实验四 动物血液中DNA的提取-教案
授课教师常祖明学生人数55
课题血液基因组DNA的提取
授课类型新授课授课方法讲授、演示
教学用具多媒体、实验室设备
教学目的掌握鸡血DNA提取的原理及方法
教学重点理解实验过程中每一步操作的目的及原理
教学难点
教学过程
一、实验目的
1.掌握鸡血DNA提取的原理；
2.掌握鸡血DNA提取的方法及操作过程。
二、实验原理
哺乳动物的成熟红细胞已经高度分化，因而当中没有细胞核，无法提取DNA。禽类的血细胞则可以。禽类代谢旺盛，血液中红细胞更多，而且红细胞中有完整的细胞核、大量的染色体。且材料易得、经济。用鸡血细胞做实验材料有两个原因。一是因为鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得；二是鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长。
三、实验仪器
1.水浴锅：55℃
2.离心机：8000转、12000转
3.离心管：5ml（120个）
4.移液枪：10μl、680μl、700μl、800μl 、900μl 、1ml
5.容量瓶：100ml
6.取血针及管
四、实验材料及药品
实验材料：普通家鸡：需血液4.08ml（每管136 l）
1.无水乙醇
作用：DNA沉淀剂、洗涤剂。
商品信息：瓶/500ml，分析纯AR。
理化性质：无色澄清液体。有灼烧味。易流动。极易从空气中吸收水分，能与水和氯仿、乙醚等多种有机溶剂以任意比例互溶。
储存：储存于阴凉、通风的库房。远离火种、热源。库温不宜超过30℃。保持容器密封。应与氧化剂、酸类、碱金属、胺类等分开存放，切忌混储。采用防爆型照明、通风设施。禁止使用易产生火花的机械设备和工具。
危害：易燃，具刺激性。蒸气与空气能形成爆炸性混合物，爆炸极限3.5%～18.0%（体积）。
2.柠檬酸
作用：ACD抗凝血剂成分之一。在抗凝剂中，中和柠檬酸钠的碱性。
商品信息：分析纯AR，白色塑料瓶/500g，
理化性质：无臭，有很强的酸味，白色粉末或颗粒，易溶于水和醇。在潮湿的空气中微有潮解性。
储存：在湿空气中有轻微潮解，需阴凉密封干燥保存。
危害：柠檬酸浓溶液对黏膜有刺激作用。柠檬酸可燃。粉体与空气可形成爆炸性混合物，遇明火、高热或与氧化剂接触，有引起燃烧爆炸的危险。
3.柠檬酸钠
作用：ACD抗凝血剂成分之一。能与血液中的钙离子结合成螯合物，而使钙离子失去凝血作用，从而阻止血液凝固。
商品信息：柠檬酸三钠分析纯500克/瓶。
理化性质：有机化合物，外观为白色到无色晶体。无臭, 有清凉咸辣味。常温及空气中稳定, 在湿空气中微有溶解性, 在热空气中产生风化现象。加热至150℃失去结晶水。易溶于水、可溶于甘油、难溶于醇类及其他有机溶剂，过热分解，在潮湿的环境中微有潮解，在热空气中微有风化，其溶液pH 值约为8。
储存：常温密闭保存
危害：无毒
4.尿素
作用：禽血裂解液成分之一。尿素能非常有效地使蛋白质变性，尤其能非常有效地破坏非共价键结合的蛋白质。
商品信息：化学试剂分析纯500克/瓶（塑料瓶装）
理化性质：无色柱状结晶或白色结晶性粉末，溶于水，乙醇和苯，难溶于乙醚，不溶于氯仿。
储存：密封避光保存。
危害：避免与皮肤和眼睛接触。
5.十二烷基硫酸钠(SDS)
作用：禽血裂解液成分之一。裂解核酸-蛋白质复合体，用于从蛋白质中分离核酸。
商品信息：500g/分析纯AR。
理化性质：白色或淡黄色粉末。溶解性：溶于水，呈透明溶液，溶液呈中性。易溶于热水，溶于水，溶于热乙醇，微溶于醇，不溶于氯仿、醚。
储存：密封阴凉干燥保存防止受潮受热
危害：对粘膜和上呼吸道有刺激作用，对眼和皮肤有刺激作用。可引起呼吸系统过敏性反应。该品可燃，具刺激性，具致敏性。遇明火、高热可燃。受高热分解放出有毒的气体。
6. 1M Tris-HCl(PH8.0)缓冲液
作用：禽血裂解液成分之一。提供一个缓冲环境，防止DNA被破坏
商品信息：瓶/100ml，无色、澄清溶液
理化性质：Tris中文品名为三羟甲基氨基甲烷，瓶/500g。是一种白色结晶或粉末。溶于乙醇和水，微溶于乙酸乙酯、苯，不溶于乙醚、四氯化碳，对铜、铝有腐蚀作用，有刺激性的化学物质。
储存：室温保存。
危害：毒性低，可致癌，不要直接接触皮肤。
7.乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）
作用：配制0.5M EDTA（PH8.0）溶液。螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制脱氧核糖核酸酶（DNase）活性，活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。
商品信息：瓶/250g。
理化性质：无味无臭或微咸的白色或乳白色结晶或颗粒状粉末。溶于水，不溶于乙醇、乙醚，其水溶液pH值约为5.3。可由EDTA与氢氧化钠和碳酸钙作用制得。
储存：于阴凉、通风的库房。远离火种、热源。应与氧化剂分开存放，切忌混储。配备相应品种和数量的消防器材。储区应备有合适的材料收容泄漏物。
危害：对粘膜和上呼吸道有刺激作用。对眼睛、皮肤有刺激作用。本品可燃，具刺激性。
8.蛋白酶K（共需300μl，每管10μl）
作用：消化组蛋白，释放出DNA；消化DNase，提高DNA产量
商品信息：（20mg/mL）1ml/支。
理化性质：一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶，从林伯氏白色念球菌中纯化得到。
储存：保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融，有效保证12月。
危害：使用时注意不要接触皮肤，以免损伤皮肤表面的蛋白质。
9.Tris饱和酚（共需60ml，每管2ml）
作用：强蛋白质变性剂。
商品信息：瓶/250ml。
理化性质：为浅黄色透明液体，上层为Tris-HCl溶液，加有抗氧化的0.25% 8-羟基喹啉和0.1%的β-巯基乙醇。
储存：4℃避光保存。
危害：Tris饱和酚有较强的腐蚀性，应尽量避免皮肤直接接触或吸入体内。如发现变为黄色或棕色，表明发生氧化，不能使用。
10.氯仿（三氯甲烷）
作用：蛋白质变性剂，加速有机相与液相分层，去除核酸溶液中的迹量酚。
商品信息：瓶/500ml。
理化性质：无色透明重质液体，极易挥发，有特殊气味。不溶于水，溶于醇、醚、苯。
储存：保存在密封的棕色瓶中。
危害：麻醉性。有致癌可能性。在光照下遇空气逐渐被氧化生成剧毒的光气。
11.异戊醇
作用：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。
商品信息：瓶/500ml。
理化性质：无色液体，有不愉快的气味。微溶于水，可混溶于醇、醚等有机溶剂。
