抗体的提取与纯化
精制免疫球蛋白的方法很多。一般采用综合技术,避免蛋白变性。如分离IgG时,多结合使用盐析法与离子交换法,以求纯化。提取IgM的方法也很多,如应用凝胶过滤与制备电泳法,或离子交换与凝胶过滤等。
一、盐析法
1.取x ml血清加x ml生理盐水,于搅拌下逐滴加入2x ml饱和硫酸铵,硫酸铵的终饱和度为50%。4℃,3h以上,使其充分沉淀。
2.离心(3000rpm),20min,充上清,以x ml生理盐水溶解沉淀,再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml。置4℃3h以上(此时硫酸铵的饱和度为33%)。
3.重复上述第二步过程1~2次。末次离心后所得沉淀物为γ-球蛋白,以 pH7.4 PBS溶解至x ml装入透析袋。
4.对PBS充分透析、换液3次,至萘氏试剂测透析外液无黄色,即无NH4+为止。
5.取透析袋内样品少许作适当倍数稀释后,以751型紫外分光光度计测定蛋白含量。
影响盐析的因素很多,如蛋白质的浓度,盐的浓度,饱和度和pH,温度等都可影响盐析的结果,操作时要充分注意。
(1)蛋白质的浓度
盐析时,溶液中蛋白质的浓度对沉淀有双重影响,既可影响蛋白质沉淀极限,又可影响蛋白质的共沉作用。蛋白质浓度愈高,所需盐的饱和度极限愈低,但杂蛋白的共沉作用也随之增加,从而影响蛋白质的纯化。故常将血清以生理盐水作对倍稀释后再盐析。
(2)离子强度
各种蛋白质的沉淀要求不同的离子强度。例如当硫酸铵饱和度不同,析出的成分就不同,饱和度为50%时,少量白蛋白及大多数拟球蛋白析出;饱和度为33%时γ球蛋白析出。
(3)盐的性质
最有效的盐是多电荷阴离子。
(4)PH值
一般说来,蛋白质所带净电荷越多,它的溶解度越大。改变PH改变蛋白质的带电性质,也就改变了蛋白质的溶解度。
(5)温度
盐析时温度要求并不严格,一般可在室温下操作。血清蛋白于25℃时较0℃更易析出。但对温度敏感的蛋白质,则应于低温下盐析。
(6)蛋白质沉淀后宜在4℃放3小时以上或过夜,以形成较大沉淀而易于分离。
二、冷酒精沉淀法
1.血清加3倍体积的蒸馏水,调节pH至7.7(±)冷却到0℃。在激烈搅拌的条件下,加预冷的酒精(-20℃)到最终浓度为20%,保持在-5℃。产生的沉淀(A),含有大多数种类的免疫球蛋白。
2.沉淀A悬浮于25倍体积的0.15~20mol/L NaCl溶液(冷)中,加有0.05mol/L醋酸调节pH到5.1,产生的沉淀(B),包括大部分的IgA和IgM,IgG留在上清液内。
3.调节上清液的pH到7.4,加冷酒精(-20℃~-30℃)到最终浓度为25%,维持在-5℃。所得到的沉淀(C)含有90%~98% IgG。不同动物,IgG分离的条件和产量略有不同。见表2-5。
4.从沉淀(B)可按下述方法进一步分离出IgA和IgM的混合物:将沉淀(B)悬浮在0℃水中,调节pH
5.1,离心去除不溶的蛋白。调节上清液离子强度到0.01~0.0075,pH5.5。然后加冷酒精到最终浓度为10%,保持在–2℃或-3℃低温,所得的沉淀(B-B)主要含IgA 和IgM。
表2-5 从几种动物和人血清沉淀A分离IgM的条件
三、DEAE-Sephadex A-50 柱层析纯化免疫球蛋白
原理:离子交换是指液相中的离子与固定相上可解离基团的可逆交换反应。利用这个反应先将要分离的混合物在一定pH的溶液中解离,而后流经固定相,使之与固定相上的可解离基团进行离子交换,吸附于固定相上,凡不能进行交换吸附的成分,则流出层析柱外。再根据交换吸附于固定相上的各组分解离度的差别,运用不同的pH值或不同盐浓度的溶液作
流动相,流过层析柱将各组分分别再交换洗脱下来,这样混合物的各组分即被分开,达到分离的目的,此即为离子交换层析。离子交换层析中的固定相称为离子交换剂。它是由在不溶性高分子母体上引入不同的可解离基团所构成。常用的不溶性高分子母体有纤维素、葡聚糖、琼脂糖及人工合成的树脂等。引入于母体上的活性基团主要有酸性或碱性物质。由于引入的酸性物质可解离出H+离子,能与液相中的阳离子交换,故这类离子交换剂称为阳离子交换剂;引入的碱性物质可解离出OH-离子,能与液相中的阴离子交换,故将这类离子交换剂称为阴离子交换剂。由于引入的酸或碱的强弱不同,两类离子交换剂又分为不同的型。
酸类物质以磺酸基(-SO3H)最强,引入磺酸基的阳离子交换剂称为强酸型;引入磷酸基(-PO3H2)、亚磷酸基(-PO2H)的称中强酸型;引入羧基(-COOH)、酚羟基(-OH)的称为弱酸型。
碱类物质主要是引入胺碱。引入季胺基的称为强碱型;引入叔胺、仲胺、伯胺基的称为弱碱型。各型离子交换剂的使用,将由用以分离的物质特性及分离的目的而定。
分离蛋白质(包括酶)常用纤维离子交换剂。由于蛋白质(酶)的分子量很大,在交换反应后要占有离子交换剂很大的空间位置,不溶性母体空间位置小的交换剂将无法与蛋白质交换容量很低。纤维素作为不溶性母体是因为纤维素具有亲水性强,容易溶胀;溶胀后具有舒展的长链,表面积大,使大分子特质容易接触并容纳。所以,以纤维素形成的离子交换剂对蛋白质(酶)等大分子物质的交换容量大,分辨力强,可以获得较好的分离效果及较高的回收率;另外纤维构成的离子交换剂对交换的离子吸附力较弱,用比较温和条件即可洗脱下来,不影响蛋白质(酶)等生物大分子物质的活性。纤维素的这些特点使它构成的纤维素离子交换剂在生物大分子的分离和纯化中得到广泛的使用。
纤维素上可以引入不同的解离基团而形成各型离子交换剂,其中最常用的是DEAE—纤维素和羧甲基纤维素。DEAE—纤维素(diethylaminoethyl—cellulose,DEAE)是在纤维素上引入二乙基氨基乙基,它是弱碱型阴离交换剂。吸附蛋白质的最适pH范围为7~9,pH超过9.5,DEAE基团则不解离带电荷。每克DEAE含0.96~1.24mmol/L可解离基团,与蛋白质的交换量可达75~122mg/100mgDEAE。
交换吸附于离子交换剂上的物质,通常利用改变洗脱液pH或提高洗脱液中离子强度的方法洗脱下来,从而获得较纯的特质。当在离子交换剂上吸附有几个物质成分时,可用两种方法分别洗脱下来。其一是用pH或离子强度不同的几种洗脱液分别洗脱,即在第1种洗脱液洗脱下第1个成分后,换成第2种洗脱另一成分,再换第3种洗脱液脱下第3个成分,如此洗脱下所有的成分,这种方法称为分段洗脱法。其二是在洗脱的过程中逐步改变洗脱液
的离子强度,从稀到浓,逐步将各种成分洗脱下来,这种方法称为梯度洗脱法。与分段洗脱法相比,梯度法使被洗脱成分的“拖尾”现象较小,分辨率高。
应用离子交换剂来纯化物质,可以是把要纯化的物质成分交换吸附于离子交换剂上,然后再分别洗脱下来获得纯品,或者把不需要的成分吸附于离子交换剂上,需要的成分直接流出,得到纯品。本实验采用DEAE-纤维素层析柱纯化血清IgG,利用pH6.7的缓冲液溶解样品IgG,此时IgG粗物中除IgG外,其他杂蛋白均带上不同数量的负电荷,可以和DEAE 上的阴离子发生交换吸附于柱上。IgG因不解离带电,而不发生交换吸附,利用此特点,让溶解后的样品流过DEAE纤维素柱,即可直接收集到较纯的IgG。
DEAE-Sephadex A-50(二乙氨基-乙基-葡萄糖凝胶A-50)为弱碱性阳离子交换剂。用NaOH将Cl-型转变为OH-型后,可吸附酸性蛋白。血清中的γ球蛋白属于中性蛋白(等电点为pH6.85~7.5),其余均属酸性蛋白。PH7.2~7.4的环境中,酸性蛋白均被
