电转化方案
一、酵母菌电转化方案:
方案一。
1、负80度取出涂平板。30度培养二天。
2、取平板单菌落接种到10ml YPD培养基的50ml的三角瓶中30度过夜摇培
3、4度3000~4000rpm半分钟离心收获细胞。
4、用20ml TE/LioAC(0.1M/0.1M pH7.5)重悬细胞，并在30度摇床摇培45分钟
5、加0。5ml 1M DTT 再摇15分钟
6、加20ml双蒸水4度3500rpm离心半分钟
第一次沉淀用30ml冰冷的无菌水重悬
第二次沉淀用20ml冰冷的1M 的山梨醇重悬
第三次沉淀用1ml冰冷的1M 的山梨醇重悬
8、每40ul一个转化体系分装
9、转化条件1。5KV 20uF 200Ω 40ul yeast /reaction 100ng DNA/reaction<5ul
10、加150ul 1M山梨醇快速混合酵母和DNA，然后涂在选择培养基上。
方案二、
1、负80度取出涂平板。30度培养二天。
2、取平板单菌落接种到10ml YPSD（加SORBITOL）培养基的50ml的三角瓶中30度过夜摇培
3、4度3000~4000rpm半分钟离心收获细胞。
4、加20ml双蒸水4度3500rpm离心半分钟
5、第一次沉淀用30ml冰冷的无菌水重悬
第二次沉淀用20ml冰冷的1M 的山梨醇重悬
第三次沉淀用1ml冰冷的1M 的山梨醇重悬
6、每40ul一个转化体系分装
7、转化条件1。5KV 20uF 200Ω 40ul yeast /reaction 100ng DNA/reaction<5ul
8、加1000ul 1M山梨醇快速混合酵母和DNA，
9、30度温浴1~2小时，不能摇动。然后涂在选择培养基上。
二、怎么样选择电转仪（电转仪的功能与适用对象）
美国著名BTX是专业的细胞融合、电穿孔仪的生产厂家。自从1983年起，苛求的科研工作者就已经把BTX产品作为电融合、转基因等应用领域的首选仪器。除了占世界领导地位的电融合、转基因系统外，BTX的产品还包括多达25种相关的配件，其中有多种专业的电极，给用户更多的选择。
BTX还在网站建立了技术数据库，提供超过5000份的参考目录和600多份的protocols供科研工作者免费查阅。
1、ECM399转基因仪主要用于哺乳动物转染、细菌酶转化，具有脉冲长、磁场强为其特点。
应用举例
高压型用于：DNA或诱变等大肠杆菌结构转基因
低压型用于转染、淋巴、髓胶质成纤维和COS-7细胞
无论任何一种哺乳动物细胞均可选择不同的电压和脉冲范围，并且脉冲可随时调整
?细菌/酵母转化（系统：ECM399/630）
电穿孔现在被认作是转化细菌及酵母的最有效的方法。革兰氏阴性细菌（例如大肠杆菌）一般比革兰氏阳性细菌更容易转化，因为他们的细胞壁组成不同。对于革兰氏阴性细菌常常可以获得10的10次方转化2/微克DNA的转化效率，而对于革兰氏阳性细菌，一般可以得到10的6次方转化2/微克DNA。Chang等人（1997）成功对一个mtz-敏感的Heliobacter pylori菌株进行电穿孔以传递mtz抵抗性。Planelles等人（1999）使用电穿孔转化大肠杆菌，以避免使用包装物质。最近电穿孔仪器方面的进展将使研究人员能够进一步优化细菌转化（例如脉冲长度产生方面扩展的功能条件）。
RNA、DNA、蛋白质以及小分子都已经通过电穿孔的方法转入酵母。没有必要在电穿孔前部分去除酵母细胞壁，因为在完整酵母电穿孔方面的进展可以产生高的转化率。Faber等人（1994）年优化了S.Cerevisiae的实验方案，使用Hansenula Polymorpha获得了比以前的报告增加300倍的转化效率。
在质粒修复中，质粒从酵母转入大肠杆菌以进行详细的DNA序列分析，这是另外一种重要的技术。这种两个步骤的过程被电穿孔进行了简化，用于验证隐性基
因的结构，将其导入酵母，看基因性和表现性之间的关系。已经建立了标准的实验方案使用指数衰减波发生器例如BTX ECM630转化细菌/酵母。使用方形波电穿孔仪的实验方案，例如BTX ECM830，来转化细菌/酵母。研究人员还成功将大的质粒（BAC及YAC）导入细菌。电穿孔杯是细胞及酵母电穿孔的最常用附件，而Model747共轴电极使用则变得越来越普遍。
2、ECM630型是多才多艺型细胞转基因仪，适应于各类细胞
应用举例：
10-500V电压：适用于哺乳动物细胞，植物细胞
50-2500V电压：适用于细菌、酵母各种型号，均有多种脉冲选择
?细菌/酵母转化（系统：ECM399/630）
电穿孔现在被认作是转化细菌及酵母的最有效的方法。革兰氏阴性细菌（例如大肠杆菌）一般比革兰氏阳性细菌更容易转化，因为他们的细胞壁组成不同。对于革兰氏阴性细菌常常可以获得10的10次方转化2/微克DNA的转化效率，而对于革兰氏阳性细菌，一般可以得到10的6次方转化2/微克DNA。Chang等人（1997）成功对一个mtz-敏感的Heliobacter pylori菌株进行电穿孔以传递mtz抵抗性。Planelles等人（1999）使用电穿孔转化大肠杆菌，以避免使用包装物质。最近电穿孔仪器方面的进展将使研究人员能够进一步优化细菌转化（例如脉冲长度产生方面扩展的功能条件）。
RNA、DNA、蛋白质以及小分子都已经通过电穿孔的方法转入酵母。没有必要在电穿孔前部分去除酵母细胞壁，因为在完整酵母电穿孔方面的进展可以产生高的转化率。Faber等人（1994）年优化了S.Cerevisiae的实验方案，使用Hansenula Polymorpha获得了比以前的报告增加300倍的转化效率。
在质粒修复中，质粒从酵母转入大肠杆菌以进行详细的DNA序列分析，这是另外一种重要的技术。这种两个步骤的过程被电穿孔进行了简化，用于验证隐性基因的结构，将其导入酵母，看基因性和表现性之间的关系。已经建立了标准的实验方案使用指数衰减波发生器例如BTX ECM630转化细菌/酵母。使用方形波电穿孔仪的实验方案，例如BTX ECM830，来转化细菌/酵母。研究人员还成功将大的质粒（BAC及YAC）导入细菌。电穿孔杯是细胞及酵母电穿孔的最常用附件，而Model747共轴电极使用则变得越来越普遍。
?动物细胞转染（系统：ECM630/830）
对真核细胞的转染可以通过多种方法获得，例如磷酸钙沉淀、脂质体转染、病毒方法以及电穿孔。电穿孔已经被正式对传统的转染方法不灵的细胞有很好的效果，因此被选为最佳的分子传递系统。电穿孔的好处有可重复性、更高的效率、大量样本处理、无毒性以及容易使用（不需要孵育时间）。
Lofin等人（1999）对NIH/3T3细胞进行电穿孔使mRNA进入，以研究细胞周期及细胞分化过程中mRNA对基因表达调节、控制。Bodwell等人（1999）在对COS-7细胞进行电穿孔是使用较长的脉冲时间后获得了较高水平的表达。Warner 等人（1997）使用电穿孔方法成功转化了淋巴细胞。Incyte Genomics公司成功使用BTX电穿孔仪转染了ES细胞进行转基因小鼠的生产。BTX ECM399\630\830型仪器、电穿孔杯以及多种特用的电极都用于动物细胞转染用途。
?蛋白质电整合/电插入（系统：ECM630/830）
将蛋白质导入细胞以及将蛋白质插入至细胞膜中也可以通过电穿孔来实现。不光肽段，而且包括抗体的多种蛋白，也可以进行导入。Ushio-Fukai等人（1998）对电穿孔插入哺乳动物细胞中的外源蛋白进行了定量。对于这些用途可以使用多种BTX电极。
?植物细胞转化（系统：ECM630/830）
对植物原生质（玉米、烟草等）及完整植物的电穿孔可以用于产生对农业/园艺有用的转基因作物。植物细胞转化的一个主要目的是对植物细胞进行稳定转化以产生具有优良品质及产量增加的作物。Lin等人（1997）优化了多种植物上用于GUS表达的电穿孔条件，结果显示完整植物细胞以及原生质都可以进行有效转化。Diaz等人（1994）针对小麦及燕麦的叶和根的原生质进行了相似的优化试验，证明了电穿孔对于植物工作的有效性。这些作者也比较了电穿孔与PEG的差别，结果发现电穿孔更有效、更有重复性、更经济。BTX是世界上体内转染用特殊电极的领先者。对于这些用途可以使用多种BTX电极，例如2针阵列、游标尺电极、以及Tweezertrodes。
