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鸡传染性支气管炎病毒的分离与鉴定

中文摘要 (2)

Abstract (3)

引言 (4)

1 材料与方法 (5)

1.1 材料 (5)

1.1.1 病料 (5)

1.1.2鸡胚、鸡红细胞 (5)

1.1.3 主要试剂 (6)

1.1.4 主要仪器设备 (6)

1.1.5 引物 (6)

1.2 方法 (7)

1.2.1 病料的采集和处理 (7)

1.2.2 病毒的增殖与纯化 (7)

1.2.3 病毒的RT-PCR检测 (7)

1.2.4 鸡胚尿囊液的血凝活性测定 (8)

1.2.5 鸡胚尿囊液的RT-PCR检测 (8)

）的测定 (8)

1.2.6 毒株半数感染量（EID

2 结果与分析 (10)

2.1 病鸡剖检结果分析 (10)

2.2 病毒RT-PCR检测结果分析 (10)

2.3 传毒结果 (11)

2.4 传代鸡胚尿囊液的血凝检测结果分析 (11)

2.5 传代鸡胚尿囊液的RT-PCR检测结果 (11)

检测结果分析 (11)

2.6 EID

2.6.1 鸡胚胚病变情况 (11)

的计算结果 (12)

2.6.2 EID

3 讨论 (12)

致谢 (14)

参考文献 (15)

鸡传染性支气管炎病毒的分离与鉴定

动物医学专业

指导老师

摘要：2011年4月17日，山东省临沂某大型养鸡厂送检一批疑似感染传染性支气管炎病毒的病（死）鸡，调查得知该鸡群临床上表现咳嗽、甩鼻，食欲不振，精神不佳，脱水，排白色稀粪，爪干、消瘦等症状且死亡率高，现进行病鸡剖检，病变表现为气管出血，“花斑肾”。采集相关病料研磨并反复冻融后，进行RT-PCR检测结果发现IBV阳性，初步诊断该鸡群发生了鸡传染性支气管炎。将病料接种10日龄SPF鸡胚进行盲传，收集各代尿囊液进行血凝试验、RT-PCR检测，同时观察对鸡胚的致病变特征，结果发现血凝试验均呈阴性，RT-PCR结果IBV表现阳性，新城疫（NDV）、禽流感（AIV）等其他外源病毒阴性，鸡胚表现蜷缩、生长阻滞现象，符合IBV的生物学特征，表示成功分离到了1株鸡传染性支气管炎病毒。

关键词：传染性支气管炎病毒；分离鉴定；RT-PCR

Infectious Bronchitis Virus Isolation and Identification

Veterinary Medicine

Tutor

Abstract：April 17, 2011, a number of patients (dead) chickens infected with suspecting infectious bronchitis viruse from a large chicken farm for inspection in Linyi, Shandong Province,survey that the clinical manifestations had cough, thrown nose, loss of appetite, of sorts, dehydration, row of white Xifen, claw dry, weight loss and other symptoms ,and high mortality, now dissect chickens, the lesions showed tracheal bleeding, "spotted kidney ".Acquisition-related disease, repeated freezing and thawing material after grinding, the RT-PCR test was found positive for IBV, the initial diagnosis of the avian infectious bronchitis in chickens was sure preliminarily . The epidemic materials was inoculated to the 10-day-old SPF chick embryo to blind transfer, allantoic fluid collected for the generation of hemagglutination test, RT-PCR test, and observed the characteristics of the embryo-induced lesions,finding that hemagglutination test were negative, the RT –PCR of IBV results showed positive for Newcastle disease (NDV), avian influenza (AIV) and other exogenous virus-negative, chick embryo displayed the phenomenon of curling and growing retardation, in line with the biological characteristics of IBV, it was successful to isolate an avian infectious bronchitis virus .

Key words: IBV ,Separated and identified ,RT-PCR

引言

鸡传染性支气管炎（Infectious Bronchitis，IB）是由鸡传染性支气管炎病毒引起的一种急性、高度接触性的传染病，其特征主要为病鸡出现呼吸道症状、产蛋数量和品质下降以及肾脏病变等。鸡传染性支气管炎可以造成非常严重的经济损失，其主要包括：饲料报酬的下降，增重的减少，同时并发感染引起气囊炎，使肉鸡在加工的过程中被淘汰，且产蛋下降和蛋品质下降等。虽然疫苗的使用对鸡传染性支气管炎的流行起到了一定的预防和控制作用，但由于IBV 属于冠状病毒科（Coronaviridae）冠状病毒属（Coronavirus）的代表种，为外被囊膜的单股正链RNA 病毒，其突出的特点是血清型众多，且不同的血清型之间缺乏交叉保护性，并不断出现新的变异株，这一特点使鸡传染性支气管炎在免疫鸡群和非免疫鸡群发生和传播，给养禽业造成了重大的经济损失。鉴于此，各国学者对IBV 的分子生物学研究越来越重视。

鸡传染性支气管炎最初于1930年发现于美国North Dakota，1931年由schalk 和Hawn首次报道【1】，Jungherr【2】等于1956年证实IBV抗原的多样性及其在传染性支气管炎流行病学中的重要性，之后很多国家和地区对该病都有报道【3-5】。1956年Bijlenga第一次确诊IB在荷兰存在。自1978年起，荷兰开始出现新血清型的IBV和变异株；1962年，Cumming在澳大利亚分离出一株肾致病性毒株。1980年到1990年分离的IBV是呼吸型毒株，主要引起病鸡的呼吸道症状。自1987起，IB主要以呼吸型为主，而且病毒的组织嗜性发生变化，由嗜肾型转变为嗜呼吸道型；1986年，El-Houadfi【6】等在摩洛哥首次分离出嗜肠型IBV毒株，主要引起呼吸道、肾脏及肠炎病变等症状。此后，1991年，英国发现一株引起高死亡率的特殊IBV毒株。日本最早于1954年分离到IBV，此后不断有IB的发生【7-9】。1980年以前的IBV分离株主要引起呼吸道症状和蛋鸡产蛋量下降，1980年以后的IBV分离株以肾致病性毒株为主，引起肾脏病变。

1986年韩国首次有关于IB发生的报道，其产蛋鸡表现为呼吸困难，产蛋量及蛋的品质下降，但通过通过免疫接种则很容易控制疾病的爆发。从1990年起产蛋鸡群和肉鸡群开始爆发肾致病型IB。

我国于1953年有呼吸型IB发生的报道。我国首次IB存在的报道是邝荣禄在广东于1972年确诊出，肾型IB的发生是辛朝安于1982年在广东首次报道【10】，之后，李康然与1990年在广西分离出一株肾致病性IBV【11】。随之，国内相继有20多个省市区出现关于肾型IB发生的报道。1995年杜元钊在中国胶东地区分离出嗜

输卵管和卵巢型IBV变异株。1995年以来，我国江苏、山东等地出现IBV变异株，其特征主要为生长阻滞、消瘦、腹泻，剖检表现为腺胃肿大、腺胃壁增厚、腺胃粘膜出血溃疡、腺胃乳头平整、融合等。2004年，刘胜旺等报道我国免疫鸡群和非免疫鸡群中有新基因型的肾致病性IBV在流行。2005年杨杰华等报道于2002年从山东分离了一株IBV变异株。1964年台湾首次分离出第一株，此后不断有IBV 发生的报道。

IB在临床上可分为呼吸型、肾型、肠型等多种病型，还有一些变异的中间型。IBV可使不同日龄、品种和性别的鸡均易感染，IBV感染的症状与感染的毒株、日龄及并发症的存在性等因素有关。1～4周龄鸡感染后的主要症状表现为精神不振、呼吸困难等，并随病情的发展而出现死亡，其中幼鸡死亡率约25％，雏鸡死亡率高达75％～90％。肾型IBV感染鸡时，其患病初期的症状主要表现为咳嗽和甩鼻，精神沉郁、羽毛松散【12】。大多数病鸡食欲下降，饮欲增强，鸡冠发绀，闭目嗜睡，两翅下垂，拉绿色或白色的稀粪，同时可见含尿酸盐的白色的粪便，并有时涂满肛门附近。少数鸡有呼吸啰音，但饮食无明显变化，部分鸡耐过后，出现严重的营养不良、体型明显的偏小。开产蛋鸡群除有呼吸道症状，产蛋量和蛋的品质也随之下降，具体表现为产蛋鸡发病2～3 d后，产蛋下降20％～40％，治愈后产蛋水平大多不能恢复到产蛋以前的水平，出现软壳蛋、畸形蛋等但一般死亡率很低。

