基因工程复习重点

基因工程期末复习

第一章：基因工程

1. 定义：通过基因操作来定向改变或修饰生物体或人类自身，并具有明确应用目的的活动称为基因工程。

2. 基因工程研究的主要内容或步骤：

基因克隆的通用策略：涉及的过程可用分/合成、切、连、转、选、鉴。

①从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段；

②在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子；

③将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（寄主细胞），并与之一起增殖；

④从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了细胞重组DNA分子的受体细胞克隆；

⑤从筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用；

⑥将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。

3.三大元件：载体、质粒、片段。

第二章：分子克隆工具酶

1、工具酶：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、DNA修饰酶、核酸外切酶、单链核酸内切酶。

2、限制性内切酶：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核苷酸内切酶。三种（Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、Ⅲ型酶）

3、甲基化酶：原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主DNA 不被相应的限制酶所切割。三种（）

4、回文结构：双链DNA中含有的二个结构相同、方向相反的序列称为反向重复序列，每条单链以任一方向阅读时都是一样的。

5、同裂酶（isoschizomers)：指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。同裂酶可能进行同样的切割，产生同样的末端。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。

6、同尾酶（isocaudamer）：指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。

7、影响核酸内切酶活性的因素：①DNA浓度②DNA的甲基化程度③酶切消化反应的温度（大多数酶的标准反应温度37度）④DNA的分子结构。

星星活性：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称为星星活性（star activity)。

8、Ｔ4连接酶：该酶常从Ｔ4噬菌体的受感细胞中提取，是由Ｔ4噬菌体基因组所编码的，所以基因工程中常用的连接酶是Ｔ4连接酶。

9、影响连接酶作用的因素

①反应温度：连接缺口的温度：37℃；连接粘性末端的最佳温度：4～15 ℃。

②Ｔ4DNA连接酶的用量：平末端DNA分子的连接反应中，最适1～2个单位。粘性末端DNA片断之间的连接，酶浓度0.1个单位。A TP的用量10μmol~1mmol/L之间。

③提高外源片断与载体的浓度的比值，（10～20倍）。

10、常用的连接方法：同聚物加尾法、衔接物法和接头连接法。

11、DNA聚合酶：DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成（在具备模板、引物、dNTP 等的情况下）及其相辅的活性。依赖于DNA的DNA聚合酶：DNA聚合酶Ⅰ(全酶)；DNA

聚合酶Ⅰ大片段(klenow片段)；耐热DNA聚合酶(Taq 酶)；依赖于RNA的DNA聚合酶：反转录酶。

12、DNA聚合酶Ⅰ活性：三种酶活性①5’→3’DNA聚合酶活性②5’→3’③3’→5’核酸外切酶活性。

13、逆转录酶：以单链RNA为模板合成双链DNA的反应。5’→3’合成DNA，无3’→5’外切活性。

第三章分子克隆载体

1、载体：将外源DNA或基因携带入宿主细胞(host cell)的工具。（克隆载体、表达载体）

来源：质粒载体、噬菌体载体、人工染色体载体、病毒载体。

二.质粒：染色体外的遗传因子，能自我复制，多数为双链闭环DNA，大小1KB-200KB

外源DNA如超过10kb，则重组质粒的转化率和DNA得率都非常低。

三大特性：自我复制、克隆位点、筛选标记（其他如易分离纯化，具有启动子）

1、能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。

2、要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点（多克隆位点multiple cloning sites ，MCS）。

3、有适合的标记，易于选择。

表达性质粒载体：按特殊设计构建的，能使克隆在其中特定位点的外源真核基因的编码序列，在大肠杆菌细胞中正常转录并转译成相应蛋白质的克隆载体。

主要包括：大肠杆菌的启动子、及操纵位点序列、多克隆位点、转录及转译信号、质粒载体的复制起点及抗菌素抗性基因。

1.构型：SC型共价闭合环形DNA（ccc DNA）、OC型开环DNA（ocDNA）、L 型线性DNA。

3.质粒的不相容性：在同一个大肠杆菌细胞，一般不能同时含有两种同一复制系统的质粒。也称为质粒的不相容性。

是指在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。

质粒的不亲合性分子基础，主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。

4.质粒DNA的转移性：在天然条件下，很多天然质粒都可以通过细菌接合作用从一种宿主细胞内转移到另外一种宿主内，这种转移依赖于质粒上的tra基因产物。

5.改造天然质粒方法：

（1）加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择。

（2）增加或减少合适的酶切位点，便于重组。

（3）缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量。

（4）改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝。

（5）根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件；方法就是重组。

6.质粒载体必须具备的基本条件：

（1）具有复制起点；（replication origin）自我增值的基本条件，一般具一个复制子。

（2）具有筛选标签；理想的质粒载体具有两种抗菌素抗性基因。

（3）具有若干限制酶切单一位点（MCS multiple cloning sites ）；

（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。

7.质粒载体的选择记号：抗菌素抗性（氨苄青霉素抗性基因ampr、四环素抗性基因tetr、氯霉素抗性基因Cmr、卡那霉素抗性基因kanr新霉素neor抗性基因）

8.α－互补：①lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补

②宿主和载体各自编码的α片段和ω片段虽然没有酶活性，但是当载体和宿主细胞同时表达时，产生的α片段和ω片段发生互补，可形成具有酶活性的β-半乳糖苷酶，称作α－互补这个互补系统用来监测质粒上有无插入序列

③蓝白斑筛选：pUC质粒

在LacZ—的大肠杆菌中，在有IPTG诱导物和X-gal生色底物的平板培养中，菌落是白色的。若在该细胞中引入pUC质粒，其上有LacZ′，质粒和大肠杆菌DNA可实现α－互补，表达出β-半乳糖苷酶，可降解生色底物使菌落呈蓝色（有活性、阴性克隆）。

如果在质粒的多克隆位点的某个酶切点上克隆了外源基因，则LacZ′基因受到破坏，便不能再和缺陷型受体菌中生成有活性的β-半乳糖苷酶，因此菌落呈白色（无活性、阳性克隆）。

9.质粒DNA的分离和纯化

从细菌中提取质粒DNA的方法都包括以下三个步骤：培养细菌、收集和裂解细菌、纯化质粒DNA

三种方法：氯化铯密度梯度离心法；碱变性法；煮沸法

原理：碱变性法抽提质粒是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH12.6的高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA都发生变性，但质粒超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，所以当以pH4.8的KAc高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，保存在溶液中。而染色体DNA 不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

流程：

1、取1.5毫升含质粒的大肠杆菌过夜培养物，加在微量离心管中，离心收集细胞沉淀；

2、加入100微升冰冷的悬浮液，（50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl PH=8.0, 10mM EDTA，4~5mg溶菌酶）静置5分钟；

