石蜡切片制备基本步骤(附HE染色步骤)
石蜡切片制备基本步骤
一、准备工作
（一）洗涤实验所需器皿：（玻璃器皿的清洗）
1、用洗衣粉将玻璃器皿表里擦洗干净反复洗刷
2、将器皿在自来水下冲洗干净
3、将器皿倒扣在铺有吸水纸或纱布的桌子上控干
注：一般情况下，经以上步骤后，用蒸馏水洗过1~3次即可烘干备用，如果做特殊染色还需浸泡在酸性清洁液内12~24小时，再经自来水彻底冲洗，再用蒸馏水过洗1~3次烘干备用。（二）配制：硫酸洗液的配制
清洁液（洗液）的配制：
成分强酸液次强酸液弱酸液
浓硫酸（ml）1000 200 100
重铬酸钾（mg）63 120 100
蒸馏水（ml）200 200 1000
重铬酸钾1200g
蒸馏水2000ml
将2000ml浓硫酸缓缓倒入上述溶液中，边倒边用木棒轻轻搅拌
（三）载玻片与盖玻片的处理
1. 将所需载玻片与盖玻片清洗后，放入硫酸重铬酸钾溶液中浸泡24小时
2. 流水冲洗，再用蒸馏水冲洗3遍
3. 95%~100%酒精浸泡24小时，用绸布擦干备用
注：在将载玻片与盖玻片放入清洁液中时，要一片片地投入，使其不致重叠。
二、常用液体的配制
（一）缓冲溶液：
1．磷酸盐缓冲液
A液：0.1mol/L磷酸二氢钠
B液：0.1mol/L磷酸氢二钠
A液与B液按比例混合调整到所需的PH值（3：7≈PH7.0）
2．枸椽酸缓冲溶液
A液：0.1mol/L枸椽酸
B液：0.1mol/L枸椽酸钠
A液与B液按比例混合调整到所需的PH值（6.2：42.8≈PH6.2）
（二）固定剂：
1．甲醛：10%甲醛
福尔马林100ml
蒸馏水900ml
注：实际甲醛含量只有3.6~4.0%但习惯上都将其视为10%。
2．10％中性福尔马林钙固定液
甲醛液10ml
蒸馏水90ml
加碳酸钙至过饱和(以容器底部碳酸钙沉淀1~2cm厚为适度)充分振荡混合后，放置24小时取上清液使用。
3．4%多聚甲醛：
8%多聚甲醛
多聚甲醛8g
蒸馏水100ml
加温至60℃左右，不时搅拌，成为乳白色溶液。滴加1N NaOH，并不停搅动至液体清明。1N NaOH
lN等于1L溶液中某种物质1mol除以该物质的氢当量价所得数值的量
氧化钠(NaOH )；分子量＝40．005，当量价＝1
1N Na0H的配制方法为：m＝40．005／1＝40．005g。取40．005gNaOH溶解于1L蒸馏水中
4%多聚甲醛
8%多聚甲醛50ml
0.1M磷酸盐缓冲液50ml
PH7.2
先取50 ml 8%多聚甲醛，用0.1M磷酸二氢钠和0.1M磷酸氢二钠将PH值调至7.2 4．Bouin液：
苦味酸饱和水溶液75ml
36％~40％福尔马林液25ml
冰醋酸5m1
5．改良Bouin氏固定液
苦味酸饱和水溶液45ml
95%酒精45ml
36％~40％福尔马林液5ml
冰醋酸5m1
6．Carnoy液：
冰醋酸10 m1
氯仿30 m1
无水乙醇60 m1
以上三者临用前混合，预冷至4℃后使用。24小时后固定液失效。
（三）染色液
1．Harris苏木精液
A液：
苏木精1g
无水酒精10ml
B液：
铵矾或钾矾20g
蒸馏水200ml
氧化汞0.5ml
冰醋酸8ml
将矾溶于水，加热溶解（B液），稍冷后将苏木精酒精液（A液）混入B液，加热，稍冷却，加氧化汞，再继续加热1分钟，染液变为紫色，注意在加氧化汞时宜逐渐少量加入，防止染液溅出。全冷后呈深紫色，将烧杯口用纱布盖好，隔夜过滤，在过滤液内每96 ml中加4 ml 冰醋酸，放置1周后成熟，即可用于染色，保存期1~2个月。此染液在加醋酸后，对核染色特具选择性，故很适于脱落细胞的核染色。由于染液内已加有氧化剂，故不能长期储存，但利于配后即用。
2．Mayer苏木精掖
苏木精1g
钾矾或铵矾50g
碘酸钠0.2g
蒸馏水1000ml
水合氯醛50g
枸橼酸1g
将苏木精，钾矾及碘酸钠依次加入水内，略加热并搅拌，此时液体呈蓝色，待全溶后过夜。再加入水合氯醛及枸橼酸并加热至煮沸5分钟，冷后过滤备用。如不急用可不煮沸而在室温待其成熟，染液可较长期贮存使用。核染色鲜明，染色时间5—10分钟。用该染液染色后，不需分化，充分水洗蓝化后即可，伊红复染细胞质，使用一段时间后就要换新溶液。3．Hasnsen甲矾苏木精的配制
A液：苏木精1g
无水乙醇10ml
B液：钾矾20g
蒸馏水200ml
C液：高锰酸钾1g
蒸馏水16ml
三液分别溶化后，将A液倒入B液，再加入C液3ml，充分搅拌均匀后加热至沸腾，1分钟左右，将容器置于冷水中使其迅速冷却，此液配后即可使用，染后无需碱化，细胞核即为蓝色，效果较好，高锰酸钾可以迅速氧化苏木精（每1g苏木精需0.177g高锰酸钾氧化）。4．伊红
0.5~1%水溶液或酒精溶液。
1．水溶性伊红
伊红5~10g
蒸馏水1000ml
冰醋酸10滴
先将水溶性伊红加入蒸馏水中，用玻璃棒搅起泡沫后过滤，再加冰醋酸。
2．醇溶性伊红
伊红5~10g
70%~90%酒精1000ml
冰醋酸10滴
（四）其它
1．麻醉剂：
2~4%戊巴比妥钠，1ml/kg体重（45mg/kg）。
2．各级浓度酒精的配制
75%；85%；95%；100%酒精。75%和85%酒精用95%酒精配制；（取75ml95%酒精，加水至95ml，即为75%酒精）
3．盐酸洒精
多用于多种染色过程中的分色，如苏木精染色后分色。配法是在100ml的70％酒精内加0.5~1ml的浓盐酸(Hcl)。用盐酸酒精分色后要经自来水充分冲洗组织切片，去除所含的酸再作其他处理。
4．碘酒
取碘5g，溶于95％酒精80ml，再加入20ml蒸溜水即成
5．生理盐水
以氯化纳0.85~0.90g溶于100m1蒸馏水配成的生理盐水适用哺乳动物
石蜡切片制备基本步骤之二
三、取材，固定
（一）实验动物的抓取及固定
1．小白鼠、大白鼠的抓取及固定方法
要点：（1）动作要轻缓；（2）不要突然袭击；（3）如发现动物的毛发竖起来时，最好停一会后再抓；（4）将四肢打开，固定在木板或方形蜡板上。
2．实验家兔的抓取及固定方法
要点：（1）随时抚摩其头部；（2）防止被其脚爪抓伤；（3）根据实验要求选择固定方法。3．豚鼠的抓取及固定方法
要点：先用一只手扣住豚鼠背部，然后抓紧两耳间头颈部的皮肤，用另一只手托起臀部送到动物固定台上。
（二）实验动物的编号、标记、分组和被毛去除方法
1．编号和标记方法
（1）染色法
标记溶液：3%~5%苦味酸黄色
2%硝酸银咖啡色（涂后光照10分钟）
0.5%中性红或品红红色
龙胆紫紫色
编号原则：先左后右，从前到后
左前脚为1，左侧腹为2，左后腿为3，头顶为4，腰背部为5，尾基为6，右前脚为7，右侧腹为8，右后腿为9。超过10可用不同的染色的标记液，一种染色为个位，另一种为十位数。
（2）挂牌法
（3）耳孔法
一般来说，小型动物适宜用耳孔法和染色法，中型动物适用于挂牌法。
2．实验动物的随机分组方法
动物实验时，常常需要将选择好的实验动物，按研究需要分成若干个组，分组时为了避免人为因素的影响，常应用随机数字表进行完全随机化的分组。
3．实验动物被毛去除方法
剪毛法
拔毛法
剃毛法
脱毛法：系用化学脱毛剂将实验动物被毛脱去，适用于无菌手术野的准备以及观察动物皮肤血液循环和病理变化。方法：将需脱毛部位的被毛先用弯头剪刀剪去，尽量剪短，勿剪破皮肤。然后用温水将该部位润湿，再用纱布包扎棉球的小棒蘸脱毛剂，在需脱毛部位涂一层，经2~3min后，用温水洗去该部位脱下的毛，自然晾干备用，切勿用纱布去擦，以免损伤皮肤。
脱毛剂配方：
（1）硫化钠3g
肥皂粉1g
淀粉7 g
加水适量调成糊状
（2）硫化钠8g
溶于100ml水中
（3）硫化钠8g
淀粉7 g
糖4 g
甘油5 g
硼砂1 g
加水75ml
（三）实验动物处死
处死动物的方法很多，无论是采用哪种方法，都要尽力避免使动物长时间陷于痛苦和濒于死亡状态。热爱生命，珍爱动物。
1．空气栓塞致死法
要点：（1）常用于大的动物（如：兔、猫、狗和猴等）；（2）用50~100ml注射器一只；（3）此方法迅速、方便，但各脏器淤血明显。
2．麻醉后处死法
注：采用此方法，取材后一定要确定动物是否已死亡，最好再行断颈。
（1）吸入麻醉法
要点：（1）适用于较小的动物（小白鼠、大白鼠、豚鼠和兔等）；（2）用乙醚浸泡过的脱脂棉；（3）时间大约1~2分钟；（4）注意防火
（2）注射麻醉法
要点：（1）适用范围较广；（2）注射方式可采用静脉、腹腔、皮下和肌内注射，最常用的是腹腔注射；（3）注射致死量一般视动物大小而定。
3．脑、脊破坏法
要点：（1）常用于蛙类；（2）用金属针经枕骨大孔进入，破坏大脑和脊髓。
4．断头处死法
要点：（1）常用于小动物；（2）用剪刀剪断颈椎；（3）如果没有特殊要求，最好不要使头和躯干分离。
5．断椎法
要点：（1）常用于大白鼠和小白鼠；（2）一手固定头部，一手拽住实验动物的尾部，轻轻一拉扯断其颈椎，使其脱位，椎管内急性损伤瘫痪或死亡后取材；（3）此方法处死动物组织结构保存较好。
（四）实验动物解剖
解剖步骤
1．实验动物被麻醉或处死后，将其；固定在动物解剖台上，用纱布蘸取生理盐水湿润被毛；2．从下颌至耻骨联合沿正中线切开皮肤；
3．打开腹腔：沿肋骨下缘腹正中，用镊子提起腹壁切开腹壁肌肉，至耻骨联合，从肋骨下端向脊柱方向，将两侧腹壁剪开，充分暴露腹腔内脏器；
4．打开胸腔：用剪刀沿肋骨的肋软骨和骨的连接处由下向上剪开，不要剪断锁骨，剪时应尽量贴着胸内壁，并注意不要剪断胸骨两侧的大血管。然后将肋弓提起，暴露腹腔内脏器。
（五）取材
取材一定要迅速，应在动物处死后立即进行解剖和切取组织材料，否则会引起细胞发生死后变化（如组织自溶及腐败现象等），进而失去原有的结构，如果进行酶组化染色，将会使大量的酶失活和丢失。