DEAE- Sephadex A-50吸附,只有γ球蛋白不被吸附。因此,通过柱层析,γ球蛋白便可在洗脱中先流出,而其他蛋白则被吸附在柱上,从而便可分离获得纯化的IgG。
(一)操作步骤
1.DEAE-Sephadex A-50预处理称DEAE-Sephadex A-50(下称A-50)5g,悬于500ml 蒸馏水内,1h后倾去上层细粒。按每克A-50加0.5mol/L NaOH 15ml的比例,将A-50浸泡于0.5mol/L NaOH液中,搅匀,静置30min,装入布氏漏斗(垫有2层滤纸)中抽滤,并反复用蒸馏水抽洗至pH呈中性;再以0.5mol/L HCl同上操作过程处理,最后以0.5mol/L NaOH 再处理一次。处理完后,将A-50浸泡于0.1mol/L pH7.4PB中过夜。
2.装柱
3.平衡
4.加样及洗脱
5.收集
6.测蛋白以751型紫外分光光度计分别测定每管OD 280nm与OD 260nm,按公式计算各管蛋白含量。并以OD 280nm为纵座标,以试管编号为横座标,绘制洗脱曲线。
7.合并、浓缩将洗脱峰的上坡段与下坡段各管收集液分别进行合并,以PEG (MW6000)浓缩至所需体积,加入0.02% NaN3防,于4℃保存备用。长期保存时应贮于-40℃冰箱。
8.A-50凝胶的再生
(二)注意事项
(1)柱的选择:从理论上说,只要柱足够长,就能获得理想的分辨率,但由于层析柱流速同压力梯度有关,柱长增加使流速减慢,峰变宽,分辨率降低。柱的直径增加,使流体流动的不均匀性增加,分辨率明显下降。
(2)纯化过程必须严格控制缓冲液的pH及离子强度。样品与A-50凝胶必须用洗脱缓冲液彻底平衡后,才能进行柱层析。
(3)所装的柱床必须表面平整,无沟流及气泡,否则应重装。
(4)洗脱过程中应严格控制流速,切勿过快。
(5)上样的体积要小,浓度不宜过高。
(6)加样及整个洗脱过程中,严防柱面变干。
四、SPA-Sepharose CL-4B 亲合层析纯化IgG及IgG亚类
(一)原理
葡萄球菌A蛋白(SPA)具有与多种哺乳动物IgG分子Fc段结合的能力,并与不同IgG 亚类的结合力有所差别。改变pH及离子强度可洗脱结合于SPA-Sepharose CL-4B 柱上的IgG 或不同的IgG 亚类,可直接纯化血清或小鼠腹水中的IgG抗体。
(二)操作步骤
1.用0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液浸泡SPA-Sepharose CL-4B凝胶,15min。按1g干胶200ml上述缓冲液充分洗涤凝胶,(用玻璃漏斗过滤或置烧杯中洗涤)。
2.装柱后用0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液平衡。
3.标本可用硫酸铵粗提物,先10000g离心除去杂质,必要时用0.22μm滤膜过滤,上样前用1mol/L pH9.0 Tris 液调整标本液pH至8.1或对平衡液透析过夜。
4.加样,一般按25~30mg IgG/g湿胶比例加样,室温作用15min,用0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液充分淋洗,到淋洗液OD值为<0.02。
5.用不同pH的枸橼酸洗脱液洗脱,流速20ml/h。如纯化小鼠IgG1一般用pH
6.0;纯IgG2a用pH4.0 ;纯化IgG2b用0.1mol/L pH3.0醋酸盐缓冲液0.1mol/L pH3.0glycine-HCl 缓冲液洗脱。
6.用pH3.0或4.0洗脱液洗脱时,用适量固体Tris直接中和含有IgG的洗脱液。
7.收集洗脱液测OD值,根据实验需要透析除盐后进行浓度、纯度和活性测定。
(三)注意事项
(1)SPA-Sepharose CL-4B凝胶价格昂贵,可再生后反复使用10~20次左右。
方法:先用10倍柱体积0.1mol/L pH8.5 Tris含0.5mol/L NaCl溶液洗脱柱上的残存杂蛋白;再用10倍柱体积0.1mol/L pH4.5醋酸钠缓冲液含0.5mol/L NaCl溶液洗脱柱上的残存杂蛋白;0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液平衡,4℃贮存。
(2)SPA-Sepharose CL-4B亲合层析法还可用于:①除去抗体液中IgG,检测非IgG抗体(如IgM)的生物学活性;②除去木瓜蛋白酶或胃蛋白酶水解IgG后的Fc段;③吸收或纯化免疫复合物。
(3)狗、猫的多克隆IgM和IgA以及单克隆IgA和IgM也具有与SPA结合的能力。
五、高效和液相色谱纯化小鼠腹水中单克隆抗体
从小鼠腹水中纯化McAb的方法有盐析、离子交换层析、凝胶过滤和亲合层析等。应用TSK DEAE-SPW离子交换层析柱从小鼠腹水中纯化McAb不仅纯化速度快,回收率和得率高,而且保持良好的生物学活性。
(一)原理
根据离子交换原理,将经硫酸铵粗提的含McAbγ球蛋白上样结合于层析柱上,通过增加洗脱液中的离子强度,洗脱并收集蛋白峰。
(二)操作步骤
1.腹水离心10000 g,10min,除去细胞和杂质,在4℃下逐滴加入饱和硫酸铵溶液,使终浓度为40%饱和硫酸铵,搅拌20~30min。
2.离心,沉淀用40%饱和硫酸铵洗涤2次后溶于PBS,对缓冲液A(pH8.5, 20mM Tris)缓冲液透析除盐,4℃过夜
3.用带有1000μl样品环的高压加样活门将透析后粗提物加样于经缓冲液A液平衡的TSK DEAE SPW离子交换层析柱
4.洗脱流速1ml/min
0~1min :0→5%缓冲液B(20nmol/L Tris, Ph 8.5,含2.0 mol/L醋酸钠)
1~2 min( 线性梯度洗脱):5→20%缓冲液B
20~22min:20→0%缓冲液B
5.洗脱液用紫外280nm进行监测,收集蛋白峰,进行含量、纯度和活性测定
(三)注意事项
(1)所用缓冲液和加样粗提物均需0.2μm滤膜过滤。
(2)在本实验条件下,IgG1峰一般在线性梯度洗脱开始11-12min。但不同类和亚类抗体以及不同特异性McAb 的存留时间(retention time)有所差异。
蛋白质纯化的方法 蛋白质的分离纯化方法很多,主要有: (一)根据蛋白质溶解度不同的分离方法 1、蛋白质的盐析 中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响,一般在低盐浓度下随着盐浓度升高,蛋白质的溶解度增加,此称盐溶;当盐浓度继续升高时,蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出,这种现象称盐析,将大量盐加到蛋白质溶液中,高浓度的盐离子(如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力,可夺取蛋白质分子的水化层,使之“失水”,于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同,故盐析所需的盐浓度也不一样,因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。 影响盐析的因素有:(1)温度:除对温度敏感的蛋白质在低温(4度)操作外,一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质(如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白)在较高的温度(25度)比0度时溶解度低,更容易盐析。