3、加入200微升微冷的裂解液（0.2NaOH，1.0%SDS）缓缓混匀置室温5分钟。

4、加入150毫升冰冷的PH=4.8的3M醋酸钠，振荡后，冰浴5分钟。

5、离心的上清液用苯酚抽提数次，用乙醇沉淀收集质粒DNA。

溶液Ⅰ：50mmol/L 葡萄糖; 25mmol/L Tris-Cl(pH8.0); 10mmol/L EDTA(pH 8.0) (主要作用：Solution I 中的EDTA可以螯合二价金属离子进而抑制依赖于二价金属离子的DNA酶的活性，对DNA起到保护作用。加入solutionⅠ后一定要充分打散菌体。)

溶液Ⅱ(pH 12.6) ：0.2mol/L NaOH ;1%SDS (现用现配) (主要作用：细胞壁肽聚糖碱性下水解，核酸和蛋白质变性. Solution II要新鲜配置,NaOH可吸收空气中的二氧化碳而减弱碱性。加入solution II后放置时间不要超过5min，以免变性质粒不易复性)

溶液Ⅲ(pH 4.8) ：100ml5mol/L NaAc 60ml; 冰醋酸11.5ml; 双蒸水28.5ml (作用：中和碱液，质粒DNA复性，变性蛋白－SDS＋, 线性DNA沉淀)

三噬菌体载体

1.基本过程：吸附、注入、合成、组装、释放

2.λ噬菌体载体（特有多极调控、9-23KB）

DNA是一条线性双链DNA分子，一旦进入宿主细胞，黏性末端互补配对形成双链环

状DNA分子，这种黏性末端结合形成的双链区段称为COS位点，随后闭合充当转录模板λ噬菌体载体的主要类型

1. 插入式载体通过特定的酶切位点允许外源DNA片段插入的载体。

2. 替换型载体（取代型载体）：具有成对的克隆位点，允许外源DNA片段替换非必需DNA 片段的载体。（广泛）

3.柯斯质粒载体：是一类人工构建的含有λ-DNA cos序列和质粒复制子的特殊类型载体，也称为黏粒载体（45KB）

特点：具有λ噬菌体特性（cos位点）、具有质粒载体特性、具有高容量的克隆能力

四其他载体

1.酵母载体：整合型载体（YIp）、复制型载体（YNp）、附加体型载体（YEp）

2.人工染色体载体（一种穿梭载体:能够在两类不同宿主中复制、增殖和选择的载体）

①酵母人工染色体（YAC）：选择标记主要采用营养缺陷型基因，例如带有突变赭石突变抑制基因在培养基上形成红色菌落，而带有赭石突变抑制基因SUP4则为白色

②细菌人工染色体（BAC）又称F黏粒

五表达载体

1.克隆基因正确表达的基本条件：

①最基本条件：应该能够进行正常的转录和转译，以及在正常情况下还与转译后加工有关。

②重要条件：编码的蛋白质产物应能维持正常的稳定性。具有核糖体结合位点；具有克隆基因的功能（强）启动子；插入序列的正确取向

2.表达元件：

①启动子：必须是强启动子、应能呈现出一种低限的基础转录水平、启动子应是诱导型的常见原核强启动子：Plac、Ptac、PL启动子、T7噬菌体启动子

Plac：受Lac阻遏蛋白负调控，受乳糖或类似物IPTG的诱导；

Ptac: Lac启动子和Trp启动子的杂合启动子。受Lac阻遏蛋白负调控，可用乳糖或类似物IPTG的诱导，启动能力比Plac和Ptrp都强；

PL启动子：噬菌体早期左向转录启动子，受λ噬菌体CI基因负调控。温度诱导（低温30℃阻遏，高温42℃诱导）。

T7噬菌体启动子：具有高度特异性，只能由T7噬菌体的RNA聚合酶识别并启动转录

T7如何诱导调控的原理

②转录终止子③转译起始序列④转译增强子⑤转译终止密码子

第四章：基因操作中大分子的分离和分析

一核酸凝胶电泳（用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段；检测：分子量、DNA浓度）1.基本原理：核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，呈负离子化状态；核酸分子在一定的电场强度的电场中，它们会向正电极方向迁移（“—”-→“+”）

2.琼脂糖凝胶电泳：核酸片段因其分子量或分子形状不同，电泳移动速度有差异而分离

①DNA迁移率的影响因素：DNA分子的大小（反比）、琼脂糖浓度（反比）、DNA构象、凝胶和电泳缓冲液中的EB、电压、琼脂糖种类、电泳缓冲液

②配制：最常用1%的，称取琼脂糖1g，加100ml电泳缓冲液（TAE），微波炉煮沸，冷却到50度时倒胶

3、RNA胶的制备：1.5g琼脂糖加115ml水，加热融化。冷却至60℃时加30ml的5 X MOPS 电泳缓冲液(终浓度为1X); 加5ml甲醛（琼脂糖终浓度为1%）。制胶。

二分子杂交

1.定义：具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下（适当的温度、离子强度等），按碱基互补的原则，重新形成双链核酸分子的过程

2. 探针（probe）：被标记的核酸分子，可以是DNA、RNA和合成的寡核苷酸

基本原理：碱基互补；

杂合双链：DNA:RNA 、DNA:DNA；

类型：液相杂交、固相杂交

3.杂交的基本过程：凝胶电泳分离→变性→印迹转移→预杂交→杂交→洗膜→杂交信号检测

4、Southern Blot原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。

DNA→琼脂糖电泳→印迹转移→预杂交→杂交（变性探针）→洗膜→放射自显影或显色

5、Northern Blot原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。

mRNA提取→甲醛变性电泳→印迹转移→预杂交→杂交（变性探针）→洗膜→放射自显影或化学发光

6、western 杂交基本原理同southern、northern blot方式。但其是检测蛋白质，关键在于探针的性质：抗体（antibody）

三PCR技术及其应用

1. 定义：是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增

2.反应体系：10×扩增缓冲液10ul、4种dNTP混合物各200umol/L、引物各10～100pmol、模板DNA0.1～2ug、TaqDNA聚合酶2.5u、Mg2+1.5mmol/L、加双或三蒸水至100ul

Taq DNA聚合酶：水生栖热菌(thermus aquaticus,Taq)的DNA聚合酶

①5’→3’DNA聚合酶活性和5’→3’外切酶活性；②无3’→5’外切酶活性，

3.PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+)

4.步骤：变性（双链DNA通过高温变性解离成互补单链DNA ）、退火（DNA加热变性+引

物慢慢冷却使其结合）、延伸（适温延伸5’→3’引物形成新链变成4条链DNA ）

基本原理：碱基互补

设计原则：（1）靠近5'上游Primer与双链DNA正链相同

3'下游Primer与双链DNA正链互补，与负链相同

正链5' ————————————3'

负链3'———————————— 5'

例如：IL-3

正链5'GCTCCATGACCCAG--------GCGA TCTTTTGAGTCCAA 3'

负链3‘CGAGGTACTGGGTC--------CGCTAGAAAACTCAGGTT 5'

