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分子生物学

CH1 绪论

分子生物学:它是研究核酸、蛋白质等生物大分子的结构与功能,并从分子水平上阐述蛋白质与核酸、蛋白质与蛋白质之间相互作用的关系及其基因表达调控机制的学科。

分子生物学研究内容:1.生物大分子的结构功能研究;2.DNA复制、转录、翻译;3.基因表达调控研究;4.DNA重组技术。

模式生物(研究对象):病毒、细菌、酵母菌、动物细胞、植物细胞。

中心法则:DNA的复制、转录和翻译。

生物大分子:相对分子质量为104到1012的有机化合物。

生物大分子种类:蛋白质、核酸、多糖等

CH2蛋白质

蛋白质的结构:1.一级结构:氨基酸的序列

2.二级结构:α螺旋、β折叠

3.三级结构:由二硫键、氢键、金属离子作用形成的三维高级结构

4.四级结构:有多个具有三级结构的蛋白质亚基组成的高级结构。

一级结构:

一级结构包括以下内容:1.组成蛋白质的多肽数目

2.每一条肽链中末端氨基酸的种类

3.每一条肽链中氨基酸的数目、种类和排列顺序

4.链内和链间的二硫键的位置和长度

结构与功能的关系:1.结构不同、功能不同

2.结构有差异,功能不一定不相同

多肽链的基本参数:1.平均每个氨基酸的分子量110

2.展开的长度1000-5000 AA

折叠后的长度40-80 A

二级结构:

氢键维持着蛋白质的二级结构

α螺旋:1.是蛋白质二级结构的主要形式之一。

2指多肽链主链围绕中心轴呈有规律的螺旋式上升,每3.6个氨基酸参节螺旋上升

一圈向上平移0.15 nm,螺距为0.54 nm。

3.螺旋方向为右手螺旋。

4.氨基酸侧脸R基团外展。

5.每个肽键的N-H和第四个肽键的羰基氧形成氢键,氢键方向与螺旋长轴基本平行。

链中所有肽键都可形成氢键,故α螺旋十分稳定。

β折叠:1.此结构的氢键主要是由两条肽链之间形成的;也可以在同一肽链的不同部分之间形成。

2.几乎所有肽键都参与氢键的交联,氢键与链的长轴接近垂直。

3.台联的主链呈锯齿状折叠构象

4.在β折叠中,α碳原子总是处于折叠的角上,氨基酸的R集团处于折叠的棱角上

并与棱角垂直;两个氨基酸之间的轴心距为0.35 nm

三级结构:

纤维状蛋白:由细长的α螺旋或β折叠构成,细胞、组织或器官的结构组成部分,难溶于水和其他溶剂的蛋白质。

球状蛋白:短的α螺旋或β折叠穿插在卷曲的蛋白中,有催化作用,结构紧密,可溶于水的蛋白。

维持蛋白质三级结构的化学键:氢键、范德华力(最弱)、疏水作用力、离子键(最强)、二硫键、配位键。

四级结构:多亚基蛋白

酶底物复合物形成机理:诱导-契合模型

CH3核酸和染色体

碱基:DNA含有4种杂环碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T);RNA 中尿嘧啶(U)替换了(T)。

一级结构:是核苷酸的序列

磷酸二酯键:核酸链中,核糖或脱氧核糖的5’位与其相邻的3’位之间的磷酸键相连接形成。方向:5’-P到3’-OH

二级结构:DNA双螺旋结构

主要内容:1.两股DNA链共同形成右手螺旋,螺距为3.4 nm,直径 2.0 nm

2.链的骨架由亲水的脱氧核糖基团和磷酸基团构成,位于双螺旋外侧。

3.碱基位于双螺旋内侧,遵循碱基互补配对原则(A-T两个氢键;C-G三个氢键);

碱基对层间距0.34 nm

4.方向:双螺旋中两股链的走向是反向平行的。一股为5’-3’,另一股为3’-5’。

5.两股连之间在空间上形成一条大沟和一条小沟。

The G+C content:核酸中的(G+C)占总碱基数的摩尔比(mol %)。

双螺旋类型:1.右手螺旋:BACDE

2.左手螺旋:Z

A-DNA、B-DNA和Z-DNA的比较:

A-DNA B-DNA Z-DNA

螺旋方向右手右手左手

每圈螺旋碱基数11 10 12

每对碱基上升距离0.255nm 0.34nm 0.37nm

螺距 2.8nm 3.4nm 4.5nm

三级结构:DNA的超螺旋结构

超螺旋:DNA双链本身进一步盘绕形成超螺旋。

正超螺旋(右旋);负超螺旋(左旋)

超螺旋的意义:(1)DNA的负超螺旋产生的结构张力促进双螺旋的解旋

(2)正超螺旋可使DNA形成高度致密的状态而折叠于有限空间。

核酸的理化特性:

1.稳定性:氢键提供了基础的稳定性

2.酸碱的影响:强酸将核酸水解为碱基、糖、磷酸。

弱酸可以脱嘌呤

强碱会使DNA和RNA发生互变异构

核酶:具有催化功能的RNA分子,是生物催化剂。

解链温度(Tm值):核酸加热变性过程中,紫外吸收值达到最大值的50%时的温度。

Tm=69.3+0.41(G+C)(成立条件:GC含量在30%-70%之间)