加强IBV的研究，对鸡疾病的防治有重大意义。本研究通过病鸡剖检、

RT-PCR检测、组织研磨液鸡胚盲传、血凝试验等来分离鉴定山东省临沂某养鸡场的疑似传染性支气管炎毒株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料

疑似鸡传染性支气管炎的病（死）鸡，来自山东省临沂某大型养鸡场。

1.1.2鸡胚、鸡红细胞

实验用10日龄SPF鸡胚由山东省农科院家禽研究所提供，本实验室孵化。1%鸡血红细胞悬液由本实验室制备。即取SPF鸡新鲜抗凝血10ml，用灭菌0.01M PBS缓冲液洗涤3次，每次以2000rpm，4℃离心5min；将沉积的红细胞用灭菌0.01M PBS缓冲液配成1%悬液，立即使用或贮存于4℃冰箱，供病毒血凝活性分

析。

1.1.3 主要试剂

M-MLV反转录酶、RNA酶抑制剂、Taq DNA聚合酶蛋白裂解液、dNTP、DNA Marker 购自大连宝生物工程有限公司；无水乙醇、氯仿、琼脂糖、购自天津化学试剂三厂；异丙醇购自上海埃彼化学试剂有限公司。

1.1.4 主要仪器设备

PCR基因扩增仪（杭州朗基科学仪器有限公司），DYY-1118型稳压稳流电泳仪（北京六一仪器厂），高压锅（LABAUTOCLAVE S/N ZY0302，SANYO），DYY-11131A 型电泳槽，三孔电热恒温水槽（DK-8D型，上海一恒科技有限公司）, 电热恒温培养箱（HENGZI，上海跃进医疗器械厂），微型漩涡混合仪（XW-80A型，上海沪西分析仪器厂），台式高速冷冻离心机（TLL-C型，北京四环科学仪器厂），超净工作台（苏州仪器四厂），紫外分光光度计（S51/52型，上海棱光技术有限公司）；

1.1.5 引物

参照GenBank发表的IBV 全基因核苷酸序列中的全基因序列设计的1对特异性引物（B1、B2）用于传支阳性病料的检测。引物由大连宝生物工程有限公司合成。引物为N基因的一段保守序列，见表1。

表1引物

Table1 The sequence of primers in the research

名称序列

B1上游5' AGATGTTGGGGAAGTCACTG 3'

B2下游5' GATTTGGACCTTATCCATACG 3'

1.2 方法

1.2.1 病料的采集和处理

对病鸡进行剖检，观察，取病死鸡的肺、气管、肾脏等组织，剪碎，将病料按1：4加PBS缓冲液研磨成乳状， -70℃冰箱反复冻融3次后5000rpm离心10min，取上清于无菌离心管中，加青、链霉素4℃作用3h，然后置-70℃保存备用。

1.2. 2 病毒的增殖与纯化

将用抗生素处理过的病料上清液通过尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，每枚鸡胚接种0.2ml上清液，接种3枚鸡胚，标明①,②,③；于电热恒温培养箱中37℃培养36h，每天照胚2次，检查鸡胚活性，弃去24h内死亡的鸡胚；连续盲传5

代并无菌收集尿囊液。

1.2.3 病毒的RT-PCR检测

1.2.3.1 病毒RNA的提取：

（1）取1.5ml离心管内加750ul裂解液，400ul病料上清，编号，颠倒均匀，室温静置5min。加入氯仿150ul，颠倒混匀，室温静置5min, 12000r离心15min。

（2）取上清700ul，加异丙醇700ul，编号，颠倒混匀，室温静置10min,12000r 离心10min,倾倒上清，沿离心管壁加入冷乙醇（75％）1000ul，冲洗1次，最后低速离心，吸去残液。

1.2.3.2 病毒cDNA的获取:

配20ul反转录体系（试剂比例见表3），震荡低速离心，溶解核酸，低速离心，放入42℃水浴锅内反转录1h。

表2反转录体系

Table2 the system of reverse transcription in the research

试剂或样品剂量

注射用水11ul

5×Buffer 4ul

dNTP(10mmol/L) 2ul

反转录酶M-MLV 1ul

RNA酶抑制剂(Inhibitor) 0.5ul

引物B1+B2 0.75ul+0.75ul

1.2.3.3 基因的RT-PCR扩增:

配30ulPCR体系(试剂比例见表4），将28 ul体系加入eppendorf管（200ul），加反转录产物2ul 吹打。编号低速离心，放入PCR仪进行扩增。程序为95℃预变性3min，然后按以下参数（变性：95℃1min；退火：55℃1 min；延伸：72℃2 min）进行30个循环，循环结束后72℃延伸10min。

表3 RT-PCR反应的体系

Table3 the system of RT-PCR reaction in the research

试剂或样品剂量

注射用水17ul

10×Buffer 3ul

Mgcl24ul

dNTP(2.5mmol/L) 2.5ul

TaqDNA 聚合酶0.5ul

引物B1+B2 0.5ul+0.5ul

反转录产物2ul

1.2.3.4 电泳

取20ml0.5×TBE加入琼脂粉0.2g，加热熔化至冒泡，冷却，加荧光染料1.3ul，倒板，冷却，点样，最后于紫外灯下观察结果，保存照片，记录数据。

1.2.4 IBV传代鸡胚尿囊液的血凝活性测定

用微量孔板法做病毒血凝活性分析，具体步骤简述如下：在微量板上，从第1孔至第8孔，依次加入25μL生理盐水，然后用微量移液器取待检尿囊液25μL，从第1孔起，依次作倍比稀释，稀释至第7个孔后，弃去微量移液器内的25μL 残液，第八孔为对照。最后，每孔加25μL 1%的鸡血红细胞悬液，立即轻微振荡、混匀，然后置37℃温箱，15min后观察结果，以100%红细胞凝集的最高稀释度，作为判定终点。

1.2.5 IBV传代鸡胚尿囊液的RT-PCR测定

取分离毒接种鸡胚后的尿囊液，按常规方法进行RT-PCR检测。

1.2.6 毒株半数感染量（EID50）的测定

1.2.6.1 稀释病毒

病毒采用毒株E1～E5鸡胚尿囊液。按参考文献[13][14]的方法，将病毒作10倍系列稀释：在8支2ml离心管中分别加入890ul 0.9% NaCl生理盐水，10ul双抗，用200ul移液枪取100ul种毒加入1号离心管，枪头不要接触液面。用过的枪头放入污物缸内，再用新的枪头混匀1号管，随之从1号管中吸取10倍稀释的原毒100ul加入2号离心管中，弃掉枪头，用新的枪头混匀，如此反复至第7支离心管，混匀后从中吸取100ul稀释毒弃掉。见表4：

表4 种毒稀释法

Table4 kinds of poison dilution method in the research

稀释倍数 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 对照组

生理盐水890ul 890ul 890ul 890ul 890ul 890ul 890ul 890ul

双抗 10ul 10ul 10ul 10ul 10ul 10ul 10ul 10ul

病毒 100ul 100ul 100ul 100ul 100ul 100ul 100ul 弃掉100ul

混匀混匀混匀混匀混匀混匀混匀混匀

管号 1 2 3 4 5 6 7 8

1.2.6.2 10日龄鸡胚接种

采用尿囊腔接种法，按常规方法进行。试验设5组。分别用10-4～10-74个

稀释度病毒液接种10日龄SPF鸡胚，每胚0. lml，每组5枚，同时设生理盐水

对照组(0. 1m1/胚)。

1.2.6.3 培养观察

置37℃培养，观察记录鸡胚死亡数或病变情况，计算各稀释度死亡病变情况。

剔除24h内死胚，剩余鸡胚继续孵化到144h，每天照胚3次，收集死胚，放至4℃

冰箱，144h后取尿囊液做血凝试验，解剖鸡胚，观察病变，称量胚重，记录数

据。最后加生理盐水研磨胚体（注意防止胚体间交叉污染），收集胚研磨液，做

好标记，反复冻融3次，为病毒检测做好准备。

1.2.6.4 EID

的测定

按Reed-Muench法（见表7）计算病毒EID

。

表5 Reed-Muench法

Table5 Reed-Muench method

结果观察累计结果

稀释度10-4 10-5 10-6 10-7 CPE数

无CPE数

CPE (%)