取材方法和注意事项
（1）取材用的刀剪必须锋利，取材时应用镊子夹该组织的周围的结缔组织，凡是用镊子夹过的或用手压过的组织均不可用。
（2）根据实验要求选择不同的取材方法（整体取出脏器法、单个脏器取出法和切取组织块法等）
（3）取材的先后顺序原则。根据死后组织结构改变的速度的快慢而定。先腹腔后胸腔，先消化管后肝、脾等多血的器官及神经组织。
（4）取材组织块的大小既要保证组织的完整性，又要力求小而薄，一般以1.0cm×1.0cm×0.5cm为好，但有些特殊要求的可视情况而定。
（5）较小的组织或器官（淋巴结、松果体、脑垂体和神经节等）应整体固定，但要破坏其表面一侧的被膜。
（6）管状及囊状组织（消化管的取材）都不应斜切，先将一段肠管或食管剪下，从中剪开管腔，使之成片状，然后将其铺在纸板下，黏膜面朝上，用大头针或细线将四边固定，用生理盐水漂洗黏膜表面，然后固定。
（7）较细的管状脏器（输尿管、输精管、输卵管、中动脉和静脉等）应取下1~2cm长，平铺于硬纸片上或吸水纸上分段固定。
（8）取材要尽量注意脏器的完整性。
（9）应根据所要观察的部位及实验目的进行选择组织的切面。对于病理材料，除切取病变部位外，还要切取病变和正常组织交界部分的区域，以利于进行正常组织与病理组织的对比观察分析。
（10）取材时要注明取材时间、组织器官名称、固定液名称、组织块的数量、所取组织位于器官的部位等，以备查。
（六）固定
1．固定的目的
（1）防止组织溶解及腐败，以保持组织和细胞与正常生活时的形态相似；
（2）使细胞内蛋白质、脂肪、糖、酶等各种成分转变为不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时的相仿；
（3）组织细胞内的不同物质经固定后可以产生不同的折光率，对染料也产生不同的亲和力，造成光学上的差异，使得在生活情况下原来看不清楚的结构变得清晰起来，并使得细胞各部分容易着色，有利于区别不同的组织成分。
（4）固定剂的硬化作用，增加组织硬度，便于制片。
2．固定的对象和方法
（1）固定的主要对象是蛋白质；
（2）固定液的量要足够，其固定液的量一般不少于组织总体积的10倍以上（一般为1：20）。对于某些需要制作神经染色和酶组织化学染色的组织固定，比一般的固定要严格。
（3）特殊的固定方法（注射或灌注固定）：某些组织块由于体积过大或固定液极难渗入内部或需要对整个脏器或整个动物进行固定，宜采用此方法，将固定液注入血管，经血管分支到整个组织和全身，从而得到充分固定。
①局部灌注固定：
肺：肺内含有空气，固定难以渗入，可将固定液从气管、支气管或肺动脉注入固定液，从支气管注入时速度一定要慢，量不宜过多。注射固定后可将整个肺投入固定液中6~12小时，再分别切成小块。
肝、肾：经肝动脉或肾动脉注入固定液。
脑：动物麻醉后暴露颈动脉，以注射针尖向着关部的方向注入固定液。
②全身灌注固定：
步骤：取大白鼠，1%戊巴比妥钠麻醉，打开胸、腹腔，纵向切开心包，用纱线在主动脉弓起始部，然后用50ml注射器，选用适当针头，从左心室向主动脉方向刺入，将纱线扎紧固定，在右心房开一孔放血，取用与动物等量的生理盐水注入血管中洗涤，待洗涤处的液体不见血时，再注入固定液。待动物体有一定硬度时即可取材，将所需组织从动物身上切去后，经适当处理，即投入固定液中（甲醛或多聚甲醛）
3．固定液的性质和条件
（1）能迅速渗入组织，使组织细胞形态在短期内不至于有较大变化。
（2）固定液有相当的渗透力，对组织各部分的渗透力相等，可使组织内外完全固定。（3）使组织细胞不至于因固定而引起人为的改变。
（4）尽可能避免固定剂使组织膨胀或收缩。
（5）使组织达到一定硬度，获得较佳的折光率和对染料具有较强的亲合力。
4．固定时应注意的事项
（1）固定液及被固定的组织必须新鲜；
（2）固定液的用量一般为组织体积的10~20倍，容器不要过小，材料也不要太多；应避免组织紧贴瓶底或瓶壁，以免影响固定液的渗入，必要的时候可以在瓶底垫上一层棉花；（3）固定时间视组织块的种类、性质、大小，固定液的种类、性质、渗透力的强弱，固定时的温度的高低，实验目的等；
（4）防止被固定的组织因固定剂的作用而发生变形；
（5）固定所用的固定液，以新配的为好，放置过久会失效；
（6）在固定期间摇动组织或摇动容器有利于固定液的渗入，对长期固定的标本，可经常更换固定液
（7）取材固定应同时作好记录，包括组织名称、固定液和时间等内容。
5．固定剂
单纯固定剂
（1）10%甲醛：对组织渗透性强，固定均匀。对组织膨胀约5%，经酒精脱水时有较大的收
缩。能保存脂肪，不能沉淀核蛋白及白蛋白，长期用其固定的组织使组织变为酸性，不利于染色，特别是细胞核的着色。经自来水冲洗6~24小时后，可以使其酸碱中和，并减少结晶。（2）4%多聚甲醛：对组织穿透性好，组织收缩小，对大多数抗原物质保存较好，特别是对脂肪和各种酶的固定效果更好。固定的时间不宜太长，以24小时以内为宜，适用于免疫组织化学染色。
（3）饱和的苦味酸溶液：能沉淀一切蛋白质，渗透力弱，对组织收缩大，故一般不能单独使用。
（4）冰醋酸：渗透力强，沉淀核蛋白，对染色质固定好，使组织膨胀，故一般不单独使用。（5）锇酸：价格昂贵，为强氧化剂，易还原成氢氧化锇，呈黑色沉淀；必须避光保存。不能沉淀蛋白质，而使蛋白质凝胶化，所以对蛋白质固定不均匀，锇酸固定的细胞能保持生活时的形态，不收缩细胞，对胞质固定较长好，核的固定不好，锇酸为脂肪及类脂质的优良固定剂，经它固定的脂肪和类脂质呈黑色，特别是对于是显示线粒体和高难度尔基复合体效果良好。
混合固定剂
（1）Bouin氏固定液：为常用的良好的固定剂，穿透速度快，组织收缩性较小，固定均匀，固定后组织有适当的硬度，对于切片和染色均有良好的效果。一般固定12~24小时，固定后入70%酒精洗去苦味酸的黄色，在脱水时经各浓度酒精也可洗去黄色，在酒精中加入氨水一滴或少许碳酸钾饱和水溶液，可加快洗去苦味酸的黄色即使留有少量苦味酸的黄色，对一般染色体并无影响。
（2）Zenker液（PH2.3）：此液多用于一般组织的固定，它能使细胞核、细胞质染色清晰但固定时间长，一般要12~36小时，加热可以缩短固定时间。固定后的组织必须流水冲洗12小时，由于固定中含有升汞，在经70%酒精脱水时，加少量的碘液（0.5%碘酒精）以脱汞。（3）Carnoy液：渗透力强，特别适宜于固定染色体、肝糖、粘液等一些较为细微的结构。显示DNA、RNA效果良好。
（4）改良Bouin氏固定液：此液对一般组织固定效果都很好，固定时间为4~18小时，固定后直接放70%乙醇脱水，固定时间较长对组织亦无损害。
（七）组织块修整
固定后的组织块可能会在外部形态上有些改变，或者由于组织在还未固定时就取材，组织器官较软，取材不容易切平。经固定后的组织有一定的硬度，此时就可以做一些修整，但改变不要太大，只是将组织材料切取平整，修掉一些不规则的部位。修整组织块时，手术切片一定要锋利。
四、水洗
1．目的：
洗去渗入组织中的固定液，终止固定。以免影响对组织内结构的观察、分析和研究。
2．原则和方法：
固定后的组织块的冲洗，一般情况下是置水龙头下以自来水流水冲洗，这样可以使组织中的固定液随时溢出，洗得更干净彻底，有些还需要进行特殊的洗涤。
（1）各种以水配制的固定液如甲醛，都必须用流水冲洗，大块组织一般冲洗24小时，小块组织一般冲洗2—10小时。
（2）固定液为多聚甲醛时，用于免疫组织化学等特殊染色的应将组织投入PB缓冲液中，每60分钟更新洗涤液一次，累计6小时。
（3）固定液为酒精或是酒精混合液，一般不需用水冲洗，其组织块的洗涤应用与固定液浓度相等垢酒精换洗或者直接进行脱水的程序。
（4）用锇酸或含有锇酸的固定液固定的组织，必须用流水彻底冲洗干净。
（5）经含有苦味酸的固定液固定的组织块，无论其固定液是水溶性还是酒精溶性，都应充分冲洗，水溶性固定液固定的组织块一般须冲洗12小时，再进入70%的酒精溶液洗涤，酒精溶性固定液固定的组织块直接进入70%的酒精溶液洗涤，该溶液可以脱掉苦味酸的黄色，但最好从50%酒精开始洗涤。
（6）冲洗好的组织可存放在75%酒精内
五、脱水包埋
（一）脱水
1．脱水的目的
组织内的水不能和支持剂混合，所以必须把组织中的水分彻底脱除。脱水有利于组织的透明和浸蜡，有利于组织的永久保存。
2．脱水剂
（1）乙醇：可作固定剂，又可脱水剂，但乙醇与水混合时有较剧烈的物理反应。高浓度的酒精对组织有强烈收缩及脆化的缺点，因此用乙醇脱水不能直接入纯酒精中脱水，而必须经过由高到低的一系列不同浓度的酒精，逐渐取代组织中水分，以保证组织脱水彻底，并避免组织过度收缩和硬化。
（2）丙酮：脱水能力比酒精强，但对组织的收缩更大，在组织学制片中较少使用，多用于病理快速切片，或用于某些组化水解酶的固定。
（3）正丁醇：是较好的脱水兼透明剂，可与酒精及石蜡混合，用于脱水是可先经过各种不同浓度的正丁醇和乙醇混合液，再入正丁醇，进行石蜡包埋时，可先用正丁醇和石蜡等量混合液，然后浸入纯石蜡包埋，正丁醇用于脱水的优点是很少引起组织收缩和脆硬，可替代二甲苯，是很好的脱水剂，但由于价格较贵，不常使用。
3．步骤
（1）乙醇脱水过程
50%乙醇6~8小时
75%乙醇6~8小时
85%乙醇3~5小时
95%乙醇1~2小时
95%乙醇1~2小时
100%乙醇Ⅰ1小时
100%乙醇Ⅱ1小时
（2）丙酮脱水
如果是丙酮固定的组织，则不必再经过乙醇，可以用新丙酮更换一次，便直接浸入二甲苯或苯中透明。其他水溶液固定的组织，均按上述乙醇脱水方法脱水，亦可由100%乙醇中移入丙酮继续脱水2~4小时再入二甲苯透明，透明后浸蜡包埋。
（3）正丁醇脱水
组织用正丁醇脱水前，先经50%乙醇脱水，然后移入正丁醇和乙醇混合液进行脱水。
