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实验四 柱色谱

实验五柱色谱

计划学时:3学时

一、实验目的:学习柱色谱的操作方法。

二、实验原理:

柱色谱(柱上层析)常用的有吸附色谱和分配色谱两类。吸附色谱常用氧化铝和硅胶作固定相;而分配色谱中以硅胶、硅藻土和纤维素作为支持剂,以吸收较大量的液体作固定相,而支持剂本身不起分离作用。

吸附柱色谱通常在玻璃管中填入表面积很大经过活化的多孔性或粉状固体吸附剂。当待分离的混合物溶液流过吸附柱时,各种成分同时被吸附在柱的上端。当洗脱剂流下时,由于不同化合物吸附能力不同,往下洗脱的速度也不同,于是形成了不同层次,即溶质在柱中自上而下按对吸附剂的亲和力大小分别形成若干色带,再用溶剂洗脱时,已经分开的溶质可以从柱上分别洗出收集;或将柱吸干,挤出后按色带分割开,再用溶剂将各色带中的溶质萃取出来。1、吸附剂

常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙和活性炭等。吸附剂一般要经过纯化和活性处理,颗粒大小应当均匀。对于吸附剂而言,粒度愈小表面积愈大,吸附能力就愈高,但颗粒愈小时,溶剂的流速就太慢,因此应根据实际分离需要而定。供柱色谱使用的氧化铝有酸性、中性、碱性三种,本实验选择中性氧化铝。

2、溶质的结构与吸附能力的关系

化合物的吸附性与它们的极性成正比,化合物分子中含有极性较大的基团时,吸附性也较强。各种化合物对氧化铝的吸附性按以下次序递减:酸和碱> 醇、胺、硫醇> 酯、醛、酮> 芳香族化合物> 卤代物、醚>烯> 饱和烃

3、溶剂

溶剂的选择是重要的一环,通常根据被分离物中各化合物的极性、溶解度和吸附剂的活性等来考虑。

先将要分离的样品溶于一定体积的溶剂中,选用的溶剂极性要低,体积要小。如有的样品在极性低的溶剂中溶解度很小,则可加入少量极性较大的溶剂,使溶液体积不致太大。

色层的展开首先使用极性较小的溶剂,使最容易脱附的组分分离。然后加入不同比例的极性溶剂配成的洗脱剂,将极性较大的化合物自色谱柱中洗脱下来。常用洗脱剂的极性按如下次序递增:

己烷和石油醚<环己烷<四氯化碳<三氯乙烯<二硫化碳<甲苯<苯<二氯甲烷<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<丙酮<丙醇<乙醇<甲醇<水<吡啶<乙酸

所用溶剂必须纯粹和干燥,否则会影响吸附剂的活性和分离效果。

4、吸附剂色谱的分离效果不仅依赖于吸附剂和洗脱剂的选择,而且与制成的色谱柱有关:

(1)柱中的吸附剂用量为被分离样品量的30—40倍,若需要可增至100倍;(2)柱高和直径之比一般是10:1-20:1;

(3)装柱有湿法和干法两种,本实验采用湿法装柱,无论采用哪种方法装柱,都不用使吸附剂有裂缝或气泡。

三、实验装置

实验四 柱色谱

四、实验药品

吸附剂:中性氧化铝

样品:甲基橙与亚甲基蓝的混合物

溶剂:95%的乙醇

洗脱剂:95%的乙醇;水

五、实验操作步骤:

1、装柱(湿法)

关闭活塞,向柱中倒入95%乙醇溶剂至约为柱高的1/4处,再将一定量的95%乙醇和硅胶在烧杯内调成浆状,慢慢倒入管中,将管子下端活塞打开,使溶剂流出,控制流出速度为1-2滴/s,硅胶渐渐下沉,进行均匀填料。橡皮塞轻轻敲打色谱柱下部,使填装紧密,当装柱至3/4时,再在上面加一片小圆滤纸。操作时一直保持上述流速注意不能使液面低于氧化铝的上层。

2、加样品

当溶剂液面刚好流至石英砂面时,立即沿柱壁加入2ml 95%乙醇溶液(内含1mg甲基橙和5mg亚甲基蓝),当此溶液流至接近石英砂面时,加入95%乙醇洗脱。

3、洗脱

用95%乙醇溶液洗脱,控制流出速度如前。整个过程都应有洗脱剂覆盖吸附剂。

亚甲基蓝因极性小首先向下移动,极性较大的甲基橙则留在柱的上端,形成不同的色带。当最先下行的色带快流出时,更换另一接受瓶,继续洗脱,至滴出液近无色为止。换水作为洗脱剂,这时甲基橙向柱子下部移动,用另一接受瓶收集。

六、实验关键步骤:

1、装柱要紧密,要求无断层、无缝隙,无气泡。

2、在装柱、洗脱过程中,始终保持有溶剂覆盖吸附剂。一个色带与另一

色带的洗脱液的接受不要交叉。

七、思考题

1、为什么极性大的组分要用极性较大的溶剂洗脱?

2、柱子中若有气泡或装填不均匀,将给分离造成什么样的结果?如何避免?

八、习题:

1、实验报告

2、思考题

预习:薄层色谱

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