(2)pH值:大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。(3)蛋白质浓度:蛋白质浓度高时,欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来(共沉现象)。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释,使蛋白质含量在2.5-3.0%。 蛋白质盐析常用的中性盐,主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多的硫酸铵,它的优点是温度系数小而溶解度大(25度时饱和溶液为4.1M,即767克/升;0度时饱和溶解度为3.9M,即676克/升),在这一溶解度范围内,许多蛋白质和酶都可以盐析出来;另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好,不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间,当用其他pH值进行盐析时,需用硫酸或氨水调节。 蛋白质在用盐析沉淀分离后,需要将蛋白质中的盐除去,常用的办法是透析,即把蛋白质溶液装入秀析袋内(常用的是玻璃纸),用缓冲液进行透析,并不断的更换缓冲液,因透析所需时间较长,所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐,所用的时间就比较短。
引物纯化方式选择指南2012-2-16 10:24:14 容导读 一、DNA合成的方法和原理 二、引物纯化的方法原理及其效果 三、纯化方法与应用指南 四、常见问题的原因分析及相应的对策 一、DNA合成的方法和原理 目前引物合成主要采用固相亚磷酰胺三酯法进行。基于该方法的DNA合成仪有多种,由ABI/PE 公司生产的高通量DNA自动合成仪得到了广泛的应用。各合成仪进行引物合成的原理基本相同,主要区别在于合成产率的高低、试剂消耗量和单个循环用时等。生工公司采用的合成仪主要机型为全新的ABI3900高通量合成仪。 固相亚磷酰胺三酯法合成DNA片段,具有高效、快速偶联以及起始反应物比较稳定的特点。该方法是在固相载体上完成DNA链的合成的,DNA化学合成不同于酶促的DNA合成过程从5’→3’方向延伸,而是由3’端开始,相邻的核苷酸通过3’→5’磷酸二酯键连接。具体的反应步骤如图一。 1、脱保护基(Deblocking) 用三氯乙酸(Trichloroacetic Acid,TCA) 脱去连结在CPG (Controlled Pore Glass) 上的核苷酸的保护基团DMT (二甲氧基三苯甲基),获得游离的5'-羟基端,以供下一步缩合反应。2、活化(Activation) 将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱,形成亚磷酰胺四唑活性中间体(其3'-端已被活化,但5'-端仍受DMT保护),此中间体将与GPG上的已脱保护基的核苷酸发生缩合反应。
3、连接(Coupling) 亚磷酰胺四唑活性中间体遇到CPG上已脱保护基的核苷酸时,将与其5'-羟基发生亲合反应,缩合并脱去四唑,此时合成的寡核苷酸链向前延长一个碱基。 4、封闭(Capping) 缩合反应后,为了防止连在CPG上的未参与反应的5'-羟基在随后的循环反应中被延伸,常通过乙酰化来封闭此端羟基,一般乙酰化试剂是用乙酸酐和N-甲基咪唑等混合形成的。 图1: DNA合成原理示意图(固相亚磷酰胺三酯法) 5、氧化(Oxidation) 缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在CPG上的寡核苷酸连接,而亚磷酯键不稳定,易被酸、碱水解,此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酰转化为磷酸三酯,得到稳定的寡核苷酸。 经过以上五个步骤后,一个脱氧核苷酸就被连到CPG的核苷酸上,同样再用三氯乙酸脱去新连上的脱氧核苷酸5'-羟基上的保护基团DMT后,重复以上的活化、连接、封闭、氧化过程即可得到DNA片段粗品。最后对其进行切割、脱保护基,合成的Oligo在脱去保护基后,目的Oligo纯度是比较低的,其中含有大量的杂质。主要杂质有:所脱下的保护基与氨形成的苯甲酸氨和异丁酸氨,腈磷基上脱下的腈乙基,以及合成时产生的短链等。以至于粗产品中全长Oligo DNA含量仅为25%左右。尽管合成时每一步的效率都在98%~99%,但累积的效率并不高。这些杂质成分,尤其是存在于粗产品中的大量盐和短链,不但造成定量不准,还会影响下一步的反应。因此必须对Oligo DNA进行纯化、定量等合成后处理即可得到符合实验要求的寡核苷酸片段。 二、引物纯化的方法原理及其效果 基于以上合成的原理和步骤,目前,常见的几种纯化方法如C18柱、OPC或HAP、PAGE、
蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤: (一)材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时,首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态,不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有: 1. 机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用,使细胞破碎。常用设备有,高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法 生物组织经冻结后,细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便,但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 (二)蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提,抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂(十二烷基磺酸钠、tritonX-100 等),使膜结构破坏,利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中,应注意温度,避免剧烈搅拌等,以防止蛋白质的变性。(三)蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法: 1.等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同,可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2.盐析法 不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同,所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质,并能再度溶解而不变性。 3.有机溶剂沉淀法 中性有机溶剂如乙醇、丙酮,它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低,进而从溶液中沉淀出来,因此可用来沉淀蛋白质。此外,有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层,促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性,使用该法时,要注意在低温下操作,选择合适的有机溶剂浓度。 (四)样品的进一步分离纯化