50%乙醇6~12小时
50%乙醇+20%正丁醇+30%蒸馏水5~8小时
50%乙醇+35%正丁醇+15%蒸馏水4~6小时
45%乙醇+45%正丁醇+10%蒸馏水3~5小时
25%乙醇+75%正丁醇2~3小时
25%乙醇+75%正丁醇1~2小时
15%乙醇+85%正丁醇1~2小时
5%乙醇+95%正丁醇1~2小时
100%正丁醇Ⅰ1小时
100%正丁醇Ⅱ1小时
4．注意事项：
（1）脱水的过程应逐步地而不应骤然地进行，不能操之过急。
（2）脱水的时间应根据组织块的大小和组织的类型而定。
（3）组织块在高浓度，特别是无水乙醇内不能放置的时间太长。无水乙醇吸水能力太强，容易造成组织块的过度硬化，使得切片理组织易碎裂。
（4）在脱水的过程中可以将组织块停留在70%~80%的酒精中。
（5）每次更换新的脱水剂时（组织块从低浓度到高浓度），都要把组织块放在吸水纸上吸干，装组织块的容器也要控干水分，以免将水及低浓度脱水剂带入高浓度脱水剂中，影响脱水效果。
（6）脱水剂的先择要根据实验的要求及实验室的条件
（二）透明
1．透明的目的
置换组织内的脱水剂，为下一步的浸蜡起到桥梁作用；
使组织呈现不同程度的透明状态，有利于光线的透过。
2．透明剂
（1）二甲苯：是现在应用最广的一种透明剂，价格较便宜，不能和水混合，遇水则变成乳白色浑浊，因此必完全脱水后才能使用；易溶于酒精又能溶解石蜡，透明力强；其最大的缺
点是容易使组织收缩变硬变脆，所以组织不能在其停留过久，透明时间视组织块的大小、性质而定；有的组织如肌肉、肌腱、软骨、骨、皮肤、头皮及眼球等，不宜用二甲苯透明，因组织过硬不易切片；长时间接触，对粘膜有刺激作用。
（2）苯：性质与二甲苯相似，对组织收缩也较小，组织也不易变脆，但透明较慢，组织在其内可以滞留12~24小时，但毒性较大。
（3）香柏油：用为透明剂，效果很好，有高度透明作用，能与醇和二甲苯混合，香柏油对组织的硬化及收缩程度比任何其他透明剂都要小，但透明的速度较慢，3mm以下厚度的组织块需12小时以上。香柏油与石蜡不易融合，即香柏油不易被石蜡取代，因此经香柏油透明以后，可经过二甲苯短时间媒浸，再进行石蜡包埋。肌肉、皮肤、血管、膀胱、垂体及肾上腺等用香柏油效果较好。
3．二甲苯的步骤：两次透明
第一次透明约40分钟
第二次时间不一定，要视透明效果而定
4．注意事项
（1）时间不宜过长，否则组织会变脆；
（2）组织块脱水必彻底。
（三）浸蜡、包埋（石蜡包埋法）
1．浸蜡
（1）浸蜡的目的
置换组织中的透明剂，为包埋做准备。
（2）浸蜡的步骤
在60度恒温蜡箱中放置3个蜡杯，分别编号1（52℃~54℃）、2（52℃~54℃，或54℃~56℃）、3（56℃~58℃），其中分别盛软蜡、软蜡、硬蜡，取透明好的组织块放入软蜡中各1小时，迅速取出放入硬蜡，同样放置1小时。如果时间来及包埋，可以将已经完成浸蜡的组织块取出放在温箱外，第二天继续。
（3）注意事项
温箱中的温度必须严格控制在60℃的范围，不能超过60℃；浸蜡时间不宜过长。浸蜡温度过高或时间过长使组织收缩过度收缩和脆变。
2．包埋
（1）步骤
①准备包埋蜡：一般应用硬蜡（56~58℃或60~62℃）为好，所用的石蜡要求透明无杂质，新的石蜡要反复熔凝，并有一定的粘韧性，可以加一些蜂蜡。蜡的熔点应与组织的硬度相适应。包埋用过的石蜡可以反复使用。
②准备包埋框：可以用金属的，也可以用硬纸摺叠。
③点燃酒精灯，准备好无齿尖镊子，需作标记应先写好标签。
④在金属框中倒入硬蜡，然后用无齿镊子取组织块放入石蜡中，置好方向。可室温下冷却。
⑤包埋框或纸盒内的蜡逐渐凝结，若表面已凝结形成一层固体状，即可放入冷水中，加速其
凝固。
⑥待蜡块完全凝固以后，便可拆卸包埋框架，或拆开纸盒，取出蜡块。
（2）注意事项
①包埋时夹取组织的镊子，用酒精灯随时烧热，以免石蜡凝结后粘附在镊子上，造成蜡块凝固不均匀。
②包埋操作要迅速，组织从浸蜡杯中取出置入包埋框中的时间应尽量缩短。
③包埋后的蜡块应呈均质半透明状，如果出现白色混浊状，一般出现在组织周围或组织的底部，应考虑这样几个方面的问题：a. 脱水不彻底。b.包埋蜡温度低了，组织进行包埋时，包埋框中的蜡已成凝结状。c.组织内还残留有较多的透明剂，d.石蜡不纯。
④包埋箱中的温度必须保持恒定。
⑤如包埋得不好，可将蜡块溶化，重新浸蜡和包埋。
⑥较小的组织可在脱水透明时开始用伊红染色
六、石蜡切片制备
（一）石蜡切片前的准备
1．切片刀。传统的切片刀在使用之前，一定要在显微镜下检查刀口的损伤程度，然后进行磨刀。现在也可以使用一次性刀片，可省去磨刀。
2．修整蜡块：切去组织周围过多的石蜡，一般情况下在组织周围留有约1~2mm的石蜡边，两边必须平行。
3．蜡块固定：修整好的蜡块先固定在事先准备好的小方木块或者金属块上，固定方法是把蜡铲先在酒精灯上加热，再将蜡块底部烙熔，迅速烙粘在小方木块或金属块底座上。
4．载玻片擦洗干净后，在其表面涂上粘附剂（蛋白甘油、APES或多聚赖氨酸），根据染色方法选择不同的粘附剂。
5．准备好毛笔、镊子、染色架。
6．调好展片器内水的温度（45℃），有时也可以加些酒精到水中。
（二）石蜡切片
1．将切片刀装在刀片机的刀架上并固定紧，固定蜡块底座或蜡块，调整蜡块与刀至合适位置，刀刃与蜡块表面呈5度角。
2．切片多使用轮转式切片机，切片时，左手执毛笔，右手转切片机转轮，先修出组织块。3．调整切片机上的切片厚度为4~7μm，然后切片。
4．切片可以是单张，也可以是连续切片形成蜡带
5．展片和捞片：
（1）直接展片法：在载玻片上滴加几滴蒸馏水，然后把切片铺在小滴上面，用酒精灯在载玻片下面加热，待完全展平，倾斜载玻片，倒弃多余水分，同时摆正切片。
（2）温水漂浮法：此法用展片机或者用恒温水浴箱，先使水温保持在45~50℃，用左手拿毛笔轻轻托起切片，用右手用眼科镊子夹起切片的一角，正面向上轻轻平铺放置于展片器的
水面上，动作要轻快，切好的石蜡切片漂浮在温水中受热后及在表面张力的作用会自然平整地展开，必要时可用眼科镊轻轻拔开，然后捞片，并及时编号。
6．展好的切片在室温下稍微干燥后，放在40℃恒温烤箱中，小片组织30分钟即可，大的需12~24小时，烤干备用。
（三）注意事项
1．切片刀刃倾斜过大或过小都不能正常进行切片。
2．修整蜡块时要细心，看清楚组织在蜡块中的位置，以免将需要的组织修掉。
3．连续转动切片机的转轮时，速度一定要均匀，不能时快时慢，以免切片厚薄不一。4．使用轮转式切片机切片时，是由下向上切，为得到定然整的切片，防止组织出现刀纹裂缝，应将组织硬、脆难切的部分放在上端，如皮肤应将表皮部分向上，肠胃等组织应将浆膜面面朝上。
5．用展片器展片时，水温应根据使用的石蜡熔点进行了调整，一般低于石蜡熔点10~15℃；捞片的时候动作要轻、稍快。动作太大容易出现气泡。如果没有展片器可以用温水浴锅来代替。
6．单个切片要摆到载玻片的1/3与2/3交界处；连续切片的粘片顺序一般是从左到右，组织切片较小是，可以并列粘贴2~3条蜡带。
7．烤片的温度不宜过高；烤片的时间要合适。脑组织要待稍微晾干一些后，才能烤片，否则容易产生气泡影响染色和观察。
七、H-E染色
（一）步骤
1．脱蜡
二甲苯I 10分钟
二甲苯II 5分钟
2．水化
100%酒精I 5分钟
100%酒精II 5分钟
95%酒精I 5分钟
95%酒精II 5分钟
85%酒精3分钟
75%酒精2分钟
蒸馏水冲洗1分钟
3．染色
苏木精染色5分钟
自来水洗
盐酸酒精分化15秒
自来水洗（镜检）
自来水洗15分钟
蒸馏水洗2分钟
75%酒精2分钟
85%酒精2分钟
0.5%伊红染色1分钟
95%酒精I 5分钟
95%酒精II 5分钟
100%酒精I 5分钟
100%酒精II 5分钟
二甲苯I 5分钟
二甲苯II 5分钟
4．封片
中性树胶封片
上述处理好的玻片，取中性树胶滴入载玻片的组织上，取盖玻片从一端逐步盖下去，避免发生气泡
（二）注意事项
1．染色之前一定要了解清楚所用的染色液的配制方法，不同的染色液染色后的处理是不一样的。
2．染色过程中所用的时间要根据染色时的室内温度、染液的新鲜程度及实验室的实际情况等灵活掌握。在室温高、切片、染色液又是新配制的，染色时间就要短，反之时间就长。3．伊红有水溶的和醇溶的，如果用的是水溶的，应该在脱水前进行染色，如果是醇溶的，应使用与溶解伊红等浓度的酒精开始脱水。
4．在二甲苯脱蜡之前可以先在60℃烤箱内0.5~1小时，这样可以使切片粘附更牢固不易脱片，也有利于脱蜡。
5．二甲苯在HE染色中有脱蜡、透明的作用。二甲苯脱蜡的好坏主要取决于切片在二甲苯内放置的时间和脱蜡时的温度以及二甲苯的使用次数。染好的切片必须经过透明，有利于显微镜观察，同时并为封片起到了桥梁作用。
6．用梯度酒精脱水时，在低浓度酒精中时间不宜过长，到高浓度时逐步延长脱水时间。以免脱水不彻底，影响二甲苯透明的效果。
7．在酸性分化液内停留的时间不要过长，分化不可过度，避免使细胞核内该染上色的结构脱色。不需分化处理的苏木精染色时要注意掌握染色时间，以防止组织切片染色背景过深或细胞核、胞质染色不足。
TUNEL染色-冰冻切片-(TMR Red)