影响Tm值的因素:1.GC含量

2.DNA长度:一定条件下,核酸分子越长,Tm值越大。

3.离子强度:溶液离子强度较低时,Tm值较低。

4.PH

5.变性剂:甲酰胺、尿素

变性:DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。(变性时氢键断裂,双螺旋稳定性破坏,一级结构不改变。)

复性:变性的DNA分子在适当条件下,两条互补链部分或全部恢复到天然双螺旋结构的现象。

退火:热变性的DNA冷却后可复性的过程。

杂交:两条单链DNA或RNA的碱基配对

CH4 基因和基因组

基因:核酸中贮存遗传信息的遗传单位。是贮存有功能的蛋白质、多肽链或RNA序列信息,以及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列。

基因的基本结构:

1.细菌的基因结构—多顺反子

顺贩子:是一个基因。

多顺反子mRNA:受同一启动序列调控,被一起转录和翻译生成多种蛋白质的mRNA。2.真核生物的基因—断裂基因

断裂基因:真核生物结构基因,由编码区和非编码区互相隔开又连续镶嵌而成,去除非编码区再连接后,可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质,这些基因称为断裂基因。

内含子:在转录后的加工中,从最初的转录产物除去的内部的核苷酸序列。

外显子:既存在与最初的转录产物中,也存在与成熟的RNA分子中的核苷酸序列,可在蛋白质生物合成过程中被表达为蛋白质。

真核生物的基因结构:

分子生物学

3.病毒基因—重叠基因

重叠基因:能编码两种或两种以上的蛋白质分子的DNA片段。

基因组:单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部DNA分子或RNA分子

1.病毒基因组的一般特点:

a.只含有一种核酸,单链或双链,闭合或线状分子;

b.基因组很小,遗传信息量也少,不同病毒基因组大小差异大。

c.相关基因集中成簇

d.大部分为编码序列,基因之间的间隔序列很短,通常有重叠基因。

e.噬菌体的基因是连续的,但真核细胞的病毒都含有不连续基因。

f.除了逆转录病毒外,通常为单倍体基因组。

2.细菌基因组的一般特点

a.通常由一条环形或线形双链DNA分子组成。

b.有操纵子结构,多个相关的结构基因串联在一起,受同一调控区调节,合成多顺反子mRNA;具有多种调控区。

c.非编码DNA序列占比例少,且基因连续。

d.编码蛋白质的结构基因为单拷贝,但rRNA基因一般是多拷贝的。

3.真核生物基因组的特点:

a.多条线状染色体,分子量很大

b.含有大量的重复序列;基因是不连续的。

c.单拷贝,单顺反子

d.具有复杂的调控结构区。

细菌与真核生物基因组特点比较:

细菌基因组真核基因组

1.通常由一条环形或线形双链DNA分子组成 1.多条线状染色体,分子量大;DNA与蛋白

质结合稳定,形成高级结构。

2.只有一个复制起始点 2.有多个复制起始点

3.具有多种调控区。

3.有操纵子结构,多个相关的结构基因串联在

一起,受同一个调控区调节,合成多顺反子

mRNA

4.单拷贝,单顺反子。

4.编码蛋白的结构基因为单拷贝;但RNA基

因一般是多拷贝的。

5.非编码DNA占比例少,基因连续 5.含有大量重复序列,基因不连续

6.无核膜,无转录后加工,转录和翻译偶联 6.有核膜,转录和翻译不偶联

7.具有可移动的DNA序列组分7.可移动的基因

CH5 DNA复制

DNA的半保留复制:分别以两条亲本连为模版,合成两个新链,新形成的双链中,一条是原来的亲本链,一条是合成的新链。

复制子:DNA中发生一次复制的单位。

复制叉:双螺旋DNA两条亲本链分开使得复制能进行的部位。

复制眼:在一个长的未复制的区域内已经复制的DNA区域

半不连续复制:DNA在复制时先导链是连续的,随从链的合成是先形成小片段,之后再连接成大片段。这样的方式称为半不连续复制。

拓扑异构酶:是一类改变DNA拓扑性质的酶,它参与DNA拓扑异构反应,在生物体内可能参与了DNA的复制与转录。

半保留复制的实验证明:

菌体在15N标记的NH4培养基培养了15代,DNA中有15N

然后将菌体转移至14N的标记的培养基中,得到了15N14N-DNA和14N14N-DNA

先导链:由5’至3’端复制不间断的DNA链。

随从链:由3’至5’端间断复制的DNA链。

冈崎片段:是一段有1000-2000bp的短片段,出现在随从链中,参与DNA复制。

原核生物DNA复制:

DNA复制体系:1.亲代DNA分子为模版。

2.四种脱氧三磷酸核苷(dNTP)为底物

3.提供3’-OH末端的引物

4.多种酶和蛋白质:DNA拓扑异构酶、DNA解链酶、单链结合蛋白(SSB)、

引物酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等。

参与DNA复制的酶和蛋白质:

A.拓扑异构酶(既能水解、又能连接磷酸二酯键)