上游引物序列：与其相同5' GCTCCA TGACCCAG 3'

下游引物序列：先写出相应负链3'→5'然后倒过来5'→3'

所以序列为：5'-TTG GAC TCA AAA GAT CGC -3'

5、Sanger双脱氧终止法

F. Sanger在1977年发明用双脱氧链终止法测定单链DNA的序列，其基本原理如下：

①DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板，合成准确的DNA互补链；

②该酶能够用2‘，3’--双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3‘-末端，从而终止其延伸反应。

在DNA测序反应中，加入模板DNA，引物（特异性引物），DNA聚合酶，dA，dT，dG，dC和一种ddNTP。常用Klenow大片段，无5'→3'外切酶活性。

基本原理：DNA的半保留复制

测序步骤

①用M13噬菌体做载体获得单链DNA模板，克隆并扩增待测DNA片段，使其变性。

②选择一条与DNA单链互补的短链引物，将引物用放射性同位素标记。

③引物先同单链模板复性。

④在四个反应管中分别加入待测DNA单链模板、互补引物分子、四种的dNTP、DNA聚合酶(Klenow 酶)以及不同的ddNTP。

⑤进行聚合反应，DNA新生链延长，当掺入ddNTP时，聚合反应终止。

⑥在聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶中电泳。

⑦根据X底片对凝胶曝光所显的条带位置，读出DNA序列。

读出序列方法：从下到上依次读出互补链的核苷酸序列

第九章重组DNA导入细胞

一、重组DNA分子导入受体菌

方式: 转化、转导、转染、感染、接合等

感受态细胞（competent cell）: 容易接受外源DNA的状态.导入方法

1. 氯化钙转化法

2. 电击法

3. 体外包装感染法

1、转化（transformation）

指某些细菌(或其它生物)能通过其细胞膜摄取周围介质中的DNA片段，并将此外DNA 片段整合到自己染色体组中的过程。

2、转导（transduction）

定义：以噬菌体为媒介所进行的细菌遗传物质重组的过程，称为转导。

3、接合(conjugation)

是细菌通过性菌毛相互连接沟通，将遗传物质（主要是质粒DNA）从供体菌转移给受体菌。能通过结合方式转移的质粒称为接合性质粒，不能通过性菌毛在细菌间转移的质粒为非接合性质粒。

生物选修3专题1 基因工程知识点复习学案

专题1 基因工程 基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过________________________，赋予生物以 _____________________，创造出______________________________________。基因工程是在____________上进行设计和施工的，又叫做__________________。 1. （1 （2 （3 2. (1)两种DNA ②区别：E· (2)与DNA 酸二酯键。 3. （1 （2 _____________________的双链___________DNA （3）其它载体： _________________________________ (二)基因工程的基本操作程序 第一步：__________________________ 1.目的基因是指： ______________________________________________________ 。 2.目的基因可采取_______________-获得，也可以用_____________________。人工合成目的基因的常用方 法有________________和_________________。 3.PCR技术扩增目的基因 （1）原理：_____________________ 将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是________________，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是 _______________。此方法的受体细胞多是 ____________。将目的基因导入微生物细胞：★原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少， 最常用的原核细胞是 ____________，其转化方法是：先用 ________处理细

扬州大学基因工程期末试题复习要点整理

基因工程期末试题复习要点整理 基因工程是70年代出现的一门科学，是生物学最具生命力和最引人注目的前沿科学之一，是现代生物技术的代表，是生命科学类专业中的一门重要的专业课。本课程主要介绍基因工程概述、重组DNA基本技术及原理、基因克隆、基因的分离及鉴定、基因工程的表达系统、基因工程的应用等。通过本课程的学习，使学生掌握基因工程技术的基本原理和了解该技术在动物、植物和微生物等方面的应用，为今后从事生物学教学、生物技术研究和产品开发，或进一步的研究生学习科研打下坚实的理论及专业基础。扬州大学试题纸 一、名词解释：共10题，每题2分，共20分。 1. 基因: 是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。 2. 定位克隆: 获取基因在染色体上的位置信息，然后采用各种方法对该基因进行定位和克隆 3. 融合基因: 是指应用DNA体外重组技术构建的一类具有来自两个或两个以上的不同基因核苷酸序列的新型基因。 4. 转化子: 导入外源DNA后获得了新遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞，又称重组体。 5. 人工接头：是人工合成的具有一个或数个特定限制性内切酶识别和切割序列的双股平端DNA短序列。 6. RT-PCR: 是指以mRNA在反转录酶作用下合成cDNA第一链为模板进行的PCR。 7. ORF : 起始于AUG、止于UAA、UGA、UAG的连续的密码子区域，是潜在的编码区。 8. MCS: 指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制核酸内切酶的酶切位点的DNA片段。 9. gene targeting : 基因工程中利用活细胞染色体DNA可与外源DNA的同源性DNA序列发生重组的性质，来进行定点修饰改造染色体上某一目的基因的技术 10. 5’RACE: 是一种通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，是以mRNA为模板反转录成cDNA第一链后用PCR技术扩增出某个特异位点到5’端之间未知序列的方法。 四、简答题：共4题，共20分。 1．简述获得目的基因常用的几种方法。（5分）

基因工程简答题总结

基因工程原理复习题思考题 5、简单叙述同尾酶和同裂酶的差别。 同尾酶：来源不同，识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端，连接后不能被相关的酶同时切割。 同裂酶：识别序列相同，切割位点有些相同，有些不同。分完全同裂酶和不完全同裂酶（PS：完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。 不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。） 6、连接酶主要有哪些类型？有何异同点？影响连接酶连接效果的因素主要有哪些？ 类型：DNA连接酶和RNA连接酶 异同点： 相同点：都能以DNA为模板，从5'向3'进行核苷酸或脱氧核苷酸的聚合反应。 不同点：DNA聚合酶识别脱氧核糖核苷酸，在DNA复制中起作用；而RNA聚合酶聚合的是核糖核苷酸，在转录中起作用。 7、试分析提高平端DNA连接效率的可能方法。（传说中的网上答案） 1、低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好。 2、在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。这样可避免载体自连，应该可以大大提高平端连接的效率。 3、足够多的载体和插入片段是最重要的。 4、平端的连接对于离子浓度很敏感 5、尽可能缩小连接反应的体积 6、建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14度好 8、基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些？ 1）大肠杆菌DNA聚合酶 2）Klenow fragment 3）T7 DNA聚合酶 4）T4 DNA聚合酶 5）修饰过的T7 DNA聚合酶 6）逆转录酶 7）Taq DNA聚合酶 第四章基因克隆的载体系统 1、作为基因工程载体，其应具备哪些条件？ 具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）； 具有合适的筛选标记； 具有较高的外源DNA的载装能力； 具有多克隆位点（MCS）； 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。 3、载体的类型主要有哪些？在基因工程操作中如何选择载体？ 基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三大类。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。 4、质粒转化原理，影响转化率的因素有哪些？