TUNEL染色（TMR Red） 一、实验原理： 细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。然后大约30 ﹪的染色体DNA在Ca 2和Mg2依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180～200bp核小体DNA多聚体。DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。 二、相关试剂： 1、酶缓冲液：vial 1: Enzyme Solution 2、标记液：vial 2: Label Solution 3、固定液：4%多聚甲醛 4、清理液：PBS（pH 7.4） 5、透性处理液（Permeabilisation solution）：含0.1% TritonX–100的0.1% 柠檬酸钠的缓冲液，新鲜配制 三、其他设备： 1、湿盒 2、荧光倒置显微镜或激光共聚焦显微镜（confocal） 四、染色步骤： 1、标本预处理： （1）用4%多聚甲醛固定组织20分钟（15-20℃）； （2）PBS清洗30min； （3）置于透性处理液（0.1% TritonX–100的0.1% 柠檬酸钠）中冰上孵育2min（2-8℃）2、TUNEL反应液： （1）从标记液（vial 2: Label Solution）中吸出100ul用于2个阴性对照（50ul/个）； （2）将50ul酶缓冲液（vial 1: Enzyme Solution）加入到剩余450ul的标记液中充分混合均匀，得到500ulTUNEL反应液（50ul/样本，检测10个样本）。 3、标记： （1）PBS清洗3min，3次； （2）吸干样品周围的液体； （3）往组织切片上滴加TUNEL反应液（覆盖整个切片），阴性对照加标记液； （4）湿盒中避光孵育60min，注意避光； （5）PBS清洗3min，3次； （6）抗荧光淬灭封片液封片，用荧光倒置显微镜或激光共聚焦显微镜（confocal）检测（激发波长520-560nm，最大540nm，绿光；检测波长570-620nm，最大580nm，红光
石蜡切片免疫组化染色步骤
石蜡切片免疫组化染色步骤 1、载玻片的处理： 抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 Histogrip TM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等几种试剂，对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下： 1.1 APES：现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中，停留20~30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。 1.2 Histogrip TM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中，停留1~2分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60o C烤箱烘烤一小时，装盒备用。 1.3 Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60o C烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。 2、常用酶消化： 2.1 胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、10~40分钟，主要用于细胞内抗原的显示。 2.2 胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30~180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin（层粘蛋白），Collagen IV（IV型胶原）等。 2.3 皂素（Saponin）：一般使用浓度为2~的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。 3、抗原热修复： 可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。请选用我公司提供的ZLI-9064 枸橼酸盐缓冲液（粉剂）配制，取该粉剂一包溶于1000ml 的蒸馏水中，混匀，其pH值在6.0 0.1，如因蒸馏水本身造成的pH值偏差，请自行调整。 3.1 石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，3％H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟×3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃~98℃之间并持续10~15分钟（注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求）。取出容器，室温冷却10~20分钟（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。PBS洗，下接免疫组化染色步骤。 3.2 石蜡切片高压抗原修复操作方法：切片脱蜡至水。将1500ml~3000ml的枸橼酸盐缓冲液（工作液）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时（约加热5~6分钟后），计时1~2分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟×3，下接免疫组化染色步骤。 3.3 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20分钟，然后端离电炉，室温冷却20~30分钟，蒸馏水冲洗，PBS洗，下接免疫组化染色步骤。 4、免疫组化染色步骤： （以美国ZYMED公司SP试剂盒为例） 4.1石蜡切片脱蜡至水。 4.2 3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。 4.3蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，(如需采用抗原修复，可在此步后进行)。
石蜡切片的基本操作流程
石蜡切片的基本操作流程 一、取材选取目的组织块，修剪到合适的大小； 二、固定 将组织块放入福尔马林固定液（10%甲醛溶液），固定时间由组织块大小而定，一般不少于24h；体积1cm3的组织块，一般为3-7天； 三、冲水自来水洗几下，泡1小时； 四、系列酒精脱水 50%酒精，1h； 70%酒精，1h； 80%酒精，1h； 90%酒精，1h； 100%酒精（I），1h； 100%酒精（II），1h； 五、透明 酒精：二甲苯=1：1溶液，过夜； 二甲苯，1h； 六、包埋 二甲苯：石蜡=1：1，65-70 ℃，2h； 新鲜石蜡（I），65-70 ℃，1h； 新鲜石蜡（II），65-70 ℃，4h； 新鲜石蜡包埋； 七、切片切片厚度为5-7um； 八、展片温水（40-42 ℃）展片； 九、捞片将展好的片子贴于载玻片上； 十、烘片42 ℃将片子上的水烘干； 十一、烤片60 ℃烤片12-24h； 十二、脱腊 二甲苯（I）：2min； 酒精：二甲苯=1：1溶液：2min； 十三、水化 100%酒精（I）：1min； 100%酒精（II）：1min； 95%酒精：1.5min； 80%酒精：1.5min； 70%酒精：1.5min； 50%酒精：1.5min； 自来水洗：2min 十四、H&E染色 Hematoxylin染色3-5min(2.5min时取出观察染色效果)，自来水洗3次，盐酸分化（2/3杯玻璃缸+3滴1N盐酸），10s；自来水洗蓝化，镜下观察染色效果；（伊红）Eosin染色30-50s，直接脱水（90%酒精-----100%酒精I，100%酒精II各1分------酒精：二甲苯=1：1溶液：1-1.5min）；十五、脱水 90%酒精-100%酒精-100%酒精，各1min； 十六、透明 二甲苯：酒精：1-1.5min；二甲苯：2min；
HE石蜡切片步骤,免疫组化步骤
HE染色 1．取材 切取的组织块不宜太大，以利于固定剂穿透，通常以6mm×6mm×5mm为宜。 注意事项： （1）取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。 （2）切片材料应根据需要观察的部位进行选，尽可能不要损伤所需要的部分。 2．固定 将切好的组织用生理盐水组织洗3次，立即投入10%中性福尔马林固定液或4%多聚甲醛中固定，固定36小时。 注意事项： （1）一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。 （2）有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定时就没有作用了。 （3）固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20~30倍，有些水分多的材料，中间应更换1-2次新液。 （4）材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外上标签，并随同材料在溶液中投入相应的标签，以免相互混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的文字，应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。 脱钙72小时中间不换液是样本30倍中杉金桥（进口脱钙液） 镊子触质粒由硬变韧性为准。 （美）：固定3-5天根据组织大小确定天数，越大固定时间越长。 