因素？ 5.DNA连接酶有哪两类？有何不同？ 6.甲基化酶有哪两类？有何应用价值？ 7.什么叫同尾酶、同裂酶？在基因工程中有何应用价值？ 8.平末端连接的方法有哪些？(图示) 9.Klenow酶的特性和用途有哪些？举例说明。 10.反转录酶的特性有哪些？有何应用价值？ 11.列举碱性磷酸酶BAP/CAP的应用之一。 12.列举末端核苷酸序列转移酶的应用之一。 13.质粒单酶切点的基因连接如何降低本底和防止自我环化和提高连接效率？ 14.基因片段与载体的平末端连接的方法有哪些？ 15.用寡核苷酸和衔接物DNA的短片段连接时为使基因内部的切点保护，常用何种办法解决？第三章基因克隆载体 1.基因工程常用的载体有哪5种？其共同特性如何？ 2.什么是质粒？质粒分哪几种？有哪两种复制类型，质粒的分子生物学特性有哪些？ 3.质粒存在的三种形式是什么？ 4.分离质粒的基本步骤有哪些？ 5.分离纯化质粒的方法有哪几种？简述CsCl密度梯度(浮密度)分离法、碱变性法的原理，如何选择合适的分离方法？ 6.作为理想质粒载体的基本条件有哪些？ 7.什么叫插入失活，举例说明之。 8.构建pBR322质粒载体的亲本质粒有哪些？ 9.什么叫插入型和替换型噬菌体载体?插入型和替换型入噬菌体

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