脾脏淋巴细胞分离方法

小鼠脾脏淋巴细胞分离方法

需要提前准备的材料：

提前高压灭菌：手术器械，200目尼龙网，

除菌过滤：8.5%和0.85%的Nacl溶液各40ml，1XPBS溶液，hanks液40ml。

红细胞裂解液，六孔板，培养皿，75%酒精，100ml烧杯，无菌注射器5-10ml，15ml、50ml 离心管，4mlEP管，离心机等。

1、配制的percoll工作液：配制15 ml

100%percoll液（简称工作液）：13.5ml percoll原液+1.5 ml 8.5%Nacl溶液混匀备用。

2、配制6个梯度，每个梯度2ml，实际配制3ml

70%percoll液（1.090g/ml）：2.1 ml工作液+0.9 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用

60%percoll液（1.077g/ml）：1.8 ml工作液+1.2 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用

50%percoll液（1.067g/ml）：1.5 ml工作液+1.5 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用

40%percoll液（1.050g/ml）：1.2 ml工作液+1.8 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用

30%percoll液（1.043g/ml）：0.9 ml工作液+2.1 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用

20%percoll液（1.031g/ml）：0.6 ml工作液+2.4 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用

找一只15ml离心管，从低到高（20% percoll液→70%percoll液）依次装入，装好备用。

3、小鼠脾脏细胞分离

（1）颈椎脱臼处死小鼠。75%酒精浸泡10min

（2）无菌条件下取出小鼠脾脏，去除筋膜等置于Hanks’ 液中，将脾脏放入2ml离心管中剪碎。

（3）将200目尼龙网置于六孔板上，用注射器头研磨，过程中不停加Hanks’ 液冲洗。（4）收集脾细胞悬液置于离心管中，1500rpm 10min，弃上清。

（5）加10ml？红细胞裂解液混悬沉淀，室温静置10min，再1500rpm 10min

（6）洗三遍，1500rpm 5min，离心去上清

（7）加入2ml 0.85%Nacl溶液混悬沉淀。

（8）用注射器缓慢沿着事先准备好的梯度分离管中，水平离心1800-2000rpm 30-40min （9）收集想要的分层，用1xPBS洗3遍

（10）用完全RPMI-1640培养基混悬沉淀，（调成浓度为1×108/ml的细胞悬液）转入培养皿中，置37℃，5%CO2下孵育30min后（去除贴壁的细胞），收获未贴壁细胞

注：贴壁为单核细胞（巨噬细胞，树突细胞）

不贴壁的悬浮细胞（T/B/NK细胞）

附件1：

(一)原理

Percoll是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。渗透压很低(<20mosm／kg H２O), 粘度也很小，可形成高达1.3g／ml密度，采用预先形成的密度梯度时可在低离心力(200～1000g)于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。由于Percoll扩散常数低，所形成的梯度十分稳定。此外，Percoll不穿透生物膜，对细胞无毒害，因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒，还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。

(二)操作方法及注意事项

1.不同浓度(密度)Percoll溶液的制备: 先用9份Percoll与1份8.5％NaCl或1.5MPBS

混合达到生理性渗透压，然后用生理溶液(0.85％NaCl或0.15M PBS)稀释到所需浓度。

Percoll浓度(％)706050403020

比重g／ml 1.090 1.077 1.067 1.056 1.043 1.031

2.不连续密度梯度Percoll层的制备: 先将试管壁用牛血清湿润，除去多余血清，这种预处理可使逐层叠加的Percoll液平稳沿管壁流下，使形成满意的界面。在制备过程中一般用长针头注射器从高密度向低密度逐层放置，有时相邻两层Percoll比重相差不大时，可将Percoll液放入注射器中，小针头斜面紧贴管壁，任其自然慢慢流下。

3.装样：样品体积和细胞浓度根据不同细胞而异，一般加样体积不宜过大，细胞浓度也不可过高，否则会影响细胞的分离和回收。

4.离心：一般采用离心力为400g，时间20～25min。由于多层Percoll之间密度差别不大，因此离心机加速、降速时要慢，要平稳。

5.取样：当所要分离的细胞绝大部分在两层的界面时，可逐层去除Percoll液后收集界面部位的细胞;有时大部分细胞位于Percoll层中,则需要逐层收集。收获含有Percoll液的细胞经2次洗涤后可供培养或检测用。

(三)分离纯化细胞举例

1.富含NK活性大颗粒淋巴细胞(LGL)的纯化:按顺序由下向上逐层加50％、47.5％、45％、4

2.5％和40％五种不同密度的Percoll,如用10ml试管(或塑料管)分离,每层Percoll 约1.2～1.5ml，初步从外周血中分离的PBMC细胞1×10８悬于１ml培基中，按要求装样、离心和取样。一般富含NK杀伤活性的LGL细胞位于42.5％与45％Percoll界面以及上下二层的Percoll液中。

2.纯化淋巴母细胞和除去死细胞：分别叠加50％和30％Percoll液。收取经PHA(或其它抗原、有丝分裂原)刺激PBMC,或含有较高比例异型的PBMC(如肾综合征出血热患者)，按要求装样、离心和取样。位于管底的淋巴细胞为小淋巴细胞；两层Percoll之间为淋巴母细胞，纯度和回收率在80％以上，位于30％Percoll表面是死细胞。收获淋巴母细胞可进行表型、结构以及功能的研究。

密度方法计算:配70%percoll液: (70mlX1.123g/ml +30ml X 1.0046g/ml)/100ml=1.0875g/ml

MTT方法测定脾淋巴细胞转化(20070727)

MTT方法测定脾淋巴细胞转化实验 1.实验步骤： 1.1.调整淋巴细胞浓度： a)小鼠断颈椎处死后，放入75%酒精液浸泡5min； b)用无菌镊子取出小鼠，手术剪剪开腹腔，取脾脏，以1ml无菌注射器将 脾在研钵中磨碎，用3.5ml预冷的Hank’s液悬浮，过筛入无菌平皿，研 钵中再次加入3.5ml Hank’s液，过筛入平皿，将7ml细胞悬液移入塑料 离心管； c)离心1500rpm, 5min； d)用Hank’s液洗2次； e)以2ml完全培养液悬浮细胞，转0.1ml细胞入3.9ml 1.5%冰醋酸，混匀 后计数；其余细胞均放于4℃冰箱预冷，防止细胞死亡； f)根据细胞计数，调整细胞浓度到1*107/ml。（假定4个大方格内总数为N，则 该细胞悬液的浓度为n=105*N） 1.2.刺激物的配备用细胞培养液将各种培养刺激物按2*终浓度稀释，混匀。以 100μl/孔加入96孔细胞培养板中。（PHA和ConA主要刺激T淋巴细胞增殖，LPS主要刺激B细胞增殖。）ConA 的常用浓度为0.1-15μg/ml，LPS的常用浓度为0.1-10μg/ml , 具体情况要根据细胞浓度和反应时间而定。不同品种的动物也有一定的不同。 1.3.加样在以上各孔中加入工作浓度的淋巴细胞悬液100μl/孔（边加边摇匀，防 止滴加过程中淋巴细胞发生沉淀。细胞培养板具体设计根据具体试验而定，设培养液对照孔。 1.4.培养将96孔细胞培养板放入细胞培养箱，培养72小时。每过24小时需取 出细胞培养板，在倒置显微镜中查看培养孔中是否出现细菌污染。 1.5.MTT培养结束前4小时，以50ul/孔添加MTT稀释液，继续培养至72小时。 1.6.处理停止细胞培养，离心（1500rpm，10min）使淋巴细胞沉淀，轻轻倾去 细胞培养液，纸巾吸干。加入DMSO，150ul/孔。充分振荡后，避光放置10-15min（直至蓝色颗粒充分溶解） 1.7.检测充分振荡后，570nm单波长酶标仪检测。