3. 洗涤 材料经固定后,PBS或双蒸水冲洗约3小时。（20，30，30，60） （美）：流水冲洗约4小时 4. 脱水 材料依次经80%、90%、100%、100%各级乙醇溶液脱水，各30min 注意事项： （1）脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分。 （2）在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏，可用吸管吸出器皿中的脱水剂，再用吸水吸尽器皿内剩余液，然后于皿中加入高一级脱水剂。 （3）在低浓度酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。 （4）在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。（5）如需过夜，应停留在80%酒精中。 （6）脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象 （美）：80％的酒精×2小时 95％的酒精×2小时 100％的酒精×2小时×2 100％的酒精×1小时或者更长时间 5．透明（环保透明脱蜡液）中杉金桥 纯酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯Ⅰ60min、Ⅱ30min（至透明为止）。 由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态。
冰冻切片和石蜡切片各自的优劣之处
创作编号： GB8878185555334563BT9125XW 创作者：凤呜大王* 冰冻切片和石蜡切片各自的优劣之处是什么 1、从一抗的选择方面来看。有的一抗既能做石蜡切片又能做冰冻切片，而有的一抗只能做冰冻切片，关键取决于所要检测的 抗原稳定性，有的抗原不稳定，经过组织固定，脱水、透明、浸蜡、包埋、脱蜡等一系列的做石蜡切片的步骤，所检测的抗原易被破坏，这时只能用冰冻切片来做，检测这类抗原的一抗只能做冰冻切片，而那些稳定的抗原，能经受住石蜡切片的的考验，一般来讲也可以用冰冻切片来做，总得来讲，对于既可以用冰冻切片也可以用石蜡切片检测的抗原，用石蜡切片检测的染色效果要比冰冻切片好一些。 2、从研究目的来看。石蜡切片对组织细胞的定位很准确，而长期冻存组织的冰冻切片可能因冰晶的形成破坏组织细胞形 态的结构，并造成抗原的弥散，从而定位不准确。 3、从抗原的保真性来看。冰冻切片对抗原的保真很好，而石蜡切片在组织固定，脱水、透明、浸蜡、包埋、脱蜡等过程 中可能会对抗原的性质造成影响。 4、从操作步骤的繁琐程度看。染色过程冰冻切片简单，而石蜡切片要求脱蜡入水、抗原修复等过程，比较繁琐。 5、总之，石蜡切片对标本的长期保存较合适，且组织细胞形态结构保持好；而冰冻切片适合对新鲜组织的制片，然后立 即固定、染色效果较好，且免疫荧光中可以相对避免石蜡自发荧光的干扰。 冰冻切片（frozen section）是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法。因其制作过程较石蜡切片快捷、简便，而多应用于手术中的快速病理诊断。冰冻切片的种类较多，有低温恒冷箱冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，甲醇循环制冷冰冻切片法等。这些方法，随着时代的变迁，科技的发展，许多年前被认为是非常重要的技术，现在也逐步被淘汰了。当然有些技术，如低温恒冷箱冰冻切片法，正在受到青睐。 编辑本段冰冻切片的应用
石蜡切片、HE、免疫组化步骤
石蜡切片、HE、免疫组化实验 一：取材及石蜡切片的制作（本次取材为小肠、膀胱、子宫、宫颈） ①取材：小鼠脱颈处死后，应立即找到自己所需的组织器官，用一张滤纸将所需器官放在其上（可以加一些生理盐水在上面，防止干了），修去多余的脂肪、系膜等不要的组织，根据不同器官切成合适大小的形状（如小肠应切成1cm长度的长柱形）。将切好的组织装于冻存管中，加入4%的PFA（PFA的作用是保护蛋白，防止蛋白降解）固定过夜（固定时间不能超过24h，如果24h后不能完成脱水工作，可以先50%、70%酒精脱水后，置于4℃冰箱保存。） ①脱水（目的是为了使组织从水相置换到有机相）（根据不同的组织，脱水时间不同）：将PFA中的组织取出，放入组织盒（组织盒子应尽量选择小格子，防止组织脱水过程中掉出来），一个组织盒可以放4~8个组织小块，切一张与格子大小合适的纸条一并装入，做好标签，防止后期辨认不出具体组织（只能用铅笔写，中性笔会被酒精脱去）。使用自动脱水机进行脱水，设定程序为：酒精50%、70%、80%、90%（各20min）、无水乙醇（30min/次，两次）、酒精二甲苯混合物（1：1）20min、二甲苯20min（两次）、二甲苯石蜡混合物（1：1）30min、石蜡①1h；脱水结束后，取出组织盒，置于石蜡①中1h（石蜡应提前融化，且不能凝固，放在70℃烘箱中）。 ①包埋：用4X6cm的小纸条根据小木块形状，叠成盒子（盒子最好四边叠平，不要左右不平，便于放融化的蜡进去后能得到比较好的形状，最好不要漏），取一个盒子，将融化的石蜡①倒入，在其快要凝固的时候，将组织按照所需的形状，摆正（如小肠切成的小柱子应立起来，便于后面切片的时候，可以切到所需的形状），再用做好标记的长纸条贴着盒子壁固定（为了包埋后识别组织，且不能将纸条放在蜡块中央，后期不好取出，会损坏刀片），倒蜡之前，可以将盒子放在铁皮或小铁块上（能够让石蜡更快凝固。），每次用镊子拿组织或摆正组织之前，先烧一下（能够更好摆正组织块，可以随时调整组织位置）。包埋过夜。 ①切片：将包埋好的蜡块取出，置于小木块上，用刀修成梯形（包埋时组织所在的底面现在变成正面，主要修这一面，蜡块厚的一面用烧过的刀块烫平，贴在小木块上，贴紧底面后，用刀片烫一下四边，使蜡块完全固定在小木块上，防止切片时掉落）（组织蜡块的梯形上下边一定要平行，梯形不用太大，也不能太
冰冻切片实验方案和HE染色
2-3人一组，分为7组（上课时需携带实验步骤） 冰冻切片操作方法及步骤： 1取材：(昆明小鼠各个组织或器官) 取材时不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24×24×2mm。 2包埋： 取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。 小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。 注意：大组织进行包埋时，只要使组织固定在支承器上即可，切勿浪费包埋剂。 3修平： 将冷冻好的组织块，夹紧于切片机直承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。 注意：修平过程中，正确使用切片机，不要一次性大量切割组织块，以防损毁切片刀。 4切片： 调好切片的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10um间。 5调防卷板： 制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。切片时，切出的切片能在第一时间顺利地通过刀防卷板间的通道，平整地躺在持刀器的铁板上。这时便可掀起防卷板，取一载玻片，将其附贴上即可。 6切片工作完成后，将冷冻机内的所有废物清理干净，切勿乱扔。 冰冻切片时的注意事项： 1 防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净，需经常用毛笔挑除切片残余和用柔软的纸张擦。有时需要每切完一张切片后就用纸擦一次。因为这个地方是切片通过和附贴的地方，如果有残余的包埋剂粘于刀或板上，将会破坏甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。 2 多例多块组织同时需做冰冻且片时，可各自放于不同的支承器上，于冷冻台上冻起来，然后依据不同的编号，依序切片，这样做既不费时也不会乱。 3 放置组织冰冻前，应视组织的形状及走势来放置，如果胡乱放置，就不能收到很好的效果。 4 组织块不须经各种固定液固定，尤其是含水的固定液，在未达到固定前，更不能使用。临床快速冰冻切片，不须要预先固定，一是为了争取时间，二是固定了的组织，反而增加了切片的难度。如果使用未完全固定的组织做冰冻切片，就会出现冰晶。这是因为含水的固定液在组织未经固定前，其中的水份也可渗入到组织中去，当冰冻发生时，这些水份就存留于组织中，形成了冰晶。 5 当切片时，如果发现冰冻过度时，可将冰冻的组织连同支承器取出来，在室温停留片刻，再行切片，或者用口中哈气，或者用大拇指按压组织块，以此来软化组织，再行切片。 6 用于附贴切片的载玻片，不能存放于冷冻处，于室温存放即可。因为当附贴切片时，从室温中取出的载玻片与冷冻箱中的切片有一种温度差，当温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时，由于两种物质间温度的差别，当它们碰撞在一起时，分子彼此间发生转移而产生了一种吸附力，使切片与载玻片牢固地附贴在一起。如果使用冷藏的载玻片来附贴切片，由于温度相同，没有发生上述的现象。
组织切片石蜡切片过程