高中生物选修三基因工程知识点

高中生物选修三基因工程知识点 基因工程：是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 （一）基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） （1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。 （3）结果： 经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。 2.“分子缝合针”——DNA连接酶 （1）两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较： ①相同点：都缝合磷酸二酯键。 ②区别：E·coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。 （2）与DNA聚合酶作用的异同：

（2）目的：获取大量的目的基因 （3）原理：DNA双链复制 （4）过程： 第一步：加热至90～95℃DNA解链为单链； 第二步：冷却到55～60℃，引物与两条单链DNA结合； 第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始进行互补链的合成。 （5）特点：指数(2^n)形式扩增 第二步：基因表达载体的构建(核心) 1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。 2.组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因 （1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA 聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。 （2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。（3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。 第三步：将目的基因导入受体细胞 1.转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 2.常用的转化方法：

基因工程期末复习总结

一、单选 1、第一个实现DNA重组的实验:1972年，美国斯坦福大学医学中心的P.Berg在世界上第一次成功地实现了DNA的体外重组。 2、第一次实现重组体转化成功的实验：1973年，科恩（Coher）和博耶（Boyer）建立的基因工程基本模式。 3、基因工程研究的主要内容：切接转增检。 4、基因工程研究的基本要素：基因、工具酶、载体、受体细胞。 5、DNA在生物体内的存在状态：染色体DNA、病毒DNA（噬菌体DNA）、质粒DNA、线粒体DNA和叶绿体DNA，有的以线型存在，有的以环状存在。 6、天然DNA提取的步骤：生物材料的准备、裂解细胞、分离抽提DNA。 7、DNA的分离抽提法：酚-氯仿抽提法（常用、经典）。 8、DNA的保存：温度越低越好，同等条件下，温度越低越不容易降解。 9、为了消除在制备RNA过程中RNA酶的污染，应用0.1% DEPC处理过的水配制试剂。 10、人工合成DNA片段的方法有化学合成法和聚合酶链式反应扩增法。 11、紫外分光光度法检测核酸样品的纯度（常用），纯净的核酸溶液的0D260/OD280值应为 1.7~2.0，0D260/OD230值应大于 2.0，如果0D260/OD280小于1.7，可能有蛋白质污染，如果0D260/OD280大于2.0

或0D260/OD230小于2.0时，核酸溶液中可能存在其他干扰物质。12、工具酶就其用途而言可分为三大类：限制性内切酶、连接酶和修饰酶。 13、 14、通常提到的限制性核酸内切酶主要指Ⅱ类酶而言，限制性核酸内切酶的命名：属名+种名。例如：B acillus am ylolique faciens H、 H aemophilus in fluenzae dⅠ→Bam H、Hind 15、限制性内切核酸酶的本质：细菌细胞的限制—修饰系统。 17、常用的酶切方法：单酶切、双酶切和部分酶切。

基因工程知识点总结归纳(更新版)

基因工程 绪论 1、克隆（clone）：作名词：含有目的基因的重组DNA分子或含有重组分子的无性繁殖。作动词：基因的分离和重组的过程。 2、基因工程（gene engineering）：体外将目的基因插入病毒、质粒、或其他载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原先没有这些基因的宿主细胞内，且能稳定的遗传。供体、受体和载体是基因工程的三大要素。 3、基因工程诞生的基础 三大理论基础：40年代发现了生物的遗传物质是DNA；50年代弄清楚DNA 的双螺旋结构和半保留复制机理；60年代确定遗传信息的遗传方式。以密码方式每三个核苷酸组成一个密码子代表一个氨基酸。 三大技术基础：限制性内切酶的发现；DNA连接酶的发现；载体的发现 3、基因工程的技术路线：切：DNA片段的获得；接：DNA片段与载体的连接；转：外源DNA片段进出受体细胞；选：选择基因；表达：目的基因的表达；基因工程的工具酶 1、限制性内切酶（restriction enzymes）：主要是从原核生物中分离纯化出来的，是一类能识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。 2、限制酶的命名：属名（斜体）+种名+株系+序数 3、II型限制性内切酶识别特定序列并在特定位点切割 4、同裂酶：来源不同，其识别位点与切割位点均相同的限制酶。 5、同尾酶：来源不同，识别的靶序列不同，但产生相同的黏性末端的酶形成的新位点不能被原来的酶识别。 6、限制性内切酶的活性：在适当反应条件下，1小时内完全酶解1ug特定的DNA 底物，所需要的限制性内切酶的量为1个酶活力单位。 7、星号活性：改变反应条件，导致限制酶的专一性和酶活力的改变。 8、DNA连接酶的特点：具有双链特异性，不能连接两条单链DNA分子或闭合单链DNA，连接反应是吸能反应，最适反应温度是4至15度，最常用的是T4连接酶。 9、S1核酸酶：特异性降解单链DNA或RNA。

基因工程期末考试重点知识整理

基因工程 第一章基因工程概述 1、基因工程的概念(基因工程基本技术路线PPT) 基因工程（Gene Engineering）,是指在基因水平上的遗传工程,它是用人为方法将大分子(DNA)提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源遗传物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得新物种的一种崭新的育种技术. 2、基因工程的历史 基因工程准备阶段：1972，第一个重组DNA分子的构建，构建人：Paul Berg及其同事PPT 基因工程诞生：1973，Cohen & Boyer首次完成重组质粒DNA对大肠杆菌的转化 基因工程发展阶段的几个重要事件： 一系列新的基因工程操作技术的出现； 各种表达克隆载体的成功构建； 一系列转基因菌株、转基因植物、转基因动物等的出现 3、基因工程的内容（P9） 4、基因克隆的通用策略（P12）(基因组文库(鸟枪法)+分子杂交筛选) 第二章分子克隆工具酶 5、限制性核酸内切酶的概念、特点、命名、分类(问答) 概念：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶，主要存在于细菌体内 特点（参加PPT） 命名：依次取宿主属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后加上序号。

如：从Haemophilus influenze Rd中提取到的第三种限制型核酸内切酶被命名为Hind Ⅲ，Hin指来源于流感嗜血杆菌，d表示来菌株Rd，Ⅲ表示序号。 分类：依据酶的亚单位组成、识别序列的种类以及是否需要辅助因子可分为：Ⅰ型酶、Ⅱ型（Ⅱs型）酶和Ⅲ型酶。 真核细胞中有4中DNA聚合酶：α，β，γ，线粒体DNA聚合酶 原核生物中3中DNA聚合酶：Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ 6、几个基本概念 粘性末端：两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置是交错的，对称地分布在识别序列中心位置两侧，这样形成的DNA片段末端称为~。 平末端：两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置处在识别序列的对称结构中心，这样切割的结果产生的DNA片段末端是平齐的，称之为~。 同裂酶：一些来源不同的限制性核酸内切酶具有相同的识别序列。如：BamHI和BstI均可识别GGATCC。 同尾酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不同，但是切割DNA分子产生相同的DNA末端。如：TaqI：TCGA；ClaI：A TCGA T；AccI：GTCGAC 星星活性：某些限制性核酸内切酶在特定条件下，可以在不是原来的识别序列处切割DNA，这种现象称为Star活性。 DNA物理图谱：（多为质粒图谱）