淋巴细胞刺激指数

小鼠淋巴细胞刺激转化指数实验 1.小鼠淋巴细胞悬液的制备 1）小鼠脱臼处死，75%酒精浸泡2-3分钟。减少污染。 2）将小鼠移入超净台内，仰卧固定在解剖盘，用眼科剪，镊子取出脾脏和胸腺（各1/2），放入装有2mL IMDM培养液的无菌平皿中。 3）将消毒好的纱布，3-4层覆盖到组织上，直头镊子固定，弯头镊子轻压组织，用移液枪反复吹打。 4）将悬液吸出，放入1.5mLEP管中，2000rpm,15-20min，吸取白色淋巴细胞层于无菌离心管中，用PBS缓冲液洗3遍。 2细胞计数 1）取上述制备好的细胞悬液混匀后，取出20mL，加到有980细mL胞计数液的EP管。 2）取20微升到细胞计数板，计数，数出四个大方格的细胞总数Y.则悬液的浓度为Y/4×104×50 3）用含有20%血清的培养液调细胞浓度至1×107/mL。 3.淋巴细胞培养 1）取含20%血清的IMDM 培养液（分别含有0g/mL,5mg/mL,10mg/mLConA)加入无菌96孔细胞培养板，每孔50mL） 2）青链霉素的浓度最终应为100单位/ml。青霉素是160万单位(0.96g)/瓶，链霉素是100万单位(1g)/瓶，取青霉素0.06g，链霉素0.1g，加10ml灭菌双蒸水，配制成青链霉素1万单位的母液，过滤后分装在小EP管中。使用时，可取1ml 母液放入100ml的培养液中，使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。 3）再加入调好浓度的淋巴细胞悬液，50mL/孔 4）将上述培养板放入含有5%CO2的37℃培养箱中培养48-72h 4、MTT 1)结束培养前2h，在显微镜下观察细胞转化情况。 2）每孔加入MTT 5mg/mL，10mL/孔，将MTT和细胞混匀。 3）在培养箱中继续培养2h 4）取出后离心2000rpm，10min,弃去上清。

【CN110016462A】从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910125091.4 (22)申请日 2019.02.20 (71)申请人 优睿赛思（武汉）生物科技有限公司 地址 430000 湖北省武汉市东湖开发区高 新大道666号生物创新园C6栋C6221室 (72)发明人 娄阳　吴海　 (74)专利代理机构 武汉河山金堂专利事务所 (普通合伙) 42212 代理人 胡清堂 (51)Int.Cl. C12N 5/0781(2010.01) (54)发明名称 从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋 巴细胞的方法 (57)摘要 本发明公开了一种从脾脏细胞中高效分离 单个抗原特异性B淋巴细胞的方法，本发明利用 采用多重淋巴细胞表面标记物抗体的负筛选，以 及快捷的荧光标记抗原物质方法的建立和利用 荧光标记抗原物质来进行高特异性的筛选，从而 实现对单个抗原特异性B淋巴细胞的高通量快速 筛选，并且使最终获得抗体特异性B淋巴细胞的 阳性率从传统杂交瘤方法的不足5％，提高至 30％。所以，该方案不但能够极大程度缩短单克 隆抗体开发的时间，而且能够大大提高所获得单 克隆抗体的数量和多样性。权利要求书1页 说明书5页 附图3页CN 110016462 A 2019.07.16 C N 110016462 A

权　利　要　求　书1/1页CN 110016462 A 1.一种从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法，所述脾脏细胞为经过普通抗原免疫的脾脏细胞，其步骤如下： 1)利用以生物标记的非B细胞淋巴细胞表面标志物抗体对脾脏细胞进行负筛选，再利用亲和素磁珠与磁性分离原理去除非B细胞，以提高脾脏细胞中B淋巴细胞相对丰度； 2)利用荧光标记的IgM多克隆抗体和预标记筛选用抗原，对步骤1得到的脾脏细胞进行进一步负筛选，以流式细胞技术去表面不表达IgG分子的B细胞，保留与预标记筛选抗原结合的目标淋巴细胞； 3)利用7-AAD进行分选，去除死细胞； 4)用流式细胞仪，进行单细胞的筛选，得到目标淋巴细胞。 其中，所述预标记筛选抗原为与小分子荧光染料偶联的普通抗原。 2.根据权利要求1所述从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法，其特征在于：所述预标记筛选抗原为与包含亲和素的小分子荧光染料偶联且经生物素标记的普通抗原。 3.根据权利要求1所述从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法，其特征在于：所述预标记筛选抗原的制备方法包括以下步骤：采用滴加方式进行偶联反应，分多次将包含亲和素的小分子荧光染料滴加到经生物素标记普通抗原中进行偶联，每次滴加后孵育使其偶联充分；其中包含亲和素的小分子荧光染料的用量为经生物素标记普通抗原的5倍以上。 4.根据权利要求2或3所述从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法，其特征在于：所述预标记筛选抗原的制备方法还包括以下步骤：在包含亲和素的小分子荧光染料和经生物素标记普通抗原偶联完成后，根据偶联产物的大小，选择合适的分子筛离心管，除去未偶联的底物。 5.根据权利要求1所述从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法，其特征在于：所述步骤1)为：以生物素标记的CD4单克隆抗体、CD8单克隆抗体和CD14单克隆抗体对脾脏细胞进行负筛选，再利用亲和素磁珠与磁性分离原理去除T淋巴细胞和单核细胞得到CD4、CD8和CD14阴性的脾脏细胞，提高B淋巴细胞的相对丰度。 6.根据权利要求1所述从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法，其特征在于：所述步骤2)中荧光标记的IgM多克隆抗体为FITC标记的IgM多克隆抗体。 2