?贴壁细胞的转染----ACT （系统：ECM630/830）
除了对盛在普通样品杯的悬浮细胞进行电穿孔外，还可以对多种培养板上的贴壁细胞进行原位电穿孔。这样可以避免用胰酶消化细胞，有助于保持细胞的活性及
细胞数目。Lewis等人（1999）使用培养皿电极将基因转染入人类及静脉内皮细胞。Paptis等人（1998）通过对长在导电载玻片的NIH/3T3细胞进行原位电穿孔研究信号转导。Teruel等人（1999）也对位于载玻片上的海马神经细胞转入DNA、RNA以及多种大分子。BTX为贴壁细胞的转染（ACT）提供了PP35-2、366、747、840及Epizap电极系统。请关注不久后为这些用途开发的新产品
?高通量筛检----HTS （系统：ECM630/830）
高通量筛检及cDNA文库的建立，需要一次处理多个样本的能力。使用传统样品杯花费很大而且有时间限制。然而，96孔板里使用的电极对于这些类型的应用肯定有用。Hoffma-Tsay等人（1994）使用96孔共轴电极在植物融合实验中检测8种化学物质。Peterfy等人（1995）比较了多种类型的多孔电极，将DNA传递入COS-7细胞。Marrero等人（1997）使用多孔电极将抗体电导入血管平滑肌细胞，以诱导细胞增值。BTX目前提供747和840用于这样的用途，并且不断开发新的产品。
?大容量生产（LVP）及先体外后体内基因治疗（系统：ECM600F）
工业用大容量生产或者先体外后体内基因治疗也为社会所需。人们可以先在样品杯里优化条件然后将实验方案转成流水线作业，将实验进行比例放大。BTX ElectroFlowPorator系统有一个泵及一个改进了的电穿孔仪组成。泵可以进行编程并与电穿孔仪进行同步操作，以将脉冲传递多批的细胞。Parham等人(1999)使用流动性系统优化了CHO、COS-7、HEK293、NSO、CV-1细胞的短暂基因表达，，获得了满意的结果。
技术规格工作状况：
具有开机自检功能
接口：数字式用户接口
输入电压：110V/220V AC
充电时间：最长5秒
电压范围：10-500V低压工作模式/每次1V调进
50-2500V高压工作模式/每次调进5V
电容：1μF，25μF-3275μF低压工作模式每次25μF调进25μF，50μF高压工作
模式
电阻：25-1575W调进/每次25W调进（高压工作模式）
脉冲：低压工作模式>8300RC时间常数
高压工作模式>126RC时间常数
安全：抗短路保护最长延迟10秒
其它指标：电流量：低压工作模式限6000A
高压工作模式限3000A
物理参数：尺寸：12.5"×12.25" ×5.5"(W×D×H)
重量：10磅（4.5公斤）
显示：20×4位LCD液晶显示屏
控制器：旋转式电压选择钮按压式电源开关及乒乓式触发开关
监测：能监测电压峰值Vp及RC充放电时间常数
3、ECM 830系列产品在转基因的应用领域中得以广泛的应用，其无以伦比的高性能得到了全球同行的厚爱。
BTX的系列产品适用于动植物、细菌、酵母、哺乳动物、人类细胞（包括动物活体）的转基因等操作，
体内基因导入（IVGD）（系统：ECM830）
在动物活体内基因转移的非病毒技术中，直接将质粒DNA注射进入肌肉内是简单、廉价及安全的。Aihara及Miyazaki（1998）第一次指出通过在肌肉内将DNA 注射与电穿孔相结合，可以将表达增强100倍。
Mir等人（1999）使用多种类型的电极将基因传递进入多种种属的骨骼肌（大鼠、小鼠、兔、猴）。他们的结果显示通过使用电穿孔以及DNA注射：（1）基因转移的效率大大增加了，只是表达增强2-4倍；（2）不同实验之间的差别缩小了，而这正是单独DNA注射的主要缺点；（3）表达持续时间很长（数月），这对于长期临床应用非常重要；（4）不同种属的不同的肌肉都有阳性的反应，说明广泛的可用性；（5）基因表达非常特异仅在局部，而周围组织则没有影响到。这种技术成功用于其他组织，例如肝、睾丸、以及皮肤。
最近Vicat等人（1999）通过体内电穿孔仪将基因传递如小鼠脑组织。与被称为有力的脑组织基因转移的非病毒载体的pCMV-luc与PolyEthylenlmine联合的方
法相比，电穿孔的效率要高50倍。Nishi等人证明使用电穿孔可以获得有效的神经胶质瘤基因转移。Nishi还显示对实体瘤进行电基因治疗后肿瘤生长阻滞了50-90%。Dean等人将基因电导入完整的肠系膜动脉获得了成功。电穿孔已经被证实确实是进行体基因/药物转移方面一项有前途的技术，有许多新奇的用途。BTX公司特制的2针阵列电极、Genetrodes、卡钳电极、Tweezertrodes提供将基因侵入性以及侵入性转移入组织的方法。
卵内基因转移（IOGD）（系统：ECM830）
Muramatsu等人（1997）比较了3种转染方法用于将外源基因转入早期鸡胚进行表达。他发现与脂质体转染及基因枪相比，电穿孔是最有效的方法。Takeuchi 等人（1999）使用电穿孔技术将早期鸡胚转染了tbx5及tbx4基因，以确定肢芽的翅/腿标志。
对于这种用途已经开发出特用的电极。Genetrodes、L形状针电极，被用于测定鸡胚及靶向组织的特定区域。许多研究人员已经转染了眼、心或者肢体组织，方便了发育生物学方法的进一步研究。刚上市的足控开关具有遥控功能，是ECM830可以在不需要手操作的情况下进行激活，这对于卵内、体内以及体外胚胎用途非常重要。
体外胚胎基因转移（IVEGD）（系统：ECM830）
Tasaki等人（1999）讨论了使用电穿孔在体外小鼠胚胎方面的运用。小鼠胚胎有柱状的结构而且有比家禽更多胚胎培养基操作需求。有可能对胚胎进行电穿孔用于异位表达研究。在小鼠中后脑部的基因表达已经被观察。这个技术也用在交配后9.5天小鼠胚胎，以研究Hu基因在神经分化中的功能。BTX为这些目的提供一种全新的电极：Genepaddles。
技术规格
工作状况：具有开机自检功能
接口：数字式用户接口
输入电压：110V AC/220Hz
充电时间：最长5秒（无延时）
电压范围：5-500V低压工作模式连续可调/每次1V调进
20-3000V高压工作模式/每次5V调进
脉宽选择：10μs-999μs低压工作模式/1μs精度
1ms-999ms高压工作模式/1ms精度
1s-10s低压工作模式/0.1s精度
10μs-600μs高压工作模式/1μs精度
脉冲个数：1-99
脉冲间隔：100ms-10s
安全性：抗短路保护设计
其它指标：电容量：4000μF
电流量：10μs 500A
物理参数：尺寸：12.5"×12.25" ×5.5"(W×D×H)
重量：15磅（6.8公斤）
显示：20×4位LCD液晶显示屏
控制器：旋转式电压选择钮
按压式电源开关及乒乓式触发开关
串连接口：RS232和RS485
监测：能监测显示电压(V)时间(t)脉冲数(n)
4、ECM2001是一台万能的细胞操作仪器，它综合了电穿孔仪和电融合仪的特点，
ECM2001在细胞融合时，分三个阶段，预融合、融合、后融合阶段
ECM2001在预融合时可产生一种独特的高频交流波，交流波将细胞排列成双体或株琏，以便融合的进行，提高了融合的效率。
融合阶段：交流波和直流波的转换之间设有微秒开关，能在极短时间内从交流电转成直流电。在方波长电波的作用下，使细胞高效融合，
融合完成后，ECM2001立即产生了低电压的交流波可使已初步融合的细胞更完美的聚集在一起，完成细胞圆体程序。
当转基因向导流需要较高的电压和较长的脉冲时，直流方波长脉冲可单独使用，完成转基因。
应用举例
?胚胎操作/核移植/动物克隆（系统：ECM2001/830）