Protocol 蛋白质纯化方法(镍柱) 柱前操作 1.IPTG诱导后,收菌,8000rpm/min(r/m)离心10min; 2.用Binding Buffer(BB)溶解(每100ml原菌液加BB 20ml),超声裂解30min(工作:5s,停止:5s),1500r/m离心10min,去除杂质; 3.取上清,12000r/m离心20min, 得包涵体; 4.用含2M尿素的BB洗包涵体,12000r/m离心20min,(上清做电泳);??? 5.用含6M尿素的BB溶解包涵体,12000r/m离心20min,(上清做电泳); 6.对照电泳结果,将上清或包涵体溶解液上柱; 平衡柱子(柱体积:V) 7. 3V(3倍柱体积)ddH2O(洗乙醇); 8. 5V Charge Buffer(CB); ??? 9. 3V BB; 柱层析 10.上样; 11. 10V Washing Buffer(WB); 12. 6V Elute Buffer(EB); 13.分管收集,每管1~2ml. 各种缓冲液配方 1. 8×BB: 4M NaCl, 160mM Tris-HCl, 40mM imidazole(咪唑),pH=7.9 1000ml NaCl: 58.44×4=233.76g Tris-HCl: 121.14×160×10-3=19.3824g Imidazole: 68.08×40×10-3=2.7232g 2. 8×CB: 400mM NiSO4 1000ml NiSO4: 262.8×400×10-3=105.12g 3. 8×WB: 4M NaCl, 160mM Tris-HCl, 480mM imidazole, pH=7.9 1000ml NaCl: 233.76g, Tris-HCl:19.3824g, Imidazole: 32.6784g 4. 4×EB: 2M NaCl, 80mM Tris-HCl, 4M imidazole, pH=7.9 1000ml NaCl: 118.688g, Tris-HCl:9.6912g, Imidazole: 272.32g 5. 6M 尿素 1000ml 尿素:60.06×6=360.36g
引物纯化方式HAP、PAGE、DHLPC等的区别 纯化方式: 一OPC纯化 OPC纯化是使用一种叫Cartridge的反向层析柱(美国Waters 公司生产 ),根据DNA保护基(DMTr基)和层析柱中树脂间的亲和力作用的原理进行纯化目的DNA片段。OPC法纯化的DNA纯度大于90%,适用于PCR用引物,DNA测序用引物,各种探针等。此级别对短链较为有效。具体操作方法如下。 1. DNA 合成是用全自动DNA 合成仪从3‘ →5‘ 进行人工合成的。在刚合成完的DNA 的5‘ 端的碱基上带有一个大型的疏水性保护基团DMTr 基,而中间产物的短链杂质DNA 中不具有DMTr 基。利用这一性质进行目的DNA 的纯化。 2. 把粗样DNA 加入Sep-Pak Cartridge 柱上(简易反相柱) 。此时,所有的合成产物全吸附于反相柱上。 3. 用甲醇清洗反相柱。此时,吸附能力强的带有DMTr 保护基的目的DNA 仍吸附于反相柱上,而短链杂质DNA 片段全部被冲走。 4. 向反相柱上加入强酸TFA (Trifluoroacetic acid) , 切断DMTr 保护基和目的DNA 之间的连接。 5. 再用乙腈洗脱目的DNA 。此时回收出来的目的DNA 的纯度能达到95% 以上。可用于DNA 测序等。 二 PAGE纯化 PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,对DNA片段进行分离,然后从凝胶中回收目的DNA的方法。PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法,纯化后的纯度大于95%,对长链Oligo DNA的纯化特别有效。适用于PCR用引物,DNA测需用引物,各种探针等。 三 HPLC纯化 采用高效液相色谱纯化,产物纯度极高,可达99%。适用于各种基因工程试验,特别是:荧光标记DNA、长链DNA、PCR克隆,定点突变,人工合成基因等。 HPLC 纯化 HPLC 纯化是使用高效液相色谱仪,对目的DNA 片段进行纯化的方法。HPLC 纯化的设备投资大,生产成本高,但使用本法纯化的 DNA 片段纯度极高,大于99% 。HPLC 纯化的操作方法如下。 1. 合成高纯度级DNA 制品时,在全自动DNA 合成仪上,需自动脱去DMTr 保护基。 2. 将粗样DNA 注入分离性能极强的离子交换高效液相色谱系统,进行粗检测,确认主峰位置、目的DNA 含量等。 3. 增加注样量,回收主峰平头部分。此时可达到去除杂质短链DNA ,纯化目的DNA 的目的。为了确保DNA 的纯度,一般一次的纯化量为 1 OD 左右。 4. 将回收后的DNA 进行纯度检测,确认纯度的可靠性。
随着分子生物学的发展,越来越多的科研人员熟练掌握了分子生物学的各种试验技术,并研制成套试剂盒,使基因克隆表达变得越来越容易lIl。但分子生物学的上游工作往往并非是最终目的,分子克隆与表达的关键是要拿到纯的表达产物,以研究其生物学作用,或者大量生产出可用于疾病治疗的生物制品。相对与上游工作来说,分子克隆的下游工作显得更难,蛋白纯化工作非常复杂,除了要保证纯度外,蛋白产品还必须保持其生物学活性。纯化工艺必须能够每次都能产生相同数量和质量的蛋白,重复性良好。这就要求应用适应性非常强的方法而不是用能得到纯蛋白的最好方法去纯化蛋白。在实验室条件下的好方法却可能在大规模生产应用中失败,因为后者要求规模化,且在每日的应用中要有很好的重复性。本文综述了蛋白质纯化的基本原则和各种蛋白纯化技术的原理、优点及局限性,以期对蛋白纯化的方法选择及整体方案的制定提供一定的指导。 1 蛋白纯化的一般原则 蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异,利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染,而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异,利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开,由于此时样本体积大、成分杂,要求所用的树脂高容量、高流速,颗粒大、粒径分布宽.并可 以迅速将蛋白与污染物分开,防止目的蛋白被降解。精细纯化阶段则需要更高的分辨率,此阶段是要把目的蛋白与那些大小及理化性质接近的蛋白区分开来,要用更小的树脂颗粒以提高分辨常用的离子交换柱和疏水柱,应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。