储存：储存于阴凉、通风的库房。远离火种、热源。库温不宜超过30℃。保持容器密封。应与氧化剂、酸类等分开存放，切忌混储。采用防爆型照明、通风设施。禁止使用易产生火花的机械设备和工具。储区应备有泄漏应急处理设备和合适的收容材料。
危害：吸入、口服或经皮肤吸收有麻醉作用。其蒸气或雾对眼睛、皮肤、粘膜和呼吸道有刺激作用，可引起神经系统功能紊乱，长时间接触有麻醉作用。易燃，其蒸气与空气可形成爆炸性混合物，遇明火、高热能引起燃烧爆炸。
12.无水葡萄糖
作用：ACD抗凝血剂成分之一。
商品信息：500g/瓶。
理化性质：无色结晶或白色结晶性粉末；无臭、味甜。水中易溶，在乙醇中微溶。
储存：无水葡萄糖易吸水结块，因此应密封保存。
危害：无。
五、实验试剂
1. 75%的乙醇
{75ml + 25ml水} →100ml75%的乙醇
2.ACD抗凝剂100ml（共需48ml，每管0.8ml）
{柠檬酸0.48g + 柠檬酸钠1.32g + 葡萄糖1.47g}→加水至100ml，灭菌后备用。
3.禽血裂解液100ml（共需51ml，每管1.7ml）
{尿素12g + SDS 1g + 1M Tris-HCl(PH8.0) 10ml + 0.5M EDTA(PH8.0) 20ml}→加水定容至100ml，备用。
【0.5M EDTA（PH8.0）】的配制：100ml
{水80ml + EDTA-2Na 18.61g}→用NaOH（约2g）调至PH8.0 →定容至100ml →分装后高压灭
菌备用。注：需加入NaOH调至PH8.0才能完全溶解。
4.氯仿-异戊醇（24:1）共需54ml，每管1.8ml
{氯仿96ml + 异戊醇4ml} = 100ml，4℃保存
5.酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）共需60ml，每管2ml
{氯仿-异戊醇（24:1）40ml + Tris饱和酚40ml} = 80ml，4℃保存
6. .TE缓冲液PH8.0 50ml
{10mM Tris-HCl（PH8.0）缓冲液0.5ml + 0.5M EDTA（PH8.0）0.1ml}→
→定容到50ml →高压灭菌后冷却4℃保存
【0.5M EDTA（PH8.0）】的配制：100ml
{水80ml + EDTA-2Na 18.61g}→用NaOH（约2g）调至PH8.0 →定容至100ml →分装后高压灭菌备用。注：需加入NaOH调至PH8.0才能完全溶解。
【10mM Tris-HCl（PH8.0）缓冲液】的配制：10ml
{1M Tris-HCl PH8.0缓冲液100μl + 水9.9ml}→定容至10ml →10mM Tris-HCl（PH8.0）缓冲液
六、实验步骤
1.采用翅静脉采血，抽取血液5mL，溶于20mL 75%的乙醇中，振荡混匀，配成家鸡血样25ml（酒精：血＝4：1）
目的：乙醇可以抑制DNA水解酶的活性，防治DNA降解，并且75%有防止血液凝固的作用。75%乙醇效果比无水乙醇效果好，血样不至于太干涩。酒精:血(4:1)混合的血样保存时间长，可达4个月。2.取血样(酒精:血＝4:1)680μL至5mL离心管中，8000转离心1分钟，弃上清；
目的：去除血样中大部分的乙醇，保证后面蛋白酶K的活性。
3.加800μLACD摇匀，8000转离心1分钟，弃上清；再加800μLACD摇匀，8000转离心1分钟，弃上清； 目的：ACD抗凝剂可以螯合血液中的钙离子，防治血细胞凝集成团凝固，影响血细胞的破碎和对血细胞里DNA的提取。多次离心可以去除血样中的乙醇，保证后面蛋白酶K的活性。
4.加1700μL裂解液，10μL蛋白酶K（100μg），摇匀，55℃水浴保温过夜；
目的：DNA裂解液的作用是破坏细胞膜、核膜,并使组织蛋白与DNA分离，抑制细胞中DNase的活性；而蛋白酶k的作用是将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来，蛋白酶k还可以消化DNAse，提高DNA产量。55℃水浴保温过夜可以让蛋白酶K充分发挥作用。
5.加2mL饱和酚，摇匀至无块状物，12000转离心10分钟；
目的：饱和酚是强蛋白质变性剂，可以将蛋白质及降解后的产物充分变性，变性后的蛋白质溶解度减低，易沉淀。
6.吸取上层透明的DNA溶液至另一5mL离心管中，注意不要搅拌下层的酚－蛋白层；
目的：加入饱和酚后溶液分层，上层是透明的DNA溶液，再往下是变性的蛋白质，饱和酚的比重最大在最下层。
7.加2mL酚-氯仿-异戊醇（25：24：1），摇匀至悬浮液，12000转离心10分钟；
目的：加入酚-氯仿-异戊醇进一步去除DNA溶液中的残留蛋白质。
8.吸取上层DNA液于另一5mL离心管中，加1.8mL氯仿-异戊醇溶液，摇匀，12000转离心10分钟；
目的：由于酚与水有部分混溶，DNA水溶液中会混有部分酚，由于氯仿和酚互溶而不溶于水，用氯仿-异戊醇在抽提一次可以把酚带走。
9.吸取上层DNA液900μL于另一5mL离心管中，加无水乙醇至满，颠倒混合，试管中出现白色团块，即是DNA；
目的：DNA水溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇与DNA不相溶但与水相溶，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合收集。用无水乙醇的目的是乙醇中如果含有水，DNA会部分溶于水中，降低DNA沉淀的产量。
10.吸出试管中的无水乙醇，加75%的乙醇，混合，吸出75%的乙醇，重复2次；
目的：像前面步骤中加入的抗凝血剂中的柠檬酸钠、葡萄糖，裂解液中的SDS、EDTA-2Na，在氯仿及醇中的溶解度低，经乙醇沉淀后的DNA中会有以上杂质存在。以上杂质有个共同的特征就是都易溶于水，故用75%的乙醇洗涤，可以利用其中的15%的水溶解这些杂质除去。
11.将DNA自然晾干后溶入1000 L TE缓冲液，-20℃保存；
目的：乙醇已挥发除去，TE缓冲液一可以抑制Dnase活性，二维持一定碱性PH值，有助于DNA的溶解和稳定。
七、实验注意事项
1.在整个实验过程中应严格执行无菌操作；
2.部分药品有毒，操作中应注意安全防护；
3.刚投入水浴时可以稍快速的晃动，之后的晃动一定要轻柔；
4.抽提时不要有太力振动，操作也要仔细，尽量避免DNA断裂；
5.吸出试管中的无水乙醇时用的枪头一定要剪过的，这点很重要，过尖的枪头会把DNA链弄断。
八、思考题
1.本实验中几次用到的不同浓度乙醇的作用是什么？
九、实验安排
全班55人，按照学号分组，每6人一组，共9组，最后一组7人。
每组作3个离心管，共用一个研钵。
每3组（共18人9个离心管）共同进行离心操作。
实验动物取血(优质参考)