石蜡切片过程 一、石蜡包埋: 1.脱水：组织水洗后便可酒精脱水，70% →80% →90% →95%→ 100%酒精（无水乙醇）→100%酒精，各级酒精脱水时间30-45 min。（注意：80%酒精内组织可留之较久，当天如果来不及做完就可以暂时保存一晚上，次日再继续做下去。70%的酒精可作为更久的保存剂。） 2.透蜡：脱水后组织：50%酒精+50%二甲苯30 - 45min. 二甲苯（组织透明即可停止) 15min. 50%二甲苯+50%石蜡20-30min. 纯石蜡1 45min. 纯石蜡2 45min.（透腊之前做好准备工作：准备腊杯，烘箱温度保持55—60℃左右，使石腊熔化，温度不宜过高，以免使组织发脆。） 3.包埋： a.折好纸盒，准备小镊子、酒精灯、解剖针、冷水等。 b.用温热吸管吸取石蜡注入纸盒。等待底稍微凝固，温镊子夹住样品放入盒子中央，面朝底(可以将蜡一次倒入纸盒，然后待蜡表面起膜后，用温镊子夹住样品放入蜡中，待冷却即可，整个操作过程中，切勿让蜡中起气泡)。 c.两手拿着两端，入冷水一半，吹气，使表面石蜡形成移较厚腊层，然后急速全部进入冷水中3分钟。 d.修正蜡块（上下两个面一定要平行并且光滑） e.固着蜡块
二、切片 1.切片（切片时，可以在刀片以及刀片周围涂上一点甘油） 2.贴片烤片（甘油蛋白=1/2甘油+1/2鸡蛋清）（在贴片时，用细吸管取一点点甘油蛋白（越少越好）于载玻片上，然后用手抹匀，手一定要干净。将切片放在载玻片（光亮面朝向下），然后滴几滴冷水使切片悬于水上。接着将载玻片放在37℃上烘烤。 常见问题分析： 1.切片分离不能形成蜡带：?室温过低，蜡过硬。 2.蜡带弯曲：?蜡块口下面不平行，或蜡块不与刀刃平行所致。 3.切片厚薄不一:?切片刀或蜡块未固定紧。 4.切成片后，组织与蜡块脱离：?脱水不干净等。 5.蜡片易粘在切片上或蜡片萎缩：?室温太高或蜡太软或刀的角度 太小。 6.切片破裂：?浸蜡不足或浸蜡温度过高，或在脱水剂、透明剂中 时间过长，引起组织发脆或有杂质，材料脱钙不完全，此种无法补救。 7.蜡片上卷，切过刀口即破裂：?刀口太钝或沾有石蜡或刀的角 度过大或蜡太硬。 *：包埋时，时间长会使标本变质，过短则石蜡不能透进标本。石蜡包埋过程中，注意控制温度保持在58-60℃，石蜡不能融化。
石蜡切片步骤
石蜡切片制作 大致步骤：取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片和粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。 1、取材 植物材料选择时必须尽可能不损伤植物体或所需要的部分。 取材必须新鲜，尽可能割取所需要的组织块，并随即投入固定液。 取材时刀要锐利，避免因挤压细胞使其受到损伤。 切取的材料应该小而薄，便于固定剂迅速渗入内部。一般厚度不超过2mm，大小不超过5*5mm2。 2、固定 用适当的化学药液—固定液浸渍切成小块的新鲜材料，迅速凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，尽可能保持其活体时的结构。 固定液的选用：FAA固定液 FAA固定液配制：福尔马林（38%甲醛）5 ml 冰醋酸 5 ml 70%酒精 90 ml 5 ml甘油（丙三醇） 固定时间根据材料块的大小及松密程度而定。 3、洗涤与脱水 固定后的组织材料需要除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响以后的染色效果。多数用流水冲洗：使用含有苦味酸的固定液固定的则需要用酒精多次浸洗；如果组织经酒精或酒精混合液固定，则不必洗涤，可直接进行脱水。 酒精为常用的脱水剂，为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行，通常从30%或50%酒精开始，经70%、85%、95%直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1-数小时，如不能及时进行脱水，材料可以放在70%酒精中保存，因高浓度酒精易使组织收缩硬化。 4、透明 选用二甲苯为酒精和石蜡的浸媒液，替换出组织内的酒精。通常组织先经过纯酒精和透明剂各半的混合液浸渍1-2小时，再转入纯透明剂中浸渍。时间根据材料块大小而定。 5、浸蜡与包埋 用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。通常把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1-2小时，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍3小时左右，浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右的温箱中进行，以利于石蜡浸入组织内。浸蜡后的组织材料块放在装有蜡液的容器中（摆好在蜡中的位置），待蜡液表层凝固即迅速放入冷水中冷却，即做成含有组织块的蜡块。容器可用光亮且厚的纸折叠成纸盒或金属包埋框盒。如果包埋的组织块数量多，应进行编号，以免差错。石蜡熔化后应在蜡箱内过滤后使用，以免因含有杂质而影响切片质量，且可能损伤切片刀。 6、切片 包埋好的蜡块用刀片修成规整的四棱台，以少许热蜡液将其底部迅速贴附于小木块上，夹在轮转式切片机的蜡块钳内，使蜡块切面与切片刀刃平行，旋紧。切片刀的锐利与否、蜡块硬度适当都直接影响切片质量，可用热水或冷水等方法适当改变蜡块硬度。通常切片厚度为 4-7微米，切出一片接一片的蜡带，用毛笔轻托轻放在纸上。 7、贴片与烤片
石蜡切片详细步骤
石蜡切片 1.仪器 石蜡切片机、烘箱、显微镜、染色缸、小培养皿、镊子、毛笔、吸水纸、纱布、载玻片、盖玻片等。 2. 试剂 FAA固定液(70%酒精90ml、冰醋酸5ml、福尔马林5ml)、10%番红水溶液、0.5%固绿（用95%的酒精配制）、酒精（100%、95%、80%、70%、50%）、二甲苯、蒸馏水、甘油、中性树胶等。 3.取材 幼嫩的油菜植株叶片和茎 4.方法与步骤(参照) 1．固定： FAA固定液固定48小时以上。 2．脱水： 50%酒精→70%酒精→83%酒精→95%酒精→100%酒精→100%酒精。每级2h。100%酒精中1.5h。其中70%酒精处可长期保存。 3．透明： 1/2二甲苯+1/2无水乙醇 (2h) →纯二甲苯(1.5h) →纯二甲苯(1.5h) 4．浸蜡： 将处理的材料置于1/2石蜡(固体粉末状)+1/2二甲苯中，40℃烘箱敞口过夜。 5．包埋： 先提升恒温箱的温度至60℃，换纯蜡3次，每次1-2h，用硬的电光纸、牛皮纸叠纸盒，置于45-60℃的烫板上，倒入材料，摆放好材料，把标签（正面向外置于底部），补足石蜡，倒好后轻轻的置于冷水盆中，注意底面要接触盆中凉水，待石蜡全部凝固后可取出晾干，也可在凉水盆中放置过夜。 6．切片 对包埋的材料进行修块、粘块、整修后，保证材料四周都有石蜡包围。但不可太多。切面的上、下边平行。用加热的解剖刀蘸取少许石蜡碎屑，并迅速将石蜡块四周的碎屑烫平，使石蜡块牢固地粘在台木上。检查切片机，安装切片刀、调整好刀的角度，调整石蜡块与刀口之间的角度与位置后开始切片。
7．粘片 将粘贴剂置簿玻片上，再取切片浮置粘片剂上，然后置烘片台上，使切片展开烫平，材料不现皱纹为度。最后将切片依次排好，用滤纸吸去多余水分，同时以记号笔在玻片上编号，放入温箱中烘干，温度30～40℃中过夜。 8．脱蜡 脱蜡用二甲苯，把烤好的载玻片放于盛二甲苯的染缸中：纯二甲苯(10-20min)→纯二甲苯(5-10min) 9．染色 将纯二甲苯脱蜡完全的材料，1/2 二甲苯十1/2纯酒精→100%酒精→95％酒精→85％酒精→70％酒精→50％酒精→1%番红染色(4h以上) →50％酒精→70％酒精→85％酒精→95％酒精→0.5%固绿(1min)→95％酒精→100%酒精→100％酒精(未注明时间各级均为3min) 10．胶封 滴加加拿大树胶封藏。 11.镜检，拍照
HE石蜡切片步骤-使用
石蜡切片制作 一、木精-伊红对染法 ——paraffin section 一、器材及试剂： 1. 器材： 切片刀，切片机，恒温箱，蜡杯，酒精灯，解剖刀，解剖剪，解剖盘，培养皿，镊子，单面刀片，毛笔，包埋盒，染色缸，盖玻片，载玻片，玻片盘，树胶，树胶瓶，显微镜，温度计，脸盆，水浴锅。 切片机，切片刀，温台，恒温箱，解剖刀，镊子，剪刀，解剖针，单面刀片，小台木，洒精灯，包埋纸盒，染色缸，烧杯，水盆，熔蜡炉，蜡杯。 2．试剂： 中性福尔马林固定液、各种浓度的酒精、二甲苯、石蜡、蜂蜡、木精染液，1%伊红酒精溶液，1%盐酸酒精溶液，甘油蛋白粘片剂，中性树胶。 卡诺（Carnoy）固定液，埃利希木精染液，1%伊红酒精溶液，1%盐酸乙醇液，各级酒精（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%），二甲苯，中性树胶。 3. 材料： 鼠肝、肾、心肌、骨骼肌或其他组织、大豆或小麦、绿豆、洋葱、大蒜、蚕豆的根、茎、叶等。 二、实验原理： 石蜡切片是最基本的切片技术，冰冻切片和超薄切片等都是在石蜡切片基础上发展起来的。木素与伊红对比染色法（简称H.E.对染法）是组织切片最常用的染色方法。这种方法适用围广泛，对组织细胞的各种成分都可着色，便于全面观察组织构造，而且适用于各种固定液固定的材料，染色后不易褪色可长期保存。经过HE染色，细胞核被木素染成蓝紫色，细胞质被伊红染色呈粉红色。 三、试剂配法： 1．中性甲醛固定液： 甲醛（37%-40%，市售，本所购买即为此浓度） 100mL 磷酸氢二钠 6.5 磷酸二氢钾（钠） 4g
