浙江省台州市书生中学高中生物浙科版选修一必背知识点（2020选考）
选修一生物技术实践必背知识---20200525
实验一大肠杆菌的培养和分离
【考点一】培养基
1、培养基配置
①微生物的生命活动需要五大营养要素：水、无机盐、碳源、氮源、生长因子；
②有的物质既是碳源又是氮源（为微生物生长提供碳元素和氮元素），如：蛋白质、蛋白胨；
③有的既是碳源又是生长因子（是微生物生长不可缺少的微量有机物），如：酵母提取物；
④“细菌喜荤，霉菌喜素”；细菌喜37℃的温度；霉菌喜25-30℃的温度；
⑤细菌的培养基：蛋白胨、酵母提取物、一定量的氯化钠，以维持一定的渗透压；通常在中性偏碱的环境中生长；
⑥霉菌的培养基：一般用无机物配制或添加蔗糖的豆芽汁即可；通常在中性偏酸的环境中生长；
⑦在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要适宜的pH、温度以及特殊营养物质，以满足微生物生长对的要求。
2、培养基的种类及用途：
①液体培养基：呈现液态，用于扩大培养和工业生产；
②固体培养基：配制时需加入琼脂（凝固剂），呈固态，用于菌种分离、鉴定、计数等；
③我们一般用LB 液体培养基来扩大培养大肠杆菌，用LB 固体培养基来分离大肠杆菌。
【考点二】灭菌和消毒
1、无菌技术：人们利用微生物完成一定的反应，必须要求某种微生物是没有被其他微生物污染的，因此，在培养微生物时必须进行无菌操作；
2、灭菌是用物理或化学的方法，杀死或除去环境中的一切微生物的方法。杀死病原菌的方法叫消毒。如：实验室要对使用前和使用后的培养基、各种容器进行灭菌；要对实验服、对病人的排泄物和衣物进行消毒。
3、干热灭菌法：是利用火焰将接种环和试管上的微生物烧死（又称灼烧灭菌法），或在140-160℃的烘箱中加热2-3h，将微生物的营养体和芽孢杀死。
4、加压蒸气灭菌法（高压蒸气灭菌法）：这是生产和实验室常用的灭菌法，将灭菌锅内通入压力达到1000g/cm 2 的高压蒸气，锅内温度达121℃，持续15-30min，即可达到灭菌目的；【注意：当培养基内有葡萄糖时，为防止葡萄糖分解碳化，要用500g/cm 2 压力（90℃以上）灭菌30min。】
5、过滤灭菌法：有些化合物（尿素、碳酸氢钠等）加热会分解，如培养基中需要时，只能配成溶液单独过滤灭菌；通常用G 6 玻璃砂漏斗过滤。其他型号（如：G 1 -G 5 ）的不能除菌。
【注意】：玻璃砂漏斗使用方法：使用前也要用高压蒸汽灭菌，玻璃砂漏斗有6 种型号，即G 1 -G 6 ，G 6 径最小，细菌不能滤过，在使用后需要用1mol/L 的HCl 浸泡，并抽滤去酸，再用蒸馏水洗至洗出液至中性，干燥后保存）
6、紫外线光灭菌法：紫外光谱范围是100-400nm，可使菌体的蛋白质和核酸变性，芽孢可在10min 内杀死。【注意】：紫外线对人的皮肤、眼睛等会造成伤害，开启紫外线灯后，人必须离开。
7、各种大小的培养皿、试管、三角瓶、取样器的头、移液管、三角刮刀、接种环、镊子等等，这些用具通
常用高压蒸汽灭菌法灭菌：试管需加棉花塞或塑料盖；三角瓶可用封口膜或6 层纱布封口；移液管上端用镊子放入少量棉花；各种用品均用牛皮纸或报纸包好；在121℃（1000g/cm 2 压力）下灭菌15-30min；将实验用具放入60-80℃的烘箱中烘干，以除去灭菌时的水分；
8、在进行实验操作前，将需要使用的用具从烘箱中取出，放到超净台上，然后打开紫外线灯和过滤风，灭菌30min。
9、实验中用的棉花不能用脱脂棉，因脱脂棉易吸水，吸水后容易引起污染。灭菌通常在60～80℃烘箱中除去灭菌时的水分；
10、在用任何器皿转接时，瓶塞和封口膜只能夹在手上，不许放在台面上，接种时要在酒精灯火焰旁操作；【考点三】细菌的培养和分离
1、接种时，先将接种环在明火上烧红后冷却，然后蘸取带菌的培养物，放到新的培养基中；（注意a.取菌种前，灼烧接种环的目：消灭接种环上的微生物；b.除第一次划线外，其余划线前都要灼烧接种环，目的是：消灭接种环上残留菌种；c.取菌种和划线前都要求接种环冷却后进行，其目的是防止高温杀死菌种；d.实验结束后灼烧接种环的目的：防止细菌污染环境和操作者）
2、（划线分离法）用接种环蘸菌液后在含有固体培养基的培养皿
平板上划线，在划线过程中接种环上的菌液逐渐减少，因此划线
最后部分的细菌间距离加大。
3、（涂布分离法）先将培养的菌液稀释，通常稀释10 -5 ～10 -7
倍，取0.1ml 稀释度不同的菌液，加在培养皿的固体培养基上，
用玻璃刮刀涂布在培养基平面上进行培养，在适当的稀释度下，可培养得到相互分开的菌落。通常每个培养皿有20 个以内的单菌落最为适合。
【注意】：使用玻璃刮刀或镊子时，把从70%酒精中取出的刀或镊子放在火焰上使酒精燃烧，但不要在火焰上加热，酒精燃尽后即可使用）
4、划线分离法，方法简单；涂布分离法，单菌落更易分开，但操作复杂些。细菌的两种分离法各有优点，都可采用。
5、接种后，培养皿必须倒放在恒温培养箱中；因为正放时，水分形成的水滴会落入培养基表面，水流扩散会使菌落的菌体扩散，很难形成单菌落，就失去了分离菌株的效果。
6、保存菌种：在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在斜面上，37℃培养24h 后，置于4℃冰箱中保存。
7、完成实验后：所有接触过细菌的器皿都必须先高压灭菌后再洗涤，特别是培养基，有可能被有害菌体污染，在培养繁殖后，大量有害菌体影响人畜健康，也污染环境；使用后的废弃物要高压蒸汽灭菌后再抛弃。
实验2 ：分离以尿素为氮源的微生物
【考点一】脲酶的作用
1、脲或称尿素，是蛋白质降解的产物；土壤环境中有一些细菌含有脲酶，它们可以通过降解尿素作为其生长的氮源。尿素分解的化学方程式为：
【考点二】配制LB 培养基
1、全营养LB 固体培养基：蛋白胨（碳源和氮源）、酵母提取物（碳源和生长因子）、NaCl（无机盐，调节渗透压）、水、琼脂糖（去氮纯化后的凝固剂），加上封口膜后高压蒸汽灭菌后待用；
（注意：配制固体培养基时要添加适量琼脂糖，而不使用琼脂，是为了防止琼脂中的含氮化合物被细菌利用，尽量做到培养基中只有尿素一种含氮化合物，有利于以尿素为氮源的细菌的筛选）
2、尿素固体培养基：葡萄糖（碳源）、NaCl（调节渗透压）、K 2 HPO 4 （无机盐）、水、琼脂糖和酚红（指示剂），加上封口膜后高压蒸汽灭菌后待用；待冷却至60℃时，加入通过G 6玻璃砂漏斗过滤（过滤灭菌法）的10mL 尿素溶液，摇动混合均匀待用。
【考点三】操作步骤：