名称：实验动物的取血 关键词：动物,取血,方法 目的：规范实验动物(家兔、狗，豚鼠，)取血的方法和途径, 主体内容： （一）家兔 1．耳缘静脉取血法 选好耳缘静脉，拔去被毛，用二甲苯或酒精涂擦局部，小血管夹夹紧耳根部，使血管充血扩张。术者持粗针头从耳尖部血管，逆回流方向刺入静脉内取血，或用刀片切开静脉，血液自动流出，取血后棉球压迫止血，取血量2～3ml。压住侧支静脉，血液更容易流出；取血前耳缘部涂擦液体石蜡，可防止血液凝固。 2．耳中央动脉取血法 家兔固定箱内，用手揉擦耳部，使中央动脉扩张。左手固定兔耳，右手持注射器，中央动脉末端进针，与动脉平行，向心方向刺入动脉。一次取血量15ml。取血后棉球压迫止血。注意兔耳中央动脉易发生痉挛性收缩。抽血前要充分使血管扩张，在痉挛前尽快抽血，抽血时间不宜过长。中央动脉末端抽血比较容易，耳根部组织较厚，抽血难以成功。 3．后肢胫部皮下静脉取血法 家兔固定于兔台上，剪去胫部被毛，股部扎止血带，胫外侧皮下静脉充盈。左手固定静脉，右手持注射器，针头与静脉走向平行，刺入血管后回抽针栓即有血液进入注射器。
4．心脏取血法 将家兔固定于兔台上，或由助手在坐位将家兔以站立位固定，剪去胸部被毛，常规消毒。术者在胸骨左侧3～4肋间摸到心尖搏动，在心搏最明显处作穿刺点；右手持注射器，将针头插入肋间隙，在左手触摸到心跳的配合下，垂直刺入心脏，当持针手感到心脏搏动时，再稍刺入即到达心腔。每次抽血量20～2 5ml。针头宜直入直出，不可在胸腔内左右探索。拔针后棉球压迫止血。 家兔颈动静脉和股动静脉取血法与大鼠相同，均需作相应的血管分离手术。 （二）豚鼠 1．心脏取血法 豚鼠心脏取血法与家兔基本相同。取血量可根据需要，采集部分血5～7ml，采集全部血15～20ml。 2．背中足静脉取血法 助手固定动物，将后肢膝关节拉直。术者可从动物脚背面找到背中足静脉，常规消毒后，左手拉住豚鼠趾端，右手持注射器穿刺，抽血后立即用纱布或棉球压迫止血。反复取血可两后肢交替使用。 （三）狗 1．心脏取血法 狗心脏取血方法与家兔相同。可抽取较多的血液。 2．小隐静脉和头静脉取血法 小隐静脉从后肢外踝后方走向外上侧，头静脉位于前肢脚爪上方背侧正前位。剪去局部背毛。助手握紧腿，使皮下静脉充盈。术者按常规穿刺即可抽出血液。
二十种常见实验动物模型
二十种常见实验动物模型 一、缺铁性贫血动物模型 缺铁性贫血（iron deficiency anemia，IDA）是体内用来合成血红蛋白（HGB）的贮存铁缺乏，HGB合成减少而导致的小细胞低色素性贫血，主要发生于以下情况：（1）铁需求增加而摄入不足，见于饮食中缺铁的婴幼儿、青少年、孕妇和哺乳期妇女。（2）铁吸收不良，见于胃酸缺乏、小肠粘膜病变、肠道功能紊乱、胃空肠吻合术后以及服用抗酸和H2受体及抗剂等药物等情况。（3）铁丢失过多，见于反复多次小量失血，如钩虫病、月经量过多等。 IDA是一种多发性疾病，据报道，在多数发展中国家，约2/3的儿童和育龄妇女缺铁，其中1/3患IDA，因此，研究IDA的预防和治疗具有重要的意义。在这些研究中，缺铁性贫血的动物模型（Animal model of IDA），又是实施研究的基础工具。常见的IDA动物模型的构建技术如下： 实验动物：一般选用SD大鼠，4周龄，雌雄不拘，体重65g左右，HGB≥130g/L。 建模方法：低铁饲料加多次少量放血法。低铁饲料一般参照AOAC 配方配制，采用EDTA浸泡处理以去除饲料中的铁，饲料中的含铁量是诱导SD大鼠形成缺铁性贫血模型的关键，现有研究表明，饲喂含铁量<15.63mg/Kg的饲料35天，SD大鼠出现典型IDA表现，而饲喂
含铁40.30mg/Kg的饲料SD大鼠出现缺铁，但并不表现贫血症状。建模时一般采用去离子水作为动物饮水，以排除饮水中铁离子的影响。少量多次放血主要用于模拟反复多次小量失血导致的铁丢失，还可以加速贫血的形成。放血一般在低铁饲料饲喂2周后进行，常用尾静脉放血法，1～1.5ml/次，2次/周。 模型指标：（1）HGB≤100g/L；（2）血象：红细胞体积较正常红细胞偏小，大小不一，中心淡染区扩大，MCV减小、MCHC降低；（3）血清铁（SI）降低，常小于10μmol/L，血清总铁结合力（TIBC）增高，常大于60μmol/L。 需要指出的是，以上模型不能用于铁吸收不良相关IDA的防治研究。根据具体的研究需要，也可以适当调整建模方法。 二、白血病动物模型 用免疫耐受性强的人类胎儿骨片植入重症联合免疫缺陷病(SCID)小鼠皮下，出于人类造血细胞与造血微环境均植入小鼠，建立具有人类造血功能的SCID小鼠模型称为SCID－hu小鼠。再将髓系白血病患者的骨髓细胞植入SCID－hu小鼠皮下的人类胎儿骨片内，植入的髓系白血病细胞选择性生长在SCID－hu小鼠体内的人类造血微环境中，即为人类髓系白血病的小鼠模型。SCID小鼠是由于其scid所致。T、B淋巴细胞功能联合缺陷，这种小鼠能接受人类器官移植物。 造模方法：
实验动物的处死方法
实验动物的处死方法 摘要阐述了实验动物的几种常用的处死方法,包括物理方法致死、化学药物致死、特殊实验动物的处死等,并从动物福利角度讨论了这些方法的利弊,以为实验动物的使用提供参考。 关键词实验动物;处死方法;动物福利 安乐死是英文单词Euthanasia的中译,Euthanasia一词来源于古希腊语,意思是美好的死亡、快乐的死亡、无痛苦的死亡。日本学者将Euthanasia翻译为“安乐死”,这一译称为中国学者所接受[1]。实施安乐死一般遵循以下原则:①尽量减少动物的痛苦,尽量避免动物产生惊恐、挣扎、喊叫。②注意实验人员安全,特别是在使用挥发性麻醉剂(乙醚、安氟醚、三氟乙烷)时,一定要远离火源。③方法容易操作。④不能影响动物的实验结果。⑤尽可能缩短致死时间,即安乐死从开始到动物意识消失的时间。⑥判定动物是否被安乐死,不仅要看动物呼吸是否停止,而且要看神经反射、肌肉松弛等状况[2]。 1物理方法致死 1.1急性失血法 此法应用于大鼠和小鼠等小动物时,常是剪断动物的股动脉,放血致死。可以采用摘眼球法,在鼠右侧或左侧眼球根部将眼球摘去,使其大量失血致死。如果是犬、猫或兔等稍大型动物应先使动物麻醉、暴露股三角区或腹腔,再切断股动脉或腹主动脉,迅速放血。动物在3~5 min内即可死亡[3]。采用急性失血法动物十分安静,对动物的脏器无损害,但器官贫血比较明显,若采集组织标本制作病理切片时可用此法。 1.2断头法 此法适用于鼠类等小动物,可用直剪刀,也可用断头器。断头法处死动物时间短,并且脏器含血量少,若需采集新鲜脏器标本可采用此法。断头法会引起血液循环的突然中断和血压的迅速下降并伴随意识的消失,只能用于恒温动物。对于变温脊椎动物不推荐用断头法,因为它们相对能更高的抵制缺氧[4]。 1.3空气栓塞法 当空气注入静脉后,可阻塞其分支,进入心脏冠状动脉可造成冠状动脉阻塞,发生严重的血液循环障碍,动物很快死亡。此法适用于较大动物的处死,家兔、猫用此法需注入20~40 mL空气,犬致死的空气剂量为80~150 mL。由于应用此法后,动物死于急性循环衰竭,所以各脏器淤血十分明显。
实验动物采血指南