100

CPE数

无CPE数

CPE (%)

100

0 83%-50%

距离比例= =0.66

83%-33%

lgEID50=高于50%的病毒稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数=-5+0.66×（-1）=-5.66

则：EID50=10-5.66/0.1ml。即将病毒悬液作10-5.66稀释后，给鸡胚接种0.1ml,可以使50%的细胞产生CPE。

2 结果与分析

2.1 病鸡剖检结果分析

图1 气管出血图2 花斑肾Figure1 Tracheal bleeding Figure2 Spotted kidney

病鸡剖检，发现有气管出血，花斑肾等症状，符合鸡感染传染性支气管炎病毒的临床特征。

2.2 病毒RT-PCR检测结果分析

图 3 病料RT-PCR扩增结果

Figure 3RT-PCR amplification for diseasing

病料检测结果与IBV阳性对照均为阳性，且条带位置与阳性对照一致，大小为622bp。

2.3 传毒结果

收集28-36h鸡胚尿囊液，标号①，②，③。

2.4 传代鸡胚尿囊液的血凝检测结果分析

IBV分离株的各代鸡胚尿囊液与1﹪鸡血红细胞做血凝实验，发现各代鸡胚尿囊液均不能使鸡外周血红细胞发生凝集，反应呈阴性。说明鸡胚尿囊液中不含能使鸡外周血红细胞凝集的禽的其它病毒，如正粘病毒、副粘病毒等。

2.5 传代鸡胚尿囊液的RT-PCR的检测结果分析

图 4 尿囊液RT-PCR扩增结果

Figure4 the RT-PCR amplification for Allantoic fluid

注：M:2000的Marker ①: 尿囊液1 ②：尿囊液2 ③：尿囊液3

④呼肠孤病毒 (REOV) ⑤网状内皮组织增殖病毒（REV）⑥鸡贫血病毒（CAV）⑦马立克病毒（MDV）⑧新城疫病毒（NDV）⑨鸡毒支原体（MG）⑩禽流感病毒（AIV）?法氏囊病毒（IBDV）?阴性对照

④-?采用的尿囊液为①②③的混合液

尿囊液PCR检测结果显示IBV阳性，所能够检测的其它病毒均为阴性，诊断该病由传染性支气管炎病毒感染所致。

2.6 EID

检测结果分析

2.6.1 鸡胚病变情况

2.6.1.1 鸡胚病变形态

存活的鸡胚病变情况表现为现胎儿蜷缩、生长阻滞，皮肤出血点明显等。对

照胚无肉眼可见病变。(如图5) 有的鸡胚大腿及尾部有点状出血，有的呈弥漫性出血；羊膜增厚，紧贴鸡胚，部分鸡胚尿囊液中有白色的尿酸盐结晶，肾小管、输尿管有白色尿酸盐沉着。

图5 SPF 鸡胚接种IBV 后的胚体病变

Figure 5 SPF chicken embryos inoculated with IBV lesions

2.6.1.2 鸡胚病变数

表7毒株E1～E5 CPE 数

Table7 Number of strains E1 ~ E5 CPE

E1（个） E2(个) E3（个） E4（个） E5（个） 10-4

10-5 10-6 10-7

5 5 4 0

5 5 0 1

5 3 0 0

4(5) 5 5 3

5 2(3) 4 0

注：“（）”内数据加上了24h 内死的鸡胚数

2.6.2 EID 50的计算结果

表8 毒株的EID 50 Table 8 Strains EID 50

E1 E2

EID 50/0.1ml

-6.12

-6.83

-5.16

-5.60

-6.70

蜷缩胚是IBV 感染鸡胚的特征性症状，的测定表示即1/10m(m ＞0)稀释的病毒，0.1ml 能使半数鸡胚致死。

3 讨论

从上世纪八十年代至今传染性支气管炎在我国不同地区普遍存在且愈演愈烈，养殖商在生产过程中，消毒不彻底会导致病毒残留于鸡舍内，使病菌在一定的温度及湿度条件下感染给雏鸡。而且不同鸡群的混养，使疾病更易传播感染。同样鸡舍内温度过低或舍内温度变化幅度过大可诱发此病。另外鸡舍的鸡粪堆积过多，氨气浓度过大，受到惊吓也可感染呼吸道疾病。因此要注意调节鸡舍温度，在保证室内温度和湿度的前提下尽可能做到通风透气，且降低饲养密度。同时要合理调配日粮，注意向日粮中适当增加禽用多维和矿物质的含量，以提高机体抵抗力。同样有两个因素使我国的IB越来越复杂。一是我国鸡场的大规模高密度的饲养模式，有利于该病的传播；二是普遍应用的疫苗不能有效地预防IB的发生。因此，进行IBV的分离鉴定，这为以后分子水平的进一步研究打下了良好基础。

IBV分离和鉴定常用的实验室宿主系统包括：9-11日龄的鸡胚、单层鸡胚肾细胞、单层肾细胞以及20日龄的气管环，其中最为常用的是9-11日龄的鸡胚【15】。

本研究中所分离到的IBV，其发病鸡群中病死鸡表现出鸡传染性支气管炎发病的特征，如呼吸道症状、“花斑肾”等。采集的病料组织处理后接种10日龄SPF 鸡胚，传5代测EID50,，胚体表现出生长发育障碍，胚体弥漫性出血，呈现典型的蜷缩胚。同时分离株的鸡胚尿囊液对鸡外周血红细胞无凝集活性，符合IBV 的特性，也表明尿囊液无禽类的正粘和副粘病毒。对各分离株传代鸡胚尿囊液的外源病毒的RT-PCR检测结果表明所分离到的病毒中不含传染性法氏囊病毒、马立克病毒、鸡贫血病毒等外源病毒。

从以上发病鸡群的临床症状、剖检病变、致鸡胚病变特征等方面初步说明本研究所分离到的病毒为鸡传染性支气管炎病毒。

致谢

！

感谢我的父母，感谢他们给予我的一如既往的关怀和支持！

参考文献

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病毒分离方法

植物内生菌分离方法植物内生菌分离方法匿名提问 2009-02-18 20:04:53 发布自然科学学术 6个回答回答曲恋| 2009-02-18 20:45:40 有0人认为这个回答不错| 有0人认为这个回答没有帮助植物内生放线菌是一类大有开发潜力的微生物资源。目前使用的分离条件和技术尚不完善，容易被外源菌和内生真菌、细菌污染，因此内生放线菌尤其是稀有内生放线菌的选择性分离技术至少是今后一段时间研究的重点。介绍了植物内生放线菌选择性分离方法并提出值得研究的问题。( 添加评论(0) nk0226 | 2009-07-25 11:13:09 有0人认为这个回答不错| 有0人认为这个回答没有帮助植物病毒与病毒防治 Plant Virology& Control of Plant Virology 32学时2学分一、课程性质、地位和任务植物病毒与病毒防治是研究病原病毒与植物病毒病害相互关系的生物学科。本课程重点讲授植物病毒相关生物学特性与研究进展：病毒侵染寄主植物生理效应与抗病免疫；植物亚病毒病原等基础理论知识。同时，根据植物病毒基础研究需要，课程理论讲授与实验技能训练并重。通过本课程的学习，使学生进一步熟悉病毒病原与其它相关病原的区别要点，病害宏观及微观鉴定基本技术、方法、手段，并能在实践中应用。为独立开展植物病毒及病毒病害研究奠定基础。二、课程教学的基本要求要求学生重点掌握以下内容：（1）植物病毒的传播途径及传毒机制；

