CMV启动子

CMV启动子

质粒设计时都需要加入启动子序列，以保证目的基因的表达。启动子可分为诱导型启动子和组成型启动子两大类，后者包括CMV，SV40，T7, pMC1，PGK启动子等。zhengzzh对CMV和T7的来源做了介绍。启动子是基因（gene）的一个组成部分，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度。启动子（Promoters）就像“开关”，决定基因的活动。既然基因是成序列的核苷酸（nucleotides），那么启动子也应由DNA组成。启动子本身并不控制基因活动，而是通过与称为转录（transcription）因子的这种蛋白质（proteins）结合而控制基因活动的。转录因子就像一面“旗子”，指挥着酶（enzymes）(RNA聚合酶polymerases) 的活动。这种酶制造着基因的RNA复制本。基因的启动子部分发生改变（突变），则导致基因表达的调节障碍。

T7启动子是当今大肠杆菌表达系统的主流，这个功能强大兼专一性高的启动子经过巧妙的设计而成为原核表达的首选，尤其以Novagen公司的pET系统为杰出代表。强大的T7启动子完全专一受控于T7 RNA聚合酶，而高活性的T7 RNA 聚合酶合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍——当二者同时存在时，宿主本身基因的转录竞争不过T7表达系统，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。由于大肠杆菌本身不含T7 RNA 聚合酶，需要将外源的T7 RNA 聚合酶引入宿主菌，因而T7 RNA 聚合酶的调控模式就决定了T7系统的调控模式——非诱导条件下，可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录，从而避免目的基因毒性对宿主细胞以及质粒稳定性的影响；通过控制诱导条件控制T7 RNA 聚合酶的量，就可以控制产物表达量，某些情况下可以提高产物的可溶性部分。有几种方案可用于调控T7 RNA 聚合酶的合成，从而调控T7表达系统。1.噬菌体DE3是lambda噬菌体的衍生株，含有lacI抑制基因和位于lacUV5启动子下的T7 RNA 聚合酶基因。DE3溶源化的菌株如BL21(DE3)就是最常用的表达菌株，构建好的表达载体可以直接转入表达菌株中，诱导调控方式和lac一样都是IPTG诱导。2.另一种策略是用不含T7 RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可完全避免因目的蛋白对宿主细胞的潜在毒性而造成的质粒不稳定。然后用λCE6噬菌体侵染宿主细胞——CE6是lambda噬菌体含温度敏感突变(cI857ts)和pL/pR启动子控制T7 RNA 聚合酶表达的衍生株，在热诱导条件下可以激活T7 RNA 聚合酶的合成。此了噬菌体之外，还可以通过共转化质粒提供T7 RNA 聚合酶。比如有人用受溶氧浓度控制的启动子调控T7 RNA 聚合酶合成，据说这比较适合工业化发酵的条件控制。由于T7 RNA 聚合酶的调控方式仍有可能有痕量的本底表达，控制基础表达的手段之一是培养基外加葡萄糖，有助于控制本底表达水平；之二是采用带有T7 lac 启动子的载体——在紧邻T7 启动子的下游有一段lacI 操纵子序列编码表达lac 阻遏蛋白(lacI)，lac 阻遏蛋白可以作用于宿主染色体上T7 RNA 聚合酶前的lacUV5 启动子并抑制其表达，也作用于载体T7 lac 启动子，以阻断任何T7 RNA聚合酶导致的目的基因转录。pLacI转化也是同样的原理。如果这还不够，更为严谨调控手段还有——在宿主菌中表达另一个可以结合并抑制T7 RNA 聚合酶的基因——T7溶菌酶基因，降低本底。常用的带溶菌酶质粒有pLysS和pLysE，相容的ori都不会影响后继的表达质粒转化，前者表达的溶菌酶的水平要比后者低得多，对细胞生长影响小，而pL ysE会明显降低宿主菌的生长水平，容易出现过度调节，增加蛋白表达的滞后时间，从而降低表达水平。通过几种不同方法来巧妙调控T7聚合酶合成，T7启动子发展出了史上功能最强大，最丰富的表达系统。