实验动物采血指南 采血方法的选择，决定于实验的目的所需血量以及动物种类。凡用血量较少的检验如红、白细胞计数、血红蛋白的测定，血液涂片以及酶活性微量分析法等，可刺破组织取毛细血管的血。当需血量较多时可作静脉采血。静脉采血时，若需反复多次，应自远离心脏端开始，以免发生栓塞而影响整条静脉。例如，研究毒物对肺功能的影响、血液酸碱平衡、水盐代谢紊乱，需要比较动、动脉血氧分压、二氧化碳分压和血液pH值以及K+、Na+、CI-离子浓度，必须采取动脉血液。采血时要注意：⑴采血场所有充足的光线；室温夏季最好保持在25-28℃，冬季，15-20℃为宜；⑵采血用具有采用部位一般需要进行消毒；⑶采血用的注射器和试管必须保持清洁干燥；⑷若需抗凝全血，在注射器或试管内需预先加入抗凝剂. 不同动物采血部位与采血量的关系
(一)小鼠、大鼠采血法 1.割(剪)尾采血当所需血量很少时采用本法。固定动物并露出鼠尾。将尾部毛剪去后消毒，然后浸在45℃左右的温水中数分钟，使尾部血管充盈。再将尾擦干，用锐器(刀或剪刀)割去尾尖0.3-0.5cm，让血液自由滴入盛器或用血红蛋白吸管吸取，采血结束，伤口消毒并压迫止血。也可在尾部作一横切口，割破尾动脉或静脉，收集血液的方法同上。每鼠一般可采血10余次以上。小鼠每次可取血0.1ml，大鼠0.3～0.5ml。 2.鼠尾刺血法大鼠用血量不多时(仅做白细胞计数或血红蛋白检查)，可采用本法。先将鼠尾用温水擦拭，再用酒精消毒和擦拭，使鼠尾充血。用7号或8号注射针头，刺入鼠尾静脉，拔出针头时即有血滴出，一次可采集10～50mm3。如果长期反复取血，应先靠近鼠尾末端穿刺，以后再逐渐向近心端穿刺。 3.眼眶静脉丛采血采血者的左手拇食两指从背部较紧地握住小鼠或大鼠的颈部(大鼠采血需带上纱手套)，应防止动物窒息。当取血时左手拇指及食指轻轻压迫动物的颈部两侧，使眶后静脉丛充血。右手持续接7号针头的1ml注射器或长颈(3～4cm)硬质玻璃滴管(毛细管内径0.5-1.0mm)，使采血器与鼠面成45℃的夹角，由眼内角刺入，针头斜面先向眼球，刺入后再转180度使斜面对着眼眶后界。刺入浓度，小鼠约2～3mm，大鼠约4～5mm。当感到有阻力时即停止推进，同时，将针退出约0.1-0.5mm，边退边抽。若穿刺适当血液能自然流入毛细管中，当得到所需的血量后，即除去加于颈部的压力，同时，将采血器拔出，以防止术后穿刺孔出血。若技术熟练，用本法短期内可重复采血均无多大困难。左右两眼轮换更好。体重20-25g的小鼠每次可采血0.2-0.3ml；体重200-300g大鼠每次可采血0.5-1.0ml，可适用于某些生物化学项目的检验。 4.断头取血采血者的左手拇指和食指以背部较紧地握住大(小)鼠的颈部皮肤，并作动物头朝下倾的姿势。右手用剪刀猛剪鼠颈，约1/2-4/5的颈部前剪断，让血自由滴入盛器。小鼠可采用约0.8～1.2ml;大鼠约5-10ml。 5.心脏采血鼠类的心脏较小，且心率较快，心脏采血比较困难，故少用。活体
从动物血液中提取基因组DNA方法的比较研究_逄洪波
第28卷第4期2005年12月 辽宁师范大学学报(自然科学版) Jour nal of Liao ning N ormal U nive rsity(N atural Science Edition) Vo l.28 No.4 Dec. 2005 文章编号:1000-1735(2005)04-0457-04 从动物血液中提取基因组DNA方法的比较研究 逄洪波1,2, 陈永燕1, 张恒庆2, 周其兴1 (1.大连大学生物工程学院,辽宁大连 116622;2.辽宁师范大学生命科学学院,辽宁大连 116029) 摘 要:从血液中提取基因组DNA的传统方法是先得到淋巴细胞,再用蛋白酶K、SDS消化,然后用酚、氯仿抽提,乙 醇沉淀.CTAB法提取基因组DNA多应用于植物和微生物,从全血中提取基因组DNA报道甚少.采用改良的CTAB 法从全血中提取基因组DNA,并以传统方法和TAKA RA Blood Genome DNA Extraction Kit作对照.结果表明: CT AB法可以得到大量的、较完整的基因组DNA,并且纯度达到1.8～2.0,可以满足PCR扩增和限制酶切等实验的 要求. 关键词:血液;CT A B法;DN A提取;PCR分析 中图分类号:R3 文献标识码:A 获得基因组DNA是进行后续分子生物学研究的基础,寻找合适的DNA提取方法是开展大多数分子生物学实验所面临的第一个问题.从血液中提取基因组DNA的方法大都是先得到淋巴细胞,再用蛋白酶K、十二烷基硫酸钠(SDS)消化,然后用酚、氯仿抽提,乙醇沉淀.该种方法的不足之处在于程序繁琐、耗时,而且蛋白酶K也比较昂贵.CTAB裂解提取法常用于新鲜植物组织的DNA提取.近年来, C TAB法也逐步应用于动植物标本和化石DNA的提取[1].刘波等[2]用C TAB法分别对稻蝗(Ox ya)的干标本和酒精浸泡标本的DNA进行提取并获得了满意结果.Yang等[3]用3种方法提取了Proboscide-an的化石和馆藏标本的DNA,也认为用C TAB法提取化石DNA的成功率最高.但是用CTAB方法从动物全血中提取基因组DNA报道甚少.本研究的目的在于寻找一种可以获得高质量,但耗费时间少、程序简单、节约药品的血液DNA提取方法. 1 材料和方法 采集新鲜的家兔全血(静脉血)[4,5],加入抗凝剂柠檬酸钠(ACD)[6],选用3种不同方法从全血中提取基因组DNA,并经琼脂糖凝胶电泳、紫外吸收光谱和PCR扩增来检测提取的DNA的纯度和浓度[7]. 1.1 血液标本的采集 对同一只健康家兔进行耳缘静脉取血,分装成每管0.5m L,冻存于-20℃. 1.2 DNA提取 1.2.1 试剂 4×C TAB提取液(0.1M Tris-H Cl(pH8.0),0.5M NaCl,0.5M EDTA,4g CTAB,1g PVP);氯仿-异戊醇(24∶1);异丙醇;抗凝剂ACD[8];磷酸盐缓冲液(PBS)[8];抽提缓冲液[8];蛋白酶K; T ris饱和酚等. 1.2.2 仪器 台式冷冻离心机(Biofuge prim o R15000rad/m in);紫外透射分析仪(S TS型,上海长明光学电子仪器厂);稳压稳流电泳仪(DYY—Ⅲ2型,北京六一仪器厂);紫外分光光度计(日本分光株式Jasco公司,V—560型). 1.2.3 方法 1.2.3.1 改良C TAB法 采用4×CTA B(Doy le&Doy le,1987)法并做适当的修改,具体步骤如下:在装有血液的2m L离心管中加入500μL预热的4×C TAB提取液和2μLβ-巯基乙醇,使材料完全分 收稿日期:2005-07-11 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30300021) 作者简介:逄洪波(1980-),女,辽宁盖州人,辽宁师范大学硕士研究生. 周其兴(1971-),男,四川资中人,大连大学副教授,博士.E-mail:dlzhqx@https://www.wendangku.net/doc/cc10237154.html,.