（2）病毒侵染植物内部症状，侵染增殖过程；（3）植物受病毒侵染的生理效应与抗病免疫；（4）植物亚病毒病原的基本特性；（5）植物病毒与病毒病害诊断鉴定的程序与方法。三、课程理论教学大纲及学时分配 1. 绪论（2学时） 1.1 病毒的发现与病毒学的发展 1.2 研究病毒的意义与任务 1.3 植物病毒与其他病毒的关系 1.4病毒与其他微生物的区别 2. 病毒的分类与命名（3学时）主要介绍病毒分类和命名的基本原则相关指标。重点：植物病毒的命名和分类系统。 2.1 病毒命名和分类的发展 2.2 病毒命名的系列 2.3 病毒分类的系列 2.4 植物病毒的命名和分类系统 3. 病毒侵染植物与增殖与增殖过程及遗传与变异（5学时）主要讲授植物病毒侵染方式，在寄主体内的增殖过程，病毒遗传变异的本质。难点:病毒进入寄主细胞的方式及粒体装配。 3.1病毒粒体的吸附与侵入 3.2病毒粒体的脱壳与生物合成 3.3病毒粒体的装配与释放 3.4病毒的遗传与变异 3.5病毒的体外重新组与生物活性 4. 植物病毒的传播途径及传毒机制（5学时）主要讲授病毒的介体传播和非介体传播的两大途径，以及不同介体传播机制与病害发生流行关系，难点：介体持久性传毒（口针传毒）与非持久性传毒（巡回传毒）机理。 4.1介体传毒 4.2非介体传毒 4.3种子与花粉传毒 4.4传毒机制 5. 病毒侵染植物生理效应与抗病免疫（5学时）主要介绍病原侵染植物的内部症状（内含体）、病毒在植物体内的运转及生理活性物质改变与寄主抗病机理。难点：病毒侵染植物的生理变化与寄主的免疫反应。 5.1病毒侵染植物内部症状（内含体及其类型） 5.2病毒在植物体内的运输

病毒的分离鉴定讲课教案

病毒的分离鉴定

病毒的分离与鉴定要证明某种疾病是由某一感染性病毒所引起，则必须满足以下原则： ①从患病者体内分离出病毒； ②在实验动物或寄主细胞中可以培养； ③证明这种培养物具有滤过性； ④在原始宿主或相关种属内能产生同样的病症； ⑤能重新分离出病毒。 1.病毒的分离 1.1标本的处理 1.1.1标本的收集 a)粪便标本：将5g粪便标本和50ml PBS放入盛有20-25颗玻璃小珠的100ml无菌瓶中，搅拌成悬液，倒出上清，3000×g，4℃离心6min。 b)拭子和生物体液：拭子浸在2-3ml运载培养基中，将棉拭子中的液体尽量挤出以获得标本，如果液体被污染，应3000×g 4℃离心30min。 c)组织标本：用无菌乳钵或匀浆器研磨组织标本，同时加入足量的 PBS制备成20%的悬液，3000×g 4℃离心30min。 1.1.2 除菌处理 a)粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位/毫升，置4℃过夜。 b)鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2000单位/毫升，置4℃作用

4小时。 c)对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、呼肠孤病毒、腺病毒、痘病毒等，则可加入等量的乙醚4℃过夜除菌。 1.2病毒的分离培养病毒是严格的细胞内寄生微生物，培养病毒必须使用细胞。根据病毒的不同选用敏感动物（动物接种）、鸡胚（鸡胚接种）或离体细胞进行分离培养（细胞培养）。 1.2.1 鸡胚接种 a)鸡卵的选择：一般都选新鲜、10天以内的受精卵以保证规格质量上的一致。 b)孵育：孵育时可将鸡卵放入卵箱内进行,气室向上，孵育的最适温度为38--39℃，相对湿度为40—70％，孵育8日后，鸡卵应每天翻动1—2次，以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。 c)检卵：鸡卵孵育4～5天后，即可用检卵器检查鸡胚发育情况（二天一次）。①未受精鸡卵：在检卵器上仅见到模糊的阴影。 ②活鸡卵：鸡胚发育4天后，在检卵器上就可见到清晰的血管，鸡卵内有一小黑点（鸡胚），有明显的自然转动。③死胎：如果发现鸡卵血管模糊、扩张、胚胎活动呆滞或不能自主地转动，则可判断胚胎频死或已经死亡，应将其挑捡出来。鸡胚孵育完毕后，用铅笔划出气室边缘和胚胎的位置待用。 d)接种：

病毒的分离鉴定

病毒的分离鉴定 Prepared on 22 November 2020

病毒的分离与鉴定要证明某种疾病是由某一感染性病毒所引起，则必须满足以下原则： ①从患病者体内分离出病毒； ②在实验动物或寄主细胞中可以培养； ③证明这种培养物具有滤过性； ④在原始宿主或相关种属内能产生同样的病症； ⑤能重新分离出病毒。 1.病毒的分离 1.1标本的处理标本的收集 a)粪便标本：将5g粪便标本和50mlPBS放入盛有20-25颗玻璃小珠的100ml无菌瓶中，搅拌成悬液，倒出上清，3000×g，4℃离心6min。 b)拭子和生物体液：拭子浸在2-3ml运载培养基中，将棉拭子中的液体尽量挤出以获得标本，如果液体被污染，应3000×g4℃离心30min。 c)组织标本：用无菌乳钵或匀浆器研磨组织标本，同时加入足量的 PBS制备成20%的悬液，3000×g4℃离心30min。除菌处理 a)粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位/毫升，置4℃过夜。

b)鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2000单位/毫升，置4℃作用 4小时。 c)对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、呼肠孤病毒、腺病毒、痘病毒等，则可加入等量的乙醚4℃过夜除菌。 1.2病毒的分离培养病毒是严格的细胞内寄生微生物，培养病毒必须使用细胞。根据病毒的不同选用敏感动物（动物接种）、鸡胚（鸡胚接种）或离体细胞进行分离培养（细胞培养）。鸡胚接种 a)鸡卵的选择：一般都选新鲜、10天以内的受精卵以保证规格质量上的一致。 b)孵育：孵育时可将鸡卵放入卵箱内进行,气室向上，孵育的最适温度为38--39℃，相对湿度为40—70％，孵育8日后，鸡卵应每天翻动1—2次，以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。 c)检卵：鸡卵孵育4～5天后，即可用检卵器检查鸡胚发育情况（二天一次）。①未受精鸡卵：在检卵器上仅见到模糊的阴影。 ②活鸡卵：鸡胚发育4天后，在检卵器上就可见到清晰的血管，鸡卵内有一小黑点（鸡胚），有明显的自然转动。③死胎：如果发现鸡卵血管模糊、扩张、胚胎活动呆滞或不能自主地转动，则可判断胚胎频死或已经死亡，应将其挑捡出来。鸡胚孵育完毕后，用铅笔划出气室边缘和胚胎的位置待用。 d)接种：