选择性指树脂与目的蛋白结合的特异性,柱效则是指蛋白的各成分逐个从树脂上集中洗脱的能力,洗脱峰越窄,柱效越好。仅有好的选择性,洗脱峰太宽,蛋白照样不能有效分离。 2.各种蛋白纯化方法及优缺点 2.1蛋白沉淀蛋白能溶于水是因为其表面有亲水性氨基酸。在蛋白质的等电点处若溶液的离子强度特别高或特别低,蛋白则倾向于从溶液中析出。硫酸铵是沉淀蛋白质最常用的盐,因为它在冷的缓冲液中溶解性好,冷的缓冲液有利于保护蛋白的活性。硫酸铵分馏常用做纯化的第一步,它可以初步粗提蛋白质,去除非蛋白成分。蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳定,可以短期在这种状态下保存中间产物,当前蛋白质纯化多采用这种办法进行粗分离翻。在规模化生产上硫酸铵沉淀方法仍存在一些问题,硫酸铵对不锈钢器具的腐蚀性很强。其他的盐如硫酸钠不存在这种问题,但其纯化效果不如硫酸铵。除了盐析外蛋白还可以用多聚物如PEG 和防冻剂沉淀出来,PEG是一种惰性物质,同硫酸铵一样对蛋白有稳定效果, 在缓慢搅拌下逐渐提高冷的蛋白溶液中的PEG浓度,蛋白沉淀可通过离心或过滤获得,蛋白可在这种状态下长期保存而不损坏。蛋白沉淀对蛋白纯化来说并不是多么好的方法,因为它只能达到几倍的纯化效果,而我们在达到目的前需要上千倍的纯化。其好处是可以把蛋白从混杂有蛋白酶和其他有害杂质的培养基及细胞裂解物中解脱出来。
引物合成的详解 1.引物是如何合成的? 目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种, 主要都是由ABI/PE 公司生产,无论采用什么机器合成,合成的原理都相同,主要差别在于合成产率的高低,试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。 亚磷酰胺三酯法合成DNA片段,具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的,合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的,相邻的核苷酸通过3′→5′磷酸二酯键连接。 第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应,脱去其5′-羟基的保护基团DMT,获得游离的5′-羟基。 第二步,合成DNA的原料,亚磷酰胺保护核苷酸单体,与活化剂四氮唑混合,得到核苷亚磷酸活化中间体,它的3′端被活化,5′-羟基仍然被DMT保护,与溶液中游离的5′-羟基发生缩合反应。 第三步,带帽(capping)反应,缩合反应中可能有极少数5′-羟基没有参加反应(少于2%),用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应,这种短片段可以在纯化时分离掉。 第四步,在氧化剂碘的作用下,亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。 经过以上四个步骤,一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5′-羟基上的保护基团DMT,重复以上步骤,直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。 通过氨水高温处理,连接在CPG上的引物被切下来,通过OPC, PAGE等手段纯化引物,成品引物用C18浓缩,脱盐,沉淀。沉淀后的引物用水悬浮,测定OD260定量,根据定单要求分装。 2.引物纯化方式有哪些,如何选择? ◆C18柱脱盐:有人称其为简易反相柱,它对DNA有特异性的吸附,可以被有机溶解洗脱,但不会被水洗脱,所以能有效地去除盐分。它不能有效去除比目的片段短的小片段。实际上,它是一种脱盐的作用。这种方法一般不会对普通PCR反应产生影响。对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。 ◆OPC纯化:OPC纯化是根据DNA保护基(DMTr基)和Cartridge柱中树脂间的亲合力作用的原理进行纯化目的DNA片段。OPC法纯化的DNA纯度大于95%。适用于40mer以下引物的纯化。 ◆PAGE纯:PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,对DNA片段进行分离,然后从凝胶中回收目的DNA的方法。PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法,纯化后的DNA纯度大于95%,对长链Oligo DNA (大于50mer)的纯化特别有效。 ◆HPLC纯化:HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理,对DNA片段进行纯化。纯度可以大于99%。主要用于短链和修饰引物的纯化。该法的弱点是成本较高,批量生产效率不高。 3.引物的OD数如何定量? 答:引物合成引物OD数是这样测定的:用紫外分光光度计,波长260nm,石英比色杯,光程为1厘米,测定溶液的光密度。测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-1.0之间。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后,用1ml水稀释测OD值。需要根据稀释倍数换算出母液的OD值。 4.需要什么级别的引物? 答:引物常用的纯化方式C18脱盐,OPC纯化,PAGE纯化,HPLC纯化。根据实验需要,确定订购引物的纯度级别。 应用引物长度要求纯度级别要求 一般PCR扩增<45 base OPC 一般PCR扩增>45 base PAGE
蛋白质纯化的方法选择 随着分子生物学的发展,越来越多的科研人员熟练掌握了分子生物学的各种试验技术,并研制成套试剂盒,使基因克隆表达变得越来越容易。但分子生物学的上游工作往往并非是最终目的,分子克隆与表达的关键是要拿到纯的表达产物,以研究其生物学作用,或者大量生产出可用于疾病治疗的生物制品。相对与上游工作来说,分子克隆的下游工作显得更难,蛋白纯化工作非常复杂,除了要保证纯度外,蛋白产品还必须保持其生物学活性。纯化工艺必须能够每次都能产生相同数量和质量的蛋白,重复性良好。这就要求应用适应性非常强的方法而不是用能得到纯蛋白的最好方法去纯化蛋白。在实验室条件下的好方法却可能在大规模生产应用中失败,因为后者要求规模化,且在每日的应用中要有很好的重复性。本文综述了蛋白质纯化的基本原则和各种蛋白纯化技术的原理、优点及局限性,以期对蛋白纯化的方法选择及整体方案的制定提供一定的指导。 1、蛋白纯化的一般原则 蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异,利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染,而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异,利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开,由于此时样本体积大、成分杂,要求所用的树脂高容量、高流速,颗粒大、粒径分布宽.并可以迅速将蛋白与污染物分开,防止目的蛋白被降解。