细胞实验方案(修改版)
生科3班1组自主实验方案
外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备，染色体组型分析
一、实验目的
1、了解动物细胞培养、传代培养的方法以及培养过程中的无菌操作。掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。
2、掌握细胞染色体的制备方法，掌握人类染色体G－带的显示方法及人类染色体
G－带在染色体识别中的意义。
3、熟悉人类染色体的镜下检查和核型分析方法。初步掌握人类染色体G带的特征
及其识别。
二、实验原理
所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。用低渗盐溶液（一般是
0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去，最后以气干法制片，可获得较好的染色体。人类外周血细胞本来是终末分化细胞，一般没有分裂能力，但经PHA（植物血球凝集素）或ConA等药物刺激后，转变成可分裂的转化细胞。
染色体显带是将染色体标本经过一定程序处理，并用特定染料染色，使染色体沿其长轴显现明暗或深浅相间的横行带纹――染色体带，这种技术，称为染色体显带技术。通过显带，人们可以准确地识别每一条染色体及染色体上的各个区段，并可发现染色体上较细微的结构变化。
在所有的显带技术中，G显带（G banding）是最常见的显带技术，它是将染色体标本用碱、胰蛋白酶或其它盐溶液处理后，再用Giemsa染液染色，在普通显微镜下，可见深浅相间的带纹，称G带（G band）。G显带方法简便，带纹清晰，染色体标本可以长期保存，因此被广泛用于染色体病的诊断和研究。
正常人类染色体的数目为46条(23对)，1960年的Denver会议和1963年的London会议制定了统一的人类染色体命名体制：按照染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数，将常染色体（22对）按大小用阿拉伯数字标记，顺次排列为1～22号，性染色体用X和Y标记；并按染色体大小和着丝粒位置，把人类染色体分为七个组，用大写字母A～G表示。
染色体经显带处理后，每条染色体都显示出其特定的带纹特征（见下表）。根据这些特征，可以准确地识别每条染色体，检出染色体数目或结构畸变。
三、实验试剂与器材
试剂：
培养基：RPMI1640,含有双抗（青、链霉素）和小牛血清；小牛血清；植物血球凝集素（PHA）；秋水仙素：50ug/ml；磷酸缓冲液：1/15mol/L,ph=6.8；低渗溶液：0.075mol/L氯化钾；Carnoy固定液：甲醇：冰乙酸（3：1）；胰蛋白酶溶液；Giemsa（姬萨姆）染液；75%的酒精、
器材：
光学显微镜，离心机，恒温水浴箱，恒温箱，离心管，量简，烧杯，培养瓶，载玻片，
玻片架，注射器，碘酒和酒精棉球，酒精灯，天平，普通冰箱，立式染缸、染色架、镊子，直头小吸管、橡皮吸头、吸水纸若干，香柏油，擦镜纸，剪子，胶水。正常人类染色体G 带核型图，核型报告纸
四、实验方法
（一）培养液配制
实验室配好
（二）采血与培养：
抽取男生和女生外周静脉血2ml。常规消毒后，立即将针头插入灭菌小瓶内，送入超净工作台，在火焰旁将血液滴入2个盛有5ml培养液的培养瓶内，每瓶0.3ml，加入100ulPHA,盖上橡皮塞，轻轻摇动以混匀。贴好标签，将培养瓶放在37℃恒温箱内静置培养72h。（每天摇动培养瓶一次）
（三）秋水仙素处理:
向经恒温培养68-72小时(细胞生长到繁殖期即可)的外周血淋巴细胞培养液中加入22ul 秋水仙素，使其终浓度为0.6ug/ml,轻轻将液体摇匀，继续恒温培养3-6小时。
（四）标本的制备:
1、收集细胞：终止培养后，将培养物混匀，倒人离心管内，离心沉淀8分钟(1000r/min)，弃去上清液。
2、低渗处理：先加入1ml 0.075mol/l的kcl溶液，轻轻吹打，使细胞重悬。然后补加6ml kcl溶液，37摄氏度低渗20分钟。
3、预固定：低渗处理完毕后，直接加入新配的Carnoy固定液1 m1进行预固定，混匀后，离心8分钟(1000r/min)，去除上清液。
4、固定：沿离心管壁缓慢加入固定液6m1，轻轻吹打混匀，置室温20分钟，离心去除
上清液。
5、重复固定一次。
6、尽量吸净上清液，视管底剩下的细胞多少加入适量固定液(0.3～0.6m1)，轻轻吹打成细胞悬液。