基因工程期末复习总结.docx

一、单选 1、第一个实现DNA重组的实验：1972年，美国斯坦福大学医学中心的P.Berg在世界上第一次成功地实现了DNA的体外重组。 2、第一次实现重组体转化成功的实验：1973年，科恩（Coher）和博耶（Boyer）建立的基因工程基本模式。 3、基因工程研究的主要内容：切接转增检。 4、基因工程研究的基本要素：基因、工具酶、载体、受体细胞。 5、DNA在生物体内的存在状态：染色体DNA、病毒DNA （噬菌体DNA）、质粒DNA、线粒体DNA利叶绿体DNA,有的以线型存在，有的以环状存在。 6、天然DNA提取的步骤：生物材料的准备、裂解细胞、分离抽提 DNAo 7、DNA的分离抽提法：酚■氯仿抽提法（常用、经典）。 8、DNA的保存：温度越低越好，同等条件下，温度越低越不容易降解。 9、为了消除在制备RNA过程中RNA酶的污染，应用0.1% DEPC处理过的水配制试剂。 10、人工合成DNA片段的方法有化学合成法和聚合酶链式反应扩增法。 口、紫外分光光度法检测核酸样品的纯度（常用），纯净的核酸溶液的 OD260/OD280值应为1.7-2.0, OD260/OD230值应大于2.0,如果OD260/OD280小于1.7,可能有蛋白质污染，如果OD260/OD280大于2.0

或OD260/OD23O小于2.0时，核酸溶液中可能存在其他干扰物质。 12、工具酶就其用途而言可分为三大类：限制性内切酶、连接酶和修饰酶。 基因工程屮最常用的工具酶 14、通常提到的限制性核酸内切酶主要指II类酶而言，限制性核酸内切酶的命名： 属名+种名。例如：Bacillus amylolique faciens H、Haemophilus influenzae d Bam H> Hind I o“属种株序” 15、限制性内切核酸酶的本质：细菌细胞的限制一修饰系统。 16、限制性内切核酸酶的作用机制识别双链DNA中特定的核昔酸 17、常用的酶切方法：单酶切、双酶切和部分酶切。

基因工程复习要点

一名词解释： 1基因：是遗传信息的基本单位，携带着某种蛋白质或的遗传信息。从化学本质上看，基因是一段携带特定遗传信息的脱氧核糖核苷酸()序列，是构成巨大遗传单位染色体的组成部分。 2基因工程：按照人们的愿望，进行严密的设计，利用体外重组和转基因等生物技术，有目的地改造生物性状使之具有满足人们特定需求的能力。最突出的优点：打破了常规育种难以突破的物种之间的界限，使不同的物种之间可以进行遗传信息的重组和转移。 3 ：熔点温度或者解链温度，是变性进行到一半时的温度 4同裂酶：有时，一些限制性内切酶虽然来源不同，但是识别序列相同，这样的酶称为同裂酶（同切酶或异源同工酶）。此种酶切割位点可同可不同。 5 技术：是一种在体外快速扩增特定基因或序列的方法，即聚合酶链式反应技术。（已知的短片段1以内） 6质粒不相容性：不同质粒有的可共存于同一细胞中，但有的不行。不能同寓于一个细胞中的不同质粒称为不相容性质粒。 7转录单元：始于启动子，止于终止子，中间是一段转录区，转录为单链的一段序列 8杂种位点：：由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点。一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。 9基因表达：基因通过的转录和的转译等过程，将其所携带的遗传信息转变成蛋白质(或转录本)的过程。 10基因组文库：某一特定生物的很多克隆的集合，其中克隆数足够大以覆盖每一个基因。 11 ：开放阅读框，以起始密码子开始终止密码子结束的一串三联体核苷酸序列。 起始密码子：终止密码子： 12克隆：动词：是指从一个共同祖先经无性繁殖得到的一群遗传上同一的分子、细胞或个体所组成的特殊生命群体；名词：指从同一个祖先产生这类同一的分子群体、细胞群体或个体群体的过程。 13蛋白质印迹杂交技术：将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。 14同尾酶：指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。 二选择题： 1焦磷酸测序中没用到以下什么酶；（聚合酶( )、硫酸化酶( ).荧光素酶(1)和三磷酸腺苷双磷酸酶()4种酶都有） 2克隆基因常用强效载体，哪种不适用于大肠杆菌，选； 3质粒克隆载体非必需元件，选融合标签； 4外源基因在下列哪种中表达最完善（哺乳动物细胞）； 5一个完整的转录单位不包括（复制起始位点）。 三简答题： 1简要勾勒一副原核表达载体图。（重点是要包括原核表达载体的６个要素：启动子、核糖

《基因工程》专题复习总结

专题1 基因工程 知识体系构建 专题整合 一、基因工程的基本工具 A.重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、连接酶、载体 B.为育成抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体细胞 C.选用细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细菌繁殖快

D.只要目的基因进入了受体细胞就能成功表达 二、基因工程的操作程序 1.目的基因的获取 （1）目的基因：指编码蛋白质的结构基因。 （2）获取方法：从基因文库获取，原核基因也可直接分离获得；真核基因主要是人工合成，人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法。 2.基因表达载体的构建 （1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。 （2）组成：启动子＋目的基因＋标记基因＋终止子。 ①启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。 ②终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。 ③标记基因的作用：鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素抗性基因。 3.将目的基因导入受体细胞

A.提取目的基因→目的基因导入受体细胞→目的基因与载体结合→目的基因的检测与鉴定 B.目的基因的检测与鉴定→提取目的基因→目的基因与载体结合→目的基因导入受体细胞 C.提取目的基因→目的基因与载体结合→目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 D.目的基因与载体结合→提取目的基因→目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 三、蛋白质工程 1.蛋白质工程流程 2.蛋白质工程与基因工程的区别：蛋白质工程的本质是通过改造基因进而形成自然界不存在的蛋白质，所以被形象地称为第二代基因工程；基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质。 训练3 利用蛋白质工程改造天然蛋白质，进而改变其功能，可获得毒副作用减小，专一性、药效和稳定性都增强的理想的药物。如胰岛素是治疗依赖型糖尿病的特效药物，但是天然胰岛素在人体内寿命只有几小时，重症病人每天得注射好几次药物，给病人增加了不便和痛苦。通过蛋白质工程改变胰岛素的空间结构，以延长胰岛素的半衰期，得到长效胰岛素；还可以在不改变胰岛素活性部位结构的前提下，增强其他部位结合强度，使之难以被酶破坏，从而增强其稳定性。 （1）若要批量生产以上提到的长效胰岛素，根据所学知识，需要用到哪些生物工程（ ）