传染性支气管炎

传染性支气管炎疾病概述：传染性支气管炎是由冠状病毒引起的鸡的急性、高度接触性传染病。临床上分为呼吸道型和肾病理变化型两种类型。病原病毒能在发育的鸡胚中生长良好，也能在气管器官组织培养中增殖。病毒经56℃15分钟或45℃90分钟即被灭活，对乙醚敏感，50％氯仿室温下作用10分钟、0.1％去氧胆酸钠4℃作用18小时能使病毒完全失去感染性。病毒对常见消毒剂敏感，0.05％或0.1％的β戊酮内酯(BPL)或0.1％福尔马林均可使其失活。流行病学：自然感染仅见于鸡、雉鸡，各种年龄的鸡均可感染，但以雏鸡发病最严重。传染源主要是病鸡和康复后带毒鸡，病鸡康复后可带毒49天。病毒主要存在于呼吸道渗出物中，也可在肾和法氏囊中增殖。传播途径通过飞沫经呼吸道传播，也可经污染的饮水、饲料和垫料传播。本病传播迅速，一旦感染几乎全群发病。一年四季都可发生，但以气候寒冷的季节较为严重。临床症状：人工感染的潜伏期为18～36小时，自然感染的潜伏期长，有母源抗体的幼雏潜伏期可达6天以上。雏鸡突然出现呼吸症状并很快波及全群，病鸡表现为气喘、咳嗽、打喷嚏、气管鸣音和流鼻涕，精神沉郁、畏寒、食欲减少、羽毛松乱、打堆，个别鸡鼻窦肿胀、流泪。6周龄以上的鸡症状不明显，主要是气管鸣音、喘气和轻微咳嗽等。蛋鸡产蛋量下降，并产软壳蛋、畸形蛋或粗壳蛋，蛋白稀薄如水样，蛋黄与蛋白分离以及蛋白粘壳等。肾病理变化型传染性支气管炎是目前发生多、流行范围较广的疾病，20～30日龄是其高发阶段。病初，病鸡表现怕冷、喷嚏和咳嗽，有的张口喘气及气管鸣音，2～3天后出明显的全身症状，表现为厌食、拱背、饮水量增大，拉白色水样粪便，粪便中含有大量尿酸盐。病鸡失水，肌

病毒的分离与鉴定

病毒的分离与鉴定（一）病毒的分离病毒分离的一般程序是：检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状鸡胚→病变或死亡细胞培养→细胞病变→鉴定病毒种型(血清学方法)无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离… （一）病毒的分离病毒分离的一般程序是：检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状鸡胚→病变或死亡细胞培养→细胞病变 →鉴定病毒种型(血清学方法) 无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离心后，取上清接种；咽洗液、粪便、尿、感染组织或昆虫等污染标本在接种前先用抗生素处理，杀死杂菌。 1．细胞培养用分散的活细胞培养称细胞培养（Cell culture）。所用培养液是含血清（通常为胎牛血清）、葡萄糖、氨基酸、维生素的平衡溶液，pH7.2～7.4。细胞培养适于绝大多数病毒生长，是病毒实验室的常规技术。原代细胞培养(Primary cell culture) 用胰蛋白酶将人胚（或动物）组织分散成单细胞，加一定培养液，37℃孵育1-2天后逐渐在培养瓶底部长成单层细胞，如人胚肾细胞、兔肾细胞。原代细胞均为二倍体细胞，可用于产生病毒疫苗，如兔肾细胞生产风疹疫苗，鸡成纤维细胞产生麻疹疫苗，猴肾细胞生产脊液灰质炎疫苗。因原代细胞不能持续传代培养，故不便用于诊断工作。二倍体细胞培养(Diploid cell cultune) 原代细胞只能传2-3代细胞就退化，在多数细胞退化时，少数细胞能继续传下来，且保持染色体数为二倍体，称为二倍体细胞。二倍体细

鸡传染性支气管炎病毒的研究进展

鸡传染性支气管炎病毒的研究进展鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis，IB)是鸡的一种急性、高度接触性传染病，它主要侵害呼吸系统、泌尿生殖系统和消化系统。本病呈世界性分布，对养鸡业的危害极大，它能使成鸡的增重和饲料报酬降低，鸡蛋的产量、质量和孵化率下降，并直接导致雏鸡死亡、肾脏病变和输卵管永久性退化；另外，IB还经常做为病因之一参与混合感染，例如诱发慢性呼吸道病(CRD)的爆发，近年来，该病的流行呈上升趋势，尤其肾病变型IB 已蔓延至全国各养鸡地区，造成了严重的经济损失。本病最早由美国Schalk和Hawn报道，临床以患鸡咳嗽、喷嚏和气管哕音的呼吸道症状为主，之后陆续在世界各国发生，1936年Beach和Schalm确定病原为病毒(呼吸型IBV)，后命名为鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus，IBV)，归入冠状病毒科，是冠状病毒的代表株。 1972年邝荣禄等首次在广东证实我国也有该病发生。传染性支气管炎病毒血清型较多，常见的有Massachussetts、Connecticat、lowa97、Iowa609、Hotle、JMK、Clark333、SEl7、Florida、Arkanass99和Australian“T”。1962年Wintefield等首次报道了肾型IBV，可引起肾脏肿大、尿酸盐沉积等症状。1986年E1 Houadfi等在摩洛哥首次分离到以G株为代表的嗜肠型IBV，主要引起呼吸道、肾脏及肠道病变。Gough等首先报道了英国存在一种新的特殊IBV血清型793/B，而来自西班牙、德国、希腊和墨西哥可疑血清样本中亦可发现抗此血清型IBV的特异性抗体，法国、荷兰、意大利、泰国等均有此血清型IBV的存在。 IBV基因组核酸RNA复制的不连续机制及RNA聚合酶的不完全校对机制，使得病毒RNA在复制过程中易发生基因点突变、插入、缺失或重组，造成大量IBV变异株的出现，目前世界上已分离到的IB血清型已达30种之多，不同血清型毒株疫苗之间仅有部分或无交叉保护作用，IB的多血清型性为其免疫预防增加了难度。 1 IBV的基因组鸡传染性支气管炎病毒是正链单股RNA病毒，直径为90～200nm，是所有RNA病毒中最大的，蔗糖浮密度值常在1.15～1.18g/ml范围内，病毒有囊膜，表面有间距较宽、呈放射性排列的杆状纤突，长约20nm，使病毒外观近似皇冠，纤突不稳定，易从病毒粒子上脱落，当离心力超过100000r/min，甚至有时在37℃孵育，都会导致某些纤突成分的丢失，IBV 是第一个测定了基因组全部序列的冠状病毒，长27～30kh，有感染性，5′末端为“帽子”结构，3′末端含有共价结合的poly(A)尾，至少有10个明显的开放阅读框架(ORF)，编码分子量6.7～440kDa蛋白，病毒RNA各基因的定位次序如下： 5’-F1-F2-S-3a-3b-3c-M-5a-5b-N poly(A)-3′。Boursnell等完成了对IBV-Beaudene株全基因组的测序，共有27608个核苷酸组成，不同IBV毒株的基因组长度略有差异。lBV被分为6个区域，由小到大分别被命名为MrnaA～F。 IBV含三种最主要特异性蛋白：纤突蛋白(Spike Glycoprotein，SGP，即S蛋白)、膜蛋白(Membrane Glycoprotein，MGP，即M蛋白)、核衣壳蛋白(Nucleocapsid Protein，NP，即N蛋白)，分别由mRNA E、C、A编码，三种结构蛋白的摩尔比为1:6:15，第四种小膜蛋白(sM)与病毒囊膜有关。病毒的血清型、血凝抑制和大多数的中和抗体均由S1蛋白决定和诱导。 2 IBV的主要结构蛋白及功能 2.1纤突蛋白(S) S蛋白由mRNA B编码，位于病毒粒子最表层的囊膜上,是构成病毒纤突的主要成分，是由2～3个相同的单体非共价连接构成的聚合物。S蛋白包含两种糖多肽S1和