实验动物的处死方法(一)
实验动物的处死方法(一) 摘要阐述了实验动物的几种常用的处死方法,包括物理方法致死、化学药物致死、特殊实验动物的处死等,并从动物福利角度讨论了这些方法的利弊,以为实验动物的使用提供参考。 关键词实验动物;处死方法;动物福利 安乐死是英文单词Euthanasia的中译,Euthanasia一词来源于古希腊语,意思是美好的死亡、快乐的死亡、无痛苦的死亡。日本学者将Euthanasia 翻译为“安乐死”,这一译称为中国学者所接受1]。实施安乐死一般遵循以下原则:①尽量减少动物的痛苦,尽量避免动物产生惊恐、挣扎、喊叫。 ②注意实验人员安全,特别是在使用挥发性麻醉剂(乙醚、安氟醚、三氟乙烷)时,一定要远离火源。③方法容易操作。④不能影响动物的实验结果。⑤尽可能缩短致死时间,即安乐死从开始到动物意识消失的时间。⑥判定动物是否被安乐死,不仅要看动物呼吸是否停止,而且要看神经反射、肌肉松弛等状况2]。 1物理方法致死 1.1急性失血法 此法应用于大鼠和小鼠等小动物时,常是剪断动物的股动脉,放血致死。可以采用摘眼球法,在鼠右侧或左侧眼球根部将眼球摘去,使其大量失血致死。如果是犬、猫或兔等稍大型动物应先使动物麻醉、暴露股三角区或腹腔,再切断股动脉或腹主动脉,迅速放血。动物在3~5min内即可死亡3]。采用急性失血法动物十分安静,对动物的脏器无损害,但器官
贫血比较明显,若采集组织标本制作病理切片时可用此法。 1.2断头法 此法适用于鼠类等小动物,可用直剪刀,也可用断头器。断头法处死动物时间短,并且脏器含血量少,若需采集新鲜脏器标本可采用此法。断头法会引起血液循环的突然中断和血压的迅速下降并伴随意识的消失,只能用于恒温动物。对于变温脊椎动物不推荐用断头法,因为它们相对能更高的抵制缺氧4]。 1.3空气栓塞法 当空气注入静脉后,可阻塞其分支,进入心脏冠状动脉可造成冠状动脉阻塞,发生严重的血液循环障碍,动物很快死亡。此法适用于较大动物的处死,家兔、猫用此法需注入20~40mL空气,犬致死的空气剂量为80~150mL。由于应用此法后,动物死于急性循环衰竭,所以各脏器淤血十分明显。 1.4断髓法 此法适用于小鼠、大鼠等小动物。用于家兔时可敲击延髓致死,用木锤用力锤动物的后脑部,破坏延脑,动物痉挛后死亡,简单迅速。用于蟾蜍、蛙类可直接捣毁脊髓,将金属探针插入枕骨大孔,破坏脑脊髓使动物死亡,操作过程中要防止毒腺分泌物射入实验者眼内。 2化学药物致死 常用安乐死药物有:吸入式麻醉剂(包括CO2、CO、乙醚、三氯甲烷等)、氯化钾、巴比妥类麻醉剂、二氯二苯三氯乙(DDT)等。
动物实验基本技术及实验动物管理法规
动物实验基本技术 (一)耳缘切口采血：先将豚鼠耳消毒,用刀片沿血管方向割破耳缘,切口约长0.5cm,在切口边缘涂上20％的柠檬酸钠溶液，防治血凝，则血可自切口处流出。此法采血每次可采0.5ml。 (二)背中足静脉采血：固定豚鼠，将其右或左后肢膝关节伸直，脚背消毒，找出足静脉，左手拇指和食指拉住豚鼠的趾端，右手将注射针刺入静脉，拔针后立即出血。 (三)心脏采血：用手二、豚鼠采血方法 指触摸，选择心跳最明显的部位，把注射针刺入心脏，血液即流入针管。心脏采血时所用的针头应细长些，以免发生采血后穿刺孔出血。 三、兔的采血方法 (一)耳缘静脉采血：将兔固定,拔去耳缘静脉局部的被毛，消毒，用手指轻弹兔耳,使静脉扩张，用针头刺耳缘静脉末端,或用刀片沿血管方向割破一小切口,血液即流出。本法为兔最常用的采血方法，可多次重复使用。 (二)耳中央动脉采血：在兔耳中央有一条较粗的、颜色较鲜红的中央动脉。用左手固定兔耳，右手持注射器，在中央动脉的末端，沿着与动脉平行的向心方向刺入动脉，即可见血液进入针管。由于兔耳中央动脉容易痉挛，故抽血前必须让兔耳充分充血，采血时动作要迅速。采血所用针头不要太细，一般用6号针头，针刺部位从中央动脉末端开始，不要在近耳根部采血。 (三)颈静脉采血：方法同小鼠、大鼠的颈静脉采血。 (四)心脏采血：使家兔仰卧，穿刺部位在第三肋间胸骨左缘3mm处，针头刺入心脏后，持针手可感觉到兔心脏有节律的跳动。此时如还抽不到血，可以前后进退调节针头的位置，注意切不可使针头在胸腔内左右摆动，以防弄伤兔的心、肺。 四、狗的采血方法 (一)后肢外侧小隐静脉采血：后肢外侧小隐静脉位于后肢胫部下三分之一的外侧浅表皮下，由前侧方向后行走。采血时，将动物固定，局部剪毛、消毒，采血者左手紧握剪毛区上部或扎紧止血带，使下部静脉充血，右手用连有6号或7号针头的注射器刺入静脉，左手放松，已适当速度抽血即可。 (二)前肢背侧皮下头静脉采血：前肢背侧皮下头静脉位于前脚爪的上方背侧的正前位。采血方法同上 (三)颈静脉采血：前两种方法需技术熟练,且不适于连续采血。大量或连续采血时,可采用颈静脉采血，方法同小鼠、大鼠的颈静脉采血方法。 (四)股动脉采血：本法为采取动脉血最常用的方法。操作简便，稍加训练的狗，在清醒状态下将狗卧位固定于狗解剖台上。伸展后肢向外伸直，暴露腹股沟三角动脉搏动的部位，剪毛、消毒，左手中指、食指探模股动脉跳动部位，并固定好血管，右手取连有5号半针头的注射器，针头由动脉跳动处直接刺入血管，若刺入动脉一般可见鲜红血液流入注射器，有时还需微微转动一下针头或上下移动一下针头，方见鲜红血液流入。有时可能刺入静脉，必须重抽。抽血毕，迅速拔出针头，用干药棉压迫止血2-3分钟。 第六节实验动物各种体液、骨髓的采集方法 一、消化液的采集 (一) 唾液 1. 直接抽取法在急性实验中，可用吸管直接插入动物口腔或唾液腺导管抽吸唾液，此法非常简单，但从口腔抽吸唾液会有杂质混入。 2. 制造腮腺瘘法在慢性实验中,收集狗的唾液，要用外科手术方法将腮腺导管开口移向体外，即以腮腺导管为中心，切成一直径约2～3cm的圆形粘膜片，将此粘膜片，与周围组织分开，穿过皮肤切口引到颊外,将带有导管开口的粘膜片与周围的皮肤缝合,腮腺分泌的唾液就流出颊外。这种方法可以收集到较纯净的唾液。 (二)胃液 1. 直接收集胃液法急性实验时，先将动物麻醉，将插胃管经口插入胃内,在灌胃管的出口连一注射器，用此注射器可收集到胃液,此法适用于狗等大型动物。如是大鼠,需手术剖腹，从幽门端向胃内插入一塑料管，
药理实验中对动物的给药体积与采血体积控制
药理实验中对动物的给药体积与采血体积控制 本文由wyj摘要翻译 本文是2001年由欧洲制药工业协会联合会 (The European Federation of Pharmaceutical Industries and Associations ，EFPIA)和欧洲替代方法验证中心（European Centre for the Validation of Alternative Methods，ECV AM)联合发布的关于对动物不同途径给药或采血时所能充许的给药体积和采血体积指导原则。动物包括小鼠、大鼠、兔、狗、猴、豚鼠，给药方法包括po、ip、im、sc、一次性iv、缓慢静注、静脉点滴等的一般给药体积、最大充许给药体积、给药速度等，采血包括各种动物的最大充许采血量和恢复时间等。是一部实用、全面而又难得的指导原则，相信对从事药理、毒理研究者及其他动物实验工作者有一定的帮助。 下面的节选由wyj摘要翻译，原文见欧洲联盟欧洲制药工业协会联合会,A Good Practice Guide to the Administration of Substances and Removal of Blood, Including Routes and Volumes(2000). J. Appl. Toxicol. 21, 15–23 (2001) 第一部分：动物实验中的给药体积与给药速度 一、一般给药体积与速度 对于各种给药途径的最大给药体积，取决实验动物种属和制剂性质。一般推荐给药最大容积为见附表（（欧洲联盟欧洲制药工业协会联合会,2000）。 特殊给药途径每次的给药体积(英国药业会，1995）：每眼0.01 ml；⑥直肠0.5 ml/kg；⑦阴道：大鼠0.2 ml，兔1 ml；⑧吸入2 mg/L；⑨鼻：猴或犬每鼻孔0.1 ml。 表1各种给药途径的给药体积及可能的最大给药体积a （欧洲联盟欧洲制药工业协会联合会,2000） 给药途径与体积 (ml/kg, except b ml/site)d 动物种属 Oral sc ip im iv (单次) iv (缓慢注射) 小鼠10 (50) 10 (40) 20 (80) 0.05b (0.1)b 5 (25) 大鼠10 (40) 5 (10) 10 (20) 0.1b (0.2)b 5 (20) 兔10 (15) 1 (2) 5 (20) 0.25 (0.5) 2 (10) 犬 5 (15) 1 (2) 1 (20) 0.25 (0.5) 2.5 (5) 猴 5 (15) 2 (5) C (10) 0.25 (0.5) 2 c 狨猴10 (15) 2 (5) C (20) 0.25 (0.5) 2.5 (10) 小型猪10 (15) 1 (2) 1 (20) 0.25 (0.5) 2.5 (5) 说明: a:给非水溶液后，确定再次给药时间时应考虑前次药物是否已被吸收。肌肉内注射每天不能 超过2次。皮下注射每天限制在2~3个部位，前述皮下注射部位，不包括弗氏佐剂的使用。