T淋巴细胞提取

淋巴细胞提取 一实验目的：小鼠脾淋巴细胞提取 二实验对象：B／C 小鼠 三实验器材： 1．试剂：淋巴细胞分离液、1640培养基 2．器材：无菌培养皿、200目尼龙网（裁成90mm*90mm正方形，灭菌）、10mL玻璃注射器内活塞（灭菌）、不同规格的镊子、剪刀若干（灭菌）、细胞实验常用器材（离心管、移液管、加样枪、离心机）、75%乙醇、烧杯（无菌）、大头针、超净台 四实验步骤： 1、断头处死小鼠，浸入75%的乙醇中浸泡1-2分钟。 2、在超净台中小心剪开小鼠腹部外皮，用大头针固定，再剪开小鼠腹腔，用镊子摘下小鼠脾脏。注意无菌操作。 3、参考图一，在35mm培养皿中放入4-5ml淋巴细胞分离液（使用前摇匀淋巴细胞分离液）。用镊子固定尼龙网，然后用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使得分散的单细胞透过尼龙网进入淋巴细胞分离液中。（没研磨每一只脾脏话费的时间最好控制在5分钟之内，防止在研磨过程中液体挥发，使得密度与渗透压改变，影响分离效果） 4、把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到离心管中，离心前再覆盖上大约200μL的1640培养基。 5、800g离心30分钟，注意离心设置较慢的加速度和减速度（如果有十档，一般设置在第三档）。离心结束后淋巴细胞会漂浮上来，在1640覆盖层下面聚集，细胞分层如图二所示

6、析出淋巴细胞层，再加入10mL1640培养基，250g离心10分钟。倾倒上清液，加入3-5mL Lympho-SpotTM无血清培养基重悬，细胞计数。 五、注意事项： ①离心前在细胞悬液上面加盖一层1640培养基，既有利于漂浮上来的淋巴细胞的聚集，又有利于下一步的吸取操作。覆盖层不必太厚，2Μl足矣。 ②如果实验者一次实验要处理很多只小鼠，需要注意两点：其一，每研磨一只小鼠，立即把脾细胞悬液从培养皿转入离心管中，注意盖严管盖，切不可敞口放在超净台中。否则，液体挥发，密度与渗透压都会改变，严重影响分离效果。其二，在所有的小鼠脾脏处理完后，统一再加1640覆盖层。如果加早了，两层液体会相互扩散，造成最终离心后的淋巴细胞层下移。 ③推荐使用尼龙网替代不锈钢网筛，以为尼龙网更柔软些 ④使用注射器活塞代替镊子研磨脾脏，由于镊子夹住脾脏的力度不好控制，易造成细胞死亡。

小鼠脾脏中分离淋巴细胞

小鼠脾脏中分离淋巴细 胞 Document serial number【UU89WT-UU98YT-UU8CB-UUUT-UUT108】

从小鼠脾脏中分离淋巴细胞 １小鼠断颈处死，酒精浸泡５分钟，超净台内打开左侧腹部皮肤，小心分离皮下组织和腹部肌肉暴露出脾脏，提起，剪去周围结缔组织，放入有PBS的小瓶中。无菌镊子夹碎，挤压脾脏，将获得的细胞悬液移入无菌试管中。 ２另取无菌试管，先加入淋巴细胞分离液，然后将试管倾斜，略放平，吸取刚刚制备的细胞悬液缓慢的加入试管中，一般分离液和细胞悬液的体积比为１：２，要轻要慢，不要冲破了淋巴细胞分离液和细胞悬液的界面。选用适合自己分离目的细胞的离心力和时间进行离心。个人用1500转/分钟，20分钟。 ３离心后取出试管，可以看到不同的分层，一般上面是非细胞成分和细胞碎片，接下来是单个核细胞，再往下是红细胞等。吸走上层非细胞层弃之，吸出单个核层在另外无菌试管中，因为淋巴细胞分离液对细胞有毒性作用，加入PBS 离心洗两遍（PBS1000转/分钟，10分钟）。 ４，洗好的细胞加入１６４０培养液和２０％的血清中重悬，缓慢加入已经制备好的尼龙毛柱子中，封好，放３７度孵育一小时。一小时后取出，超净台内将柱子立起，针头下面放无菌试管（我们的柱子是用大号注射器做的），以HANKS液和血清先后缓慢冲洗，巨噬细胞贴在尼龙毛上不下来，B细胞也相对吸附冲洗下来的不多，所以冲洗来的大多是T细胞，纯度可打到８０％到９０％，再次冲洗并且用力挤压，这样得到的就是B细胞。得到的细胞可以以１６４０加血清配制的培养液进一步培

养或做它用。但是淋巴细胞分离液得到的细胞只能算是粗分，如果实验要求高最好选用磁珠或流式分离。

小鼠淋巴细胞分离方法

小鼠淋巴细胞分离方法 一、实验用品的准备： 1.采血用品：10ml注射器10个；手套20付；15ml离心管10个；20μl枪头、200μl 枪头、1000μl枪头。摄子、剪刀各2把；加样器；70%酒精；5%碘酒； 2.取脾用品：10ml注射器10个；手术器械10套；手套20付，60mm玻璃培养皿10个； 200 目尼龙网，裁成100mm×100mm正方形10块；10mL 玻璃注射器内活塞10个； 5mL刻度吸管、15mL离心管、1640培养基；鼠淋巴细胞分离液；摄子、剪刀各10 把；70%酒精；5%碘酒；移液器、离心机；刀剪浸泡液（新洁尔灭）； 注：红色必须灭菌；蓝色可以不灭菌；绿色需特殊处理；黑色不用灭菌。 二、相关实验： （一）实验名称：分离小鼠脾脏淋巴细胞 实验目的：获得小鼠脾脏淋巴细胞，为ELISPOT实验做准备。 实验动物：BABALB/c小鼠；雌性 实验材料： 1．小鼠淋巴细胞分离液, 2．60mm玻璃培养皿 3．10mL 玻璃注射器内活塞，灭菌 4．气管切开包 5．5mL刻度吸管、15mL离心管、移液器、离心机 6．1640培养基 实验方法 1. 断颈处死小鼠，浸入75%的乙醇中浸泡1-2分钟。 2. 在超净台中小心剪开小鼠的腹部外皮，用大头针固定，再剪开小鼠的腹腔，用镊子取出小鼠脾脏。注意无菌操作。 3. 在培养皿中放入3mL1640基础培养基，将小鼠脾脏放入培养皿中，用1ml注射器吸取小鼠淋巴细胞分离液，注入小鼠脾脏，直至完全分离。 4. 把悬有脾脏细胞的1640培养基缓慢转移到装有6 mL淋巴细胞分离液的15 mL离心管中。 5. 3000转离心15分钟。（病毒室离心机） 6.吸出淋巴细胞层，加入5mL 1640培养基洗涤一次，1500转离心10 分钟。 7.倾倒上清液，加入3-5mL5ml5%FCS1640培养基重悬，细胞计数。 8.对获得的小鼠脾脏淋巴细胞进行ELSPOT 检测。

