文档库 最新最全的文档下载
当前位置:文档库 › 基因芯片技术筛选人不同发育阶段表皮干细胞差异表达基因的研究

基因芯片技术筛选人不同发育阶段表皮干细胞差异表达基因的研究

?26?主堡缝垡盘查垫!!生!旦箜!!鲞箜!塑璺!垫!璺!翌!:!!!坐!翌垫!!:!!!:!!:型!:!

基因芯片技术筛选人不同发育阶段表皮

于细胞差异表达基因的研究

蓝蔚刘德伍李国辉毛远桂陈桦易先锋王联群彭燕钟清玲

【摘要】目的分析人不同发育阶段表皮干细胞基因表达变化特征,探讨其可能的生物学意

义。方法收集胎龄28~32周胎儿、4一12岁少儿、35—55岁成人3组正常皮肤组织标本,每组10

例。采用胰蛋白酶和乙二胺四乙酸联合消化法分离表皮,Ⅳ型胶原快速黏附法分离、纯化表皮干细

胞,免疫细胞化学染色法行整合素B.、角蛋白19单克隆抗体检测鉴定。TrizoI一步法分别提取各组

细胞总RNA,琼脂糖甲醛变性凝胶电泳质检。制备探针并与表达谱芯片进行杂交,扫描芯片荧光信

号图像。对芯片图像进行分析,以2倍差异表达值筛选差异表达基因。选择明显上调或下调的基因,

用实时RT—PcR技术进一步验证相关基因。结果与少儿组比较,成人组差异表达基因1808个,

其中上调的基因1089个、下调的基因719个,已知基因1462个、未知基因346个。少儿组样本与胎

儿组比较,差异表达基因4534个,其中上调的基因1783个、下调的基因2751个,已知基因3577个、

未知基因957个。根据基因功能分类,成人组与少儿组差异表达基因可分为128类,少儿组与胎儿组

差异表达基因可分为216类。1104个基因在胎儿组、少儿组与成人组样本中呈持续差异表达,根据

基冈功能分为32类。实验检测到持续差异表达基因中,有94个差异表达基因呈持续上调状,75个

差异表达基因呈持续下调趋势。实时RT—PCR验证结果与芯片筛选结果一致。结论体外培养的

胎儿、少儿与成人表皮干细胞基因表达谱有明显不同,其差异可能与不同发育阶段人表皮干细胞的增

殖分化能力及皮肤创伤修复能力不同密切相关。

【关键词】表皮;干细胞;基因;芯片分析技术;发育

Screeningofdi仃erentiaIexpress沁ngenesofhumanskinepidermalstemceUsatd州krentdeveIop-

mentstagesbycDNAmicr蚰rraytechnique“Ⅳ肌i,L,∥De一埘Ⅱ,“Guo-^“,朋rAD地d,l—gui,CHEⅣ

Huo.Y|x缸n0毫ng,WANGLinn—qun.PENGY8n.zHoNGQtng—ttng.DePnrtment可8urT谌armReh口b让tta?

f如,l,CⅡ口,wdo,lgPrD口inciof矸I"彘蛳,),Re|Iln6iZit口£幻,l^bs_Pi£Df。C“口,I舻^o“5,D970,C^i,ln

Co门-espo几di,lg口Ⅱt^or:L,UDe.埘“,33DOD6,Em口“:de埘“fi“@J26.com,7’eZ:D79J古692539

【Abstract】ObjectiveToan8lyzeexpressionchamcteristicsofhumanskinepidemal8temcellat

diffbI℃ntdevelopmentalstages,andtoexploreitsbiologicalsignificance.MethodsHealthskinsamples

f而m28-32wfeluses(Fgroup),4一】2ychjldren(Cgroup),and35-55yaduJl(Agroup)wereharvesled,

withlOcasesineachgroup.Epidemiswere8eparatedusingtl了psindiSestionandEDTA,andhumanepi-

demalstemcellswereisolatedandpurinedwithtypeⅣcollagenattachmentmethod.Themonoclonalanti.

bodyofinte鲥nBlandkeratin19wereusedfordetectionandidentificationofepidermalstemcensbyimmu-

nohistochemicaistaining.TotalRNAwa8extractedfromaboveceHsbyTrizolone.stepmethod,andwerede.

tectedbyfbmaldehydedenaturingagarosegelelectrophore8is.Probeswerepreparedandhybridizedinto

cDNAmicmarrayforscanningnuorescentsignalsandanaly8isofimages,withtwo—folddifkrentialexpres8ion

valueforscreening.Signmcantlyup/down—regulatedgeneswereselectedforverificationbyrealtime

RT.PCR.ResuJtsBycompafjngexpr℃ssionprofiJebe£weenAandCgmups.ato£aJofl808geneswilh

diffbrentialexpressionweredetected,including1089up?regulatedgeneBand719down—regulatedgeneB,and

theywereclassifiedinto128categories.Amongthem,1462geneswereknown(fbundinGeneBank),346

geneswereunknown.