核移植是将细胞核从供体转入受体的过程。细胞核指导胚胎的发育，导致新生体安全出生。在这个过程中，电融合用于将供体细胞与受体卵细胞融合，并进一步激活细胞分裂，形成胚胎。Meng等人（1997）将核移植技术扩展至灵长类动物模型，克隆出恒河猴。技术的进步使研究人员能够从分裂球进展至更高分化的胚胎细胞以及静止的胚儿细胞，作为核的供应来源。胚胎产生的细胞在体外培养6-13代，然后在转入前使用血清饥饿的方法使细胞静止。如前文所述，Roble、Cibelli以及Stice是第一次在1998年报告使用非老化胚成纤维细胞作为核的供体进行核移植而产生绵羊克隆转基因牛的人。Ian Wilmut在1996年震惊了整个世界，他从成年乳腺的细胞产生出第一个动物克隆——多利。使用分化的成年细胞进行克隆的能力打开了核移植广泛运用的大门即基因治疗的令人激动的模式。最近的成功事例PPL Therapeutics公司从成年体细胞克隆出猪。对于这些用途可以使用多种细胞融合样品池及微型载玻片。
?动物细胞融合（系统：ECM2001）
肿瘤及树突的电融合目前在过继性免疫疗法中进行使用。肿瘤细胞本身不能作为良好的抗原提成细胞，因此不会刺激T细胞生长。树突细胞是已经发现的最好的抗原提呈细胞，在融合后可以将肿瘤细胞转变成抗原提呈细胞。刺激后比未融合肿瘤细胞至少增加100倍。对于这些用途可以使用多种细胞融合附件及微型载玻片。
?杂交瘤/细胞杂交瘤技术（系统：ECM2001）
在过去十年中，使用电融合技术进行杂交瘤的产生及抗体大大增加。电融合的过程可以通过显微镜进行观察，与PEG相比需要的细胞数量较少。使用电融合用于这种用途还有无毒性及高效性的优点。
Panova等人（1995）通过把人类B细胞与Heteromyeloma、Spam-8细胞进行电融合增强了人类杂交瘤的生成。Kreutz等人（1998）引入了一种使用电融合及FACS分选的新方法产生细胞杂交瘤。Cao等人（1995）建立了另一种快速非选择性方法通过电融合产生人类细胞杂交瘤。数据明确支持电融合用于这种重要目的的有效性。对于这些用途可以使用多种细胞融合附件及微型载玻片。
植物原生质的融合（系统：ECM2001）
电融合可被用于融合植物原生质以产生杂交体及创造具有所需特性的作物。
Hofmann-Tsay等人（1994）试验了可以的融合促进物质，发现一些多聚物可以便利融合过程而不影响细胞新生。Chen等人（1995）将原生质从2种种属的Porphyria进行融合，成功率高达85%。这些鼓舞人心的数据提示电融合与传统的PEG融合方法相比，可以改善融合效率以及可重复性。对于这些用途可以使用多种细胞融合附件及微型载玻片。
5、BTX Electro Flow Porator T9000,与电穿孔系统一起使用，用于对大容量的细胞进行转化/转染。T9000是市场上可购到的唯一一个大容量电穿孔系统
BTX Electro Flow Porator T9000,与电穿孔系统一起使用，用于对大容量的细胞进行转化/转染。T9000是市场上可购到的唯一一个大容量电穿孔系统。这个系统可以于指数衰减脉冲发生器一起使用。
Electro Flow Porator包括带I/O接口一个蠕动泵、一个安全座台、五个无菌镀金流通室箱及管道。
T9000可以用于在一个电穿孔杯中使用一个小的容量，再对电穿孔参数进行优化后对大容量的细胞进行电穿孔。一旦确定理想的电场强度及脉冲长度，试验可以很容易地应用Electro Flow Porator进行比例放大。蠕动泵可以按照电穿孔参数编程，设定流速和脉冲时间。
毕赤酵母化学转化
（化学转化） 如果没有电转仪，LiCl转化是一种可供选择的方法，转化率是102到103cfu/ug。 主要过程为： 取过夜活化培养的菌液按1：1000接种于15ml新鲜的YPD液体培养基，30℃培养至OD600达到0.8-1.0；4℃，4500rpm离心5分钟，用8ml冰预冷的无菌水洗涤菌体，倾除洗涤液，用1mL ，4℃，4500rpm离心5分钟，沉淀用50μl冰预冷的100mmol/L LiCl悬浮，最后定容至80-90ml。 LiCl转化取适量单链鲑精DNA（2mg/mL）煮沸5min，立即置于冰上备用，取上述制备好的感受态细胞12 000rpm，离心15s，吸弃LiCl溶液，按顺序依次加入 50%PEG 240ml 1mmol/L LiCl 36 ml 单链鲑精DNA 25ml 线性化质粒DNA 10 ml (约10mg) 用吸头反复吹打，使细胞沉淀与加入的溶液混匀，30℃静置温育30min，42℃热击20-25min，4500rpm离心10min，吸弃转化液，细胞沉淀加1ml YPD培养基于30℃200 rpm培养2-4hr，取转化混合液100ml涂布含100μg/mL ZeocinTM 的YPDS平板，30℃培养2-3天。 LiCl 转化方法 作为电转化的替代方法，在线性化DNA条件下，转化效率介于102~103cfu/ug 之间 溶液： 1M LiCl 用无离子水溶解，过滤除菌。（稀释使用无菌水。） 50% PEG 3350 无离子水溶解，过滤除菌，密封保存 2mg/ml变性的鲑精DNA片段（10mM Tris-HCl，pH 8.0,10mM EDTA）-20℃保存。 准备感受态细胞： 1.在50ml YPD中，培养至OD600 在0.8~1.0之间（大约108个/ml）。 2.收集细胞，用25ml无菌水洗涤，1500g室温离心10min。 3.重悬细胞于1ml 体积的100mMLiCl中，将悬液转移至1.5ml离心管中。 4.使用最大转速离心15s，吸去LiCl上清。 5.重悬细胞于400ul体积的100mMLiCl中。 6.每个转化组取50ul细胞悬液置于1.5ml离心管中，立即使用。勿要存于冰上或冻存于 -20℃。 转化： 1.取1ml单链DNA鲑鱼精标准煮沸5min，后快速于冰上降温并存于冰上。注意：不需要 也不推荐在每次使用前煮沸载体DNA。分装冻存于-20℃，并且每使用3-4次后再次煮沸更加适宜。 2.离心上面步骤6的细胞，吸去残留的LiCl。 3.每次转化都要向细胞中顺次加入下列试剂。PEG可以保护细胞不会因高浓度的LiCl而受 到损伤。 I.240 ul50% PEG 3350 II.36 ul 1M LiCl III.25 ul 2mg/ml 单链鲑鱼精DNA IV.质粒DNA（5~10ul）溶于50ul无菌水中。
2021年毕赤酵母表达系统资料整理
毕赤酵母表达系统 欧阳光明（2021.03.07） Mut+和Muts 毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶——AOX1及AOX2，细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物，甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长(去抑制)时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。在YPD(酵母膏、蛋白胨、葡萄糖)培养基中，不论是Mut+还是Muts其在对数期增殖一倍的时间大约为2h。Mut+和Muts菌株在没有甲醇存在的情况下生长速率是一样的，存在甲醇的情况下，Mut+在对数期增殖一倍的时间大约为4至6个小时，Muts在对数期增殖一倍的时间大约为18个小时。
菌株GS115、X-33、KM71和SMD1168的区别 GS115、KM71和SMD1168等是用于表达外源蛋白的毕赤酵母受体菌，与酿酒酵母相比，毕赤酵母不会使蛋白过糖基化，糖基化后有利于蛋白的溶解或形成正确的折叠结构。GS115、KM71、SMD1168在组氨酸脱氢酶位点(His4)有突变，是组氨酸缺陷型，如果表达载体上携带有组氨酸基因，可补偿宿主菌的组氨酸缺陷，因此可以在不含组氨酸的培养基上筛选转化子。这些受体菌自发突变为组氨酸野生型的概率一般低于10-8。GS115表型为Mut+，重组表达载体转化GS115后，长出的转化子可能是Mut+，也可能是Muts(载体取代AXO1基因)，可以在MM和MD培养基上鉴定表型。SMD1168和GS115类似，但SMD1168基因组中的Pep4基因发生突变，是蛋白酶缺陷型，可降低蛋白酶对外源蛋白的降解作用。 其中X-33由于是野生型，因此耐受性比较好，如果担心转化率的话可以考虑这种酵母菌，而X33与GS115一样都是属于MUT＋表现型，也就是说可以在含甲醇的培养基中快速生长，但是据说会对外源基因表达有影响， KM71的亲本菌在精氨酸琥珀酸裂解酶基因(arg4)有突变，在不含精氨酸的培养基中不能生长。用野生型ARG4基因(约2kb)插入到克隆的野生型AOX1基因的BamHI(AOX1基因15/16密码子)及SalI(AOX1基因227/228密码子)位点，取代了AOX1基因16-227密码子，此结构转化至KM71亲本菌(arg4his4)中，分离产生KM71