脾淋巴细胞分离

小鼠脾脏单个核细胞的分离 一、实验目的 1.熟悉细胞分离的基本原理 2.掌握小鼠脾脏单个核细胞的分离的方法 3.掌握流式细胞术检测细胞表面标志的方法 二、实验原理 1.台盼蓝染色：正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内。丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡。 2.脾是人和脊椎动物最大的淋巴器官。人的脾脏位于左季肋区的后外侧部，呈卵圆形，脾是血循环中重要的滤过器，能清除血液中的异物、病菌以及衰老死亡的细胞，特别是红细胞和血小板。 三、实验材料 小鼠 手术器械（剪刀、镊子）、酒精喷壶、杀鼠板 平皿，尼龙膜指套、研磨棒、 吸管、试管、EP管、移液器和tips PBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK） 细胞计数板 0.2%台盼蓝染液 8.显微镜 四、实验步骤 （一）取小鼠脾脏 1.小鼠颈椎脱位处死——用拇指和食指往下按住鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉，使之颈椎脱臼，造成脊髓与脑髓断离。 2.取其后右侧卧位，消毒左侧背腹交界处皮肤，剪取脾脏并尽量将去除脂肪及筋膜组织。 （二）制备单个核细胞悬液： 1.将脾脏置于盛有5mLPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中。用针芯轻轻碾磨使 单个核细胞通过尼龙指套悬浮于平皿中； 2.吸取平皿中细胞悬液（再次用尼龙指套过滤）置于刻度离心管中，加PBS缓冲液（可冲 洗培养皿）至10mL，以1500rpm离心5min。弃去上清，弹散细胞沉淀，加ACK2ml，轻轻吹打混匀并放置3-4min，以破坏红细胞。然后加PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心5min； 3.弃去上清，弹散细胞沉淀，加PBS缓冲液至2ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬 液。(放置冰上) 4.取100uL至EP管中，进行计数和活力测定（建议5倍稀释） 5.以1500rpm离心5min，根据计数结果稀释到合适的浓度 a)注：减少操作的时间，并放置冰上或低温离心机里以保证细胞活力 （三）计算细胞浓度 1.将上述细胞悬液做一定倍数的稀释；（建议5倍稀释）。 2.混匀稀释后，取1滴加至细胞计数板中，计数细胞计数板中4大方格细胞总数； 3.细胞计数：细胞浓度（个/mL)=平均每个大方格中细胞数（4个大方格细胞总数/4）

流式细胞分析和混合淋巴细胞反应实验中小鼠脾脏的摘取(图文解说)

流式细胞分析和混合淋巴细胞反应实验中 小鼠脾脏的摘取 最近老婆要提取脾脏细胞做流式，我就做个简单的解说，也顺便传到网上供菜鸟理解，如果有大神看到这篇文章，也欢迎指导。大家一起讨论，把实验做得更好。 无论是做混合淋巴细胞反应或者流式细胞分析都要用到脾脏。小鼠的脾脏摘取颇为简单，但有很多同学是第一次接触，所以在此做一个简单的图文讲解。在此讲解不甚详细，具体步骤请同学参照网上已有各种protocol,本文重点在于图文解说，让大家对照图片和其他protocol更好的理解脾脏的摘取。 一，小鼠处死后泡酒精2-3分钟，泡久了细胞会缩水，泡的时间短了起不到消毒杀菌的作用 二，摆好小鼠体位，取右侧卧位。 三，沿着小鼠左侧肋骨走行方向做切口。准备眼科镊和眼科剪若干（文中笔者使用眼科直镊3把，眼科剪2把）

四，向小鼠左后背方探查，在皮下很浅的地方可见深红色脾脏。脾脏走行向与肋骨方向近似平行 五，用镊子轻轻提起脾脏。脾脏下会连着许多结缔组织，轻轻把它们撕掉。

六，完整摘下脾脏，放于培养皿中【事先在培养皿中放入PBS （混淋）或红裂（流式）和200目的铁丝网】如下右图所示，银色的为本步骤中使用的铁丝网，白色的为后面要用到的过滤膜

七，一把新的眼科剪和一把新的眼科镊（新消毒过的。本文所用的为新高压的），把脾脏在培养皿里剪成小块。然后用2.5ml或5ml注射器柄，把脾脏研磨成细胞。研磨过程要轻柔，否则会损伤脾脏中的细胞。

八，研磨至培养皿中不见整块脾脏，只剩一些不能磨碎的结缔组织为止。

九，再加入4ml红细胞裂解液，冲洗铁丝网，注射器内芯，并用枪头吹打混匀，裂解5min 十，将液体一并转入15ml离心管中，400g,5min,离心 十一，弃去上清，加入5ml含10%FBS的1640 ,重悬, 用装有200目的尼龙滤膜过滤(可过滤两次); 尼龙滤膜就是第六步中右图的白色滤膜。 十二，滤液离心400g,5min,弃上清，加入1ml含10%FBS的1640,重悬混匀，稀释50(20+980)倍计数，； 至此，脾脏细胞就算提取完成了。后面几步没有上图，但做过实验的同学很容易就能理解是怎么回事啦。

淋巴细胞的分离及鉴定

离心分离技术与淋巴细胞分离及鉴定 【实验目的】 1.了解离心分离技术的原理与分类。 2.掌握应用密度梯度离心法分离单个核细胞及B淋巴细胞鉴定的方法。 【实验原理】 1.利用离心力将悬浮液中的悬浮微粒快速沉降，借以分离比重不同的各种物质成分。因此 用比重与被分离细胞比重相近的细胞分离液则可通过密度梯度离心方法，在分离液界面上收集到所需要的单个核细胞。 2.用过氧化物酶标记的抗IgM，在一定条件下与淋巴细胞混合，标记的抗IgM抗体可以与 B细胞表面的IgM结合，通过DAB显色，在普通光学显微镜下观察可见细胞膜上出现特定染色。 【实验步骤】 一.细胞分离 1.将小鼠用颈椎脱臼法处死，解剖左侧腹腔靠上部位，将腹膜剪开，找到并取出脾脏。 2.将脾脏置于培养皿内100目筛网上，加入8ml的生理盐水，用磨棒磨碎脾脏后过滤，即 获得脾细胞混合悬液。 3.1500rpm,5min,离心细胞混合悬液，弃部分上清，调整体积至4ml,重悬细胞。 4.取盛有3ml细胞离心液（比重1.088）的试管一支，用移液器加入细胞混合液4ml。 5.将试管离心1800rpm，（上升和下降率为2）20℃30min。 6.离心后取出试管，观察细胞分层，底层为红色的红细胞，依次向上为细胞分离液和生理 盐水，在此之间可见一层淡淡地白色细胞层。 7.用尖吸管小心取出中层间的细胞到另一洁净离心管，并加2ml PBS洗涤一次，1500rpm 离心5min后去上清。 8.再将细胞均匀悬浮于0.1ml PBS中，取出10μl滴于黏附剂处理的载玻片上，自然干燥后， 可进行细胞类型鉴定。 二.细胞鉴定 1.分离出单个核细胞并取出10μl滴于黏附剂处理的载玻片左右各一滴涂片，自然干片 2.在室温条件下，用甲醇固定细胞，自然干燥后用蜡笔标出细胞范围，蒸馏水洗三次。 3.配制封闭液。室温浸泡30分钟，PBS洗3次。 4.滴加适当稀释（1:100）的过氧化物酶标记的兔抗小鼠IgM抗体于左侧涂片，滴加适量 的封闭液于右侧涂片（做阴性对照），于37℃30分钟，PBS洗2分钟3次。 5.滴加DAB显色液，37 ℃显色30分钟，蒸馏水洗3次，干片后，显微镜下观察。 【注意事项】 1.向分离液管加脾细胞混合悬液时应沿试管壁缓缓加入，使脾细胞混合悬液与分离液形成 明显的界面，小心放取试管，保持界面完整，避免打乱界面，影响分离效果。 2.在滴DAB显色液前要彻底去除游离的抗体，以免假阳性结果。 3.DAB潜在致突变作用，请注意适当防护,请穿实验服并戴一次性手套操作。 【实验结果】 如下图：