基因工程期末考试重点知识整理教学文案

基因工程期末考试重点知识整理

基因工程 第一章基因工程概述 1、基因工程的概念(基因工程基本技术路线PPT) 基因工程（Gene Engineering）,是指在基因水平上的遗传工程,它是用人为方法将大分子(DNA)提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源遗传物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得新物种的一种崭新的育种技术. 2、基因工程的历史 基因工程准备阶段：1972，第一个重组DNA分子的构建，构建人：Paul Berg 及其同事PPT 基因工程诞生：1973，Cohen & Boyer首次完成重组质粒DNA对大肠杆菌的转化 基因工程发展阶段的几个重要事件： 一系列新的基因工程操作技术的出现； 各种表达克隆载体的成功构建； 一系列转基因菌株、转基因植物、转基因动物等的出现 3、基因工程的内容（P9） 4、基因克隆的通用策略（P12）(基因组文库(鸟枪法)+分子杂交筛选)

第二章分子克隆工具酶 5、限制性核酸内切酶的概念、特点、命名、分类(问答) 概念：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶，主要存在于细菌体内 特点（参加PPT） 命名：依次取宿主属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后加上序号。如：从Haemophilus influenze Rd中提取到的第三种限制型核酸内切酶被命名为Hind Ⅲ，Hin指来源于流感嗜血杆菌，d表示来菌株Rd，Ⅲ表示序号。 分类：依据酶的亚单位组成、识别序列的种类以及是否需要辅助因子可分为：Ⅰ型酶、Ⅱ型（Ⅱs型）酶和Ⅲ型酶。 真核细胞中有4中DNA聚合酶：α，β，γ，线粒体DNA聚合酶 原核生物中3中DNA聚合酶：Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ

基因工程复习要点

一 1.载体的功能 1.运送外源基因高效转入受体细胞 2.为外源基因提供复制能力或整合能力 3.为外源基因的扩增或表达提供必要的条件 2.基因工程学科建立的理论和技术发明 1.三大理论：DNA是遗传物质、1953年提出DNA的双螺旋结构、提出中心法则和遗传密码 2.三大技术：工具酶的发现、载体的发现、逆转录酶的发现 3.质粒的特点 质粒是一类存在于细菌和真菌细胞中能独立于染色体DNA而自主复制的共价、闭合、环状DNA分子，也称cccDNA.通常在1~100范围内。 自主复制性、可扩增性、可转移性、不相容性 4.描述PBR322质粒筛选过程 PBR322质粒有两个标记基因，氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因。 若在康四环素抗性基因上插入外源DNA,则 1.先将转化液涂布在含有氨苄青霉素的平板上，未长的菌落是未导入质粒的菌落 2.再将上述平板上存活的菌落影印到含有四环素平板上，在四环素上不长但在氨苄青霉素 上长的转化子即为重组子。 5.简述PUC系列质粒筛选重组子的过程 PUC是在PBR322质粒上改造的 若在lacZ’标记基因上插入外源DNA，则 将转化液涂布在含有Amp的平板上，蓝色菌落为非重组子，白色菌落为重组子，没长的未导入质粒。 6.基因工程操作的基本流程 1.离：从供体细胞中分离出基因组DNA 2.切、连：用限制性核酸内切酶分别将外源DNA和载体分开,用DNA连接酶将含有外源基 因的DNA片段接到载体分子上，构成重组DNA分子 3.转、增：将重组DNA导入受体细胞，段时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其 整合到受体细胞的基因组中 4.筛：筛选经转化处理的细胞，获得外源基因高效稳定的基因工程菌或细胞 5.表达：筛选好的菌或细胞导入到受体中使其高效稳定表达 7.为什么说逆转录酶的发现对基因工程学科的建立至关重要 1.对分子生物学的中心法则进行修正和补充 2.使真核基因的制备成为可能可将mRNA反转录形成DNA用于获得目的基因 3.在致癌病毒的研究中发现癌基因，为肿瘤发病机理的研究提供有价值线索 8.蓝白斑筛选 是一种基因工程常用的重组菌筛选方法。野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色

高考圈题(新课标I卷)高考生物总复习题组训练18基因工程

题组18 基因工程 （一）考法解法 【命题特点分析】 本部分属于每年高考选考内容，近年来多以非选择题（选做题）的形式呈现，难度系数在0.5-0.6之间；考查重点为基因工程的工具及基本操作过程。试题多以进行实验设计或者其他考查，考查的内容多种多样。既注重对主干知识的考查，又重点考查“双基”和实验能力。 【解题方法荟萃】 解决该部分试题，需要从以下几个方面着手考虑： 1、基因工程的基本工具 限制酶DNA连接酶(运)载体 作用 切割目的基因和载 体 拼接DNA片段形成 重组DNA 携带目的基因进入受体细胞作用部 位 两核苷酸的脱氧核糖与磷酸间形成的磷酸 二酯键 ------------------ 作用特 点 (条 件) ①识别特定的 核苷酸序列 ②在特定位点 上切割 ①E·coli DNA连接酶只 能连接黏性末端 连接酶能连接黏 DNA 4 T ② 性末端和平(口)末端 ①能在宿主细胞内稳定存在并大 量复制 ②有一个或多个限制酶切割位点 ③具有特殊的标记基因 2、基因工程的操作步骤 (1) 目的基因的获取： ①从基因文库中获取。 ②利用PCR技术扩增。 ③用化学方法直接人工合成。 (2) 基因表达载体的构建： ①基因表达载体的组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因。 ②基因表达载体的构建方法： (3)将目的基因导入受体细胞： 植物细胞动物细胞微生物细胞