良好的实验动物给药和采血规范指南
A Good Practice Guide to the Administration of Substances and Removal of Blood,Including Routes and Volumes 良好的实验动物给药与采血(包括途径与体积)规范指南 Karl-Heinz Diehl1, Robin Hull2, David Morton3, Rudolf Pfister4, Yvon Rabemampianina5, David Smith6,*, Jean-Marc Vidal7 and Cor van de V orstenbosch 8 1Aventis, PO Box 1140, D35001 Marburg, Germany 德国马尔堡市35001区1140信箱安万特公司 2N I B S C, Blanch Lane, South Miimms, Potters Bar, Hertfordshire EN6 3QG 英国赫特福德郡EN6 3QG波特斯巴镇South Miimms布兰奇道英国国家生物制品检定所 3The University of Birmingham, Medical School, Edgbaston, Birmingham B15 2TT 英国伯明翰市B15 2TT艾吉马斯顿伯明翰大学医学院 4Novartis Pharma AG, CH-4002 Basel, Switzerland 瑞士巴塞尔CH-4002诺华制药公司 5Centre de Recherche Pfizer, Etablissement d’Amboise, Z1 Poce′-sur-Cisse-BP 159 37401 Amboise Cedex, France 法国Amboise Cedex Z1 Poce′-sur-Cisse-BP 159 37401 Etablissement d’Amboise 辉瑞研究中心 6AstraZeneca R&D Charnwood, Bakewell Road, Loughborough, Leics LE11 5RH 英国莱斯特郡LE11 5RH拉夫堡市贝克韦尔路Charnwood阿斯利康研究中心 7Aventis, 102 Route de Noisy, 95235 Romainville Ce′dex, France 法国Romainville Ce′dex 95235 Noisy路102号安万特公司 8N V Organon, PO Box 20, 5340 BH Oss, Netherlands 荷兰BH Oss5340 20号信箱欧加农公司 Key words: blood volumes; blood removal; administration substances; laboratory animals; refinement、 关键词:血容量;采血;给药;实验动物;简化 This article is the result of an initiative between the European Federation of Pharmaceutical Industries Associations (EFPIA) and the European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECV AM)、Its objectives are to provide the researcher in the safety evaluation laboratory with an up-to-date, easyto-use set of data sheets to aid in the study design process whilst at the same time affording maximum welfare considerations to the experimental animals、 该文章为欧盟制药工业协会(EFPIA)与欧洲替代动物实验方法验证中心(ECV AM)之间的初步结果。其目的在于为安全性评价实验室的研究者提供最新的易于使用的数据库以帮助研究设计过程,同时最大可能地考虑到实验动物的福利。 Although this article is targeted at researchers in the European Pharmaceutical Industry, it is considered that the principles underpinning the data sets and refinement proposals are equally applicable to all those who use these techniques on animals in their research, whether in research institutes,universities or other sectors of industry、The
动物血中超氧化物歧化酶的提取和活性测定
动物血中超氧化物歧化酶的提取和活性测定原理 超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。离子(02-)是人体氧代谢产物，它在体内过量积累会引起炎症、肿瘤、色斑沉淀、衰老等疾病，超氧阴离子与生物体内许多疾病的发生和形成有关。由于SOD能专一消除超氧阴离子(O2 -)而起到保护细胞的作用，SOD作为一种药用酶，具有广阔的应用前景，并引起了国内外医药界、生物界和食品界的极大关注。 按金属辅基成分的不同可分成3种类型。最常见的一种含有铜锌金属辅基(CuZn-SOD)，主要存在于真核细胞的细胞质中，在高等植物的叶绿体基质、类囊体内以及线粒体膜间隙也有存在，CuZn-S0D 酶蛋白的分子量约为3.2×104，纯品呈蓝绿色，每个酶分子由2个亚基通过非共价键的疏水基相互作用缔合成二聚体。每个亚基(肽链)含有铜、锌原子各一个，活性中心的核心是铜。第二种含有锰离子(Mn-SOD)，主要存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中，在植物的叶绿体基质和类囊体膜上也有存在，纯品呈粉红色，由4条或2条肽链组成。第三种是Fe-S0D，过去一直认为只存在于原核细胞中，近来发现有一些真核藻类甚至某些高等植物中也有存在。Fe-SOD纯品呈黄色或黄褐色，由2条肽链组成，多数情况下每一个二聚体中含有一个Fe原子。 l969年，McCord和Fridovich第一次从牛血中提纯到超氧化物岐化酶。自然界中SOD分布极广，其含量随生物体的不同而不同，即使同一种生物的不同组织或同一组织的不同部位，其SOD的种类和含量也有很大差别。迄今为止人们已从细菌，真菌、原生动物。藻类、昆虫、鱼类、植物和动物等各种生物体内分离得到SOD。为拓宽提取SOD的原料，筛选或基因过程开发产SOD量较高的菌株。目前，研究开发最多的资源还是从动物血液、动物组织中制备提纯SOD。 SOD的活力测定方法很多，常见的有化学法、免疫法和等电点聚焦法。其中化学法应用最普遍，化学法的原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有色中间物和O2 -，利用SOD分解而间接推算酶活力。在化学方法中，最常用的有黄嘌呤氧化酶法，邻苯三酚法，化学发光法，肾上腺素法，NBT-还原法，光化学扩增法，Cyte 还原法等。其中改良的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用。化学发光法和光化学扩增法不适用于测定Mn-SOD，但对于Cu/Zn-SOD反应极灵敏。Cyte还原法用于Mn-SOD活力测定结果稳定，重复性好。但专一性和灵敏度不够理想，而且需要特殊仪器，实际应用受到限制。