7、滴片：沉淀物中加入0.2-0.5ml固定液，用吸管吹打使其成为细胞悬液，用镊子取预先冰冻的干净载玻片，迅速滴上2-3滴细胞悬液，立即用嘴向同一方向吹气，使细胞分散均匀，干燥
（五）染色：
1、将载玻片反扣在染色板上，使板和片之间有一缝隙，将稀释后的Giemsa染液滴在片隙中，染色20分钟，自来水冲洗，吹干。
2、镜下观察染色体分带及染色情况。
（六）染色体核型分析
1、在显微镜下找出染色体分散良好，长度适中，姐妹染色单体清楚地中期分裂相进行显拍摄
2、将显微镜拍摄的放大照片上的一个细胞的全部染色体一条一条的剪下来
3、根据染色体的长短和形态特征进行同源染色体的配对。
4、测量出每条染色体的长度，计算相对长度、着丝粒指数、臂指数，记录数据。
5、根据数量数据校正排列结果，调整。
6、将染色体按1-23号的顺序一对一对的排列，断臂向上，长臂向下，性染色体单独排列，贴成完整的染色体核型图。
五、实验结果
这里就是女生的效果明显，男生的不明显。原因多多分析
八体外哺乳动物细胞染色体畸变试验
九、体外哺乳动物细胞染色体畸变试验 In Vitro Mammalian Cells Chromosome Aberration Test 1 范围 本规范规定了体外哺乳动物细胞染色体畸变试验的基本原则、要求和方法。 本规范适用于检测化妆品原料及其产品的致突变性。 2 规范性引用文件 OECD Guidelines for Testing of Chemicals ( No.473, July 1997) 3试验目的 本试验是用于检测培养的哺乳动物细胞染色体畸变，以评价受试物致突变的可能性。 4 定义 染色体型畸变(Chromosome-type aberration)：染色体结构损伤，表现为在两个染色单体相同位点均出现断裂或断裂重组的改变。 染色单体型畸变(Chromatid-type aberration)：染色体结构损伤，表现为染色单体断裂或染色单体断裂重组的损伤。 染色体数目改变(Numerical aberration)：所用细胞株的正常染色体数目的变化。 结构畸变(Structural aberration)：在细胞分裂的中期相阶段，用显微镜检出的染色体结构改变，表现为缺失、断片、互换等。 有丝分裂指数(Mitotic index)：中期相细胞数与所观察的细胞总数之比值；是一项反映细胞增殖程度的指标。 5 试验基本原则 在加入和不加入代谢活化系统的条件下，使培养的哺乳动物细胞暴露于受试物中。用中期分裂相阻断剂（如秋水仙素或秋水仙胺）处理，使细胞停止在中期分裂相，随后收获细胞，制片，染色，分析染色体畸变。 6 试验方法 6.1 试剂和受试物制备 6.1.1 阳性对照物：可根据受试物的性质和结构选择适宜的阳性对照物，阳性对照物应是已知的断裂剂，能引起可检出的、并可重复的阳性结果。当外源性活化系统不存在时，可使用甲磺酸甲酯（methyl methanesulphonate (MMS)）、甲磺酸乙酯（ethyl methanesulphonate(EMS)）、乙基亚硝基脲(ethyl nitrosourea)、丝裂霉素C(mitomycin C)、4-硝基喹啉-N-氧化物（4-nitroquinoline-N-oxide）。当外源性活化系统存在时，可使用苯并（a）芘[benzo(a)pyrene]、环磷酰胺(cyclophosphamide)。 6.1.2 阴性对照物：应设阴性对照，即仅含和受试物组相同的溶剂，不含受试物，其它处理和受试物组完全相同。此外，如未能证实所选溶剂不具有致突变性，溶剂对照与本实验室空白对照背景资料有明显差异，还应设空白对照。 6.1.3 受试物 6.1.3.1 受试物的配制：固体受试物需溶解或悬浮于溶剂中，用前稀释至适合浓度；液体受试物可以直接加入试验系统和/或用前稀释至适合浓度。受试物应在使用前新鲜配制，否则就必
(完整word版)2015 动物细胞培养技术实验报告