Atotalof4534geneswithdif艳rentialexpressionweredetectedbetweenCandF

groups,inwhichl783

geneswereup?regulated

and275l

genesweredown—regulated,andtheywereclassi—

fiedinto2l6categories.Amongthem,3577geneswereknown(fbundinGeneBank),and957geneswere

DOI:lO.3760/cma.j.issn.1009-2587.2011.01.008

基金项目:国家自然科学基金(30560058);江西省科技厅重大科技招标项目(200604)

作者单位:510970广州.广东省T伤康复医院烧伤康复科(蓝蔚、易先锋);南昌大学第一附属医院烧伤科(刘德伍、李国辉、毛远桂、陈桦、王联群、彭燕、钟清玲)

通信作者:刘德伍,330006。Email:dewuliu@126.com,电话:079I.8692539

?再生医学?

万方数据

万方数据

oSpin@ExtraetⅡ试剂盒纯化。以随机Primer为引物对反转录互补DNA进行KLENOw酶标记,分别用Cy3一dcTP、cy5一dCTP标记人类基因参照与胎儿组、少儿组和成人组样品,标记产物用PcRNucle—oSpin@ExtmctⅡ试剂盒纯化,纯化后抽干。

1.7芯片杂交与扫描

标记的DNA溶于80斗L杂交液[含3倍浓缩的枸橼酸钠盐缓冲液(SSC)、2g/L十二烷基硫酸钠(SDS)、5倍浓缩的Denhart溶液、体积分数25%甲酰胺]中,于42℃杂交过夜。用42℃含2g/LSDS、2倍浓缩的sSC的液体洗涤5min,在2倍浓缩的SsC中室温洗涤5min。玻片干后用Luxscan10K—A型双通道激光扫描仪扫描。采用LuxScan3.0图像分析软件对芯片图像进行分析,将图像信号转化为数字信号。

1.8数据检测与分析

对芯片上的数据采用STATA11.O软件,用Lowess方法进行归一化。根据Cy5和Cy3总体信号的平均值对各芯片进行片间线性校正,使各张芯片的平均值相同。根据信号强度和图像质量对基因进行标记,删除荧光信号弱的基因以及芯片上的阳性对照、阴性对照、外参照等冗余数据。胎儿组、少儿组与成人组探针标记为cy5荧光素(呈红色),人对照探针标记为cy3荧光素(呈绿色),将少儿组与胎儿组、成人组与少儿组芯片结果两两叠加,筛选胎儿组、少儿组与成人组之间表皮干细胞的差异表达基因。判定基因有差异表达的标准为:表达差异值即Cy5/Cy3值大于2或小于0.5。在分子注释系统(MoleculeAnnotationSystem)中,对筛选出的差异表达基因进行Go数据库系统分类统计分析,按基因功能进行分类。

1.9对芯片筛选的差异表达基因TuBGcP3和FOSL2进行实时荧光RT-PCR验证分析

根据基因芯片检测结果,选取上调表达差异基因TuBGCP3和下调表达差异基因FOsL2,以GAPD为内参照,在胎儿组、少儿组与成人组样品中分别进行实时荧光RT—PCR定量检测。引物设计基本要求:PcR产物150~250bp,退火温度60℃,根据美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库(下同)GeneBank中TuBGcP3和FOSL2序列,选定目标片段,并由此设计合成引物,引物序列见表l。以反转录产物连续行10倍梯度稀释,用于制备标准曲线样品。采用荧光定量PCR仪分别扩增目的基因和内参照基因,测定标准嗌线。根据扩增结果计算待测基因循环阈值(ct),用ct值表示样本中测定模板的起始拷贝数。Ct值越小,起始拷贝数越大;Ct值越大,起始拷贝数越小。根据标本的Ct值和标准曲线计算目的基因与GAPD含量,以胎儿组为对照,目的基因表达水平以少儿组/胎儿组、成人组/胎儿组进行表示。

表1实时荧光RT.PcR引物序列

基因名称引物序列扩增大小(bp)