GS115毕赤酵母PEG感受态细胞
https://www.wendangku.net/doc/cb1398515.html, GS115 毕赤酵母PEG感受态细胞 组成规格： 货号名称规格数量 GT2504 GS115酵母感受态细胞50ul 20支 GT2505 GS115酵母感受态细胞50ul 50支 GT2506 GS115酵母感受态细胞50ul 100支 为了满足广大科研工作者对大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母和农杆菌等菌种感受态细胞的需求，华越洋现推出各种系列的感受态细胞供大家选择。 毕赤酵母感受态细胞试剂盒 1 介绍 本试剂盒包括酵母感受态细胞、Solution 1和Solution 2。其中酵母感受态细胞是用于转化的细胞，需-70度低温保存；Solution 1和Solution2为转化时使用的试剂，均为无菌，需-20度保存，使用时解冻即可。本酵母感受态细胞采用专利技术制备的感受态，有别于传统山梨醇制备的感受态细胞，并配有Solution 1和Solution 2，可直接用于热击法转化，而不需要使用电转仪和电击杯。本方法是电击法的替代方法，也避免了LiCl方法需要现制备感受细胞的繁琐。转化效率可以达到102-103cfu/ug线性化DNA，经本公司反复验证-80保存6个月不影响转化效率。 2 转化步骤 2.1 线性化质粒片段的制备 取过夜培养的质粒菌种3ml,使用质粒抽提试剂盒抽提质粒，最后溶解于50ul的TE或水中。将所有的质粒片段在200μl的体系中酶切线性化。用酚氯仿试剂去除蛋白并且浓度片段至20ul体系中（保证有100μg的质粒片段）。 2.2 转化 2.2.1直接加于冻结的酵母细胞中，以获得最大转化率；（注意加入至冻结的细胞中，而不是解冻的细胞中）； 2.2.2. 加入后迅速放入37℃水浴孵育5min，中间混合样品1～2次； 2.2. 3. 取出离心管，加入1.5ml Solution 1，彻底混匀；(注意可以弹或移液器轻轻混合，不可用移液器剧烈来回混合也不可用涡旋振荡器) ； 2.2.4. 30℃水浴孵育1h； 2.2.5. 室温下2000g离心10min，去除上清液，菌体沉淀重悬于1.5ml Solution 2中； 2.2.6. 离心样品，去除上清液，轻微操作将样品重悬于0.2ml Solution 2中； 2.2.7. 将所有转化液铺于选择性平板（例如MD板），于30℃孵育3～4天后，鉴定；
毕赤酵母感受态制作及转化
毕赤酵母感受态细胞制作 1、GS115活化：100ml三角瓶中装入20ml YPD培养基，接种100ul菌保，过夜活化。 2、转接：500ml三角瓶中装入100ml YPD培养基，取1ml活化菌液接种到100ml YPD培养基中，培养至OD约为1.3-1.5。 3、收菌：将菌放置冰上15min，或者放于4°冰箱冷却。一般100ml菌液可以制备4份感受态细胞。将无菌水和过滤除菌的山梨醇（1M）提前置于4°冰箱冷却。 4、用100ml离心管收集菌体，4000rpm/min离心5min去除YPD培养基。 5、用20ml预冷的无菌水洗菌体，4000rpm/min离心5min，重复一次。 6、用20ml预冷的山梨醇洗菌体，4000rpm/min离心5min。 7、每个离心管中加入3ml预冷的山梨醇，重悬菌体。 7、将菌体分装至1.5ml灭菌离心管中，分装4管，4000rpm/min离心5min，弃上清。 8、每管加入80ul预冷山梨醇，重悬菌体，置于冰上待用或加入10%DMSO保存于-80冰箱。 毕赤酵母电击法转化 1、将感受态细胞在冰上融化，电转杯和山梨醇在冰上预冷。 2、将80ul感受态细胞与5-10ug线性化质粒混合，转移至0.2cm电转杯中，置于冰上5min。 3、根据电转仪选择合适的程序，进行电击。 4、电击后立即加入500ul预冷的山梨醇，将电击杯中液体全部转移至无菌的1.5ml离心管中，30℃水浴2h。 5、将菌体低转速离心5min，吸出多余上清，留100ul涂板即可。 6、将菌液均匀涂布于His缺陷型培养基，30℃培养1-2天。 要准备灭菌的有：水，1M山梨醇，滤器，大离心管，1.5ml离心管，大小枪头，所有的离心都是低温离心。
[VIP专享]毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选
毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选 菌体的准备： 1. 挑取酵母单菌落，接种至含有5ml YPD 培养基的50ml 三角瓶中，30℃、250-300r/min 培养过夜； 2. 取100-500μl （≤1:100）的培养物接种至含有50ml 新鲜培养基的200mL三角摇瓶中，28~30℃、250-300r/min培养过夜(约20h)，至OD600 达到1.3~1.5； 3. 将细胞培养物于4℃，1500g 离心5min，用50ml 的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬； 4. 按步骤3 离心，用25ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬 5. 按步骤3 离心，用2-5ml，1M的冰预冷山梨醇溶液将菌体沉淀重悬； 6. 按步骤3 离心，用160μl的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为240 ul； 备注：可将其分装为80 μl 一份的包装-70冷冻起来，2周之内使用，但会影响其转化效率。 比如常见的pPIC9K的载体转GS115一般先用MD平板初筛，然后长出的克隆子可以挑到不同浓度的含G418抗性的YPD平板上筛选高拷贝。对正确筛选出的单菌落接YPD小瓶摇活后，转大瓶BMGY摇瓶发酵。一般对于甲醇诱导菌株，摇瓶一天左右后开始补加甲醇，就类似BMMY的功能了。 ?KM71比GS115生长的要慢。毕赤酵母都应该是白色菌落的 ?对于LOX家族蛋白的表达，可尝试在酵母培养基中加入Cu2+ 离子，提高表达量和蛋白活性? 菌种保存： 挑单克隆到YPD中培养18-24h,然后取菌液以1:1加入30%灭菌甘油， -80o C ul/管冻存 （一般用10ug以上质粒用SalI酶切，然后直接加乙醇沉淀，70％乙醇洗一遍，约20ul ddH2O重溶。转化效率一般大于100个克隆每ugDNA。建议你不要用胶回收kit，回收的DNA可能还有盐，导致电击时放电时间很短。 乙醇沉淀主要步骤如下： 1）酶切体系（80ul）中2倍体积的无水乙醇加1/10体积的PH5.2 NaAC，混匀 2)-20℃ 20分钟沉淀 3)13200rpm，20min，离心后弃上清 4)75%乙醇300ul轻轻洗，同上离心5min，弃上清 5)37 度烘箱至无乙醇气味（或是用摇床的出风口吹出的暖风吹）。 6)20ul ddH2O重溶） 电击转化： 8. 将5~20 μ g 的线性化DNA 溶解在5~10 μ l TE溶液中，与80 μ l 的上述步骤6 所得的菌体混匀，转至0.2cm 冰预冷的电转化杯中； 9. 将电转化杯冰浴5min； 10. 根据电转化仪提供的资料，参考其他文献及多次摸索，确定合适的电压、电流、电容等参数，按优化的参数，进行电击； 11. 电击完毕后，马上加入1ml 1M的冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5ml 的EP 管中；（置于30度摇床低速培养1h，再涂板） 12. 将菌体悬液涂布于MD平板上，每200~600 μ l 涂布一块平板； 13. 将平板置于30℃倒置培养，直至单个菌落出现（3-4天）。