精细纯化阶段则需要更高的分辨率,此阶段是要把目的蛋白与那些大小及理化性质接近的蛋白区分开来,要用更小的树脂颗粒以提高分辨率,常用离子交换柱和疏水柱,应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。选择性树脂与目的蛋白结合的特异性,柱效则是指各蛋白成分逐个从树脂上集中洗脱的能力,洗脱峰越窄,柱效越好。仅有好的选择性,洗脱峰太宽,蛋白照样不能有效分离。 2、各种蛋白纯化方法及其优、缺点 2.1 蛋白沉淀蛋白能溶于水是因为其表面有亲水性氨基酸,在蛋白质的等电点处若溶液的离子强度特别高或者特别低,蛋白则倾向于从溶液中析出。硫酸铵是沉淀蛋白最常用的盐,因为它在冷的缓冲液中溶解性好,冷的缓冲液有利于保持目的蛋白的活性。硫酸铵分馏常用作试验室蛋白纯化的第一步,它可以初步粗提蛋白质,去除非蛋白成分。蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳定,可以短期在这种状态下保存中间产物,当前蛋白质纯化多采用这种办法进行粗分离翻。在规模化生产上硫酸铵沉淀方法仍存在一些问题,硫酸铵对不锈钢器具的腐蚀性很强。其他的盐如硫酸钠不存在这种问题,但其纯化效果不如硫酸铵。除了盐析外蛋白还可以用多聚物如PEG和防冻剂沉淀出来,PEG是一种惰性物质,同硫酸铵一样对蛋白有稳定效果,在缓慢搅拌下逐渐提高冷的蛋白溶液中的PEG浓度,蛋白沉淀可通过离心或过滤获得,蛋白可在这种状态下长期保存而不损坏。蛋白沉淀对蛋白纯化来说并不是多么好的方法,因为它只能达到几倍的纯化效果,而我们在达到目的前需要上千倍的纯化。其好处是可以把蛋白从混杂有蛋白酶和其他有害杂质的培养基及细胞裂解物中解脱出来。 2.2 缓冲液的更换虽然更换缓冲液不能提高蛋白纯度,但它却在蛋白纯化方案中起着极其重要的作用。不同的蛋白纯化方法需要不同pH及不同离子强度的缓冲液。假如你用硫酸铵将蛋白沉淀出来,毫无疑问蛋白是处在高盐环境中,需要想办法脱盐,可用的方法有利用半透膜透析,通过勤换透析液体去除盐分,此法尚可,但需几个小时,通常要过夜,也难以用于大规模纯化中。新型的设备将透析膜夹在两个板中间,板的一侧加缓冲液,另一侧加需脱盐的蛋白溶液,并在蛋白溶液一侧通过泵加压,可以使两侧溶液在数小时内达到平衡,若增加对蛋白溶液的压力,还可迫使水分和盐更多通过透析膜进入透析液达到对蛋白浓缩的目的。也有出售的脱盐柱,柱内的填料是小孔径的颗粒,蛋白分子不能进入孔内,先于高浓度盐离子从柱中流出,从而使二者分离。蛋白纯化的每一步都会造成目的蛋白的丢失,缓冲液平衡的步骤尤甚。蛋白会结合在任何它能接触的表面上,剪切力、起泡沫和离子强度的快速变化很容易让蛋白失活。 2.3 离子交换色谱这是在所有的蛋白纯化与浓缩方法中最有效方法。基于蛋白与离子交换树脂间的相互电荷作用,通过选择不同的缓冲液,同一种蛋白既可以和阴离子交换树脂(能结合带负电荷的分子)结合,也可以和阳离子交换树脂结合。树脂所用的带电基团有四种:二乙基氨基乙基用于弱的阴离子交换树脂;羧甲基用于弱的阳离子交换树脂;季铵用于强阴离子交换树脂;甲基磺酸酯用于强阳离子交换树脂。蛋白质由氨基酸组成,氨基酸在不同的pH环境中所带总电荷不同。大多数蛋白在生理pH(pH6~8)下带负电荷,需用阴离子交换柱纯化,极端的pH下蛋白会变性失活.应尽量避免。由于在某个特定的pH下不同的蛋白所带电荷数不同,与树脂的结合力也不同,随着缓冲液中盐浓度的增加或pH的变化,蛋白按结合力的强弱被依次洗脱。在工业化生产中更多地是改变盐浓度而不是去改变pH值,因为前者更容易控制。在实验室中几乎总是用盐浓度梯度去洗脱离子交换柱,利用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升,当离子强度能够中和蛋白的电荷时,蛋白就被从柱上洗脱下来。但在工业生产中盐浓度很难精确控制,所以常用分步洗脱而不足连续升高的盐梯度。与排阻层析相比,离子交换特异性更好,有更多的参数可以调整以获得最优的纯化效果,树脂也比较便宜。值得一提的是,即便是用最精确控制的条件,仅用离子交换单一的方法也得不到纯的蛋白,还需要其他的纯化步骤。
第二部分:蛋白的纯化 如何区分蛋白表达在上清还是包涵体? 破碎细胞后离心分别收集上清和沉淀,表达的蛋白可能分布在上清中也有可能分布在沉淀中,还有可能是二者中都有分布。 根据我们实验室的经验,超声碎菌之后,如果菌液比较清亮,沉淀比较少,那表达的蛋白基本上是可溶的。但如果超声完之后,菌液是浑浊的,而且当离心之后,离下的沉淀比较多,而且沉淀的颜色也比较白,那基本上就是包涵体了。包涵体是基因重组蛋白在大肠杆菌中高水平表达时所形成的无活性的蛋白质聚集体,难溶于氺,可溶于变性剂如尿素,盐酸胍等,其实,包涵体也就是我们常说的不可溶蛋白。对于后者,可将上清和沉淀分别跑一个PAGE,看看上清中的量能达到多少,对于某些蛋白来说,一部分是以包涵体形式表达,一部分是以可溶的形式表达,而且量也不少,可以满足后续实验的需要,这个时候最好是纯可溶的,因为包涵体即使最后复性,活性也不太可信。 对于沉淀跑SDS-PAGE,如何处理,用什么使其溶解,还有在大肠杆菌中表达的蛋白,在提取过程中,使用什么蛋白提取缓冲液。 沉淀用Buffer B重悬,(组成:8M尿素+10mMTRIS base+100mM NaH2PO4,用NaOH调节pH到8.0),1克沉淀(湿重)加5ml Buffer B,使其充分溶解(可以放在微量震荡器上震荡20min),然后室温下12000转离心20min,留上清,弃沉淀。 取10ul上清加入10ul 2xSDS上样缓冲液,就可以跑PAGE了。 无论是纯可溶蛋白还是包涵体,在菌体裂解这一步我用的都是Lysis Buffer(组成:10mM 咪唑+300mM NaCl+50mM NaH2PO4,用NaOH调节pH到8.0)每克菌体(湿重)加2-5ml Lysis Buffer,充分悬起后,加入溶菌酶4度作用半小时就可以超声破碎了。 包涵体,简单的说就是翻译的蛋白没有正确折叠而聚集在一起形成的,主要的是疏水作用。实际上就是很多个蛋白分子,这些蛋白并不是交联在一起的,用高浓度的尿素和盐酸胍可以使他们变性,解聚。 电泳检测的话,可以用SDS-PAGE检测,在上样之前,需要用上样缓冲液处理样品,处理后,包涵体也就解聚了,每个蛋白分子与SDS结合,形成了可溶物。 包涵体是不容易破碎的,超声可以破碎菌体释放里面的包涵体,但是不能破碎包涵体;但如果用水煮的话,包涵体会变性,会有一部分可溶于水,所以你跑的上清中有可能有包涵体存在,也有可能没有包涵体; 建议: 还是先将菌体超声破碎,然后离心,取沉淀和上清再跑一次电泳,如果沉淀上清中都有你要的蛋白,说明表达的结果是部分可溶;如果仅上清有就是可溶性表达;如果仅沉淀中有,就是完全包涵体了。不过,一般情况下,应该是第一者的可能性大。
蛋白质的分离纯化方法 2.1根据分子大小不同进行分离纯化 蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白 质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质(88∶12)、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白[1]。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质[7]。 2.2 根据溶解度不同进行分离纯化 影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。 等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最