一、实验目的 1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 2、学习并掌握细胞传代培养的方法。 3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。 二、实验原理 细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。 动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。 动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。 原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。 传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 三、细胞培养相关设施及材料 1、细胞培养室 无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。 孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO2。 制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。 储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。 清洗区和消毒灭菌区：清洗区为相对污染区，消毒灭菌区与清洗区分开。 2、细胞培养常用基本设施： 荧光显微镜、超净工作台、孵箱、电热鼓风干燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒温水浴槽、滤器等。 细胞培养常用器皿：培养瓶、培养板、培养皿，玻璃瓶、吸管，离心管、冻存管，注射器，烧杯、量筒等。 3、细胞培养用品的清洗、消毒 新玻璃器皿要用5%稀盐酸浸泡，以中和其表面碱性物质：刷洗： 硫酸清洁液浸泡：浓硫酸+重铬酸钾+蒸馏水； 冲洗：流水冲洗15-20次，蒸馏水冲洗3次，三蒸水漂洗1-3次。 所有需灭菌的器械、物品灭菌前均需包装，防止灭菌后污染。使用时放入超净工
大鼠骨骼肌细胞培养实验指导
大鼠骨骼肌细胞培养 骨骼肌是一种横纹肌，通常是通过肌腱固定到骨骼上，其伸缩可以带动骨骼的移动，促进机体运动。 肌细胞呈纤维状，不分支，有明显横纹，核很多，且都位于细胞膜下方。肌细胞内有许多沿细胞长轴平行排列的细丝状肌原纤维，每一肌原纤维都有相间排列的粗肌丝及细肌丝。肌纤维收缩并不是肌纤维中肌丝本身的缩短或卷曲，而是细肌丝在粗肌丝之间滑行的结果，肌丝滑行使肌节长度缩短，肌原纤维缩短表现为肌纤维收缩。 体外培养大鼠骨骼肌细胞，为临床肌肉损伤的治疗提供理论依据. 一、实验前准备 实验开始前，将眼科剪刀、眼科镊子、培养皿，15ml离心管、移液管、移液枪、枪头等放入无菌超净工作台，以紫外线照射30min。 按照含0.2%的XI胶原酶、0.2%的中性蛋白酶、0.1%的胶原酶进行配制消化液，用0.22微米的PES微孔滤膜进行过滤除菌，置于50毫升离心管中，可直接用于组织消化。瓶口消毒后室温待用。 取出无菌培养皿，分别作好标记，吸取适量PBS置于相应标记的培养皿中。 无菌条件下，准备好各种大小的眼科剪刀、止血钳、眼科镊子和手术刀。将断颈处死后浸泡于体积分数为 75%乙醇的SD大鼠仰卧在超净台内的干净培养皿上。 二、骨骼肌提取 眼科剪刀剪开大鼠后肢皮肤，暴露腿部肌肉，用手术刀小心割取后肢大腿肌肉，同样方法分离另一后肢大腿肌肉。小心剪取表面无附着膜和脂肪组织的肌肉，置于装有PBS的无菌培养皿中。 吸取适量消化液于相应标记的培养皿中。 将剪取的骨骼肌在无菌PBS浸泡清洗，去除脂肪组织后放置于含消化液的培养皿中，采用眼科剪刀剪碎骨骼肌组织，成1平方毫米不规则碎片。 轻轻摇匀，室温静置消化30分钟 收集组织悬液于50毫升离心管中，用消化液反复冲洗培养皿，直至将全部组织块收集到离心管内。 轻轻吹打混匀组织块悬浮液。
细胞培养实验指导
细胞培养实验指导陈轶霞刘俊林
实验报告书写要求： 1、学生实验后应按时完成并提交实验报告。报告要求结构完整、内容充实、图表齐全、书面整洁、分析讨论认真合理等。 2、严禁互相抄袭实验报告，发现雷同实验报告一律视为不及格。 3、切忌全班同学统一打印相同的实验结果图（以前曾发生过全班同学共用一张错误的图的情况） 实验一细胞培养实验室介绍及使用卫生要求 【目的与要求】 1.了解细胞培养实验室的基本设施和布局 2. 掌握细胞培养实验室的使用卫生要求 【基本原理】 细胞培养必须无菌操作，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素影响，应建立专门的实验室并划分不同功能区。理想的细胞培养实验室可分为准备室、更衣室、缓冲室、培养室等。 【内容与方法】 1．