Topo Ⅰ型:切开双螺旋的一条链,改变一个互绕数。

Topo Ⅱ型:切开双螺旋的两条链,改变两个互绕数。

Gyrase旋转酶,促旋酶:一种Topo Ⅱ型酶,它能催化松弛DNA负超螺旋,需ATP;在无ATP时催化超螺旋DNA松弛。

B.解链酶:在复制起始点处打开氢键、解开双链,需ATP。

C.单链结合蛋白(SSB):—与解开的单链DNA结合,使其稳定不会再度螺旋化。

—避免核酸内切酶对单链DNA的水解,保证了其作为模版时的

延伸状态。

—可重复利用。

D.DNA聚合酶:以DNA为复制模版,将DNA由5’端开始复制到3’端的酶。

共同特点:1.都以dNTP为底物。

2.都需要Mg2+激活。

3.聚合时必须有模板链和具有3’-OH末端的引物链

4.链的延伸方向为5’-3’。

校阅作用:可以在复制时对配上的碱基进行检查并切开错配的碱基。

缺口平移:DNA polⅠ的DNA聚合酶活性和5’-3’外切酶协同作用,可以使DNA链上的切口向前推进的的反应。

原核生物DNA中的三种DNA聚合酶

分子生物学

E.引物酶

引物:一种由RNA聚合酶催化形成的一个约1-60bp的短片段,可以使DNA链进行复制。引物酶:催化引物形成的酶。

F.连接酶:可以连接DNA链上的缺口。

复制的基本过程:

1.起始阶段:包括解链、引发体的形成

2.DNA链的延长:包括前导链以随从链的形成和切除RNA引物后填补空缺及连接冈崎片段。

3.终止阶段。

原核生物的复制:(以oriC为例)

oriC序列是E.col的唯一复制起始位点

DnaA稳固9个核酸序列

复制起始点核苷酸序列特征:TTAT CCACA

A.起始阶段:

a.DNA超螺旋的解旋

分子生物学

解旋酶使DNA的两条链分开。需ATP水解供能。

b.引发体的形成:起始需要解链酶、单链结合蛋白和引物酶。

B.链的延伸阶段:

先导链的延伸

随从链的延伸

DNA复制时随从链的回环模型

C.链的终止:

终止位点:在起始位点的对面。通常为23bp

Tus:终止时需要的一个36KDa的蛋白。Ter-Tus复合物能够阻挡复制叉的前移。

环状DNA复制到最后,由DNA拓扑异构酶Ⅱ切开双链DNA,分开亲子两条DNA链。

真核生物的DNA复制:

与原核的区别:1.更复杂的过程。

2.复制叉移动速度更慢

3.多复制起点。

端粒:真核生物染色体末端的蛋白质-DNA结构,其功能是完成染色体末端的复制,可以防止染色体融合、重组或降解。

端粒酶:一种自身携带模版的逆转录酶,催化端粒DNA合成,能够在缺少DNA模版的情况下延伸端粒的寡核苷酸片段

链式聚合酶反映(PCR):在DNA聚合酶催化下,以母链DNA为模板,以特定引物为延伸起点,通过变性、退火、延伸等步骤,体外复制出与母链DNA互补的子链DNA的过程。

CH6 DNA的转录

基因表达包括转录和翻译两个阶段:

1.转录生成信使RNA

2.翻译生成蛋白质

编码连:与mRNA序列相同的那条DNA链。

模板链:根据碱基互补配对原则指导mRNA合成的DNA链。

从DNA到RNA的转录:

原核生物:

转录:遗传信息由DNA转到RNA的过程。

RNA聚合酶:催化以DNA为模板,三磷酸核糖核甘酸为底物通过磷酸二酯键合成RNA的酶,方向5’-3’

转录单位:从启动子到终止子的一段序列,是一段以一条单链RNA分子为表达产物的DNA

片段。

模板链:只有一条链可以作为模板链。

转录的基本过程:

1.模板识别

2.转录起始

3.转录的延伸

4.转录的终止

模板识别:

启动子:RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列,含有RNA pol特异性结合与转录起始所需的保守序列位点,启动子本身不被转录。

启动子的4个保守序列:1.起始点

2.-10区

3.-35与-10序列间隔序列

4.-35序列

-10区:一个由5个核苷酸组成的保守序列,是聚合酶的结合位点。

-10区功能:1.与RNA pol紧密结合,形成开放启动复合物。

2.使RNA pol定向转录。

-35序列功能:1.为RNA pol的识别位点

2.RNA pol的核心酶只能起到模板结合和催化的功能,并不能识别-35序列,

只有σ亚基才能识别-35序列,为转录选择模板链。

-10区和-35区的最佳距离是16-19bp。

原核生物启动子的共同特点:1.结构典型,都含有识别,结合和起始三个位点

2.序列保守,如-35序列和-10序列都很保守。

3.位置和距离都比较恒定。

4.直接和多聚酶相结合

5.常和操纵子相邻

6.都在其控制基因的5’端

7.决定转录的启动和方向。

RNA聚合酶是转录过程中最关键的酶:

1.主要以双链DNA为模板,以4种核苷三磷酸作为活性前体。

2.需要Mg2+/Mn2+为辅助因子。

3.它不需要任何引物。

4.以5’-3’的方向合成RNA链

5.缺乏3’-5’外切酶活性

6.是一个含有多个亚单位的酶。

σ因子:是RNA聚合酶识别启动子的关键亚基,与RNA聚合酶结合使其转变为聚合酶全酶。RNA聚合酶覆盖区域-55-+20区域。

转录的起始过程:启动子的识别与起始转录

1.全酶与模板的DNA接触,生成非专一的,不稳定的复合物在模板上移动。

2.起始识别:全酶与-35序列结合,产生封闭的酶-启动子二元复合物。

3.全酶紧密地结合在-10序列处,模板DNA局部变性,形成开放的启动子二元复合体。

4.在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应,形成转录起始复合物。

转录延长:

1.σ亚基脱落,RNA pol聚合酶核心酶变构,与模板结合松弛,沿着DNA模板前移。

2.在核心酶作用下NTP不断聚合,RNA链不断延长

3.形成转录空泡

转录空泡:D NA解开两条单链与RNA聚合酶及其转录产物RNA构成的转录复合物。

怎样用实验证实mRNA的合成总是沿着5’-3’方向进行的?

- E.coli 在0℃时需13秒才能机上一个核苷酸,在37℃时每秒可加上40个核苷酸。

-利用这个差别以14C来标记U,在0℃培养E.coli

-提取这种正在延长的mRNA分子,发现14C标记首先出现在伸长的3’端,因此可以证明合成是沿着5’-3’方向进行的。

终止:

当RNA链延伸到转录终止位点时,RNA聚合酶在DNA模板上停止前进,转录产物RNA链从转录复合物上脱落。

终止子:给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列。在一个操纵元中至少在结构基因群最后一个基因的后面有一个终止子。

-终止子通常含有自我互补区域,在RNA产物中可以形成茎-环或发夹结构。

E.coli中终止子的两种类型:1.内在型终止子

2.依赖ρ因子的终止子

内在型终止子:DNA模板近终止处有特殊的碱基序列,转录出RNA产物形成特殊的结构终止转录。

内在型终止子的三个结构特征:1.一段短的反向重复序列(约20核苷酸)

2.有他转录出mRNA可形成茎环结构,茎部富含GC可组织

RNA pol的前进。

3.末端polyU:U:A不稳定。

依赖ρ因子的终止:

特点:1.只含有自我互补区域可形成茎环结构,但在茎中的GC含量少,茎环易打开,终止需要ρ因子因子参与。

2. ρ因子与ssRNA的特定点结合

3. ρ因子通过催化NTP的水解促使新生RNA链从三元转录复合物中解离

ρ因子:是一个相对分子质量为2.0×105的六聚体蛋白。其功能是作为RNA pol的一种辅助因子。

穷追模型:1.ρ因子附着到RNA识别位点上

2.ρ因子跟在RNA pol后沿RNA移动

3.RNA pol在终止位点停下,被ρ因子追上

4.在转录空泡中ρ因子使DNA-RNA杂种双链解开,转录终止并释放出RNA pol、

ρ因子和RNA

顺反子:被转录后编码一条多肽链的DNA片段。

转录的过程总结

1.开始

-在原核生物中,当RNA聚合酶的σ亚基发现其识别位点(-35区)时,全酶就与启动子的-35区序列结合形成一个封闭的启动子复合物。

-全酶分子一段达到-10区,整个酶分子向-10序列转移并与之牢固结合,在此发生局部DNA解链,形成全酶和启动子的开放性复合物。

-在复合物起始位点和延长位点被相应的核苷酸充满,在RNA聚合酶β亚基催化下形成RNA的第一个磷酸二酯键。

2.延伸

-RNA聚合酶离开启动子,沿DNA链移动并使新生的RNA链不断延长的过程就是转录的延伸。

-此时σ因子就完成了它战一次起始的使命,从全酶解离下来,靠核心酶在DNA链上向下游滑动,而脱落的σ因子与另一个核心酶结合成全酶,可以反复利用。

3.终止

-转录是在DNA模板上某一位置停止的,人们比较了若干元和生物RNA转录终止位点附近的DNA序列,发现DNA模板上的转录终止信号有两种情况:

1.一类是不依赖与蛋白质因子而实现的终止作用

2.依赖是依赖蛋白质辅助因子才能实现的终止作用。

3.两类终止信号有共同的序列特征,摘终止之前有一段回文序列。

真核生物的RNA转录

真核生物的RNA聚合酶:

根据对α-鹅膏蕈碱的敏感性不用,分为3类ENA聚合酶

RNA pol 位置产物相对活性α-鹅膏蕈碱Pol Ⅰ核仁28s、18s、5.8s、

50-70% 不敏感

rRNA

20-40% 高度敏感Pol Ⅱ核质hnRNA、mRNA、

某些SnRNA

-40% 中度敏感Pol Ⅲ核质tRNA、5SrRNA、

某些SnRNAs

真核生物启动子特点:

1.有多种元件:TATA框、GC框、CATT框、OCT等

2.结构不恒定:有的有多种框盒;有的只有TATA框和GC框

3.他们的位置、序列、距离和方向都不完全相同。

4.有的有远距离的调控元件存在,如增强子,这些元件常常起到控制转录效率和选择起始

位点的作用。

5.不直接和RNA pol结合,转录时先和其他转录激活因子相结合再和聚合酶结合。

Ⅱ型基因的启动子和调控区

TATA框

-常在-25左右,相当于原核的-10序列。

-作用是:

1.选择正确的转录起始位点,保证精确起始,也称选择子

2.影响转录的速率。

增强子:能提高转录频率的序列,它可能远离转录起始位点,在其上有或下游。

特点:

1.具有远距离效应:常在上游-200bp处,但可增强远处启动子的转录。

2.无方向性:无论在靶基因的上游、下游或内部都可发挥增前转录的作用。

3.顺式调节:只调节位于同一染色体上的靶基因,对其他染色体上的基因无作用。

4.无物种和基因的特性:可以接到异源基因上发挥作用。

5.具有组织的特异性:增强子的效应需要特定的蛋白质因子参与。

6.有相位性:其作用和DNA的构象相关。

7.有的增强子可以对外部信号产生反应:如热体克基因在高温下才表达。

转录调控因子:真核生物RNA聚合酶不能直接识别基因的启动子区,需要一些蛋白因子的辅助按特定顺序结合与启动子上,RNA聚合酶才能与之相结合并形成复杂的前起始复合物以保证有效地起始转录。

转录后RNA的加工:

RNA加工的基本方式:1.从原初产物中删除一些核苷酸。

2.添加一些基因没有编码的核苷酸

3.对那些碱基进行共价修饰

rRNA的转录后加工:

原核:- rRNA前体被大肠杆菌RNaseⅢ,RNAseE等剪切成一定链长的rRNA分子- rRNA在修饰酶催化下进行碱基修饰。

真核:扑入动物的初级转录产物为45s,低等真核生物的rRNA前体为38s。

tRNA前体的加工:

原核:

-在7种rRNA操纵子中

-加工:

5’端的成熟:RNaseP切除5’端额外的几个核苷酸

3’端的成熟:6种RNase共同参与,机制不清

碱基修饰

真核:

-单顺反子、有内含子

内切酶修剪5’端引导序列和3’端两个核苷酸

tRNA核苷酸转移酶在3’末端添加CCA尾巴

去内含子

碱基修饰

核糖核酸酶P:是一种核糖核酸酶,也是一种核酶,有一个RNA分子发挥催化活性。功能是剪切tRNA分子中多余的前体或序列。

核酶:是具有催化功能的RNA分子,是生物催化剂,可降解特异的mRMA序列。

mRNA的加工:

原核生物mRNA不用加工

真核:1. 5’端口加帽

2. 3’端加多聚A尾

3. 剪切

4. 甲基化

1.加帽:在mRNA的5’-端加上m7GTP(7-甲基鸟核苷三磷酸)的结构。过程发生在细胞核内,转录开始即可加帽。

帽子类型:cap 0、cap 1、cap 2。

帽子结构功能:

1.保护5’端不被降解

2.帽子结构对mRNA前体的剪接是必需的

3.有助于mRNA通过核膜

4.使mRNA能与核糖体小亚基结合,被蛋白质合成的起始因子所识别,促进蛋白质合成。

2.加多聚腺苷酸尾:长约40-200bp

3’-末端PolyA尾的生成方式

-剪切因子在加尾位点AAUAA下游11-13nt处剪切RNA

-末端腺苷转移酶(PolyA聚合酶)合成PolyA尾巴。

多聚A的功能

-还不完全清楚

-可能与mRNA从细胞核转送到细胞质有关

-能稳定mRNA结构,保持一定的生物半衰期。

-对真核mRNA的翻译具有某种作用。

真核与原核mRNA特征比较

原核真核

1.mRNA常以多顺反子形式存在 1.一般以单顺反子形式存在

2.无5’端帽子结构和3’端尾巴 2.有5’端帽子结构和3’端尾巴,且有内含子

3.mRNA转录与翻译一般偶联 3.转录mRNA前体需经转录后加工

4.mRNA半寿期短 4.mRNA半寿期长

CH7 DNA的翻译

翻译:是指将mRNA链上的核苷酸从一个特点的起始位点开始,按每3个核苷酸代表一个氨基酸的远策,一次合成一条多肽链的过程。

转录和翻译统称为基因的表达。

在不同蛋白质分子中,氨基酸有着特定的排列顺序,严格按照蛋白质的编码基因中的碱基排列顺序决定的。

蛋白质的生物合成:

场所:核糖体

模板:mRNA

tRNA是模板与氨基酸之间的接合体

蛋白质合成需要多种蛋白质、酶和其他生物大分子的参与。

蛋白质合成是一个需能反映。

遗传密码:mRNA中含有遗传信息的碱基序列成为遗传密码

三联子密码:mRNA上没3个核苷酸翻译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸,这三个核苷酸成为三连子密码。

4种核苷酸可组成64个密码子,61个是编码氨基酸的密码子,3个即UAA、UGA、UAG是终止密码子。

遗传密码的特点:

1.三连密码、连续性、不重叠

2.简并性:多种密码子编码一种氨基酸的特性。

同意密码子:对应于同一氨基酸的密码子

3.通用性:不论是病毒、原核生物还是真核生物的密码子含义相同。

4.以AUG为起始密码子;UAA,UAG和UGA为终止密码子

5.MRNA从5’端到3’端的和核苷酸序列就决定了多肽链中N端到C端的氨基酸排列顺序。开放阅读框:从其实密码子到终止密码子的阅读框可能编码一条完整的多肽链,期间不存在是翻译中断的终止密码子。

编码区域:能够编码蛋白质的开放阅读框。

tRNA的功能:

只有tRNA上的反密码子能与mRNA上的密码子相互识别并配对,而氨基酸本身不能识别密码子,只有结合到tRNA上生成AAtRNA,才能被带到mRNA-核糖体复合物上,插入到正在合成的多肽链的适当位置上

1.专一性地识别氨基酸,形成氨基酰-tRNA,是氨基酸活化阶段。

2.依靠核糖体的特定位点,识别mRNA密码子。

tRNA三个功能区:1.氨基酸结合位点

2.反密码子区

3.识别区

氨基酰-tRNA合成酶:

功能:将氨基酸共价地与tRNA连接,包括两步反应

1.氨基酸活化生成氨酰-腺苷酸

2.氨酰基转移到tRNA3’末端腺苷残基的2’或3’羟基上。

20种分2大类:Ⅰ型:2’-OH;Ⅱ型:3’-OH

氨酰-tRNA合成酶决定蛋白质合成的真实性:

AA-tRNA合成酶既要能识别tRNA,又要能识别氨基酸,它对两者都具有高度的专一性,使氨基酸与对应的tRNA相结合

氨酰-tRNA合成酶利用校读功能来提高精确性。

原核生物中Met-tRNA fMet必须首先甲酰化生成fMet-tRNA fMet才能参与蛋白质的生物合成。

分子生物学

密码子与反密码子的识别:

1966年,Crick提出摆动假说。

摇摆假说:

1.任意一个密码字的前两位氨基都与tRNA中相应碱基形成Watson-Crick碱基配对。

2.反密码子第一位是A或C时,只能识别一个密码子。

当反密码子第一位是U或G时,能识别两个密码子。

当次黄嘌呤(Inosine,I)作为反密码子第一位时,能识别三个密码子。

3.如果数个密码子同时编码一个氨基酸,凡是第一、二位碱基不相同的密码子都对应于各

自的tRNA。

4.根据上述规则,至少需要32种不同的tRNA 才能翻译61个密码子。

同工tRNA:代表相同氨基酸的不同tRNA

SD序列:原核生物中每一个mRNA都具有其核糖体结合位点,它是位于AUG上游8-13个核苷酸处的一个短片段。

参与蛋白质合成的材料:

-核糖体:30S小亚基和50S大亚基。

-模板mRNA

-tRNA

-氨基酸

-酶和蛋白因子

-核苷酸及无机金属离子。

核糖体发挥生物学功能的5个基本部位

1.mRNA结合部位—小亚基

2.结合或接受AA-tRNA部位(A位)—大亚基

3.结合或接受tRNA部位—大亚基

4.肽基转移部位(P位)—大亚基

5.形成肽键的部位(转肽酶中心)—大亚基

大小亚基的生物学功能:

小亚基:通过密码子与反密码子的配对,识别并结合模板mRNA,蛋白质合成中A位、P位、E位的一部分。

大亚基:结合多肽链,催化肽键形成、蛋白质合成中A位、P位、E位的一部分。

多聚核糖体:合成蛋白质时,多个甚至十几个核糖体串联附着在一条mRNA分子上,形成念珠状结构。

翻译的过程

1.氨基酸的活化

2.翻译的起始

3.肽链的延伸

4.肽链的终止

5.蛋白质前体的加工

翻译的起始:

起始因子:

分子生物学

分为三步:

第一步:在IF-1作用下核糖体大小亚基分离,在IF-3作用下mRNA模板通过SD序列与30S 小亚基相结合。

第二步:在IF-2和GTP的帮助下,fMet-tRNA fMet进入小亚基的P位,tRNA上的反密码子与mRNA上的起始密码子配对,形成30S起始复合物。

第三步:带有tRNA、mRNA和3个翻译起始因子的小亚基复合物与50S大亚基结合,GTP 水解,释放翻译起始因子。

原核生物蛋白质合成的起始小结

①IF1 使70S核糖体解离成30S、50S亚基;

②IF-3结合到30S亚基上,形成稳定的30S小亚基;

③SD序列与小亚基内16S 3’端反SD序列之间有3个以上的碱基配对,使小亚基附着在mRNA 上,形成30S起始前复合物(即IF3-30S亚基-mRNA三元复合物);

④IF-2结合于起始tRNA(fMet-tRNA fMET),使fMet-tRNA fMET与30S亚基起始密码子结合,形成30S起始复合物;

⑤IF-3解离,50S亚基结合,同时释放IF1,IF-2使GTP水解并解离,形成完整的有活性的70S起始复合物。

肽链的延伸:

肽链延伸由许多循环组成,每加一个氨基酸就是一个循环,每个循环包括:

1.AA-tRNA与核糖体结合

起始复合物形成以后,第二个AA-tRNA在延伸因子EF-Tu及GTP的作用下,生成AA-tRNA·EF-Tu·GTP复合物,然后结合到核糖体的A位上

2.肽键的生成:由转肽酶/肽基转移酶催化

3.移位:

核糖体向mRNA3’端方向移动一个密码子。

需要消耗GTP,并需EF-G延伸因子。

肽链的终止:

-UAG、UAA和UGA

-终止因子:

原核:RF1识别UAA和UAG

RF2识别UAA和UGA

RF3作用不明确

真核:只有一种eRF

真核生物翻译起始复合物形成(区别原核生物):