毕赤酵母实验操作手册
毕赤酵母表达实验手册 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。 与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、繁殖快、易于工业化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵体变性、复性等等间题［1］。 与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力，人们对酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）分子遗传学方面的认识最早，酿酒酵母也最先作为外源基因表达的酵母宿主．1981年
毕赤酵母表达系统使用心得
Pichia酵母表达系统使用心得 甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会遇到这样那样的问题，收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。 + 表示优胜于；- 表示不如；= 表示差不多 EasySelect Pichia Expression System 产品性能： 优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化 缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题
全面产品报告及心得体会： 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris ）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。 毕赤酵母表达载体pPICZ 在多克隆位点（MCR ）3'端带有his-tag 和c-myc epitopes ，这些tag 有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor （α-factor ）用以增加表达，并且在表达后α-factor 可以自动被切除。在进行克隆的时候，如果你选择的是EcoRI ，那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。另外pPICZ 系列选用的是Zeocin 抗生素作为筛选标记，而诱导表达的载体需要甲醇——甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG 便宜。 第一步——构建载体 Xiang Yang ：pPICZ 系列有许多克隆位点可供选择，同时也有三种读码框以便不用的用户需要。 红叶山庄：有关是选择pPIC9K 还是pPICZ 系列？pPIC9K 属于穿梭质粒，也可以在原核表达，而pPICZ 系列比较容易操作，大肠和毕赤酵母均用 抗Zeocin 筛选（PIC9K 操作麻烦一点，大肠用amp 抗性，而毕赤酵母先用His 缺陷筛选阳性克隆，在利用G418筛选多拷贝），而且对于大小合适（30—50KD ）的蛋白在产量上是pPIC9K 无法比拟的。 leslie ：要做毕赤酵母表达实验，首先当然就要了解这个可爱的酵母了（椭圆形，肥嘟嘟的，十分可爱），她和大肠杆菌长得有较大区别（大肠杆菌是杆状的），因此在培养的过程中要区别这两种菌体，除了气味，浓度，颜色以外，也可以取样到显微镜中观测。大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧，表达过程中染菌（我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌，那真是一段可怕的经历），如果在不知情的情况下继续做下去，那可以就是浪费大把的时间了。 基本熟悉了毕赤酵母，了解了她生长的喜好（多糖偏酸环境），生长的周期等等情况后，当然更多的精力还是应该花在表达的目的蛋白上，我的表达蛋白有些恐怖，有100KD ，本来当然应该放在大肠杆菌中表达，但是为了分泌表达（其实后来发现大肠杆菌pET 系列分泌表达系列也不错）和糖基化修饰（主要是这个方面，因为我的蛋白是人源的，表达出来用于酵母双杂，因此需要有完备的糖基化修饰）。这样我的DNA 片段由于较长，所以在做克隆的时候也要非常小心，需要注意的是： ①酶切位点不能出现在目的DNA 片段中——如果片段长无法避免，可以采用平末端连接； ②虽然α-factor 可以自动切除，但是在设计表达的时候，如果在N 端不能出现任何多余的aa （比如药物蛋白表达），需要特别留意（说明书上有详细说明：P13）； ③有三种不同的读码框（对于pPICZα系列来说就是对上α-factor 序列），在设计克隆的时候要反复确定自己的读码框是否正确，这可是致命的问题； ④无论pPICZ 还是pPICZα都有TGA （终止密码子），但是pPICZ 系列没有ATG （起始密码子），有人认为酵母启动
毕赤酵母常用培养基与载体
毕赤酵母常用培养基与载体 一、毕赤酵母表达常用载体： 典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的启动子和转录终止子（5'AOX1和3'AOX1），它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基因可以在此插入。此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4）选择标记及3'AOX1区。当整合型载体转化受体时，它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号—α交配因子(α-factor)引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌。分泌表达载体主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα A，pYAM75P等。胞内表达载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。工程菌株Y11430，MG1003，GS115 （AOX1），KM71，SMD1168。毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点彼ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。多拷贝表达菌株的获得方式：与自主复制的质粒型表达载体不同，整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。多拷贝表达菌株的获得方式有两种：一种是利用SDS-PAGE 电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。得到产量高的表达菌株。另一种在转化前将多个表达盒拷贝插入到单个载体中，而后再通过交换整合到受体染色体上。表达蛋白纯化方法：酵母系统表达的蛋白一般都具有活性，所以都采用较温和的纯化方式来纯化目的蛋白，分泌型表达的蛋白有利于纯化，可用硫酸铵沉淀，然后用离子交换，凝胶过滤层析，疏水层析等方法进一步纯化。具体的方法和操作应按所处理的目的蛋白的性质选择。 二．毕赤酵母表达的培养基配制和用途 2.1 LB（Luria－Bertani）培养基： Trypton l％ Yeast Extract 0.5％ NaCl l％ PH 7.0 制作平板时加入 2％琼脂粉。121℃高压灭菌 20min。可于室温保存。用于培养pPICZ αA原核宿主菌TOP10F’时可加入Zeocin 25ug / ml。 2.2 LLB（Low Salt LB）培养基： Trypton l％ Yeast Extract 0.5％