1.提取淋巴细胞步骤

提取大鼠淋巴细胞的步骤： 1.准备工作：将实验用具（小剪子3把，小镊子3把，磁盘1个，离心管1盒，离心管盖1盒，筛网1盒，表面皿1组，注射器2支，手套1副，1000ul枪头1盒，200ul枪头1盒，10ul枪头1盒，白大褂）放在紫外光下照射30分钟以上。实验试剂（PBS、无血清的培养液、有血清的培养液、淋巴细胞分离液）准备好。检查酒精灯内酒精量灯芯、酒精棉量。 脱颈处死，放入酒精中浸泡20分钟（可放到无菌室中）。 3.拿好实验药液（有血清的培养液，无血清的培养液，PBS，淋巴细胞分离液）进入无菌室，穿好白服套袖，于手上身上喷好酒精消毒，进入操作台，擦拭台子，台子干后点燃酒精灯。 （缓冲液，生化反应中以免影响体系PH值波动），将大鼠取出至于磁盘中，于腹中线剪开皮毛，向左侧剪开，用镊子在大鼠左侧找到长条状的脾脏，将脾脏至于PBS中分离结缔组织。 注意：勿将脾脏接触到皮毛引起污染，结缔组织尽量去除干净 200目），浸湿，用镊子夹取脾脏至于筛网上，用第一个注射器芯将其碾碎干净（碾碎至筛网上剩余物质为白色），吸取无血清培养液2ml PBS的无用表面皿中。 注意：夹取脾脏的镊子不可以碰到筛网以外的液体中，以免污染组织；注入培养液时不要产生气泡（气泡会影响细胞生长）。 6.避光条件下，第二个注射器吸取3ml淋巴细胞分离液（先注入气体再抽取液体）加于离心管中（加4个）。将装有组织液的表面皿倾 用新的一二混用注射器吸取3ml缓慢注入离心管中，一定要让界面明显。 7.稳拿离心管放入离心机中，离心（2500r/min，20min）。 注意：动作稳，配平时找放的稳得离心管。若脾脏的状态不好，可适当增加离心转数（3000）。 8.稳稳拿出离心管，用200ul 的枪吸取离心管中处于中间的淡黄色条带（先排气后插入吸取液体，一般能吸取500-600的液体），集中收于第五、六个离心管中，9.离心（1500r/min，10min），慢弃上清（倒入刚才的表面皿中），加入PBS 6-7ml 反复吹吸充分，离心（1500r/min，10min）。准备细胞计数板。 10.慢弃上清，加入有血清的培养液4ml，↓吸取10ul于细胞计数板上，开始计 64个格中的数量= a/4 *10000 ml） 可变根据具体提到的细胞数量及下面试验所应用的具体用量来定稀释的剂量11.取培养板分别于每个孔中加入淋巴细胞液1ml，再加入适量所需测定的物质，盖好盖子，标记好，喷酒精放入CO2培养箱中，培养24小时。 12. 枪调回最大量程放好；酒精擦拭台子；废液缸倒掉垃圾清理掉，鼓风机关闭。

达科为小鼠脾脏淋巴细胞分离解决方案

小鼠淋巴细胞分离液说明书 Cat#:DKW33-R0100 本品为深圳达科为生物技术有限公司自主研发的新一代密度梯度分离液。主要成份为Iodixanol ，分子量为1550。它是完全化学惰性、无生物毒性的碘化物，不会结合任何已知的生物功能蛋白、不会干扰任何细胞表面膜蛋白、不会抑制酶活性、不会干扰抗原抗体反应。 EZ-Sep?Mouse 1×小鼠淋巴细胞分离液分离的淋巴细胞的纯度高、状态好、得率高。小鼠脾脏淋巴细胞分离方法操作简单、易学，对实验者的经验要求不高。 本实验室的研究表明，小鼠脾脏淋巴细胞暴露在该分离液中长达1小时，离心分离后，淋巴细胞的数量和质量没有明显变化，随后的ELISPOT 检测结果同其它组完全一致。 产品信息： 商品名：EZ-Sep?Mouse 1×（英文） 易得小鼠淋巴细胞分离液（中文） 规格：100mL/瓶 密 度：1.0810±0.0005g/mL (20oC) 渗透压：280±15mOsm 主要成份：Iodixanol ，化学惰性，无生物毒性 内毒素：≤0.5EU/mL 适用范围：分离小鼠/大鼠脾脏淋巴细胞 分离大鼠/兔子血液中的PBMC 保存方法：4oC 避光保存，保持无菌保质期：12个月 使用方法： 自备材料：35mm 培养皿、10mL 玻璃注射器内活塞、200目尼龙网——裁 成90mm×90mm 正方形（以上材料均为无菌要求）、其他常用器材：离心管，移液管，加样枪，离心机等 实验步骤：1.断颈处死小鼠，浸泡于75%的乙醇中。2.在超净台中取出小鼠脾脏。注意无菌操作。 3.在35mm 培养皿中放入4-5mL EZ-Sep?Mouse 1×淋巴细胞分离液（取用前摇匀）。研磨（研磨操作请参考图二）。 4.把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到15mL 离心管中，覆盖200-500uL 的1640培养基（保持液面分界明显）。 5.室温，800g 离心30min 。设置较慢的加速度和减速度，如果有十档，设为第三档。离心结束后细胞分层如图一所示。 6.吸出淋巴细胞层，再加入10mL 1640培养基，颠倒洗涤。室温，250g 离心10min 收集细胞。 7. 倾倒上清液，用无血清培养基或其他培养液重悬细胞，细胞计数。 注意 ： 若小鼠饲养时间较长，或者小鼠脾脏异常肿大，导致研磨后细胞悬液呈现暗红色时，须将细胞悬液用小鼠