常用 方法 农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法 显微注射技术 感受态细胞法 )处理＋2Ca 用( 受体 细胞 受精卵、体细胞 受精卵 原核细胞 (4) 目的基因的检测与鉴定： ①目的基因插入检测：DNA 分子杂交。 ②目的基因转录检测：(核酸)分子杂交。 ③目的基因翻译检测：抗原—抗体杂交。 ④个体生物学水平检测：根据目的基因表达出的性状判断。 （二）真题剖析 【题干】（2013·全国新课标I 卷理综·40）阅读如下材料： 材料甲：科学家将牛生长激素基因导入小鼠受精卵在，得到了体型巨大的“超级小 鼠”；科学家采用农杆菌转化法培育出转基因烟草。 溶菌酶的基因进行改 4T 溶菌酶在翁度较高时易失去活性，科学家对编码4T 材料乙：为的 97位的异亮氨酸变为半胱氨酸，在该半胱氨酸与第3溶菌酶的第4T 造，使其表达的溶菌酶的耐热性。 4T 半胱氨酸之间形成了一个二硫键，提高了 材料丙：兔甲和兔乙是同一物种的两个雌性个体，科学家兔甲受精卵发育成的胚胎移 植到兔乙的体内，成功产出兔甲的后代，证实了同一物种的胚胎课在不同个体的体内发 育。 回答下列问题： 体导入小鼠的受精卵中常用）材料甲属于基因工程的范畴。将基因表达载1（。在培育转基因植物 和 法。构建基因表达载体常用的工具酶有 。 是，常用农杆菌转化发，农杆菌的作用是 工程范畴。该工程是指以分子生物学相关理论为基础， ）材料乙属于2（的技 进行改造，或制造制造一种 通过基因修饰或基因合成，对序列 溶菌酶空间结构改变的原因是组成该酶肽链的4T 术。在该实例中，引起发生了改变。 种 ）材料丙属于胚胎工程的范畴。胚胎移植是指将获得的早期胚胎移植到3（的，生理状况相同的另一个雌性动物体内，使之继续发育成新个体的技术。在资料丙的实 体。 体，兔乙称为 例中，兔甲称为 【答案】（1）显微注射法 限制性内切酶 DNA 连接酶 农杆菌可感染 植物将目的基因转移到受体细胞中 （2）蛋白质工程 现有蛋白质 新的蛋白质 氨基酸 （3）同 供 受 【解析】（1）基因工程中，将基因表达载体导入小鼠的受精卵中常用显微注射 法．构建基因表达载体常用的工具酶是限制性内切酶和DNA 连接酶．在培育有些转基因植物时，常用农杆菌转化法，农杆菌易感染双子叶植物和裸子植物，对单子叶植物没有感染

基因工程制药复习提纲

名词解释 1.基因工程基因工程是值在体外合成或重组特定的DNA，再与载体连接，最后导入到宿 主细胞内表达、扩增出人们需要的蛋白质，而且使这种性状可遗传给后代的技术。包括上游技术和下游技术。 2.基因工程制药基因工程制药是通过基因工程的方法生产药物，具体包括获得目的基因、 构建重组质粒、构建基因工程菌、培养工程菌、产物分离纯化、产品加工检验等步骤。 3.逆转录逆转录（reverse transcription）是某些RNA病毒由逆转录酶直接利用RNA为模 板合成DNA的过程。 4.CDNA以生物细胞的mRNA为模板，在逆转录酶的作用下合成cDNA的第一条链，然后 在合成双链DNA，并将合成的cDNA双链重组到质粒载体或噬菌体载体上，倒入宿主细胞进行增殖。在这个过程中合成的双链DNA叫做cDNA。 5.引物引物是人工合成的单链DNA小片段，碱基顺序分别与所要扩增的模板DNA双链的 5’端相同。是PCR的起始点。 6.表达载体所谓表达载体（expression vector）是指具有宿主细胞基因表达所需的调节控制 序列，能使外源基因在宿主细胞内转录和翻译的载体。 7.克隆载体克隆载体（cloning vector)是把一个有用的制药DNA片段通过重组DNA技术， 送进受体细胞中进行繁殖的工具。 8.载体载体（vector），指在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至 受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。 9.报告基因载体分子上有一种特殊意义的基因序列，它们表达的目的是为了证明载体已经 进入宿主细胞，并将含有外源基因的宿主细胞从其他细胞中区分并挑选出来。这种基因就是报告基因。 10.启动子启动子是位于结构基因5'端上游的DNA序列，能被RNA聚合酶识别并结合，具 有转录起始的特异性 11.PCR聚合酶链式反应是一种体外放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术，它主要包括 变性、退火、延伸三个过程，并且多次循环。 12.包涵体包涵体（inclusion body）是存在于细胞质中的一种不可溶的蛋白质聚集折叠而 形成的晶体结构物。通常包涵体虽然具有正确的氨基酸序列，但是空间结构却是错误的。 13.蛋白表达系统蛋白表达系统是指由宿主、外源基因、载体和辅助成分组成的体系，通过 这个体系实现外源基因在宿主细胞中表达的目的。 14.单克隆抗体由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，称为 单克隆抗体。 15.基因工程抗体基因工程抗体就是按不同的目的和需求，对抗体基因进行加工、改造和 重新装配，然后导入适当的受体细胞中表达得到的抗体分子。 16.改形抗体改性抗体（reshaped antibody,RAb）是指利用基因工程技术，将人抗体可变区 （V）中互补决定簇序列改换成鼠源单抗互补决定簇。重构成既具有鼠源性单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体。 17.嵌合抗体在基因水平上将鼠源单克隆抗体可变区和人抗体恒定区连接起来并在合适的 宿主细胞中表达，这种抗体叫做嵌合抗体（chimeric antibody）。 18.镶面抗体将鼠源单抗可变区中氨基酸残基改造成人源的，消除了异源性且不影响可变区 的整体空间构象。 19.单链抗体单链抗体(single chain antibody fragment，scFv)，是由抗体重链可变区和轻链 可变区通过15～20个氨基酸的短肽(linker)连接而成。scFv能较好地保留其对抗原的亲

2013届高考生物总复习 专题一 基因工程(单元卷)新人教版选修3

2013届高考生物总复习 专题一基因工程（人教版选修三单元卷）1．(2011·四川高考)北极比目鱼中有抗冻基因，其编码的抗冻蛋白具有11个氨基酸的重复序列，该序列重复次数越多，抗冻能力越强。下图是获取转基因抗冻番茄植株的过程示意图，有关叙述正确的是( ) A．过程①获取的目的基因，可用于基因工程和比目鱼基因组测序 B．将多个抗冻基因编码区依次相连成能表达的新基因，不能得到抗冻性增强的抗冻蛋白 C．过程②构成的重组质粒缺乏标记基因，需要转入农杆菌才能进行筛选 D．应用DN A探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其完全表达解析：过程①中通过逆转录法获得的目的基因，可用于基因工程，但该目的基因不存在内含子和非编码序列，因此不能用于比目鱼的基因组测序；将多个抗冻基因编码区相连形成的能表达的新基因可能不再是抗冻基因；利用农杆菌的目的是将重组质粒导入受体细胞，而不是筛选重组质粒；应用DNA探针技术，可以检测受体细胞中是否成功导入了目的基因，但不能检测目的基因是否完全表达。 答案：B 2．(2011·浙江高考)将ada(腺苷酸脱氨酶基因)通过质粒 pET28b 导入大肠杆菌并成功表达腺苷酸脱氨酶。下列叙述错误的是( ) A．每个大肠杆菌细胞至少含一个重组质粒 B．每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点 C．每个限制性核酸内切酶识别位点至少插入一个ada D．每个插入的ada至少表达一个腺苷酸脱氨酶分子