-原核生物中30S小亚基首先与mRNA模板相结合,再与fMet-tRNA fMet结合,最后与50S 大亚基结合;

-在真核生物中,40S小亚基首先与Met-tRNA Met相结合,再与模板mRNA结合,最后与60S大亚基结合。

分子生物学

蛋白质翻译后的加工:

1.N端fMet或Met的切除

2.二硫键的形成

3.特定氨基酸修饰

4.切除新生链中非功能片段

5.蛋白质的折叠

分子伴侣:细胞内帮助新生台联正确组装,成为成熟蛋白质,而本身却不是最终功能蛋白质分子的组成成分的分子

6.与辅基结合

蛋白质的转运:

翻译转运同步机制:蛋白质的合成和转运同时发生

翻译后转运机制:蛋白质从核糖体上释放后才发生转运。

信号肽假说:

蛋白质前导序列:短的N 端序列,负责进出膜。

信号肽:常指新合成多肽链中用于指导蛋白质的跨膜转移的N-末端的氨基酸序列

前导肽:信号肽的一种,位于成熟蛋白的N端,引导蛋白穿膜,并且在后来被剪切掉。

信号肽结构特点:

①常位于蛋白质N末端,可被切割掉

②长度:13~36个氨基酸残基

③序列内有10~15个疏水氨基酸;

④靠近该序列N 端常有1个或数个带正电荷氨基酸;

⑤其C-末端靠近蛋白酶切割处常带有数个极性氨基酸,离切割点最近的那个氨基酸往往带有很短的侧链(Ala或Gly)。

小结:

1、氨基酸的活化

2、翻译的起始

3、肽链的延伸

(1)AA-tRNA与核糖体A位点结合

(2)肽键的形成

(3)移位

4、肽链的终止

5、蛋白质前体的加工

(1)N端fMet或Met的切割

(2)二硫键的形成

(3)特定氨基酸的修饰

(4)切除新生链中非功能片段

6、蛋白质运输

(1)翻译运转同步机制

(2)翻译后转运机制

(3)核定位蛋白的转运机制

CH8 基因表达调控

基因表达:包括基因转录及基因翻译的过程。

基因表达调控:对基因表达的调节。

组成性表达:指不大受环境变动而变化的一类基因表达。

管家基因:其基因表达产物是细胞或生物体内不可缺少的,这样的基因叫管家基因。

适应性表达:指环境的变化容易使其表达水平变动的一类基因表达。

诱导:应环境条件变化基因表达水平增高的现象。

阻遏:随环境条件变化而基因表达水平降低的现象。

时间特异性:按功能需要,某一特定基因的表达严格按特定的时间顺序发生的特性。

空间特异性:在个体生长全过程,某种基因产物在个体按不同组织空间顺序出现的特性。结构基因:编码蛋白质的基因。

调控基因:编码能与操纵子序列结合的调控蛋白的基因

操纵子:指能被调控蛋白特异性结合的一段DNA序列,常与启动子邻近或与启动子序列重叠,调控蛋白结合在操纵子序列上,会影响其下游基因转录的强弱。

负调控:在没有调节蛋白质存在时基因是表达的,加入这种调节蛋白质后基因表达活性便被关闭,这样的调控负调控。

阻遏蛋白:参与负调控,能关闭基因表达活性的蛋白。

辅阻遏物:一种能与阻遏蛋白形成功能阻遏物,而使合成代谢的操纵子受到阻遏的代谢终产物。

正调控:如果在没有调节蛋白质存在时基因是关闭的,加入这种调节蛋白质后基因活性就被开启,这样的调控方式为正转录调控。

激活蛋白:参与政调控,能开启基因活性的蛋白。

诱导物:指当作用于细胞群体时,通过诱导机制、能增加特定基因转录的mRNA含量的一种化学因子或物理因子。

操纵元:

基本组成:

A.结构基因群:各结构基因头尾衔接、串连排列,组成结构基因群。

B.操纵子:是指能被调控蛋白特异性结合的一段DNA序列,常与启动子邻近或与启动子序列重叠,调控蛋白结合在操纵子序列上,会影响其下游基因转录的强弱。

C.启动子:是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。

D.调控基因:编码能与操纵子序列结合的调控蛋白的基因。

现象1.β- 半乳糖苷酶的诱导产生

调控机理:乳糖操纵子的负调控及乳糖对乳糖操纵元的诱导作用

1.大肠杆菌细胞内β- 半乳糖苷酶的表达受乳糖操纵元的调控。

乳糖操纵元含有z (β-半乳糖苷酶基因)、y(半乳糖透过酶)和a(转乙酰酶)三个结构基因,启动子,操纵子,和调控基因。

调控基因低水平、组成性表达产生阻遏蛋白R。

2.在环境没有乳糖存在时,乳糖操纵元处于阻遏状态。

R形成活性四聚体,能特异地与操纵子紧密结合,阻碍了RNA聚合酶与启动子的结合,阻止了结构基因的转录起动。

3.当环境中有足够的乳糖时,lac操纵元处于解除了阻遏的状态。

乳糖受原先存在于细胞中的少数β-半乳糖苷酶作用转变为别乳糖,别乳糖与R结合,使R的空间构像变化,失去与操纵子特异性紧密结合的能力,从而解除了阻遏蛋白的作用,基因转录开放,可使β-半乳糖苷酶在细胞内的含量增加。