组织学与胚胎学——脾和淋巴结的对比

脾是放大版的淋巴结 华西口腔09级七年制范莹莹0975031023脾和淋巴结在结构、功能上十分相似。 结构上2者大同小异。 淋巴结的被膜和门部的结缔组织深入淋巴实质，形成互相连接的小梁，构成淋巴结的粗支架，血管行于其内。小梁之间为淋巴组织和淋巴窦。脾的被膜较厚，因为脾是器官，富含弹性纤维及平滑肌的膜对它有一定的保护功能。与淋巴结相似的是，被膜和脾门的结缔组织深入脾内形成小梁，构成脾的粗支架。脾动脉从脾门进入后，分支也是随小梁走行。 被膜下方的组织也有一定的相似。 淋巴结被膜下方，分为皮质和髓质。脾实质分为白髓和红髓。 淋巴结皮质分为以下3个区域。 1.浅层皮质，含淋巴小结及淋巴小结之间的弥散淋巴组织，为B细胞区。 2.副皮质区（胸腺依赖区）位于皮质深层，为较大片的弥散淋巴组织，以T细胞为主，还有特殊的是存在许多高内皮微静脉，是淋巴再循环的重要部位。在细胞免疫应答时，此区的细胞分裂相增多，区域迅速扩大。 3.皮质淋巴窦，即被膜下方和小梁周围的淋巴窦，内有呈星状的内皮细胞支撑窦腔，巨噬细胞附着于内皮细胞。供淋巴液缓慢流动，使淋巴组织与异物接触供充分，工作效率更高。 淋巴结的髓质由髓索和其间的髓窦组成。 1髓索是相互连接的索条状淋巴组织，主要含浆细胞、B细胞和巨噬细胞。其中浆细胞来自皮质淋巴小结，它们在此分泌抗体. 2.髓窦与皮质淋巴窦的结构相同，但较宽大，腔内的巨噬细胞较多，故有较强的滤过功 能。 脾的白髓有如下结构。 1.动脉淋巴鞘，它是围绕在中央动脉的厚层弥散淋巴组织，主要由T细胞构成，中央动脉旁有一条伴行的小淋巴管，为鞘内T细胞经淋巴迁出脾的重要通道。当发生细胞免疫应答的时候，动脉周围淋巴鞘内的T细胞分裂增殖，鞘增厚。它相当于淋巴结的副皮质区。 2淋巴小结，位于动脉周围淋巴鞘一侧，主要由大量B细胞构成。和淋巴结的浅层皮质相似。 3边缘区，为红髓和白髓交界的狭窄区域，含有T细胞、B细胞及较多的巨噬细胞。中央动脉的侧枝末端在此区膨大，形成小血窦，供血液内抗原及淋巴细胞进入白髓的通道，也是白髓内的淋巴细胞参与再循环的通道。此区的结构和淋巴结的皮质淋巴窦相似。 脾的红髓也由脾索和脾血窦组成。 1.脾索由富含血细胞的淋巴组织构成成不规则条索状，并互联成网，网孔即为脾血窦。脾索含较多的浆细胞、B细胞和巨噬细胞和数突状细胞。以上均与淋巴结髓类似。与淋巴结髓索不同的在于脾索内含有中央动脉分支形成的笔毛微动脉。它开口于脾索使大量血液直接进入脾索。 2脾血窦与淋巴结的髓窦在结构上基本一样。 功能上两者有交叉的部分，也有其独特的部分。

淋巴结和脾的结构和功能上的异同点

淋巴结和脾的结构和功能上的异同点 相同点 不同点 淋巴结脾 染成红色的组外表薄层为被膜，镜下呈 被膜较厚，为致密结缔组条索状或不规则形的断 被膜与小织即为被膜，伸织，包绕实质。表面被覆间 面。被膜内可见多个输入 梁人实质的部分皮，其内可见明显的小梁动 淋巴管的断面。有时可见 即是小梁。脉和小梁静脉。 瓣膜。 淋巴细胞在实质中表现为 淋巴细胞呈深紫蓝色。形状各异，大小不一的蓝色 区域。 低 皮质（脾许多淋巴细胞聚集成圆可分为淋巴小结和动脉周倍 脏称白淋巴细胞密集，形细胞团即是淋巴小结，围淋巴鞘两种组织结构，在镜 髓）淋巴小结一般靠近被膜小结旁边可见到处于偏心下 排列。位置的中央动脉。 ——边缘区：红、白髓间的过渡地带，无确切边界。 皮质深面即髓质，髓质中实质中的浅红色区域，脾窦髓质（脾有髓索（脾脏称色深的细胞条索即髓索，与脾索不易分辩，在显示较脏称红脾索）、髓窦（脾髓索间的浅色区域即髓好的视野里见脾窦内细胞 髓）脏称脾窦）窦。小梁形状不规则，呈成分略少且无网状支架，颜 红色。色浅淡。 淋巴小结形成生发中心，淋巴小结，除了密集的淋 脾小结，密集淋巴细胞，主（脾脏称区分为暗区、明巴细胞外，还可见巨噬细 要为 B细胞脾小结）区、小结帽胞和网状细胞。 高髓索（脾髓索，由密集的淋巴细脾索，细胞成分密集，可区倍脏称脾——胞，网状细胞和巨噬细胞分出红细胞、淋巴细胞等，镜索）构成。但其它细胞成分不易区分 下 髓窦，扁平的内皮细胞围脾窦的杆状内皮在切片中髓窦（脾 成，窦内有有较多巨噬细表现为高矮不一的断面，窦脏称脾—— 胞，因此有较强的过滤功腔不规则，腔内见大量血细窦） 能。胞。 功能上的相同点：都参与免疫应答 不同点：淋巴结能滤过淋巴，而脾能滤血，造血。

复旦大学免疫实验小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数

小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数 实验时间：实验地点：实验人： 1实验原理 小鼠脾脏位于上腹部左后侧，体积较大，长条形，属于外周免疫器官。 外周血中淋巴细胞可经再循环驻如脾脏等外周免疫器官的特定区域，所以富含各类免疫细胞。 免疫细胞的分离：采用红细胞裂解法，是根据细胞对渗透压变化的敏感度。红细胞由于细胞结构较为简单，仅有细胞膜结构，对于膨胀的耐受能力较差，因此绝大部分就会涨破，受到破坏。是一种比较温和的去除红细胞最简便易行的方法。 2实验材料： 1)健康小鼠 2)手术器械（剪刀、镊子）、解剖板 3)70%乙醇 4)PBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK） 5)0.2%台盼蓝 6)细胞计数板、计数器 7)离心机 8)显微镜 3实验方法： 3.1取小鼠脾脏 ●将小鼠颈椎脱位处死，用酒精消毒。 ●用剪刀剪开背部皮肤，再找到脾脏，用镊子夹出脾脏并剪除周围组织。 3.2制备单个核细胞悬液 ●将取出的脾脏置于盛有3mlPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中，