解析：受体大肠杆菌成功表达腺苷酸脱氨酶，说明每个大肠杆菌细胞至少含有一个重组质粒，且每个ada至少指导合成一个腺苷酸脱氨酶分子。重组质粒的形成需先用限制性核酸内切酶切割目的基因和质粒形成相同的黏性末端，再在 DNA 连接酶的作用下连接起来，连接起来的序列中会含有限制性核酸内切酶的识别位点。不同的限制性核酸内切酶识别位点不同，不是每个限制性核酸内切酶的识别位点都能插入ada，C项错误。 答案：C 3．(2011·安徽高考)家蚕细胞具有高效表达外源基因的能力。将人干扰素基因导入家蚕细胞并大规模培养，可提取干扰素用于制药。 (1)进行转基因操作前，需用________酶短时处理幼蚕组织，以便获得单个细胞。 (2)为使干扰素基因在家蚕细胞中高效表达，需要把来自cDNA文库的干扰素基因片段正确插入表达载体的________和________之间。 (3)采用PCR技术可验证干扰素基因是否已经导入家蚕细胞。该PCR反应体系的主要成分应包含：扩增缓冲液(含Mg2＋)、水、4种脱氧核糖核苷酸、模板DNA、__________和__________。 (4)利用生物反应器培养家蚕细胞时，贴壁生长的细胞会产生接触抑制。通常将多孔的中空薄壁小玻璃珠放入反应器中，这样可以________增加培养的细胞数量，也有利于空气交换。 解析：胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理可以将动物组织分解成单个细胞；基因表达载体包括启动子、目的基因、终止子、标记基因等，其中启动子和终止子有利于目的基因的表达，标记基因有利于目的基因的检测；PCR技术中需要原料(4 种脱氧核糖核苷酸)、缓冲液、模板DNA、引物和耐热DNA聚合酶等；在生物反应器中放入多孔的中空薄壁小玻璃珠的目的是：一方面有利于细胞的贴壁生长，避免接触抑制；另一方面有利于气体交换。 答案：(1)胰蛋白(或胶原蛋白) (2)启动子终止子 (3)对干扰素基因特异的DNA引物对Taq DNA聚合酶 (4)扩大细胞贴壁生长的附着面积 4．(2011·北京高考)T－DNA可随机插入植物基因组内，导致被插入基因发生突变。用此方法诱导拟南芥产生突变体的过程如下：种植野生型拟南芥，待植株形成花蕾时，将地上部分浸入农杆菌(其中的T－DNA上带有抗除草剂基因)悬浮液中以实现转化。在适宜条件下培养，收获种子(称为T1代)。 (1)为促进植株侧枝发育以形成更多的花蕾，需要去除________，因为后者产生的________会抑制侧芽的生长。 (2)为筛选已转化的个体，需将T1代播种在含________的培养基上生长，成熟后自交，收获种子(称为T2代)。

基因工程复习总结.docx

思考题 第二章分子克隆工具酶 1简述基因工程研究用的工具酶的类型和作用特点。 常用的工具酶 硝基序列内部进庁切割 DrU逵接癖 DT?A 1 i HaSe 将两条以上的纯性HA方子咸序喪傕化昭成磷酸二酣键逢接战一6盘傢 DNAJSt 合BBl DNA PDIytoeraSe 1通?u≡ιg'掰遥一蝎如械昔≡κ???板. 从3'方向令咸新生的互补谜 专一懺降解RMA 内切械肢晦.4?M4tl?或双1?DNA 2?说明限制性内切核酸酶命名原则(举例)

基因工程原理练习题及答案

基因工程原理练习题及其答案 一、填空题 1．基因工程是_________年代发展起来的遗传学的一个分支学科。 2．基因工程的两个基本特点是：(1)____________，(2)___________。 3．基因克隆中三个基本要点是：___________；_________和__________。 4．通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小的片段，可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点相互位置的___________。 5．限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的，第一个大写字母取自_______，第二、三两个字母取自_________，第四个字母则用___________表示。 6．部分酶切可采取的措施有：(1)____________(2)___________ (3)___________等。 7．第一个分离的限制性内切核酸酶是___________；而第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是_____________。8．限制性内切核酸酶BsuRI和HaeⅢ的来源不同，但识别的序列都是_________，它们属于_____________。 9．DNA聚合酶I的Klenow大片段是用_____________切割DNA聚合酶I得到的分子量为76kDa的大片段，具有两种酶活性：(1)____________；(2)________________的活性。 10．为了防止DNA的自身环化，可用_____________去双链DNA__________________。 11．EDTA是____________离子螯合剂。 12．测序酶是修饰了的T7 DNA聚合酶，它只有_____________酶的活性，而没有_______酶的活性。 13．切口移位(nick translation)法标记DNA的基本原理在于利用_________的_______和______的作用。 14．欲将某一具有突出单链末端的双链DNA分子转变成平末端的双链形式，通常可采用_________或_______________。15．反转录酶除了催化DNA的合成外，还具有____________的作用，可以将DNA- RNA杂种双链中的___________水解掉。 16．基因工程中有3种主要类型的载体：_______________、_____________、______________。 17．就克隆一个基因(DNA片段)来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部分：_______________、_____________、______________。另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子量。 18．一个带有质粒的细菌在有EB的培养液中培养一段时间后，一部分细胞中已测 不出质粒，这种现象叫。 19．pBR322是一种改造型的质粒，它的复制子来源于，它的四环素抗性基因来自于，它的氨苄青霉素抗性基因来自于。 20．Y AC的最大容载能力是，BAC载体的最大容载能力是。 21．pSCl01是一种复制的质粒。 22．pUCl8质粒是目前使用较为广泛的载体。pUC系列的载体是通过 和两种质粒改造而来。它的复制子来自，Amp 抗性基因则是来自。 23．噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：一是；二是。 24．野生型的M13不适合用作基因工程载体，主要原因是 和。 25．黏粒(cosmid)是质粒—噬菌体杂合载体，它的复制子来自、COS位点序列来自，最大的克隆片段达到kb。 26．野生型的λ噬菌体DNA不宜作为基因工程载体，原因是：(1) (2) (3) 。 27．噬菌粒是由质粒和噬菌体DNA共同构成的，其中来自质粒的主要结构是，而来自噬菌体的主要结构是。 28．λ噬菌体载体由于受到包装的限制，插入外源DNA片段后，总的长度应在噬菌体基 因组的的范围内。 29．在分离DNA时要使用金属离子螯合剂，如EDTA和柠檬酸钠等，其目的是 。 30．用乙醇沉淀DNA时，通常要在DNA溶液中加人单价的阳离子，如NaCl和NaAc， 其目的是。 31．引物在基因工程中至少有4个方面的用途：(1) (2) (3) (4) 。 32．Clark发现用Taq DNA聚合酶得到的PCR反应产物不是平末端，而是有一个突出 碱基末端的双链DNA分子。根据这一发现设计了克隆PCR产物的。 33．在cDNA的合成中要用到S1核酸酶，其作用是切除在 。 34．乙醇沉淀DNA的原理是。 35．假定克隆一个编码某种蛋白质的基因，必须考虑其表达的三个基本条件：