禽传染性支气管炎

有关鸡传染性支气管炎的病疾病概述：鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)是一种对鸡危害严重的急性、高度接触性传染病,临床症状与Ⅰ群和Ⅱ群人的冠状病毒引起的症状相似,在我国大部分地区都有流行。本病是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectiouss bronchitis virus,IBV)引起的,主要侵害呼吸道、肠道和泌尿生殖道,某些毒株可引起肾脏和肠道疾病。所有日龄的鸡历史及分布： 1930年在美国北达科他州首先发现了鸡传染性支气管炎。次年Schalk和Hawn，对该病的临床症状和初步实验研究结果作了报道。此后，加拿大、英国、意大利、澳大利亚、日本、比利时、印度等都有相关报道。 1936年Beach和Schalm确定了该病的病原，1937年Reaudette和Hudson首次在鸡胚上成功培养该病毒。 1962年Winterfield和Hitchner报道了肾病变型IB。早期报道的IB主要是幼鸡的疾病，但后来发现此病也存在于育成鸡和产蛋鸡群中。我国于1972年由邝荣禄教授在广东首先发现IB的存在。此后北京、上海相继有报道，现已在我国大部分地区蔓延。 1996年以来，又见有腺胃型传染性支气管炎的报病原：传染性支气管炎病毒属冠状病毒科冠状病毒属。本病毒对环境抵抗力不强，对普通消毒药过敏，对低温有一定的抵抗力。传染性支气管炎病毒具有很强的变异性，目前世界上已分离出30多个血清型。在这些毒株中多数能使气管产生特异性病变，但也有些毒株能引起肾脏病变和生殖道病变。本病主要通过空气传播，也可以通过饲料、饮水、垫料等传播。饲养密度过大、多热、过冷、同分不良等可诱发本病。1日龄雏鸡感染时刻使输卵管发生永久性的损伤，使其不能达到应有的产量。流行病学： 1.传染源：病鸡和带毒鸡是主要传染源。感染后的病鸡主要通过呼吸道和泄殖腔等途径向外界排毒，为该病主要的传染源。病鸡康复后可带毒49d，在35d内具有传染性。 2.传播途径：主要通过呼吸道和消化道传播。受污染的飞沫、尘埃、饮水、饲料、垫料等则是最常见的传播媒介。 3.易感性：鸡是IBV的自然宿主，但不同品种和品系的鸡群对IBV的敏感性不同。各种龄期的鸡均易感，其中,(1)呼吸型IB 以雏鸡和蛋鸡产蛋高峰发病较多；(2)肾型IB 多发生于10～50日龄的幼鸡；(3)腺胃型IB 多发生于30～80日龄的鸡) 流行特点：本病一年四季均流行，但以冬春寒冷季节较严重。本病属于高度接触性传染病，在鸡群中传播速度快，2周内可波及全场。发病率和死亡率与毒株的毒力和环境因素(如气温、通风、饲养密度、健康状况、日粮配合、应激等)有很大关系诱病因素：过冷、过热、拥挤、通风不良、维生素缺乏及疫苗接种会促进病的发生。

犬细小病毒的分离与鉴定

犬细小病毒的分离与鉴定摘要：采用细胞培养法对疑似犬细小病毒的粪便和内脏进行了分离和鉴定，并对分离到的病毒进行生物学特性鉴定和动物回归试验。结果共分离到3株CPV，分离株在猫肾细胞F81产生明显细胞病变，血凝效价达1∶27～1∶210，细胞病变能被犬细小病毒阳性血清所抑制，接种幼犬后，分离株3可以引起试验犬发病死亡。关键词：犬细小病毒；分离；鉴定犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）属于细小病毒科细小病毒属，为单股、负义、线形无囊膜的DNA病毒[1]。CPV可引起犬的出血性肠胃炎和心肌炎，并使白细胞大量减少，在幼犬中的发病率和死亡率都很高[2]。CPV对多种理化因素和常用消毒剂具有较强的抵抗力，在4～10 ℃存活6个月，37 ℃存活2周，56 ℃存活24 h，80 ℃存活15 min，在粪便中可存活数月至数年[3]；该病毒对乙醚，氯仿和醇类有抵抗力[4]。CPV一年四季均可发病，以冬、春多发[5]，饲养管理条件骤变、长途运输、寒冷、拥挤均可促使该病发生[6]。病犬是主要传染源，其呕吐物、唾液、粪便中均有大量病毒[7]。根据临床症状和血清学反应，可做出准确诊断[8-13]。本研究通过对山东毒株分离，并对其部分生物学特性进行研究，为该病的防治和后续研究提供一定的理论基础。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 主要试剂DMEM培养基为Gibco产品；小牛血清、谷氨酸胺、双抗、胰蛋白酶等购自大连宝生物TaKaRa有限公司；其他化学试剂均为分析纯试剂。 1.1.2 病料病料为2009～2011年聊城大学兽医院收集或其他养犬场送检的可疑CPV病料，包括20份粪便样品和10份脏器。 1.1.3 试验动物和细胞8只40～50日龄的山东细犬幼犬（抗CPV HI抗体效价小于1∶4），健康状况良好；猫肾传代细胞系（F81）和犬肾传代细胞系（MDCK）等由聊城大学农学院实验室保存。 1.2 方法 1.2.1 试剂的配制 1）1%猪红细胞悬液的制备。用20 mL注射器内吸入阿氏液3～5 mL，于健康猪前腔静脉采血10～15 mL，立即混匀，4 ℃保存备用。使用时用PBS洗涤保存的猪红细胞，1 000 r/min离心5 min，洗涤3次，取红细胞泥1 mL加稀释液100 mL，再加入小牛血清白蛋白0.1 g，即为1%猪红细胞悬液。 2）HA抗原配制。用移液器向V型血凝板每孔加稀释液25 μL，然后吸取25 μL经福尔马林灭活的CPV细胞培养物，在血凝板上倍比稀释，最后1孔不稀释，作为阴性对照；接着每孔加稀释液25 μL和1%猪红细胞悬液50 μL，于振荡器上振荡1 min混匀，于4 ℃冰箱静置1～2 h，待红细胞完全沉淀后判定。判定的方法是以50%红细胞凝集为终点，在对照孔红细胞完全不凝集，呈圆形小点

病毒的分离鉴定

病毒的分离与鉴定要证明某种疾病是由某一感染性病毒所引起，则必须满足以下原则： ①从患病者体分离出病毒； ②在实验动物或寄主细胞中可以培养； ③证明这种培养物具有滤过性； ④在原始宿主或相关种属能产生同样的病症； ⑤能重新分离出病毒。 1.病毒的分离 1.1标本的处理 1.1.1标本的收集 a)粪便标本：将5g粪便标本和50ml PBS放入盛有20-25颗玻璃小珠的100ml无菌瓶中，搅拌成悬液，倒出上清，3000×g，4℃离心6min。 b)拭子和生物体液：拭子浸在2-3ml运载培养基中，将棉拭子中的液体尽量挤出以获得标本，如果液体被污染，应3000×g 4℃离心30min。 c)组织标本：用无菌乳钵或匀浆器研磨组织标本，同时加入足量的 PBS制备成20%的悬液，3000×g 4℃离心30min。 1.1.2 除菌处理 a)粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位/毫升，置4℃过夜。 b)鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2000单位/毫升，置4℃作用4 小时。

c) 对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、呼肠孤病毒、腺病毒、痘病毒等，则可加入等量的乙醚4℃过夜除菌。 1.2 病毒的分离培养病毒是严格的细胞寄生微生物，培养病毒必须使用细胞。根据病毒的不同选用敏感动物（动物接种）、鸡胚（鸡胚接种）或离体细胞进行分离培养（细胞培养）。 1.2.1 鸡胚接种 a) 鸡卵的选择：一般都选新鲜、10天以的受精卵以保证规格质量上的一致。 b) 孵育：孵育时可将鸡卵放入卵箱进行,气室向上，孵育的最适温度为38--39℃，相对湿度为40—70％，孵育8日后，鸡卵应每天翻动1—2次，以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。 c) 检卵：鸡卵孵育4～5天后，即可用检卵器检查鸡胚发育情况（二天一次）。①未受精鸡卵：在检卵器上仅见到模糊的阴影。②活鸡卵：鸡胚发育4天后，在检卵器上就可见到清晰的血管，鸡卵有一小黑点（鸡胚），有明显的自然转动。③死胎：如果发现鸡卵血管模糊、扩、胚胎活动呆滞或不能自主地转动，则可判断胚胎频死或已经死亡，应将其挑捡出来。鸡胚孵育完毕后，用铅笔划出气室边缘和胚胎的位置待用。 d) 接种：