通过教师讲解并参观了解开展本课程教学的细胞培养实验室的布局、设施与仪器设备的摆放情况 2.使用卫生要求。 （1）实验室的消毒 实验室日常采用紫外灯消毒；按实验室的卫生管理要求对实验室洁净区按周期进行熏蒸消毒；在培养期间发生严重污染时要进行熏蒸消毒。 （2）培养工作开始操作前将所有培养用的物品经专用物流通道通过传递窗放进培养室，开紫外灯消毒30min，关紫外灯后方进入操作。配有空气净化系统的洁净室在风机开启至少30min后才能达到相应的洁净度级别。 （3）操作者进入培养室时要遵守的程序 a: 用肥皂洗手，在干手器上吹掉手臂上的水滴。 b: 换穿无菌室专用鞋，进入更衣室，外衣挂到指定的衣柜里，用0.1%新洁尔灭溶液对手及前臂进行消毒，戴帽子（不露头发）、口罩（应包住胡须），穿已消毒的洁净服，进入缓冲室。再用0.1%新洁尔灭溶液对手及前臂消毒，在其滞留3min后进入培养室。 （4）开超净工作台10min，期间用0.1%新洁尔灭溶液的擦拭操作台面后可开始具体的操作，同时点燃酒精灯用于临时性的火焰消毒。 （5）实验完毕，关闭超净工作台，及时清理实验用品，废物从通往物流通道的传递窗中传出。工作台面用0.1%新洁尔灭溶液的擦拭消毒后方可出培养室。 （6）出培养室时，将工作服放在更衣室指定的位置以便清洗和消毒，鞋放到隔离鞋柜里，跨过隔离鞋柜，将用过的一次性帽子、口罩、鞋套等放到指定的废物桶，出实验室前用肥皂洗手，关闭空气净化系统，开紫外灯30min。 注：(不写实验报告)
体外细胞实验方法
细胞株在适当的培养基中保持10% FBS。 从Addgene(质粒)购买HA-FLAG-UCHL3。 #22564，然后再克隆到pGEX-4T-2载体(Clontech)中。UCHL3C94A和S75A突变体由位点定向突变层积产生)。抗uchl3抗体购自ProteinTech公司 (12384 - 1 - ap)。抗ub (P4D1)、抗rpa32 (9H8)、抗brca1 (D9)抗体购自Santa Cruz Biotechnology。抗rad51 (N1C2)是从GeneTex购买的。反 γH2AX(05 - 636),anti-BRCA2(OP95)和anti-MDC1(05 - 1572) 从微孔被购买。Anti-BRCA2(推上a303国道- 435 a)和 anti-γH2AX架a300型(- 081 a)从Bethyl购买实验室。抗53bp1 (NB100-304)购自Novus Biologicals。Anti-Flag(m2)、anti-HA anti-β-actin抗体 购买的σ。反磷（血清/thr）atm/atr衬底抗体（2851）是从细胞信号技术中购买的。 CRISPR / Cas9敲除 (sgRNAs)使用:sgUCHL3-1(5′-GCCGCTGGAGGCCAAT CCCGAGG-3′)和sgUCHL3-2(5′-GCCCCGAAGCGCGCCC ACCTCGG-3′)。gRNA序列被克隆到载体中。 LentiCRISPR-V2-puro。细胞被慢病毒感染 sgRNA-puro随后与2μg /毫升嘌呤霉素广泛的选择,和单一的克隆是通过连续稀释和放大。通过免疫印迹鉴定克隆 抗uchl3抗体，并通过DNA测序验证。 重组蛋白表达和下拉试验。 构建表达His-RAD51和GSTUCHL3蛋白的质粒，构建RAD51和UCHL3的编码序列 被亚克隆为pET-32a和pGEX-4T-2。为了产生重组蛋白，每个表达结构都转化为大肠杆菌BL21 (DE3)。总之,在LB培养基培养细菌在37°C到1.2(OD600)和冷却30分钟在冰上。然后细胞连续培养15 h在18°C添加0.8毫米isopropyl-b-D-hiogalactopyranoside之后(IPTG)。细胞 然后用超声波提取和裂解。细胞溶解产物 用16000g离心30min，得到的上清液与他的Mag Sepharose Ni (GE Healthcare)孵育，纯化His- rad51蛋白和GSH珠(Promega)，纯化 分别是GST和GST- uchl3蛋白。 体外GST-UCHL3拉试验,50μg重组GST和GST-UCHL3蛋白质绑定到谷胱甘肽珠子被5% BSA 在4°C 2 h其次是孵化与50μg His-UCHL3额外2 h在4°C。然后用不同盐浓度的NETN缓冲液冲洗5次。结合蛋白被筛选了1×SDSPAGE缓冲与加热10分钟在95°C。用单克隆抗his 抗体检测His-RAD51，用Coomassie blue染色GST-UCHL3 体内变性去泛素化实验和体外脱泛素化实验 对于体内去泛素化实验，控制U2OS细胞，UCHL3敲除U2OS细胞，或UCHL3敲除 U2OS细胞稳定表达HA-UCHL3野生型和突变Cys95阿拉巴马州(CA突变)在120年被细胞溶解μL 62.5毫米Tris-HCl(pH值6.8),2% SDS、10%甘油,20毫米NEM,1