乳糖操纵子的本底水平表达:本底水平的组成型合成,即非诱导状态下有少量的mRNA 合成。

安慰诱导物:如果某种物质能够促使细菌产生酶而本身又不被分解,这种物质被称为安慰诱导物。

现象2. 二次生长现象与葡萄糖效应

当培养基中含有葡萄糖和乳糖时,细菌优先利用葡萄糖;

当葡萄糖耗尽,细菌停止生长;

经过短时间的适应,就能利用乳糖,细菌继续呈指数式繁殖增长。

现象2 葡萄糖对乳糖操纵子的影响:

在启动子上游有CAP结合位点,当大肠杆菌从以葡萄糖为碳源的环境转变为以乳糖为碳源的环境时,cAMP浓度升高,与CAP结合,使CAP发生变构,CAP结合于乳糖操纵子启动序列附近的CAP结合位点,激活RNA聚合酶活性,促进结构基因转录,调节蛋白结合于操纵子后促进结构基因的转录,对乳糖操纵子实行正调控,加速合成分解乳糖的三种酶。

正调控和负调控协调调节:

1.当阻遏蛋白封闭转录时,CAP对该系统不能发挥作用;如无CAP存在,即使阻遏蛋白没

有与操纵序列结合,操纵子仍无转录活性。

2.在环境葡萄糖耗尽时,细胞内cAMP水平升高,使CAP发生变构,形成有活性的cAMP-CAP,

后者能与乳糖启动子内一段22bp 序列结合,大大促进了RNA聚合酶对启动子-35和-10序列的识别和结合,利于形成开放型起始复合物,提高了乳糖操纵元结构基因的转录效率,因此细胞获得新的碳原而继续生长。

3.在环境有葡萄糖存在时,葡萄糖的分解代谢产物使细胞内cAMP水平下降,阻止形成有

活性的cAMP-CAP,从而阻止了RNA聚合酶与启动子的结合,使乳糖操纵元结构基因的转录效率也下降,细胞不能利用乳糖。

总结---乳糖操纵子的作用机制:

1.乳糖操纵子的组成:大肠杆菌乳糖操纵子含Z、Y、A三个结构基因,分别编码半乳糖苷

酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶,此外还有一个操纵子,一个启动子和一个调节基因。

2.阻遏蛋白的负性调节:没有乳糖存在时,调节基因编码的阻遏蛋白结合于操纵子处,乳

糖操纵子处于阻遏状态,不能合成分解乳糖的三种酶;有乳糖存在时,乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构,不能结合于操纵序列,乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。所以,乳糖操纵子的这种调控机制为可诱导的负调控。

3.CAP的正调节:在启动子上游有CAP结合位点,当大肠杆菌从以葡萄糖为碳源的环境转

变为以乳糖为碳源的环境时,cAMP浓度升高,与CAP结合,使CAP发生变构,CAP结合于乳糖操纵子启动序列附近的CAP结合位点,激活RNA聚合酶活性,促进结构基因转录,调节蛋白结合于操纵子后促进结构基因的转录,对乳糖操纵子实行正调控,加速合成分解乳糖的三种酶。

4.协调调节:乳糖操纵子中的调节基因编码的阻遏蛋白的负调控与CAP的正调控两种机制,

互相协调、互相制约

试说明真核细胞与原核细胞在基因转录,翻译及DNA的空间结构方面存在的主要差异,表现在哪些方面?

1.真核细胞中,一条成熟的mRNA链只能翻译出一条多肽链,很少存在原核生物中常见的

多基因操纵子形式。

2.真核细胞DNA与组蛋白和大量非组蛋白相结合,只有一小部分DNA是裸露的。

真核生物基因表达调控的特点:

(1)受环境影响较小

(2)个体发育复杂

(3)多层次

CH9 基因的突变、损伤与修复

突变:DNA中的碱基发生永久的改变

突变体:发生突变的个体。

突变剂:一些能使生物体内的遗传信息发生变化的物理或化学因子。

突变的类型:

根据怎样发生的:自发突变、诱发突变、位点特异性突变。

根据数目:单点突变、多位点突变。

导致点突变的原因:

①DNA复制过程中的自发突变。此类引起突变的频率很低。

②诱导突变。由于物理、化学原因,导致DNA发生了改变。

基因突变的后果:

1.沉默突变:基因内密码子改变,但对应的氨基酸不变。

2.中性突变

3.错义突变:由于结构基因中某个核苷酸的变化使一种氨基酸的密码子变为另一种氨基酸

的密码子,这种基因突变叫错义突变。

4.无义突变:一个核苷酸的改变使代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子,使蛋白质合

成提前终止,合成无功能的或无意义的多肽,这种突变就称为无义突变。

DNA损伤:DNA 双螺旋结构发生的任何改变。

分为两种:①单个碱基的改变;②双螺旋结构的异常扭曲

DNA的修复:

1.回复修复

a.光修复

b.烷基的转移

c.单链断裂的重接

d.碱基的直接插入

2.切除修复

3.错配修复

4.重组修复

5.SOS修复

回复突变:突变体经过第二次突变又完全地或部分地恢复为原来的基因型和表现型。

校正tRNA:通过tRNA中反密码子改变来校正密码子突变,使其在突变位点引入正确氨基酸。