浅析鸡传染性支气管炎、喉气管炎与禽流感的鉴别诊断要点

龙源期刊网 https://www.wendangku.net/doc/cb5224617.html, 浅析鸡传染性支气管炎、喉气管炎与禽流感的鉴别诊断要点作者：乔保磊来源：《农家科技下旬刊》2017年第12期摘要：鸡传染性支气管炎、喉气管炎和禽流感都是危害养鸡业发展的重要疫病，临床上极易出现错判误断，贻误病情，分析区别三种疫病临床症状、发病原因、流行特点、剖检变化等诊断要点，准确判别出鸡群所患的疫病，及时采取有效措施，防治疫病发生和流行。关键词：支气管炎；喉气管炎；禽流感；鉴别；诊断进入21世纪以来，养鸡业迅速发展，规模场不断增加，已经成为主要的养殖模式；同时养鸡业的快速发展丰富了人们的“菜篮子”，提高了人们的生活水平。养鸡业现已成为促进农业发展、增加农民收入的主要产业，很多贫困户依靠养鸡已经脱贫致富。然而，在养鸡生产中，疫病仍然是阻碍发展的最大“天敌”，很多疫病对养鸡业威胁很大，给养殖场户造成巨大损失。我们常见的鸡传染性支气管炎、喉气管炎、禽流感在整个养殖生产中是发病率、死亡率、危害率较高的疫病，可以说98%以上的养殖场都发生过这几种病，由于这几种病在流行特点、临床症状、发病规律、病理变化等方面极为相似，临床上容易出现误诊误判，以至于造成防治失败，给养殖场造成损失。分析区别鸡传染性支气管炎、喉气管炎、禽流感的诊断要点，准确判断鸡群发生的疫病，有针对性地开展防治工作。笔者根据多年的积累，总结出三种疫病的鉴别要点，供大家在今后的养殖生产中借鉴。一、流行特点 1.发病季节性。三种疫病的发病季节没有明显差异，都是秋末、冬季和早春季节多发，但是禽流感在春季的发病率高于传染性支气管炎、传染性喉气管炎，而传染性支气管炎、喉气管炎在冬季的发病率高于禽流感。 2.饲养条件不良。鸡群拥挤、通风不畅、阴雨潮湿、贼风侵袭、饲养管理不善、缺乏维生素、营养不良、寄生虫感染等因素能够引发三种疫病发生流行，这些因素可用来区别于其他疫病。 3.易感性。传染性支气管炎感染鸡，5周龄以内的鸡感染后症状明显，没有品种差异。传染性喉气管炎主要侵害鸡，各种年龄及品种的鸡均可感染。但以成年鸡症状最为特征。

病毒分离鉴定技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的猪的一种繁殖障碍与呼吸困难的传染病。其特征为发病母猪厌食、发热，怀孕后期发生流产、死胎和木乃伊胎，幼龄仔猪发生呼吸道症状[1]。1987年在美国中西部首先发现该病，并分离到病毒，其后在北美、欧洲、亚洲等国家流行。目前该病已在全球范围内传播、蔓延。我国郭宝清等[4]于1996年首次从暴发流产的胎儿中分离到PRRSV。国内诸多血清学检测结果表明，该病在我国许多地方已有流行[5]。河南某猪场"猪场发生临床症状疑似PRRS的传染病，用间接ELISA法检测，呈PRRS 抗体阳性。从病猪肺、淋巴结病料中分离到1株疑似PRRSV，并对其进行了一系列的鉴定。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1病料采自河南某猪场疑似PRRS发病仔猪肺脏及淋巴结。 1.1.2细胞及血清细胞系Marc145、Vero、PK15均购自中国兽药监察所；阳性血清购自中国兽药监察所；阴性血清采自无PRRS病史猪场的新生仔猪血清，经中和试验证明为阴性。 1.1.3主要试剂及试剂盒RNasin、dNTP、反转录 Buffer、MMLV、rTaq酶均购自宝生物(大连)工程有限公司；琼脂糖为 Sigma公司产品；其他常规试剂均为分析纯；UNIQ10柱式Trizol 总RNA抽提纯化试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.1.4RTPCR引物设计根据GenBank公布的PRRSV美洲株ORF5核苷酸序列，参照文献[6]自行设计并由宝生物(大连)工程有限公司合成下述一对引物，引物扩增片段长度为720bp；上游引物P1 5′CTG GAG CCG TGC TAT CAT3′；下游引物P2 5′TCC ATT TCA TGA CAC CTG3′。 1.2方法 1.2.1细胞培养生长液为含100 mL/L新生牛血清(NCS)的RPMIl640培养液；维持液为含20 mL/L NCS的RPMIl640培养液。Marc145、Vero和PK15细胞均在体积分数为5%的CO2培养箱中于37 ℃培养至单层后传代培养。 1.2.2病料的处理无菌采集发病仔猪的淋巴结、肺脏、脾脏等组织并剪碎，用Hanks液研磨并制成5倍～10倍的乳悬液，反复冻融3次后，经5 000 r/min离心30 min，上清悬液用0.22μm微孔滤膜过滤后，－20 ℃保存备用。 1.2.3病毒的分离将上述处理的病料悬液1 mL分别接种于长成单层的 Marc145细胞、Vero细胞和PK15细胞，37 ℃吸附1 h，补加维持液至8 mL，继续培养3 d～5 d，反复冻融3次，收获培养上清液，同时设参考毒株、正常细胞作为对照。出现典型PRRSV细胞病变时按上述方法继续传代，供进一步检测备用，连传5代未出现CPE者判为阴性。

病毒的分离与测定

第二十九讲病毒的分离与测定教学目的：掌握病毒效价的测定方法教学重点：噬斑法、终点法教学难点：病毒的分离与鉴定课时分布：1学时教学过程：一、病毒的分离与纯化 1、病毒的分离病毒的分离是将疑有病毒的样品经处理后，接种于敏感的宿主，经培育后，通过检查其特异性病理表现或其它方法以肯定病毒的存在。（1）标本的采集与处理标本应含有足够量的活病毒；加入抗菌素除细菌；研磨或超声波处理破碎细胞，让病毒充分释放出来；标本处理后立即接种，否则冷冻保藏。（2）标本接种与感染表现接种实验宿主（动植物、细菌）、鸡胚或细胞（要求：操作简单、易于培养、产生的感染结果易判定）。噬菌体以噬菌斑为标记；动物病毒产生致细胞病变效应；植物病毒致敏感质感植物出现坏死斑或枯斑。 2、病毒纯化通过分离得到的是病毒感染的宿主机体、组织或破细胞后的抽提物，或感染的宿主的体液、血液和分泌物，或培养液，须将杂质成分除去。（1）病毒纯化的标准：纯化的病毒制备物应保持其感染性；纯化的病毒毒粒应具有均一性。（2）病毒纯化的方法毒粒的主要成分是蛋白质，故可利用蛋白质提纯方法纯化；毒粒具一定的大小、形状和密度，可离心提取。二、病毒的测定在谷氨酸、抗菌素、酶制剂等生产中，经常出现不正常的发酵现象。发酵缓慢、发酵液含菌数下降、菌体畸形、耗糖缓慢或停止，镜检时发现有云雾状碎片，严重时以致倒罐。

1、病毒的物理颗粒计数（1）电镜下直接计数（2）血细胞凝集试验许多有包膜的动物病毒能在一定条件下凝集一定种类的脊椎动物红血球，凝集量与病毒浓度成正比。此外，可根据病毒的抗原性质，与抗体发生特异性结合，利用分光光度计对病毒进行定量。但灵敏度较低，多在特殊情况下使用。总之，该方法测得的是有活力与无活力病毒数量的总和。 2、病毒的感染性测定测定的是因感染所引起宿主或细胞发生某一特异性病理反应的病毒数量。病毒感染单位：能引起宿主或宿主细胞一定特异性反应的病毒最小剂量。病毒效价：指单位体积病毒悬液的感染单位数目。（1）噬菌斑的测定噬菌斑：噬菌体感染敏感细胞后，通过复制使宿主细胞裂解，释放大量噬菌体，扩散到周围的细胞中，继续侵染，从而在有噬菌体的地方形成一个透亮无菌近似圆形的空斑。它是phage存在的一种指示性指标。在液体培养基中培养物变清。一个phage产生一个噬菌斑，故可根据在固培上形成的噬菌斑数测得phage的效价。通常是将噬菌体悬液分别与高浓度的敏感细菌以及半固体琼脂均匀混合后涂布在较高浓度的营养琼脂上，培养后计算噬菌斑数便可算出噬菌体效价。 ①双层平板法底层培养基10ml 上层培养基4ml、凝固指示菌0.2 ml、检样0.1 ml →32℃16-24h 测定前，事先配制含2%和1%的琼脂底层培养基和上层培养基，将铺成平板，用无菌吸管吸取一定量的指示菌和被测样品与上层培养基混合，冷到45℃迅速倒在底层平板上铺平，凝固后恒温培养16—20小时，如有phage存在，则在双层琼