用针芯轻轻碾压使得单个核细胞悬浮于平皿中。 ●吸取平皿中细胞悬液置于刻度离心管（15ml）中，以1500rpm离心10min， 弃去上清液，加入ASK至2-3ml，轻轻吹打混匀并放置2min，以破坏红细胞。 然后加入PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心10min。 ●弃去上清液，用PBS缓冲液定容至2ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞 悬液。 3.3计算细胞浓度 稀释十倍，随机选取一个大方格计数 细胞计数为324个，计算细胞浓度为324×104×10=3.24×107/ml 3.4计算细胞活力 在总计为324个细胞中计数，死亡细胞有16个，计算细胞活力为： 324-16/324×100%=95.1% 在理论范围之内 4实验结果 4.1研磨脾脏得到细胞悬液 本实验中将小鼠的脾脏放入尼龙指套内，置于少量PBS液中缓慢研磨，获得细胞悬液。实验中，我们发现尼龙指套不能滤去所有结缔组织，操作中会有结为絮状团块的结缔组织。这些结缔组织在离心后会和细胞绞缠在一起，去除十分麻烦，而且会损失细胞。应该在离心之前尽早用吸管吹打后小心弃去（这样损失的细胞比较少，造成较小的误差）。 研磨脾脏时的力度、时间、温度都会影响细胞的活性。所以应置于冰上快速、轻柔地研磨，置于液体中避免干磨。我们在实验室室温下碾磨，造成细胞破碎较多，影响最终实验结果。 4.2白细胞计数 在使用血球计数板时，遇到了镜下看不到计数板格子线的问题:起初，我们小组能够在镜下观察到细胞，但是细胞清晰时无法找到计数板格子线。后来我们

小鼠脾细胞分离+CFSE染色步骤

小鼠脾脏淋巴细胞分离与CFSE染色步骤 实验材料：小鼠1只、组织剪1把、镊子2把、75%酒精、小鼠固定板、1640培养液（10%FBS，1%双抗）、含0.1%FBS的PBS溶液（无菌）、PBS溶液（无菌）、ACK溶液（无菌）、移液管、枪头、组织研磨棒（无菌）、12孔细胞培养板、15mL离心管、300目尼龙网（无菌），细胞计数板，手术台布。 实验前准备工作： 做好上述实验器具的灭菌工作；将手术台布裹在小鼠固定板上，喷75%酒精，组织剪和镊子用75%酒精浸泡后置于生物安全柜中紫外照射30min； 实验步骤： 1. 取一只6-8周小鼠颈椎脱臼处死后，将其全部浸泡于75%酒精中5min。 2. 取出小鼠将其固定于固定板上，用组织剪和镊子沿小鼠腹白线剪开腹腔，拨开小肠在腹腔左上方紧贴小肠部位取褐红色长条型脾脏，用组织剪剪开筋膜同时不要把脾脏剪破，将取下的脾脏用PBS冲洗两遍，剪去脾脏上连接的结缔组织。 3. 将脾脏转移入组织研磨棒中，向其中加入2mLPBS溶液后研磨三下，尽量不残留较大组织块；再用3ml PBS冲洗研磨棒后，将脾脏研磨液经300目尼龙网过滤至15mL离心管中，再用2ml PBS冲洗研磨器内壁，同样过滤至15mL离心管中，离心500g，5min。 4. 弃上清后，加入2mL 常温ACK，轻微吹打，裂解红细胞1min后加入等体积（2mL）PBS 终止裂解，轻微吹打细胞混匀后离心500g，5min。 CFSE染色开始： 5. 弃上清，用4ml PBS（0.1%FBS）重新混匀细胞，反复吹打为单细胞悬液，再用300目尼龙网过滤。取10μL细胞液于细胞计数板上计数，并将细胞浓度调至1.0×107/ml。 6. 提前将CFSE按照说明书配成5mM母液并2ul分装储存于-80冰箱备用，其工作浓度为0.5-25μM. 7. 分出一部分细胞加入24孔板中，用于做CFSE空白对照 8. 2μlCFSE + 6ml浓度1.0×107/ml的细胞，工作浓度约为1.67μM，37℃，10min，避光。 9. 加入等体积（ice-cold）含血清1640培养基（10%FBS）终止反应，混匀后冰上孵育5min，再离心：500g，5min； 10. 弃上清，用不含血清1640培养基洗细胞一次； 11. 用6ml不含血清培养基（混合TP5或者Tα1或TP5-Myr）重悬细胞沉淀，充分吹打成单细胞悬液，铺12孔板，每孔1ml，孵育2h后再加100ul FBS至终浓度为10%； 11. 37℃，5%CO2培养3-5天后用流式细胞仪分析细胞488nm激光器检查细胞增殖情况。

脾脏淋巴细胞分离方法

小鼠脾脏淋巴细胞分离方法 需要提前准备的材料： 提前高压灭菌：手术器械，200目尼龙网， 除菌过滤：8.5%和0.85%的Nacl溶液各40ml，1XPBS溶液，hanks液40ml。 红细胞裂解液，六孔板，培养皿，75%酒精，100ml烧杯，无菌注射器5-10ml，15ml、50ml 离心管，4mlEP管，离心机等。 1、配制的percoll工作液：配制15 ml 100%percoll液（简称工作液）：13.5ml percoll原液+1.5 ml 8.5%Nacl溶液混匀备用。 2、配制6个梯度，每个梯度2ml，实际配制3ml 70%percoll液（1.090g/ml）：2.1 ml工作液+0.9 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用 60%percoll液（1.077g/ml）：1.8 ml工作液+1.2 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用 50%percoll液（1.067g/ml）：1.5 ml工作液+1.5 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用 40%percoll液（1.050g/ml）：1.2 ml工作液+1.8 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用 30%percoll液（1.043g/ml）：0.9 ml工作液+2.1 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用 20%percoll液（1.031g/ml）：0.6 ml工作液+2.4 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用 找一只15ml离心管，从低到高（20% percoll液→70%percoll液）依次装入，装好备用。 3、小鼠脾脏细胞分离 （1）颈椎脱臼处死小鼠。75%酒精浸泡10min （2）无菌条件下取出小鼠脾脏，去除筋膜等置于Hanks’ 液中，将脾脏放入2ml离心管中剪碎。 （3）将200目尼龙网置于六孔板上，用注射器头研磨，过程中不停加Hanks’ 液冲洗。（4）收集脾细胞悬液置于离心管中，1500rpm 10min，弃上清。 （5）加10ml？红细胞裂解液混悬沉淀，室温静置10min，再1500rpm 10min （6）洗三遍，1500rpm 5min，离心去上清 （7）加入2ml 0.85%Nacl溶液混悬沉淀。 （8）用注射器缓慢沿着事先准备好的梯度分离管中，水平离心1800-2000rpm 30-40min （9）收集想要的分层，用1xPBS洗3遍 （10）用完全RPMI-1640培养基混悬沉淀，（调成浓度为1×108/ml的细胞悬液）转入培养皿中，置37℃，5%CO2下孵育30min后（去除贴壁的细胞），收获未贴壁细胞 注：贴壁为单核细胞（巨噬细胞，树突细胞） 不贴壁的悬浮细胞（T/B/NK细胞）

小鼠尾静脉取血和脾淋巴细胞分离

小鼠尾静脉取血 所需器材： 热光源（如：普通台灯），鼠尾固定器，刀片，1.5mlEP管。 步骤： 1.烘烤。用热源烘烤小鼠使其血管膨胀。烤至小鼠开始有剧烈反应 时，关掉热源。 2.割尾。烤完后将小鼠固定将尾部露在外面，用刀片割一下鼠尾远 心端腹侧静脉血管使血液流出，立即用1.5mlEP收集滴下来的血液。 3.止血。用干棉球按压伤口或按压尾部近心端止血，以防失血过多 死亡。 要点 1.烤： 烤的不够：血管未膨胀，割尾后血液不易流出。 烤的太过：小鼠死亡。 2.割： 割的太浅：血液不流出。 割的太深：鼠尾被割断。 后续应用： 取血时可根据需要选择是否需加抗凝剂。所取血可用于血液学指标的