CMV：CMV基因组有229kb，属疱疹病毒亚β科。CMV DNA只有一个单向性的IE启动子复合体，可指导多个基因的表达[1]。在IE94基因上游存在一个强启动子，IE94的上游区比SV40病毒的72bp重复序列具有更高的增强子功能。IE94基因启动子区序列分析证明这一区段内有多个回文结构，并相间着保守的序列。在这一区段的-50～-580bp之间至少有4套13～18bp的重复序列。IE1和IE2蛋白的表达受增强子的调控，此增强子也称为主要增强子立即早期启动了一增强子、IE1/IE2增强子或CMV增强子，是上游调节区复合体的一部分。因集中了细胞转录因子结合位点而具有异常高的活性，并且在多种类型的细胞的影响条件下均有活性。根据对基因表达的影响可将此增强子分为3个区。在CMV感染中，增强子调控的表达先激活后抑制。在CMV复制早期可诱导NF-κB、AP-1和CREB/ATF等细胞转录因子与增强子中多位点结合。感染后可诱导产生NF-kB和aP-1。在感染晚期，A TF的结合受影响，其活性受病毒基因产物的调节。

CMV启动子/增强子被广泛应用于构建高效真核表达载体，用于基因工程、基因治疗和DNA免疫[9]。用基因小鼠分析CMV增强子活性，其主要立即早期启动子（MIEP）的转录活性可能部分决定病毒在子宫内特异性感染胎儿组织的能力[10]。MIEP不是广泛特异性的启动子，因在转基因小鼠中，表达由MIEP调控的报告基因的组织和CMV自然感染的组织一致的

CMV是大家公认的启动真核基因表达的最有力量的启动子。也可以作为II型启动子启动shRNA的表达。但是它的启动效应不会被六个T终止，所以如何构建启动shRNA的表达的CMV 启动子是一个非常有意义的话题。

同时，相比较H1/u6启动子是属于原核启动子，在真核细胞里面的启动效率非常低，所以介导的干扰效应也是非常有限的。研就、推广CMV启动子介导干扰效应，意义重大，希望大家踊跃提出宝贵意见，相互交流，共同提高！

搞笑：

1）商业公司的载体上的H1和U6启动子不是人源就是鼠源的；

2）CMV启动子用来表达shRNA序列只是Ambion公司的产品有，而且是修饰过的CMV启动子，不是常见的。

感爱好,最近也在看shRNA的问题, 关于II型启动子, 我看到国内吉凯基因(genechem)公司推出了一系列

的该型载体----pGCLM系列载体,使用的是CMV等polII识别的启动子, 没用过, 想问问用过的/有经验的

大侠,效果怎样? 另外, 我看吉凯的shRNA载体的MCS是插在报告基因后的一段"microRNA结构序列"中间, 不太清楚microRNA结构序列是指的什么, 我们自己设计的shRNA不就是参照内源的miR30-a结构设计的么? 请求高手解惑. 3X A LOT.

另,请教楼上大侠和各位, 表达siRNA的CMV启动子和我们常说的CMV启动子有什么不同?

“H1和U6启动子不是人源就是鼠源的”

确实如此，但是它是一种启动效果比交差的启动子。比起CMV启动子地启动效率要差。

请教楼上大侠和各位, 表达siRNA的CMV启动子和我们常说的CMV启动子有什么不同?

给你说一种方法，自己去找答案：

1。找ambion公司网站，把CMV序列根据位点找出来。

2。找invitrogen或者promege公司网站，把真核表达载体的CMV序列找出来。

3。对比。

这样，不就知道了？！要学会自己学习！

位点差异当然知道怎么比, 但是具体使用上为什么这些点突变, 还有就是可不可以互换, 感谢您费这么大

劲儿教我比对, 但是学习不仅要知其然,更要知其所以然!

这是一个非常有意思的话题，我曾经比对过ambion的pSilencer4.1和真核表达的CMV，具体结果忘记了，但是差异很小。希望各位有爱好的或者有研究的同仁多多发表高见！