项目二十七 常用实验动物的接种和采血方法
项目二十七常用实验动物的接种和采血方法 一、接种方法 (一) 皮下注射 皮下组织疏松的部位都可皮下注射。一般小鼠在腹部两侧，豚鼠在腹部或大腿内侧，家兔取背部，大腿内侧或耳根部皮下注射。注射部位消毒后，左手提起皮肤，右手持注射器将针头水平刺入皮下，针头摆动无阻力，说明已进入皮下，慢慢注入，注射部位随即隆起。注射完毕，用棉球压住针刺处，再拔出针头。小鼠注入量一般为0.2～0.5ml。家兔或豚鼠注入量为0.5～1.0ml． (二) 皮内注射 先将动物注射部位的毛剪去，消毒，然后左手绷紧皮肢，针头斜面向上，紧贴皮肤表层刺入，然后向上挑起再稍刺入，缓慢注射。若注入皮内，注射部位马上有小泡隆起。皮内注射量一般为0.1～0.2ml。 (三) 肌内注射 应选择肌肉发达、无大血管通过的部位。一般多选臀部、大腿内侧或外侧。针头直接刺入肌肉，回抽针栓如无回血即可注射。家兔等大动物注射量不超过2ml。 (四) 腹腔注射 小白鼠腹腔注射时，用右手拉鼠尾，左手食指和拇指捏住脑背部皮肤，翻转鼠体，把鼠尾和一侧的后腿夹于小指和无名指之间，使动物处于头低位，使内脏移向上腹，右手持注射器在下腹部左侧或右侧刺入皮下，沿皮下朝头部方向进针0.5～1.0cm，再以45°角刺入腹腔，此时有落空感，回抽无肠液，尿液或血液即可缓缓注入。家兔等较大动物注射，应先固定，于腹部腹中线旁侧1cm处进针。小鼠注射量一般为0.5～1.0ml，家兔或豚鼠为5ml。 (五) 静脉注射 1．家兔将家兔固定，用酒精棉球轻轻按摩耳翼，压迫耳根部静脉，使耳缘静脉扩张。用左手拇指与中、食指抓住耳尖部，从耳尖部边缘静脉平行进针，试推进少量注射液，如果觉得没有阻力，局部也没有隆起，表示已进入静脉，将注射液缓缓注入。若失败，再逐步向耳根部移位重新注射。注射完毕，用棉球压住针眼处，拔出针头。注射部位一般选用耳外缘静脉，易固定，表浅；耳内缘静脉深，不易固定，故不常用。 2．小鼠于尾部两侧静脉注射。固定小鼠使尾巴露出，置45℃～50℃温水浸泡1～2min，使尾部静脉扩张。取出尾巴，擦干消毒，在末端1/3或1/4处用左手捏住尾巴，右手持注射器，针头与静脉平行缓慢进针，试注入少许注射液，如无阻力，皮肤不发白，表示针头刺入静脉，否则应更换部位重扎。注射时多选用4 1/2# 针头。最大注射量为0.5ml。 二、采血方法 (一) 小鼠采血方法 1．断尾采血将小鼠固定，露出尾巴，用手轻揉或浸泡于45℃温水中数分钟或用酒精棉球涂擦，使尾血管充血。将鼠尾擦干，用剪刀剪去尾尖1～2mm。然后用手指从尾根部向尾尖捋，血即从断端流出。采血结束后消毒止血。此法采血每只小鼠可采十余次，每次可采血约0.1ml。 2．眼眶后静脉丛采血左手抓注鼠耳间头部皮肤，将头按在桌面或鼠笼上，轻压颈部两侧，引起头部静脉血液回流困难，使眼球充分突出，眶后静脉丛充血。右手持长为7～10cm 玻璃滴管(毛细管端内径1～1.5mm，长约1cm)或7# 针头的1ml 注射器，在内眼角与眼球之
动物实验方案设计
动物实验方案设计 动物实验指在实验室内，为了获得有关生物学、医学等方面的新知识或解决具体问题而使用动物进行的科学研究。以下小编为你整理了动物实验方案设计，希望对你有所参考帮助。 实验设计就是拟定实验方案，在进行科学研究时，对研究方案作合理的安排，以减少随机误差的影响。采用适当的研究实验次数，减少实验的成本并能对数据进行有效的分析，提高实验研究的可靠性，从而实现研究的目的。 研究设计包括专业设计与统计设计两个部分。统计设计主要是依据研究目的，从研究的现况条件出发，规定研究因素、选择效应指标、确定研究对象的引入方式方法和规模，拟实施的方法、方案，及数据收集、整理分析的模式，直至结果的解释，进行系统的安排，使其消耗最少的人力物力和时间，而获得可靠的信息与结论。 实验设计的基本要素为：实验单位、处理因素和实验效应。 (1)大多数情况下，实验单位等同于实验对象、受试对象，在动物实验中的动物即为实验单位。 (2)处理要素：是研究者根据研究目的施加于实验单位，在实验中需要观察并阐明其效应的因素，是实验单位分组的标志。而非处理因素则是指实验中非人为施加的、与处理因
素同时存在，同样可以使受试对象产生实验效应的因素，如实验动物的雌雄、体重等因素。突出研究因素的主导作用，排除混杂因素的干扰作用，可以通过相应的实验设计方法，尽量使非处理因素在各处理组中的分布达到一致或均衡，以便分离出处理因素的效应。另外，处理因素的施加方法、强度、频率和持续时间等，在整个实验中应始终保持不变，以保证实验结果评价的可靠性和稳定性；处理因素作用于受试对象的反应，是研究结果的最终体现，其基本要求客观性、特异性、灵敏性和精确性。 (3)实验效应：处理因素作用于实验动物后，出现实验效应，一般是用各种指标来反映的。指标按其性质可分为计数(含等级)指标和计量指标，计数指标如“是”“否”“有”“无”，“阳性”“阴性”，“痊愈”“显效”“好转”“无效”，“存活”“死亡”等。计量指标指可测量(含间接测量)的指标，如很多检查和检验指标。 在对指标进行观察时应注意： ①实验效应的观察应避免偏性。研究者的心理往往偏于阳性结果，为了消除或减少测量偏差，设计时常采用盲法。 ②应注意处理和效应的关系：处理与效应之间存在一定的关系，如剂量反应曲线。做实验应选择一个合适的实验剂量。 实验设计的三大原则即为重复(replication)、随机化
(完整版)各动物采血方法
各种动物采血方法及注意事项 1牛的静脉采血 1.1牛颈外静脉采血颈外静脉位于颈部肩骨乳突肌与胸头肌间凹窝处的颈静脉沟内。牛站立，助手保定好头部，使头部稍前伸上仰并稍偏向对侧，颈部稍有弯曲，颈静脉暴露出来，局部剪毛，消毒，术者稍弓腰蹲于颈静脉暴露的一侧，用左手拇指或食指与中指在颈静脉沟稍下方（近心端）压迫静脉管，使颈静脉充盈怒张，部分牛由于膘肥看不清，此时就要用左手食指和中指点击颈静脉沟，有跳动，再按压，用右手食指和中指探摸跳动的部位，有波动和弹性的管状物，颈为颈外静脉。右手拇指、食指、中指夹住16号针头，对准颈外静脉，并使针头与皮肤接近垂直（75°角），用腕力迅速将针头扎进皮肤，穿入血管，血液会喷射出来，即可采血，停止采血后先松左手，后拔针头，用消毒棉球压迫采血部位1min。 1.2牛尾静脉采血牛自然站立保定，术者站于牛的正后方，左手抓住牛尾中段用力抬起，使之与地面平行，右手触摸尾椎前段腹侧凹陷沟（大约在尾后下方4-5cm处），消毒后持12号针头与尾椎纵轴成垂直方向，依靠腕力快进针0.5-1cm后血液即喷射出来。 2马的静脉采血 马的颈静脉比较浅显，位于静脉沟内，术者用左手拇指或食指和中指横压颈下1/3与颈中1/3处的颈静脉沟，使脉管充盈怒张，右手持16号针头沿颈静脉在压迫点前方与皮肤成45°角用腕力迅速刺入皮肤血管内，感到空虚无阻力即见回血后，再沿脉管向前进针使针头
靠近皮肤靠近皮肤以减小其间的角度，近似平行地将针头再伸入血管内1-2cm，血液流出，即可采血。停止采血后，先松左手，后拔出针头，并用消毒棉球压迫采血点2min止血消毒。 3猪静脉采血 3.1耳静脉采血用捕猪器将猪站立保定，耳静脉局部常规消毒处理，助手用手指捏压耳根部静脉管处或用胶带于耳根部结扎，使静脉充盈，怒张，也可用酒精棉球反复擦静脉血管使之充血，血管怒张，或用手指弹叩引起血管充盈。术者用左手拇指和食指把持耳尖，将耳拉直托平，用中指、无名指和小指在耳下面向上托，使采血进针部位稍高，右手持一次性血样采集针沿静脉管使针头与皮肤呈30°角，向远心端刺入血管，有空虚感无阻力时即进入血管。回血，立即插入负压管采血。采血结束后，先松开握耳根的手，再拔针头，干棉球压迫采血处1min，伤口不出血为止。 3.2前腔静脉采血：前腔静脉由左右两侧的颈静脉与腋静脉在第一对肋骨的胸腔入口的气管腹侧面汇合而成。采血部位在第一肋骨与胸骨柄结合处的前方，由于左侧靠近膈神经，易损伤，故多于右侧进行采血，针头刺入方向呈近似垂直稍向中央及胸腔倾斜，刺入深度依猪体大小2-6cm，针头7-12号。站立保定时进针部位在右侧，于耳根至胸骨柄的连线上，距胸骨端1-3cm处，术者拿连接针头的注射器，稍斜向中央刺向第1肋骨间胸腔入口处，边刺边抽动注射器活塞，见回血即可采血，仰卧保定时胸骨柄向前突出，并于两侧第1肋骨结合处的直前侧方呈两个明显的凹陷窝称为前腔窝：是第1肋骨与胸骨柄