蛋白质纯化与结晶的原理 获得蛋白质的晶体结构的第一个瓶颈,就是制备大量纯化的蛋白质(>10 mg),其浓度通常在10 mg/ml 以上,并以此为基础进行结晶条件的筛选。运用重组基因的技术,将特定基因以选殖(clone)的方式嵌入表现载体(expression vector)内,此一载体通常具有易于调控的特性。之后再将带有特定基因的载体送入可快速生长的菌体中,如大肠杆菌(Escherichia coli),在菌体快速生长的同时,也大量生产表现载体上的基因所解译出之蛋白质。一般而言纯度越高的蛋白质比较有机会形成晶体,因此纯化蛋白质的步骤就成为一个重要的决定因素。 在取得高纯度的蛋白质溶液后,接下来就是晶体的培养。蛋白质晶体与其他化合物晶体的形成类似,是在饱和溶液中慢慢产生的,每一种蛋白质养晶的条件皆有所差异,影响晶体形成的变量很多,包含化学上的变量,如酸碱度、沈淀剂种类、离子浓度、蛋白质浓度等;物理上的变数,如溶液达成过饱和状态的速率、温度等;及生化上的变数,如蛋白质所需的金属离子或抑制剂、蛋白质的聚合状态、等电点等,皆是养晶时的测试条件。截至目前为止,并无一套理论可以预
测结晶的条件,所以必须不断测试各种养晶溶液的组合后,才可能得到一颗完美的单一晶体(图一) 。 蛋白质晶体的培养,通常是利用气相扩散法(Vapor Diffusion Method) 的原理来达成;也就是将含有高浓度的蛋白质(10-50 mg/ml)溶液加入适当的溶剂,慢慢降低蛋白质的溶解度,使其接近自发性的沈淀状态时,蛋白质分子将在整齐的堆栈下形成晶体。举例来说,我们将蛋白质溶于低浓度(~1.0 M) 的硫酸铵溶液中,将它放置于一密闭含有高浓度(~2.0 M)硫酸铵溶液的容器中,由气相平衡,可以缓慢提高蛋白质溶液中硫酸铵的浓度,进而达成结晶的目的(图二)。 蛋白质晶体在外观上与其他晶体并无明显不同之处,但在晶体的内部,却有很大的差异。一般而言,蛋白质晶体除了蛋白质分子外,其他的空间则充满约40 %至60 %之间的水溶液,其液态的成分不仅使晶体易碎,也容易使蛋白质分子在晶格排列上有不规则的情形出现,造成晶体处理时的困难及绕射数据上的搜集不易等缺点。但也由于高含水量的特性,让蛋白质分子在晶体内与水溶液中的状态,极为相似。所以由晶体所解出的蛋白质结构,基本上可视为自然状态下的结构。
(二)利用溶解度差别 影响蛋白质溶解度的外部因素有:1、溶液的pH;2、离子强度;3、介电常数;4、温度。但在同一的特定外部条件下,不同蛋白质具有不同的溶解度。 1、等电点沉淀:原理:蛋白质处于等电点时,其净电荷为零,由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。因此在其他条件相同时,他的溶解度达到最低点。在等电点之上或者之下时,蛋白质分子携带同种符号的净电荷而互相排斥,阻止了单个分子聚集成沉淀,因此溶解度较大。不同蛋白质具有不同的等电点,利用蛋白质在等电点时的溶解度最低的原理,可以把蛋白质混合物分开。当pH被调到蛋白质混合物中其中一种蛋白质的等电点时,这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来,那些等电点高于或低于该pH的蛋白质则仍留在溶液中。这样沉淀出来的蛋白质保持着天然的构象,能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。 5、盐析与盐溶:原理:低浓度时,中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后,带电层使蛋白质分子彼此排斥,而蛋白质与水分子之间的相互作用却加强,因而溶解度增高。球蛋白溶液在透析过程中往往沉淀析出,这就是因为透析除去了盐类离子,使蛋白质分子之间的相互吸引增加,引起蛋白质分子的凝集并沉淀。当溶液的离子强度增加到一定程度时,蛋白质溶解程度开始下降。当离子强度增加到足够高时,例如饱和或半饱和程度,很多蛋白质可以从水中沉淀出来,这种现象称为盐析。盐析作用主要是由于大量中性盐的加入使水的活度降低,原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水。此时那些被迫与蛋白质表面的疏水集团接触并掩盖他们的水分子成为下一步最自由的可利用的水分子,因此被移去以溶剂化盐离子,留下暴露出来的疏水基团。蛋白质疏水表面进一步暴露,由于疏水作用蛋白质聚集而沉淀。 盐析沉淀的蛋白质保持着他的天然构象,能再溶解。盐析的中性盐以硫酸铵为最佳,在水中的溶解度很高,而溶解度的温度系数较低。 3、有机溶剂分级分离法:与水互溶的有机溶剂(甲醇、乙醇和丙酮等)能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。在室温下有机溶剂会引起蛋白质变性,如果预先将有机溶剂冷却到-40°C以下,然后在不断搅拌下逐滴加入有机溶剂,以防局部浓度过高,那么变性可以得到很大程度缓解。蛋白质在有机溶剂中的溶解度也随温度、pH和离子强度而变化。在一定温度、pH和离子强度条件下,引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同,因此控制有机溶剂浓度也可以分
含组氨酸标签的蛋白的诱导表达及纯化 一.用IPTG诱导启动子在大肠杆菌中表达克隆化基因 所需特殊试剂:1M IPTG 1.将目的基因与IPTG诱导表达载体连接,构成重组质粒并转化相应的 表达用的大肠杆菌。将转化体铺于含相应抗生素的LB平板,37℃培养 过夜。通过酶切序列分析等筛选带有插入片段的转化体。 2.分别挑取对照菌和重组菌1个菌落,接种于1ml含有相应抗生素的LB 培养液中,37℃通气培养过夜。 3.取100微升过夜培养物接种于5ml含有相应抗生素的LB培养液中(各 10份),适当的温度(20-37℃)震荡培养4小时,至对数中期(A550 =0.1-1.0)。 4.对照菌和重组菌各取1ml未经诱导的培养物于离心管中,剩余培养物 中加入IPTG至终浓度分别为0.5,1.0,1.5,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5, 5.0mM相同的温度继续通气培养。 5.在诱导的1,2,3,4,5个小时取1ml样品于Ep管中。 细菌的生长速率严重影响外源蛋白的表达,因此必须对接种菌量,诱 导前细菌生长时间和诱导后细菌密度进行控制。生长过度或过速会加 重细菌合成系统的负担,导致包涵体的形成。生长温度可能是影响大 肠杆菌高度表达目的蛋白的最重要因素。低温培养能在一定程度上抑 制包涵体的形成。IPTG的浓度对表达水平的影响也非常大。所以通过 试验确定最佳的培养条件是很必要的。 6.将所有样本室温最高速度离心1分钟,弃上清,沉淀重悬于100微升 1×SDS蛋白上样缓冲液中,100℃加热5分钟,室温最高速度离心1 分钟,取15微升样品上样于SDS聚丙烯酰胺凝胶,用SDS-PAGE 观察表达产物条带,从而确定优化的培养条件。 二.大量表达靶蛋白 1.取保存的重组大肠杆菌菌液150微升接种于30毫升含相应抗生素的 LB培养液中,在100毫升锥形瓶中,300rpm,37℃通气过夜培养。