鸡传染性支气管炎病毒的分离与鉴定

目录中文摘要 (2) Abstract (3) 引言 (4) 1 材料与方法 (5) 1.1 材料 (5) 1.1.1 病料 (5) 1.1.2鸡胚、鸡红细胞 (5) 1.1.3 主要试剂 (6) 1.1.4 主要仪器设备 (6) 1.1.5 引物 (6) 1.2 方法 (7) 1.2.1 病料的采集和处理 (7) 1.2.2 病毒的增殖与纯化 (7) 1.2.3 病毒的RT-PCR检测 (7) 1.2.4 鸡胚尿囊液的血凝活性测定 (8) 1.2.5 鸡胚尿囊液的RT-PCR检测 (8) ）的测定 (8) 1.2.6 毒株半数感染量（EID 50 2 结果与分析 (10) 2.1 病鸡剖检结果分析 (10) 2.2 病毒RT-PCR检测结果分析 (10) 2.3 传毒结果 (11) 2.4 传代鸡胚尿囊液的血凝检测结果分析 (11) 2.5 传代鸡胚尿囊液的RT-PCR检测结果 (11) 检测结果分析 (11) 2.6 EID 50 2.6.1 鸡胚胚病变情况 (11) 的计算结果 (12) 2.6.2 EID 50 3 讨论 (12) 致谢 (14) 参考文献 (15)

鸡传染性支气管炎病毒的分离与鉴定动物医学专业指导老师摘要：2011年4月17日，山东省临沂某大型养鸡厂送检一批疑似感染传染性支气管炎病毒的病（死）鸡，调查得知该鸡群临床上表现咳嗽、甩鼻，食欲不振，精神不佳，脱水，排白色稀粪，爪干、消瘦等症状且死亡率高，现进行病鸡剖检，病变表现为气管出血，“花斑肾”。采集相关病料研磨并反复冻融后，进行RT-PCR检测结果发现IBV阳性，初步诊断该鸡群发生了鸡传染性支气管炎。将病料接种10日龄SPF鸡胚进行盲传，收集各代尿囊液进行血凝试验、RT-PCR检测，同时观察对鸡胚的致病变特征，结果发现血凝试验均呈阴性，RT-PCR结果IBV表现阳性，新城疫（NDV）、禽流感（AIV）等其他外源病毒阴性，鸡胚表现蜷缩、生长阻滞现象，符合IBV的生物学特征，表示成功分离到了1株鸡传染性支气管炎病毒。关键词：传染性支气管炎病毒；分离鉴定；RT-PCR

鸡传染性支气管炎的研究进展

鸡传染性支气管炎的研究诊断文献综述题目：鸡传染性支气管炎的研究进展

鸡传染性支气管炎的研究进展摘要鸡传染性支气管炎（Avian Infedtious Bronchitis，简称IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（Avian Infectious Bronchitis Virus，IBV）引起的鸡的一种急性高度接触性传染病，主要侵害鸡的呼吸、泌尿生殖和消化系统。IBV往往引起混合感染，也可引起产蛋鸡的产蛋量和鸡蛋品质的下降，甚至造成成年鸡的死亡，从而加重了对鸡群的危害，也给养鸡业造成很大的损失，是目前危害我国养禽业的主要疫病之一。我国在80年代初发现有IB的存在，随后IB在国内相继爆发，且流行十分广泛。IBV 的血清型至少有29种之多，并不断出现新型。在生产过程中，免疫失败的现象时有发生，传染性支气管炎成为禽病防治工作中的一大难题。因此，研究不同地区IBV的发生，血清型的鉴定和分子病原学研究，揭示IBV分子变异机理，对于从根本上控制传支，具有重要意义。关键词鸡、冠状病毒、传染性支气管炎、IBV 1.IB的历史 IB于1931年由shalk首先报道于美国，1936年Beach和Schalm确定了该病原[1]。在我国，20世纪40年代，传支主要以呼吸道症状、产蛋量下降为主。1962年，Winterfield 和Hitchner在美国报道了肾病变型IB，证实IBV的某些毒株可主要引起肾脏病变。1972年在广东首次发现本病。1985年EI-Houadtih和Jone在摩洛哥分离了一种以致肠道病变为主的IBV肠型变种，该毒株除引起气管、肾脏和生殖道的的病变外，还可以造成肠道损害[2]。1994-1995年，江苏、山东等省爆发了腺胃型传支，但该病的病因尚有争论[3]。1997年王玉东报道的腺胃病变型鸡传染性支气管炎，多数学者认为是由冠状病毒引起的鸡传染性支气管炎就是禽流感的代名词。也有人从腺胃病变中分离到新城疫病毒和网状内皮组织增殖病病毒等。 2.病原学 2.1形态 IBV属于冠状病毒科，冠状病毒属，单股正链RNA，呈螺旋对称，形态多样，大都数为球形，直径为80-120nm，囊膜表面呈松散状，上有均匀排列的花冠状的纤突样蛋白，纤突长约20nm，其末端呈球状，易从病毒粒子上脱落，纤突不如副粘病毒的棒状纤突排列紧密，有间隙，使病毒外形酷似皇冠。IBV内部有RNA和蛋白质组成的螺旋状核衣壳组成，宽约9-16nm，呈长颈瓶样或圈样[4]。

病毒的分离鉴定

病毒的分离鉴定 Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT

病毒的分离与鉴定

（一）病毒的分离病毒分离的一般程序是：检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状鸡胚→病变或死亡细胞培养→细胞病变→鉴定病毒种型(血清学方法)无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离… （一）病毒的分离病毒分离的一般程序是：检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状鸡胚→病变或死亡细胞培养→细胞病变 →鉴定病毒种型(血清学方法) 无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离心后，取上清接种；咽洗液、粪便、尿、感染组织或昆虫等污染标本在接种前先用抗生素处理，杀死杂菌。 1．细胞培养用分散的活细胞培养称细胞培养（Cell culture）。所用培养液是含血清（通常为胎牛血清）、葡萄糖、氨基酸、维生素的平衡溶液，～。细胞培养适于绝大多数病毒生长，是病毒实验室的常规技术。原代细胞培养(Primary cell culture) 用胰蛋白酶将人胚（或动物）组织分散成单细胞，加一定培养液，37℃孵育1-2天后逐渐在培养瓶底部长成单层细胞，如人胚肾细胞、兔肾细胞。原代细胞均为二倍体细胞，可用于产生病毒疫苗，如兔肾细胞生产风疹疫苗，鸡成纤维细胞产生麻疹疫苗，猴肾细胞生产脊液灰质炎疫苗。因原代细胞不能持续传代培养，故不便用于诊断工作。二倍体细胞培养(Diploid cell cultune) 原代细胞只能传2-3代细胞就退化，在多数细胞退化时，少数细胞能继续传下来，且保持染色体数为二倍体，称为二倍体细胞。二倍体细胞生长迅速，并可传50代保持二倍体特征，通常是胚胎组织的成纤维细胞（如WI-38细胞系）。二倍体细胞一经建立，应尽早将细胞悬浮于10%二甲基亚砜中，大量分装安瓿贮存于液氮（-196℃ ）内，做为“种子”，供以后传代用。目前多用二倍体细胞系制备病毒疫苗，也用于病毒的实验室诊断工作。传代细胞培养 (Continous cell culture) 通常是由癌细胞或二倍体细胞突变而来（如

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