关于动物取血问题
1、关于小鼠血液量的问题： 小鼠循环血量占体重的6%，或50-70ml/kg，采血占全血量的10%不会对机体造成严重的不良影响。3-4周后可以重新采集一次。特别注意的是：老年小鼠血量降低。疾病会加重不良反应，所以必须考虑这些影响因素。采血后应补充响应体积的液体，如果需要很短时间反复采血，比如每天一次，每次的采血量不应超过全血的1%。 2、关于取血方法的问题： （1）尾尖取血：当所需血量很少时采用本法。固定动物并历出鼠尾，将鼠尾在45℃温水中浸泡数分钟，也可用二甲苯等化学药物涂擦，使局新血管扩张。将鼠尾擦干，剪去尾尖，血自尾尖流出，让血液滴入盛器或直接用移液器吸取。如需间隔一定时间，多次采取鼠尾尖部血液，每次采血时，将鼠尾剪去很小一段，取血后，先用棉球压迫止血并立即用6％液体火棉胶涂于尾巴伤口处，使伤口外结一层火棉胶薄膜，保护伤口。也可采用切割尾静脉的方法采血，三根尾势脉可交替切割，并自尾尖向尾根方向切割，每次可取0.2～0.3ml血，切割后用棉球压迫止血。这种采血方法在大鼠进行较好，可以较长的间隔时间连续取血，进行血常规检查。 （2）眼眶后静脉丛取血：当需中等量的血液，而又需避免动物死亡时采用此法。用左手固定鼠，尽量捏紧头部皮肤，使头固定，并轻轻向下压迫颈部两侧，引起头部静脉血液回流困难，使眼球充分外突（示眼眶后静脉丛充血），右手持毛细玻璃管，沿内眦眼眶后壁向喉头方向旋转刺入。刺入深度小鼠2～3mm，大鼠4～5mm。当感到有阻力时再稍后退，保持水平位，稍加吸引，由于血压的关系，血液即流人玻璃管中。得到所需的血量后，拨出毛细管。若手法恰当，小鼠约可采血0.2～0.3ml，大鼠约可采血0.4～0.6ml。 （3）断头取血：当需要较大量的血液，而又不需继续保存动物生命时采用此法。左手捉持动物，使其头略向下倾，右手持剪刀猛力剪掉鼠头，让血液滴入盛器。小鼠可采血0.8～1.0ml，大鼠可采用5～8ml。 （4）眶动脉和眶静脉取血：此法既能采取较大量的血液，又可避免断头取血法中因组织液的混入导致溶血的现象，现常取代断头取血法。先使动物眼球突出充血后，以弯头眼科镊迅速钳取眼球，并将鼠倒置，头向下，眼眶内很快流出血液，让血液滴入盛器，直至不流为止。此法由于取血过程中动物未死，心脏不断在跳动，因此取血量比断头法多，一般可取鼠体重4～5％的血液量，是一种较好的取血方法。 （5）心脏取血：动物仰卧固定在固定板上，剪去心前区部位的被毛，用碘酒酒精消毒皮肤。在左侧第3～4肋间，用左手食指摸到心搏处，右手取连有4～5号针头的注射器，选择心搏最强处穿刺，当针刺入心脏时，血液由于心脏跳动的力量自动进人注射器。此法要求实验者掌握以下要点：要迅速而直接插入心脏，否则，心脏将从针尖处滑脱；如第一次没刺准，将针头抽出重刺，不要在心脏周围乱探，以免损伤心、肺；要缓慢而稳定的抽吸，否则，太多的真空反而使心脏塌陷。若不需保留动物生命时，也可麻醉后切开动物胸部，将注射器直接刺人心脏抽吸血液。 （6）大血管取血：大、小鼠还可从颈动、静脉，股动、静脉和腋下动、静脉取血，在这些部位取血均需麻醉后固定动物，然后作动、静脉分离手术，使其暴露清楚后，用注射器沿大血管平行刺入（或直接用剪刀剪断大血管），抽取所需血量。切断动脉时，要防止血液喷溅。
从动物血液中提取DNA(英文)
ＤＮＡ Ｆｒｏｍ Ｗｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ ｆｏｒ ＰＣＲ （ｆｒｏｍ Ｈｉｇｕｃｈｉ， Ｒ． （１９８９） Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ２： １－３） １．Ｏｂｔａｉｎ ６５－１００ μｌ ｏｆ ｂｌｏｏｄ ｂｙ ｒｅｔｒｏ－ｏｒｂｉｔａｌ ｂｌｅｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｈｅｐａｒｉｎｉｚｅｄ ｍｉｃｒｏｃａｐｉｌｌａｒｙ ｔｕｂｅ． Ｅｘｐｅｌ ｂｌｏｏｄ ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ ｉｎｔｏ ａ １．５ ｍｌ ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ ｔｕｂｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ２０ μｌ ｏｆ １０ ｍＭ ＥＤＴＡ． Ｍｉｘ ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ ｔｏ ｐｒｅｖｅｎｔ ｃｌｏｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｓｔｏｒｅ ｏｎ ｉｃｅ ｕｎｔｉｌ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ． ２．Ａｄｄ ２００ μｌ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ ｔｏ ｅａｃｈ ｔｕｂｅ ａｎｄ ｖｏｒｔｅｘ ｔｏ ｓｕｓｐｅｎｄ ｅｖｅｎｌｙ． ３．Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ ２５ ｓｅｃｏｎｄｓ ａｔ １６０００ｘｇ ｔｏ ｐｅｌｌｅｔ ｎｕｃｌｅｉ． ４．Ｒｅｍｏｖｅ ａｎｄ ｄｉｓｃａｒｄ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ａｎｄ ｒｅｐｅａｔ ｓｔｅｐｓ ２－４ ｔｗｏ ｍｏｒｅ ｔｉｍｅｓ， ｏｒ ｕｎｔｉｌ ｎｏ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｒｅｍａｉｎｓ． ５．Ｒｅｓｕｓｐｅｎｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｅｌｌｅｔ ｉｎ １００ μｌ ＰＢＮＤ ｗｉｔｈ ６０ μｇ／ｍｌ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ ａｎｄ ｉｎｃｕｂａｔｅ ａｔ ５５ Ｃ ｆｏｒ ６０ ｍｉｎｕｔｅｓ （ｏｒ ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ， ｉｆ ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ）． ６．Ｈｅａｔ ｓａｍｐｌｅｓ ｔｏ ９７ Ｃ ｆｏｒ １０ ｍｉｎｕｔｅｓ ｔｏ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ． ７．Ａｄｄ １－５ μｌ ｏｆ ＤＮＡ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ ａ ２５ μｌ ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ． Ｒｅａｇｅｎｔｓ： １） Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ ０．３２ Ｍ Ｓｕｃｒｏｓｅ １０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ （ｐＨ ７．５） ５ ｍＭ ＭｇＣｌ２ １％ ｖ／ｖ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００