注:P。为上游引物,P2为下游引物

2结果

2.1表皮干细胞生物学特性

体外培养的胎儿组、少儿组与成人组表皮干细胞形态相似,胎儿组(图1—3)和少儿组细胞克隆形成速度较快,克隆集落较大。整合素B.、角蛋白19免疫细胞化学染色显示,细胞均呈棕黄色阳性表达,符合表皮干细胞特征"1(图4,5)。

图l经贴壁法筛选的人胎儿表皮干细胞呈圆形,细胞

体积较小.折光性较强倒置相差显微镜×200

圈2人胎儿表皮干细胞培养3d时呈明显克隆性生长

倒置相差显微镜×200

万方数据

万方数据

生堡缝垡壅查垫!!生!旦箜!!鲞笙!塑垦!也』!!婴!:!!!坐!翌垫!!!!!!:!!坐:!

表23组表皮干细胞中持续差异表达基因的功能分类

基因功能分类差异基因数基因功能分类差异基因数未折叠蛋白结合53热休克蛋白结合6

RNA结合73氧化还原酶滔性2l

核苷酸结合163肌动蛋白结合lO

ATP结合86钙离子结合37

锌离子结合98转移酶括性3l

蛋白结合254结构分子活性10

DNA结合175水解酶活性49

鸟苷三磷酸结合4l受体活性15

鸟苷三磷酸酶活性15信号转导活性25

序列特异性DNA结合23核酸结合12

MAPK磷酸酶活性3RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性15

MAPK活性2金属离子结合ll

转录因子活性47氧化还原酶活性12

转录激活活性39镁离子结合6

转录辅阻遏活性13翻译起始因子活性19

锰离子结合8ECM结构组成2

2.5实时RT.PcR验证分析结果

从差异基因中选择TuBGcP3、F0sL2基因进行验证,实时RT—PCR产物电泳检测反应特异性良好。胎儿组、少儿组与成人组样本中TuBGcP3表达量持续增高,FOSL2表达量持续降低,与芯片筛选结果一致。见图8,表3。

图8表皮干细胞差异基因实时RT-PcR产物电泳检测结

果。l一3分别以胎儿组、少儿组和成人组样品的第一链互

补DNA(18t.cDNA)为模板,扩增GAPD基因;4—6分别以胎

儿组、少儿组和成人组样品的lst—cDNA为模板,扩增TUB?

GcP3基因;7—9分别以胎儿、少儿和成人样品的lst—cDNA

为模板,扩增FOsL2基因;M为MarkerD12000

表3表皮干细胞差异基因实时RT?PCR验证

注:“一”表示无需统计;各组相对表达值以胎儿组为对照

3讨论

本研究利用基因芯片技术筛选胎儿、少儿与成人表皮干细胞差异表达基因。结果显示,随着人的生长发育,表皮干细胞的基因表达发生了较大改变,表皮干细胞在人体不同时期所处的状态受到多种基因的表达调控。其中“04个基因在胎儿组、少儿组与成人组样本中呈持续差异表达,根据其表达蛋白的功能分为32类,涉及蛋白质翻译、能量合成和DNA复制等。

本研究结果显示,在胎儿组、少儿组与成人组中表达持续七调的基因共计94个,主要分为以下几类:(1)核苷酸结合蛋白基因,如DYNclH1、蛋白激酶C1(PRKcl)。DYNclHl属于动力蛋白,参与微管为基础的运动及染色体的定位与细胞分裂。参与蛋白定向膜、细胞骨架组织的生物发生,确立和(或)维持表皮细胞极性及组装和维持细胞间连接’61。(2)蛋白质折叠结合相关基因,如TuBGCP3、热休克蛋白El(HsPEl)。TuBGCP3与1微管蛋白结合,参与微管成核和细胞骨架结构的形成。HSPEl参与蛋白质的折叠与伸展、多聚复合体的组装。(3)锌离子结合蛋白基因。(4)ATP结合蛋白基因。上调基因主要为细胞骨架结构蛋白基因。细胞骨架是指真核细胞中的蛋白纤维网架体系"1。它不仅在维持细胞形态和保持细胞内部结构的有序性中起着重要作用,而且与细胞的胞质运动、物质运输、能量转换、信息传递、基因表达、分裂和分化等生命活动密切相关。