双蒸水 900mL 2．木精、伊红染色液为碧云天产品 3．1%盐酸乙醇液 盐酸 1份 70%酒精 100份 四、实验步骤： 1．取材 颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔，剪取肝组织（或其他组织）。 切取的组织块不宜太大，以利于固定剂穿透，通常以5mm×5mm×2mm或10 mm×10 mm×2 mm为宜。取下所需要的肝组织，切成一小块2－3mm厚。 注意事项： （1）取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。 （2）切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部分。 2．固定 将切好的肝组织用生理盐水组织洗一下，立即投入中性福尔马林固定液中 固定，固定30－50min。（4度过夜） 注意事项： （1）一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化 学变化，失去固定作用。 （2）有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合 太早，固定时就没有作用了。 （3）固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20~30倍，有些水分多的材料，中间 应更换1-2次新液。 （4）材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外上标签，并随同材 料在溶液中投入相应的标签，以免相互混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签 上的文字，应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。 3. 洗涤 材料经固定后,流水冲洗，数小时或过夜。 4. 脱水
冰冻切片免疫荧光染色流程
冰冻切片免疫荧光染色流程(表面分子，以CD4为例) （1）冰冻切片室温晾干15分钟； （2）用组化油笔将待染组织圈好，置PBS中浸泡10分钟，以去除OCT；（3）用含10％正常山羊血清的PBS室温封闭切片1 小时（此步可以不洗涤，把封闭液吸干即可）； （4）加入CD4单抗(1:100; SeroTec, Inc, Raleigh, NC, USA)，4℃孵育过夜；（5） PBS洗3次，每次10分钟； （6）加入罗丹明标记的羊抗小鼠的IgG二抗(1:50; Sigma 公司)，37℃孵育1小时； （7） PBS洗3次，每次15分钟； （8）封片后，荧光显微镜观察结果并拍照； （9）在每切片中随机选择5个视野计数阳性细胞数。 注意事项：（1）整个实验过程中勿使表面干燥 （2）稀释、加二抗（荧光抗体）及此后的洗涤过程中注意避光 附注1：如目的分子为胞内分子，各种液体中需要加透膜剂0.3%TrixtonX100。附注2：所用液体（表面分子染色不用0.3%TrixtonX100）： （1）pH7.4 0.01MPBS： 配方为：0.1MPBS 100ml+ddH2O 900ml+NaCl 7.65g 0.1MPBS 配方为：Na2HPO4 23g+NaH2PO4﹒2H2O 5.9g+NaCl 17g 定容至2000ml, 高压， pH7.2-7.4 （2）洗涤液：0.3%TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装15ml/支－20℃保存 （3）封闭液：10％NGS－0.3% TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装1.2ml/支－20℃保存 （4）抗体稀释液：1％BSA－0.3% TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装1ml/支－20℃保存
免疫组化HE染色步骤
免疫组化H E染色步骤 The Standardization Office was revised on the afternoon of December 13, 2020
骨组织石蜡切片制作 步骤： 1.固定：切取骨缺损出的骨组织，用PBS冲洗，放入4%多聚甲醛缓冲 液内固定12—24h。 2.脱钙：将固定好的骨组织放入脱钙液中侵泡脱钙24h. 3.脱水：将固定好的骨组织用蒸馏水冲洗3次，再用50%的酒精冲洗2次，常规脱水，70%酒精（60min），80%酒精（40min）,95%酒精（30min）,100%酒精1（25min）,100%酒精II（25min）。 4.透明：二甲苯I(35min)，二甲苯II（35min）。 5.包埋：将透明处理后的骨组织依次侵入石蜡I1小时，石蜡II1小时。 6.切片：包埋后的组织块经修理后，用切片机切成4um的石蜡带，将组织石蜡块在50℃温水中展片，然后用干净的载玻片捞片。 7.烤片：将切好的组织片放入63℃恒温箱中烤片2小时。 免疫组化检测 步骤： 1.脱蜡：将组织切片放入62℃恒温箱中烘烤20min二甲苯1 （10min）二甲苯2（10min）。 2.水化：100%酒精1（2min）100%酒精（2min）95%酒精（2min） 80%酒精（2min）70%酒精(2min)。 冲洗3次，每次5min.。
4.抗原修复：将组织片置的柠檬酸缓冲液（）中煮沸15min,自然冷 却至室温。 冲洗3次，每次5min。 6.阻断：3%去离子水37℃孵育10min,以灭活内源性过氧化物酶活 性。 冲洗3次，每次5min。 8.滴加1抗（GFP1：100稀释,4℃过夜） 冲洗3次，每次5min。 10.滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂1，37℃孵育,20min,PBS冲洗 3次，每次5min。 11.滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂2，37℃孵育,20min,PBS冲洗 3次，每次5min。 显色5min。 13.自来水冲洗10min。 14.苏木精复染2min,盐酸酒精分化。 15.自来水冲洗10min。 16.常规脱水，透明，封片，镜检。 组织切片HE染色 步骤 1、将烘烤后的组织切片依次侵入二甲苯1，二甲苯II进行脱蜡各 10min。 2、脱蜡后的组织切片依次浸入无水乙醇I、无水乙醇II、95%酒精、80%酒精、70%酒精中各2min，PBS冲洗2次，每次5min。
石蜡切片的制作过程(精)
石蜡切片的制作 目的要求:了解生物制片的基本原理和方法;了解石蜡切片制作的基本过程;学会制作石蜡切片。 一、生物制片的基本原理 (一生物制片的目的与发展概况 生物制片是研究生物有机体微观结构的基础方法,其目的是提供在显微镜下以适度的样品,有效地对其进行形态和功能观察研究。 (二生物制片的方法 当我们研究生物体的组织或细胞时,除了某些生物体可用相差显微镜或偏光显微镜等方法达到观察目的外,其余大部分生物体,因为组织较厚,光线不易透过内部等关系而达不到观察的要求,为了达到此目的,就必须将生物体的组织切成薄切片或不切片,经过一系列处理,使光线易于透过,即可进行观察。因此,根据标本的制作方法分为切片法和非切片法两种。这些方法,各有优缺点,应该适当的配合使用,才能获得比较理想的结果。 1.切片法 (1切片法的种类 切片法就是利用锐利的刀具,将器官组织或幼小个体分割成许多极薄的薄片,而制成切片标本的一种方法。切片法在切成薄片以前必须设法使组织内渗透某种支持物质。使组织保持一定的硬度,然后利用切片机进行切片。根据所用支持物质的不同切片法又可分为石蜡切片法、火棉胶切片法、冰冻切片法、炭蜡切片法等类型。现分述如下: ⅰ.石蜡切片法
石蜡切片法即用石蜡作为支持剂进行切片的方法。石蜡切片法是一般组织学、病理学等常规制片方法,因此用得最多,它有很多优点:比较省时间,容易操作,可切成极薄的切片(4um 以下,能制作连续切片,组织块可包埋在石蜡中永久保存。缺点是只能用于较小的组织块,较大的组织块不易切好,容易破碎,组织在脱水透明过程中产生收缩并易变脆。制片时间太长。 ⅱ.火棉胶切片法 火棉胶切片法是以火棉胶为支持剂进行切片的方法。此法的优点是包埋过程中不用二甲苯及石蜡,不经高温,可避免组织收缩及变脆,适于精细材料(如脑的切片,也引火棉胶有韧性切片不知有折卷或破裂,适宜于大块组织及多空洞的组织(脑、眼球,硬度较高的组织(骨、肌腱。缺点:手续麻烦、费时间,切片不能切薄,起码在10um以上,不能作连续切片,因此,在生物制片技术上已经不经常采用。 ⅲ.冰冻切片法 冰冻切片法是利用液体二氧化碳或其它药剂(如氯乙烷在变成气体时吸收大量的热使组织迅速结成冰块而后再进行切片的方法。目前国内外用半导体致冷调节器来代替二氧化碳的冰冻,冷冻速度更快更为方便。 冰冻切片法的优点是较前两种方法简便,组织不经脱水、透明、包埋等手续即可切片,因而可节省很多时间,十分钟左右即能制成切片。常用于临床病理手术诊断,银材料不经溶媒处理就可直接进行切片,材料不受试剂的激烈刺激及温度影响,所以组织没有显著的收缩,细胞形态不致有大的改变,也引冰冻切片不需有机溶剂处理,所以能保存脂肪、类脂等成分,所以冰冻切片法常用于组织化学,尤其是神经组织,临床病理学等方面的研究。 新鲜的组织或已经固定的组织,经短时间处理后即可进行切片。用任何固定及处理的材料均适合冰冻切片,但一般的经验用福尔马林固定的材料最适合冰冻切片,而用酒精、甘油保存的材料必须充分水洗后才易于冰冻,否则不易切成完整的切片
HE石蜡切片步骤,免疫组化步骤.