检测，如EPO浓度、甘油三酯浓度、红细胞数及红细胞压积等。 附表：本实验室常用的2种取血方法的比较 尾静脉取血VS 眼眶后静脉丛取血

小鼠脾淋巴细胞分离 所需器材（以下均为取1只鼠脾需准备的量）： 手术器械——剪刀、镊子至少2套（高压灭菌），止血钳一个（高压灭菌），细头玻璃吸管一根（高压灭菌），，200目尼龙网一张（高压灭菌），一次性5ml注射器一支，15ml和50ml离心管各一个，60mm 中皿及血球计数板一块。 所需试剂： 小鼠淋巴细胞分离液，无血清1640，进口血清，青链霉素（双抗）（100X），NEAA，丙酮酸钠，谷氨酰胺，β-巯基乙醇 注：200目尼龙网和小鼠淋巴细胞分离液均从达科为公司购买。 分离原理示意图

图一小鼠脾脏研磨示意图图二离心后小鼠脾细胞分层示意图 分离步骤及要点： 1.断颈处死小鼠，75%乙醇中浸泡几分钟消毒。 2.将小鼠转移至超净台中，先用一套剪刀和镊子剪开小鼠皮肤使 腹腔内脾脏可见。换一套干净的剪刀和镊子剪开腹腔，小心用镊子夹出脾脏，用剪刀尽量去除附着其上的脂肪组织。脾脏位于小鼠左侧腹部，为一暗红色长条形器官，不要误取肾和肝。 取出后浸泡于RPMI1640中稍作清洗。注意无菌操作。 3.在一无菌的中皿中加入5ml淋巴细胞分离液，用止血钳将尼龙 膜固定在中皿上，放上脾脏开始研磨（如图一所示）。注意利用尼龙膜的弹性研磨。研磨时间不要超过5分钟，否则淋巴细胞分离液挥发导致其密度发生改变，影响分离效果。

分离脾脏组织细胞及胞内流式的protocol

分离脾脏组织细胞及胞内流式的protocol 1.准备六孔板，1xPBS溶液，50ml离心管，15ml离心管, 1.5ml管子， 70um滤器,把淋巴细胞分离液拿到室温放着 2.杀小鼠，分离脾脏和肺组织，肺用OCT包埋，至于-80度保存，脾 脏放入六孔板 3.用10ml注射器的头将其研碎，匀浆 4.将其转移到装有70um滤器的50ml离心管中 5.在15ml离心管底部铺上一份淋巴细胞分离液，与细胞悬液之比为 1:2 6.500g, 15度，升降速为0，分离15分钟 7.吸取乳白色细胞层，至于1.5ml离心管中 8.加入PBS重悬，500g离心15分钟，重复两次 9.配置10%培养基，将细胞悬浮其中待用 10.500g, 离心10分钟，弃上清 11.加入2ml 1xPBS重悬，离心，重复洗2次，并转移至2ml离心管中 12.在离心过程中，配置穿孔液，还有固定液，表面抗体的稀释液 13.从重悬细胞中吸取部分细胞作为Blank，吸取部分做表面抗体单染： 比如CD4、IFN-γ、IL-4 14.表面染色标记各流式样品和CD4单染样品，4度避光孵育20-30分 钟 15.加入1ml 1xPBS中和抗体，离心，CD4单染样品加入流式染色液避

光放置 16.流式样品和IFN-γ、IL-4单染在避光条件下，各加入100ul IC Fixation buffer，轻轻弹一弹，室温避光孵育20分钟 17.每管加入2ml 1xpermeabilization buffer,300g 室温离心5min，弃上 清 18.2ml 1xpermeabilization buffer 重悬，300g 室温离心5min, 弃上清 19.用1xpermeabilization buffer配IFN-γ、IL-4抗体，分别加入到每管 中，单染只加一种抗体即可，室温避光孵育20-30分钟 20.每管加入2ml 1xpermeabilization buffer,300g 室温离心5min，弃上 清 21.每管加入2ml 1xPBS,300g 室温离心5min，弃上清 22.加适量1xPBS（300-500ul）重悬，避光放置等待上机检测 23.软件分析结果

密度梯度法分离小鼠淋巴细胞

密度梯度法分离小鼠淋巴细胞 一、实验目的 掌握密度梯度法分离单个核淋巴细胞 二、实验原理 红细胞和多核白细胞的比重（1.092左右）比淋巴细胞的比重（1.075-1.090）大，因此利用一种比重介于1.075~1.092之间的等渗溶液（淋巴细胞分离液）作密度梯度离心，使不同比重的细胞按不同的密度梯度分布。 三、实验试剂和器材 Balb/c鼠，1640培养基，淋巴细胞分离液，镊子，剪刀，金属网，研棒，平皿，枪头、15ml离心管、移液器、离心机、白瓷盘、酒精棉球、烧杯。 四、实验步骤 1、对Balb/c鼠先用摘眼球放血并拉脊椎处死。 2、用酒精棉球擦拭小鼠腹部，用剪刀和镊子在腹部剪开一个小口，用手撕开小鼠的皮毛，使肌肉裸露，用剪刀和镊子剪开肌肉，取脾脏。去除血细胞及脂肪组织，用2ml 1640进行清洗。 3、将清洗过的脾脏放到置于平皿中的金属网上，先加入1ml 1640，用研磨棒压碎脾脏成单细胞，补加2ml 1640冲洗金属网。 4、将研磨的单细胞悬液小心的靠壁滴加入5ml体积的淋巴细胞分离液的液面上（小心不破坏淋巴细胞分离液液面），2000r/min，离心20min，此时离心管中由上至下细胞分四层。用枪头小心吸取第二层的环状乳白色淋巴细胞层，放入加入了约10ml的PBS的离心管中，充分混匀，1500r/min，离心5min，弃上清。剩余约100ul PBS，重悬，混匀，即得淋巴细胞悬液。 五、实验结果 1、离心后溶液分为四层，最上层为粉红色澄清液体，第二层处于分界处，稍微发白模糊，第三层为透明状液体，有少量絮状漂浮物，最下层为深红色沉淀。 2、最后得到的淋巴细胞悬液较为浑浊，颜色发白。 六、实验分析及讨论 （一）实验讨论 1、淋巴细胞分离液看起来是无色透明的，实际上由两种糖分构成，具有梯度，故可以对淋巴细胞产生分离作用。 2、再去脾脏前要确保小鼠已被处死，避免小鼠挣扎造成污染。 3、在解剖前用酒精棉球擦拭小鼠腹部，即可起到消毒作用，又可以弄湿鼠毛露出皮肤，方便解剖。