在胎儿组、少儿组与成人组中表达持续下调的基因共计75个,主要包含以下几类:(1)鸟苷三磷酸(GTP)结合蛋白基因如EFTuD2,它含有延伸因子TuGTP结合域2,参与核mRNA剪接、蛋白生物合成以及RNA剪接。(2)序列特异性DNA结合蛋白基因,如FOSL2、E74样因子4(ELF4)。FOSL2属于转录因子激活蛋白1家族成员,它对细胞因子、生长因子、感染或致癌刺激等生理或病理信号产生应答,调节基因的转录,参与细胞的增殖、分化等过程。ELF4参与细胞增殖,正调控转录自RNA聚合酶Ⅱ启动子,调控转录¨’。(3)MAPK、MAPK3、MAPKl3、双重特异性磷酸酶1(DUSPl)H1和DUSP2。DUSPl和DUsP2参与蛋白、氨基酸的去磷酸化,抑制MAPK,促使细胞分化。MAPK3和MAPKl3参与调控细胞周期及蛋白、氨基酸磷酸化。(4)核仁蛋白家族基因的NOLA2和NOLCl,参与核糖体RNA加工,调控细胞周期和有丝分裂。(5)ECM结构蛋白基因,如WNT3和WNT4。WNT蛋白是控制细胞和组织生长的分泌信号分子,可以激活B连环蛋白(B—catenin)。

目前对于WNT信号传导通路的研究已经取得万方数据

万方数据

基因芯片技术筛选人不同发育阶段表皮干细胞差异表达基因

的研究

作者:蓝蔚, 刘德伍, 李国辉, 毛远桂, 陈桦, 易先锋, 王联群, 彭燕, 钟清玲, LAN Wei, LIU De-wu, LI Guo-hui, MAO Yuan-gui, CHEN Hua, YI Xian-feng, WANG

Lian-qun, PENG Yan, ZHONG Qing-ling

作者单位:蓝蔚,易先锋,LAN Wei,YI Xian-feng(广东省工伤康复医院烧伤康复科,广州,510970), 刘德伍,李国辉,毛远桂,陈桦,王联群,彭燕,钟清玲,LIU De-wu,LI Guo-hui,MAO Yuan-

gui,CHEN Hua,WANG Lian-qun,PENG Yan,ZHONG Qing-ling(南昌大学第一附属医院烧伤科)刊名:

中华烧伤杂志

英文刊名:CHINESE JOURNAL OF BURNS

年,卷(期):2011,27(1)

被引用次数:2次

参考文献(10条)

1.Zanet J;Pibre S;Jacquet C Endogenous Myc controls mammalian epidermal cell

size,hyperproliferation,endoreplication and stem cell amplification[外文期刊] 2005

2.Mangrum WI;Farassati F;Kadirvel R mRNA expression in rabbit experimental aneurysms:a study using gene chip microarrays 2007(05)

3.王联群;刘德伍;蓝蔚人端粒酶反转录酶基因转染对人胎儿表皮干细胞增殖的影响[期刊论文]-中华创伤杂志2010(03)

4.Haimov-Kochman R;Fisher SJ;Winn VD Modification of the standard Trizol-based technique improves the integrity of RNA isolated from RNase-rich placental tissue 2006(01)

5.刘德伍;黄培信;毛远桂不同发育阶段人表皮干细胞端粒酶反转录酶表达的比较[期刊论文]-中国组织工程研究与临床康复 2007(50)

6.Rohr S;Bit-Avragim N;Abdelilah-Seyfried S Heart and soul/PRKCi and nagie oko/Mpp5 regulate myocardial coherence and remodeling during cardiac morphogenesis[外文期刊] 2006(01)

7.Fukui Y;De Lozanne A;Spudich JA Structure and function of the cytoskeleton of a Dictyostelium myosin-defective mutant 1990(02)

https://www.wendangku.net/doc/c611923236.html,corazza HD;Yamada T;Liu Y The transcription factor MEF/ELF4 regulates the quiescence of

primitive hematopoietic cells[外文期刊] 2006(03)

9.Liu YX;Wang J;Guo J DUSP1 is controlled by p53 during the cellular response to oxidative stress 2008(04)

10.Merrill BJ;Gat U;DasGupta R Tcf3 and Lef1 regulate lineage differentiation of multipotent stem cells in skin 2001(13)

引证文献(2条)

1.黄跃生组织再生是烧伤组织修复的重要手段[期刊论文]-中华烧伤杂志 2011(1)

2.李勇铁.刘德伍.刘德明.毛远桂.彭燕.宁璞.胡翔.邹萍.邹永红.余群洪人诱导性多潜能干细胞向表皮样干细胞分化的实验研究[期刊论文]-中华烧伤杂志 2012(4)

本文链接:https://www.wendangku.net/doc/c611923236.html,/Periodical_zhsszz201101008.aspx

相关文档
相关文档 最新文档