毕赤酵母表达手册
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毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白 综述： 基本特征： 作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。 与酿酒酵母相似技术： 许多技术可以通用： 互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。 毕赤酵母是甲醇营养型酵母： 毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。 两种醇氧化酶蛋白： 毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1及AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物。甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。 表达： AOX1基因的表达在转录水平受调控。在甲醇中生长的细胞大约有5%的polyA+ RNA 来自AOX1基因。AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长（去抑制）时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。 AOX1突变表型： 缺失AOX1基因，会丧失大部分的醇氧化酶活性，产生一种表型为Muts的突变株（methanol utilization slow），过去称为Mut，而Muts可更精确地描述突变子的表型。结果细胞代谢甲醇的能力下降，因而在甲醇培养基中生长缓慢。Mut+（methanol utilization plus）指利用甲醇为唯一碳源的野生型菌株。这两种表型用来检测外源基因在毕赤酵母转化子中的整合方式。 蛋白胞内及分泌表达： 外源蛋白可在毕赤酵母胞内表达或分泌至胞外。分泌表达需要蛋白上的信号肽序列，将外源蛋白靶向分泌通路。几种不同的分泌信号序列已被成功应用，包括几种外源蛋白本身分 制作者：陈苗商汉桥
毕赤酵母表达操作手册(精译版)
毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白 综述： 基本特征： 作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。 与酿酒酵母相似技术： 许多技术可以通用： 互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。 毕赤酵母是甲醇营养型酵母： 毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。 两种醇氧化酶蛋白： 毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1及AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物。甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。 表达： AOX1基因的表达在转录水平受调控。在甲醇中生长的细胞大约有5%的polyA+ RNA 来自AOX1基因。AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长（去抑制）时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。 AOX1突变表型： 缺失AOX1基因，会丧失大部分的醇氧化酶活性，产生一种表型为Muts的突变株（methanol utilization slow），过去称为Mut，而Muts可更精确地描述突变子的表型。结果细胞代谢甲醇的能力下降，因而在甲醇培养基中生长缓慢。Mut+（methanol utilization plus）指利用甲醇为唯一碳源的野生型菌株。这两种表型用来检测外源基因在毕赤酵母转化子中的整合方式。 蛋白胞内及分泌表达： 外源蛋白可在毕赤酵母胞内表达或分泌至胞外。分泌表达需要蛋白上的信号肽序列，将外源蛋白靶向分泌通路。几种不同的分泌信号序列已被成功应用，包括几种外源蛋白本身分
2020年毕赤酵母表达系统资料整理
作者：非成败 作品编号：92032155GZ5702241547853215475102 时间：2020.12.13 毕赤酵母表达系统 Mut+和Muts 毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶——AOX1及AOX2，细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物，甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长(去抑制)时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。在YPD(酵母膏、蛋白胨、葡萄糖)培养基中，不论是Mut+还是Muts其在对数期增殖一倍的时间大约为2h。Mut+和Muts菌株在没有甲醇存在的情况下生长速率是一样的，存在甲醇的情况下，Mut+在对数期增殖一倍的时间大约为4至6个小时，Muts在对数期增殖一倍的时间大约为18个小时。 菌株GS115、X-33、KM71和SMD1168的区别 GS115、KM71和SMD1168等是用于表达外源蛋白的毕赤酵母受体菌，与酿酒酵母相比，毕赤酵母不会使蛋白过糖基化，糖基化后有利于蛋白的溶解或形成正确的折叠结构。GS115、KM71、SMD1168在组氨酸脱氢酶位点(His4)有突变，是组氨酸缺陷型，如果表达载体上携带有组氨酸基因，可补偿宿主菌的组氨酸缺陷，因此可以在不含组氨酸的培养基上筛选转化子。这些受体菌自发突变为组氨酸野生型的概率一般低于10-8。GS115表型为Mut+，重组表达载体转化GS115后，长出的转化子可能是Mut+，也可能是Muts(载体取代AXO1基因)，可以在MM和MD培养基上鉴定表型。SMD1168和GS115类似，但SMD1168基因组中的Pep4基因发生突变，是蛋白酶缺陷型，可降低蛋白酶对外源蛋白的降解作用。 其中X-33由于是野生型，因此耐受性比较好，如果担心转化率的话可以考虑这种酵母菌，而X33与GS115一样都是属于MUT＋表现型，也就是说可以在含甲醇的培养基中快速生长，但是据说会对外源基因表达有影响， KM71的亲本菌在精氨酸琥珀酸裂解酶基因(arg4)有突变，在不含精氨酸的培养基中不能生长。用野生型ARG4基因(约2kb)插入到克隆的野生型AOX1基因的BamHI(AOX1基因15/16密码子)及SalI(AOX1基因227/228密码子)位点，取代了AOX1基因16-227密码子，此结构转化至KM71亲本菌(arg4his4)中，分离产生KM71 MutsArg+His-菌株，Arg+转化子遗传分析显示野生型AOX1被aox1::ARG4结构所取代，所以KM71所有转化子都是Muts 表型。AOX1位点没有被完全缺失，理论上可用你的目的结构通过基因取代方法替换
常用试剂培养基 毕赤酵母实验技术