HE染色 1.取材 切取的组织块不宜太大,以利于固定剂穿透,通常以6mm×6mm×5mm为宜。 注意事项: (1取材动作要迅速,不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。 (2切片材料应根据需要观察的部位进行选,尽可能不要损伤所需要的部分。 2.固定 将切好的组织用生理盐水组织洗3次,立即投入10%中性福尔马林固定液或4%多聚甲醛中固定,固定36小时。 注意事项: (1一般固定液,都以新配为好,配好后应贮存在阴凉处,不宜放在日光下,以免引起化学变化,失去固定作用。 (2有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用,一定要在使用前才混合,如果混合太早,固定时就没有作用了。 (3固定材料时,固定液必须充足,一般为材料块的20~30倍,有些水分多的材料,中间应更换1-2次新液。 (4材料固定完毕后,保存于严密紧塞或加盖的容器里,同时在容器外上标签,并随同材料在溶液中投入相应的标签,以免相互混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的文字,应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。 脱钙72小时中间不换液是样本30倍中杉金桥(进口脱钙液
镊子触质粒由硬变韧性为准。 (美:固定3-5天根据组织大小确定天数,越大固定时间越长。 3. 洗涤 材料经固定后,PBS或双蒸水冲洗约3小时。(20,30,30,60 (美:流水冲洗约4小时 4. 脱水 材料依次经80%、90%、100%、100%各级乙醇溶液脱水,各30min 注意事项: (1脱水必须在有盖的玻璃品中进行,防止吸收空气中的水分。 (2在更换高一级的脱水剂时,最好不要移动材料以免损坏,可用吸管吸出器皿中的脱水剂,再用吸水吸尽器皿内剩余液,然后于皿中加入高一级脱水剂。 (3在低浓度酒精中,每级停留不宜太长,否则易使组织变软,助长材料的解体。 (4在高浓度或纯酒精中,每级停留的时间也不宜太长,否则会使组织变脆,影响切片。 (5如需过夜,应停留在80%酒精中。 (6脱水必须彻底,否则不易透明,甚至使透明剂内出现白色混浊现象 (美:80%的酒精×2小时 95%的酒精×2小时 100%的酒精×2小时×2
冰冻切片实步骤
全部实验步骤 1 取新鲜组织于4%多聚甲醛固定24小时 2 30%蔗糖脱水48小时以上 3 -250C包埋（冰冻切片机内） 4冰冻切片 冰冻切片步骤 冰冻切片免疫组化染色步骤： 冰冻切片4~8μm，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3次。用3%过氧化氢孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗，5分钟×2次。下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤。(见我发的前面的帖子) 你确定你是冰冻切片吗？？？ 冰冻切片不能用热修复啊！！！ 以下是我的步骤： 1 冰冻切片室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，PBS洗，5分钟×2。 2 5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。 3 PBS冲洗，5分钟×3次。 4 滴加滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育30分钟。 PBS冲洗，5分钟×3次。 5 滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。 6 PBS冲洗，5分钟×3次。 7 显色剂显色（DAB）。 8 自来水充分冲洗，复染，封片。 冰冻切片免疫组化染色用的灭活内源性过氧化物酶，最好是用3%H2O2/甲醇溶液，室温20分钟。此配方不易产生脱片。 配制方法是在9ml甲醇中加30%H2O2 1ml，混匀后使用，每次新鲜配制。 冰冻切片免疫组化染色步骤 冰冻切片4~8mm，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2。 下接免疫组化染色操作步骤。
石蜡切片步骤
石蜡切片基本步骤 （一）取材和固定 根据实验目的选择材料。将整个虫体或虫体的内部器官（如肠道、马氏管、唾液腺等）取出后，立即投入固定液。 取材大小：0.5cm×0.5 cm×0.2或者1.0 cm×1.0 cm×0.2，厚度不宜超过3mm。 固定液：2.5%的戊二醛固定液，Bouin氏液，10%甲醛等。 固定时间：4oC固定24小时。 注意事项： 取材：1．勿使组织块受挤压切取组织块所用刀、剪要锋利，切割时不可来回切割。夹取组织时，镊子要轻，切勿挤压，以免损伤组织。取材时，组织块可稍大一点，以便在固定后，将组织块的不平整部分修去。 2.选好组织块的切面应熟悉器官组织的组成，并根据观察目的来确定纵切或横切。 3．保持材料的清洁组织块上如有血液、污物、粘液、食物等，先用生理盐水冲洗干净，再入固定液。 4．切除（清除）不需要的部分特别是组织周围的脂肪等，应尽可能清除掉，以免影响以后的程序和观察。 固定：1．材料新鲜取出组织后须立即固定。否则时间相隔过久，体积就要收缩变形或发生自溶现象。 2．抽气生物组织常有气体的存在，使材料不能沉入固定液中，抽气使得固定液有效渗入。真空泵抽气或者用空针管抽气。昆虫整体固定，固定前用解剖针刺数个小孔，以利用固定液渗透。 3．固定剂用量一般为组织体积的10~20倍。勿使组织贴于瓶底或瓶壁，以免影响固定剂的渗入。 4．避免阳光尽可能避免接触阳光以免失去固定作用。 5．加速固定轻轻摇动盛器使组织移动有利于固定液渗入，对长期固定的标本可经常更换固定液。
（二）洗涤 2.5%戊二醛固定液固定的组织：0.2M, pH7.2磷酸缓冲液漂洗三次，每次10min Bouin氏固定液固定的组织：直接入70%酒精更换数次即可脱水，注意苦味酸。 甲醛固定的组织：直接投入50%或70%酒精脱水，不经水洗。但如果在甲醛中时间过长，则仍应当用流水冲洗。 陈旧性标本和混合性固定液应及时洗涤，有利于脱水、切片和染色。否则会影响以后的染色效果。 （三）脱水与透明 漂洗后即入酒精脱水，经50%，70%，80%，90%，95%，100%酒精脱水，其中95%，100%酒精需重复两次。每级10min。 脱水后，入1/3二甲苯+2/3乙醇混合液→1/2二甲苯+1/2乙醇混合液→2/3二甲苯+1/3乙醇混合液→二甲苯→二甲苯，每次约10min，至组织透明为止。 注意： 1. 一般经水洗的材料脱水可从35%开始，柔弱的材料从15%开始，若用酒精洗涤，则可直接移入50%或70%酒精中继续脱水。 2. 每级脱水时间，依照材料的大小、性质以及留在固定液中的时间长短和固定液的溶解性而定。动物组织每级10~30min。 3. 脱水应彻底，否则与二甲苯混合后混浊，必须倒回重脱水且效果不好；如需过夜，则停留在70%酒精中。 （四）透蜡 透明后，先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍3小时，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍6小时左右，直至用石蜡完全置换了组织块中的二甲苯，浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右（60°C）的温箱中进行，以利石蜡浸入组织内。便于今后的包理与切片。
HE石蜡切片
组织包埋步骤 一、 脱水 ① 95%乙醇 Ⅰ 30 min ② 95%乙醇 Ⅱ 30 ~ 40 min ③ 100%乙醇 Ⅰ 20 ~ 30 min ④ 100%乙醇 Ⅱ 20 ~ 30 min ⑤ 100%乙醇 Ⅲ 20 ~ 30 min ⑥ 二甲苯 Ⅰ 20 min ⑦ 二甲苯 Ⅱ 30 min 二、 浸蜡包埋 ⑧ 软蜡 30 min ⑨ 软蜡 30 min ⑩ 硬蜡 2 ~ 3 h （或过夜温度低2 ~ 3℃） ? 包埋蜡 切片石蜡58 ~ 60 ℃；脱水、浸蜡过程可在温箱中进行。
常规HE 染色步骤 ① 二甲苯 Ⅰ ② 二甲苯 Ⅱ ③ 95%乙醇 Ⅰ ④ 95%乙醇 Ⅱ ⑤ 80%乙醇 （可有可无） ⑥ 蒸馏水 （＜10 min ） ⑦ 苏木精染色 （10 ~ 15 min ） ⑧ 流水稍洗去苏木精液 (1 ~ 3 s 流水冲组织背面) ⑨ 1%盐酸乙醇 （1 ~ 3 s 分化上下移动 去蓝色） ⑩ 流水冲洗 （15 ~ 20 min 去盐酸） ? 蒸馏水过洗 （1min ） ? 0.5%伊红液染色 （1 ~ 3 min ） ? 95%乙醇 Ⅰ ? 95%乙醇 Ⅱ ? 95%乙醇 Ⅲ ? 100%乙醇 ? 100%乙醇 ? 二甲苯 Ⅰ （20 min ） ? 二甲苯 Ⅱ （20 min ） ? 二甲苯 Ⅲ （≥20 min ） 21 中性树胶封固 （将周围液体吸去 加光学树胶1滴 盖片）
伊红染液配法 ① 水溶性伊红0.5 g ，用最少量水（1 ~ 2 ml ）溶解后 ② 用冰醋酸滴加至完全沉淀（呈浆糊状） ③ 加95%酒精至100 ml 苏木素染液配法 ④ 苏木素1g ⑤ 100%乙醇10 ml ⑥ 钾明矾 20 g ⑦ 蒸馏水200 ml ⑧ 氧化汞0.5 g ——加热离火后（1 min ）缓慢少量沿杯加入氧化汞， 以免溢出伤人 1%盐酸乙醇（分色） ⑨ 盐酸1ml ⑩ 70%乙醇99ml 淡氨水—在400 ml 自来水中滴2滴 浓氨水—胞核蓝化