组氨酸(His)标签蛋白的纯化 His-Tag融合蛋白是目前最常见的表达方式,而且很成熟,它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性,无论是表达的蛋白是可溶性的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和色谱(IMAC)纯化。 IMAC(Immobilized Metal-ion affinity chromatography)是Porath et 年用固定IDA作为配基的填料螯合过渡金属铜、镍、钴或锌离子,可以吸附纯化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白,1987年Smith et al. 发现带有几个组氨酸或色氨酸小肽和螯合金属离子的IDA-sephadex G-25作用力更强,此前在1986年他和他的合作者用Ni2+-IDA-sephadex G-25亲和纯化在氨基端带组氨酸和色氨酸的胰岛素原。同年1987年Hochuli et al.发现带有相连组氨酸的多肽和Ni2+-NTA填料作用力更强于普通的肽,1988年他第一次用这样的方法纯化了带六个组氨酸标签的多肽,无论是在天然还是变性条件下一次亲和纯化都得到很好效果,此后表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC变得非常普遍,相对而言,不带标签的蛋白纯化就非常困难,所以表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC 纯化变成最常用而且最有效的研究蛋白结构和功能的有力手段。1986年Porath et al.还发现Fe3+-IDA-sephadex G-25可以用于磷酸化蛋白的纯化,而后发现Ga3+-IDA也有同样的效果,这样螯合这两种金属离子的填料就有效用于磷酸化多肽的富集和纯化,同时IMAC也可以用于纯化各种和金属离子结合的多肽,应用非常广泛。 Ni柱中的氯化镍可以与有HIs(组蛋白)标签的蛋白结合,也可以与咪唑结合。 步骤是:过柱子前可以选择Ni柱重生,也就是往柱子里倒氯化镍,一个柱长体积就行了,然后平衡柱子,拿你自己的buffer,给蛋白提供最适的环境,我一般平衡4个柱长,然后蛋白上样,你可以让他自己挂,这样挂柱子的效果好一些,如果流速太慢,可以加个恒流泵,但是一定不能太快,太快挂柱效果差,当然你也可以选择循环挂柱,就是恒流泵的一头接你装蛋白的烧杯,从柱子中留下来的液体还用同一个烧杯接回去。挂完之后,按理想来讲,你的蛋白在Ni柱中与Ni就结合了,杂蛋白多数在烧杯里,留下来了,当然肯定有少量杂蛋白也挂上了,这时候你要,拿咪唑和你的buffer配,一般从0 20mM 40mM。。。。100mM 这样洗脱(当你不知道你的蛋白大概在什么时候出来的时候)我指的是咪唑的终浓度。咪唑加入之后,会和蛋白争夺与Ni的结合位点,杂蛋白、你的目的蛋白,会在不同的浓度被洗脱下来,洗完之后,你可以用400mM咪唑洗柱子,清理一切蛋白,然后平衡几次,是否选择重生你自己定咯~然后放上20%乙醇保存柱子就可以咯~过的蛋白用不同的管子收下,然后SDS-page检测在哪个管子里。 市面常见的商品化IMAC用于带六个组氨酸标签蛋白的配基有以下几种: 一、组氨酸(His)标签蛋白的纯化步骤: 大肠杆菌的破碎方法: 1)收集培养发酵液,4度7000-8000g离心10分钟,收集沉淀的菌体(如果不是马上破碎可以放-70度冷冻,但是最好能保存成小块或者薄片,这样好用。) 2)取1-2克菌体加10ml破碎缓冲液(的50mM磷酸缓冲液含NaCl,ml溶菌酶,1mM PMSF,1mM MgCl2,ml Benzonase,其中的菌酶,1mM PMSF,ml Benzonase现加)在冰上混合45分钟,如果pH不在7-8,需要用NaOH一边搅拌一边滴加.如果溶菌酶10mg/ml混合时间可以缩短到10分钟.
分离纯化某一特定蛋白质的一般程序可以分为前处理、粗分级、细分级三步。 1.前处理:分离纯化某种蛋白质,首先要把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来并保持原来的天然状态(如果做不到呢?比如蛋白以包涵体形式存在),不丢失生物活性。为此,动物材料应先提出结缔组织和脂肪组织,种子材料应先去壳甚至去种皮以免手单宁等物质的污染,油料种子最好先用低沸点(为什么呢)的有机溶剂如乙醚等脱脂。然后根据不同的情况,选择适当的方法,将组织和细胞破碎。动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆机破碎或用超声波处理破碎。植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁,一般需要用石英砂或玻璃粉和适当的提取液一起研磨的方法或用纤维素酶处理也能达到目的。细菌细胞的破碎比较麻烦,因为整个细菌细胞壁的骨架实际上是一个借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子,非常坚韧。破碎细菌细胞壁的常用方法有超声波破碎,与砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理等。组织和细胞破碎后,选择适当的缓冲液把所要的蛋白提取出来。细胞碎片等不溶物用离心或过滤的方法除去。 如果所要的蛋白主要集中在某一细胞组分,如细胞核、染色体、核糖体或可溶性细胞质等,则可利用差速离心的方法将它们分开,收集该细胞组分作为下步纯化的材料。如果碰上所要蛋白是与细胞膜或膜质细胞器结合的,则必须利用超声波或去污剂使膜结构解聚,然后用适当介质提取。 2. 粗分级分离:当蛋白质提取液(有时还杂有核酸、多糖之类)获得后,选用一套适当的方法,将所要的蛋白与其他杂蛋白分离开来。一般这一步的分离用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。这些方法的特点是简便、处理量大,既能除去大量杂质,又能浓缩蛋白溶液。有些蛋白提取液体积较大,又不适于用沉淀或盐析法浓缩,则可采用超过滤、凝胶过滤、冷冻真空干燥或其他方法进行浓缩。 3.细分级分离:样品经粗分级分离以后,一般体积较小,杂蛋白大部分已被除去。进一步纯化,一般使用层析法包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等。必要时还可选择电泳法,包括区带电泳、等电点聚焦等作为最后的纯化步骤。用于细分级分离的方法一般规模较小,但分辨率很高。 结晶是蛋白质分离纯化的最后步骤。尽管结晶过程并不能保证蛋白一定是均一的,但是只有某种蛋白在溶液中数量上占有优势时才能形成结晶。结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化,而重结晶又可除去少量夹杂的蛋白。由于结晶过程中从未发现过变性蛋白,因此蛋白的结晶不仅是纯度的一个标志,也是断定制品处于天然状态的有力指标。 蛋白质分离纯化的方法: 一、根据分子大小不同的纯化方法 1、透析和超过滤 2、密度梯度离心 3、凝胶过滤 二、利用溶解度差别的纯化方法 1、等电点沉淀和pH控制 2、蛋白质的盐析和盐溶 3、有机溶剂分级分离法 4、温度对蛋白质浓度的影响 三、根据电荷不同的纯化方法