主要培养基： 10×YNB（13.4%酵母氮源，含硫酸铵不含氨基酸）： 溶解13.4gYNB于100mL水中，过滤除菌，加热至YNB完全溶解，存于4℃。500×B（0.02%生物素）： 溶解20mg生物素于100mL 水中，过滤除菌，放于4℃。 100×AA（0.5%各种氨基酸）： 溶解各50mg L-谷氨酸，L-蛋氨酸，L-赖氨酸，L-亮氨酸，L-异亮氨酸于100mL 水中，过滤除菌，存于4℃。 10×D（20%葡萄糖）： 溶解200g D-葡萄糖于1 000mL水中，高压灭菌15min或过滤除菌，可放1年。 500×生物素(0.02%)： 溶解20mg生物素于100mL水中，过滤除菌，放于4℃，可放1年。 100×H（0.4%组氨酸）： 溶解400mg L-组氨酸于100mL水中，低于50 度加热以促溶解，过滤除菌，可放1年。 10×M（5%甲醇）： 混合5mL甲醇与95mL水，过滤除菌存于4℃，可放2个月。 10×GY（10%甘油）： 混合100mL甘油与900mL 水，过滤或高压灭菌，室温放置，可存放1年以上。 100×AA（0.5%各种氨基酸）： 溶解各50mg L-谷氨酸，L-蛋氨酸，L-赖氨酸，L-亮氨酸，L-异亮氨酸于100mL 水中，过滤除菌，存于4℃，可放1年。 1mol/L磷酸钾缓冲液pH6.0： 32mL 1mol/L K2HPO4，868mL 1mol/L KH2PO4，调整pH值为6.0±0.1（如果需调pH值，用磷酸或KOH）。过滤或高压灭菌，室温下可放1年以上。100mg/mL遗传霉素： 用无菌水制备30mL 100mg/mL 遗传霉素贮存液，过滤除菌，存于-20℃。 用来制备含不同终浓度遗传霉素平板：0.25，0.5，0.75，1.0，1.5，1.75， 2.0， 3.0， 4.0。LB培养基： 5%酵母提取物，10%胰蛋白陈，10%NaCI，pH7.0；高压灭菌后4℃保存。LB平板培养基 在LB液体培养基中加入琼脂粉15g，高压灭菌，冷却至45℃左右时倒平皿，4℃保存。 LA平板培养基 待LB液体培养基冷却至45℃左右加入Amp (100μg/mL)，摇匀后倒平皿，4℃保存。 YPD培养基： 1%酵母提取物，2%胰蛋白膝，2%葡萄糖； RDB 转化固体培养基：(Regeneration Dextrose Medium+ Histidine) （lmol/L山梨醇，l%葡萄糖，1.34% Yeast Nitrogen Base with Ammonium Sulfate with amino acids(YNB)，0.00004%Biotin，0.005%谷氨酸，0.005%甲硫氨酸，0.005%赖氨酸，0.005%亮氨酸，0.005%异亮氨酸，1.5%琼脂；） 100mL：超纯水80ml，山梨醇18g(186g/L)，琼脂糖2g（20g/L） 121℃灭菌20分钟，待温度将至60℃以后，在超净台内加入10*YNB 10ml, 10*D（20%葡萄糖）10ml, 500*B（0.02%生物素）0.2ml 100*AA（含每种氨基酸0.5%）1ml.混匀，倒平板。 YPD-遗传霉素平板： 1%酵母浸出物，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%不同量的遗传霉素4.0，250mL （8-10个遗传霉素平板）。取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液或PBS中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒，4度保存。具体方法如下：1g包装的G418瓶子中，加入10ml HEPES溶液，浓度为100 mg/ml完全溶解后，0.22 um过滤，－20度保存。HEPES缓冲液配方如下：90 ml 水中，0.8 g NaCl, 0.037 g KCl, 0.0135 g Na2HPO4.2H2O, 0.1 g 葡萄糖，0.5 g HEPES,溶解，NaOH调PH至7.05, 定容至100ml。 0.50mg/ml，0.75mg/ml，1.0mg/ml，2.0mg/ml，4.0mg/ml五个梯度 MD： 选择培养基：(Minimal Dextrose Medium+ Histidine) （1.34%YNB， 0.00004%Biotin，2%葡萄糖，1.5%琼脂；）
毕赤酵母LiCl 转化方法
实验概要 本文介绍了毕赤酵母LiCl 转化方法。该程序是电转化的替代方法。转化效率为102-103cfu/ug线性化DNA。 实验原理 主要试剂 溶液准备：不能用醋酸锂，一定要用氯化锂 1. 用无菌去离子蒸馏水配制1M LiCl，过滤除菌，用无菌水稀释 2. 用无菌去离子蒸馏水配制50%PEG(3350)，过滤除菌，存于盖紧的瓶中 3. 用TE(10mM Tris-HCl pH8.0，1.0mM EDTA)溶解2mg/ml 变性断裂鲑鱼精DNA，存于-20度 主要设备 实验材料 实验步骤 1. 细胞准备： 1) 在50mlYPD 中培养毕赤酵母至OD600＝0.8-1.0(约108个/ml)。 2) 收集细胞，用25ml灭菌水洗涤，室温1500g离心10min。 3) 去除水，用1ml 100mM LiCl 重悬细胞。 4) 将细胞悬液转至1.5ml 离心管中。 5) 最大转速沉淀细胞15s，用吸头吸去LiCl。 6) 在400ul 100mM LiCl中悬浮细胞。 7) 将50ul细胞悬浮液移到1.5ml离心管中，每次用一管，现做现用，不要置于冰上或-20度保存。 2. 转化： 1) 煮沸单链DNA 5min，快速放于冰水中使变冷，后置于冰上。 注意：载体DNA不需要在每次用之前都煮，在-20 度保存等份少量样品，每次解冻一管，用3-4 次后再煮。 2) 取上面第7步中细胞，离心去除LiCl。 3) 每个转化样品，按顺序加入下列试剂，PEG 可保护细胞免受高浓度LiCl的有害作用240ul 50%PEG，36ul 1M LiCl，25ul 2mg/ml 单链DNA，溶解于50ul灭菌水中的质粒DNA(5-10ug)。 4) 剧烈涡旋细胞沉淀至完全混匀(1min)。 5) 在30 度孵育30min(不要摇动)。 6) 在42 度水浴热击20-25min。 7) 6000-8000rpm离心，将转化溶液转移走。 8) 用1ml 灭菌水重悬细胞沉淀。
毕赤酵母表达经验总结
毕赤酵母表达经验总结 甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会遇到这样那样的问题，生物通编者特地收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。 甲基酵母部分优点与其他真核表达系统比较与原核表达系统比较 1.属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的表达优点-+ 2.AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，可以达到每升数克表达产物的水平++++ 3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，远较真核系统简单，非常适合大规模工业化生产。+++= 4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化。=+ 5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母更可以甲醇等工业产物替代葡萄糖作为碳源，生产成本低++++ + 表示优胜于；- 表示不如；= 表示差不多 EasySelect Pichia Expression System 产品性能： 优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化 缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题 全面产品报告及心得体会： 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。 毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以增加表达，并且在表达后α-factor 可以自动被切除。在进行克隆的时候，如果你选择的是EcoRI，那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列选用的是Zeocin抗生素作为筛选标记，而诱导表达的载体需要甲醇——甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG便宜。 第一步——构建载体 Xiang Yang：pPICZ系列有许多克隆位点可供选择，同时也有三种读码框以便不用的用户需要。 红叶山庄：有关是选择pPIC9K还是pPICZ系列？pPIC9K属于穿梭质粒，也可以在原核表达，而pPICZ系列比较容易操作，大肠和毕赤酵母均用 抗Zeocin筛选（PIC9K操作麻烦一点，大肠用amp抗性，而毕赤酵母先用His缺陷筛选阳性克隆，在利用G418筛选多拷贝），而且对于大小合适（30—50KD）的蛋白在产量上是pPIC9K无法比拟的。leslie：要做毕赤酵母表达实验，首先当然就要了解这个可爱的酵母了（椭圆形，肥嘟嘟的，十分可爱），她和大肠杆菌长得有较大区别（大肠杆菌是杆状的），因此在培养的过程中要区别这两种菌体，除了气味，浓度，颜色以外，也可以取样到显微镜中观测。大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧，表达过程中染菌（我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌，那真是一段可怕的经历），如果在不知情的情况下继续做下去，那可以就是浪费大把的时间了。 基本熟悉了毕赤酵母，了解了她生长的喜好（多糖偏酸环境），生长的周期等等情况后，当然更多的精力还是应该花在表达的目的蛋白上，我的表达蛋白有些恐怖，有100KD，本来当然应该放在大肠杆菌中表达，但是为了分泌表达（其实后来发现大肠杆菌pET系列分泌表达系列也不错）和糖基化修饰（主要是这个方面，因为我的蛋白是人源的，表达出来用于酵母双杂，因此需要有完备的糖基化修饰）。这样我的DNA片段由于较长，所以在做克隆的时候也要非常小心，需要注意的是： ①酶切位点不能出现在目的DNA片段中——如果片段长无法避免，可以采用平末端连接； ②虽然α-factor可以自动切除，但是在设计表达的时候，如果在N端不能出现任何多余的aa（比如药物蛋白表达），需要特别留意（说明书上有详细说明：P13）； ③有三种不同的读码框（对于pPICZα系列来说就是对上α-factor序列），在设计克隆的时候要反复确
BIO-RAD电转化仪使用教程(自制)
BIO-RAD Gene Pulser Xcell Electroporation System BIO-RAD电转化仪使用教程（自制） cexoihtydx 20110902
一电转仪示意图 Figure 1 connecting the shockpad to the Gene Pulser Xcell main unit. Figure 2 Shockpod with cuvette. Figure 3 Gene Pulser Xcell front panel.
二电转仪主界面 在主界面中，我们经常会用到： 4. Pre-set protocols和 5. User protocols Pre-set protocols(预置方案)中，有Bacterial,Fungal和Mammalian三种预置方案。 下面简单介绍一下Bacterial中E. coli和Fungal中Pichia pastoris的电转化方案和注意事项。
三Electroporation of Bacterial Cells (E. coli) 1 制备电转化感受态细胞 1). Inoculate 5 ml of a fresh overnight E. coli culture into 500 ml of L-broth in a 2.8 L Fernbach flask. 2). Grow the cells at 37°C shaking at 300 rpm to an OD600 of approximately 0.5–0.7. The best resultsare obtained with cells that are harvested at early- to mid-log phase; the appropriate cell densitydepends on the strain and growth conditions but should be about 4–5 x 107cells/ml. 3). Chill the cells on ice for ~20 min. For all subsequent steps, keep the cells as close to 0°C as possi-ble (in an ice/water bath) and chill all containers in ice before adding cells. Transfer the cells to asterile, cold 500 ml centrifuge bottle and centrifuge at 4000 xg for 15 minutes at 4°C. 4). Carefully pour off and discard the supernatant. It is better to sacrifice yield by pouring off a fewcells than to leave any supernatant behind. 5). Gently resuspend the pellet in 500 ml of ice-cold 10% glycerol. Centrifuge at 4000 xg for 15 minutes at 4°C; carefully pour off and discard the supernatant. 6). Resuspend the pellet in 250 ml of ice-cold 10% glycerol. Centrifuge at 4000 xg for 15 minutesat4°C; carefully pour off and discard the supernatant. 7). Resuspend the pellet in ~20 ml of ice-cold 10% glycerol. Transfer to a 30 ml sterile Oakridge tube.Centrifuge at 4000 xg for 15 minutes at 4°C; carefully pour off and discard the supernatant. 8). Resuspend the cell pellet in a final volume of 1–2 ml of ice-cold 10% glycerol. The cell concentration should be about 1–3 x 1010cells/ml. 9). This suspension may be frozen in aliquots on dry ice and stored at -70°C. The cells are stable forat least 6 months under these conditions.