细胞实验设计
原生质体的分离培养与融合 一、实验目的 1、了解植物原生质体分离、融合基本原理。 2、了解并掌握利用PEG原生质体融合的原理和方法。 二、实验原理 植物原生质体最方便的来源是叶片，因为叶片中可以分离出大量的比较均一的细胞，而又不致使植物遭到致命的破坏。由于叶肉细胞排列疏松，酶的作用很容易达到细胞壁。其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。 许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合，现在被广泛采用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法。 PEG为一种高分子化合物，能与水、蛋白质、和碳水化合物等一些基团能形成氢键。普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合。 三、实验用品 材料 植物叶片（菠菜叶片）
仪器 倒置显微镜，离心机，过滤筛（100目），漏斗，烧杯，吸管，长注射针，注射器（5—10ml）三角瓶、离心管、解剖刀、长、短镊子、培养皿、滤纸。 试剂 纤维素酶2% ，果胶酶1%（在0.65mol甘露醇，0.05M氯化钙和0.1%MES 中，pH调至5.6—6.0），0.16M氯化钙溶液（内含0.1%MES）Ph5.6，22%蔗糖溶液，30%聚乙二醇（PEG）溶液，高pH高钙洗脱液（Ph=9）： 0.1M氯化钙、0.1M梨酶醇、0.5ml/100ml 1molTris，0.24M氯化钙 四、实验过程 （一）原生质体的分离收集 1.取菠菜叶片撕去下表皮，称0.2g,切成小块放到10ml酶液中，在26℃下酶解4—5小时，或含酶量减半过夜，期间轻轻摇动几次。 2．用100目的过滤筛过滤。 3.用与滤液等体积的0.16mol氯化钙溶液冲洗过滤筛，使冲洗液冲入过滤液。 4.滤液用离心机100—300rpm，离心5分钟，弃上清液。 5.沉淀中加入0.16mol氯化钙溶液1—2ml于沉淀，轻摇使之悬浮，用带长针头的注射器自离心管底部轻轻地加入6—8ml 22%蔗糖溶液，使之形成界面。 6.静置待原生质体形成一条带时弃去上、下液及残渣，用吸管收集原生质体。 7.用.0.24Mmol氯化钙溶液洗涤一次，离心吸取上清液。 8.沉淀中加入1—2ml.0.16mol氯化钙溶液悬于沉淀，用血球计
细胞原代培养细胞生物学实验报告
细胞生物学实验报告 细胞原代培养 姓名： 学号： 班级： 专业： 同组成员： 一、实验原理
细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养。由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。同时也为以后传代培养创造条件。 原代培养的方法： 1、组织块法在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。用Hanks 液洗涤2—3次，自然沉淀。用吸管吸去上清液。将组织块贴于培养瓶进行培养。 2、酶消化法将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的%的胰蛋白酶。370C磁棒搅拌消化20－30分钟。然后终止消化。用几层无菌纱布过滤。取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。 取材注意事项： 取材要注意新鲜和保鲜。取材应严格无菌。取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。 二、实验目的 1、理解细胞原代培养原理 2、熟悉细胞原代培养方法与过程 3、了解细胞原代培养的应用 4、独立进行细胞原代培养操作 三、实验材料 手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯。 动物：9-12日龄的鸡胚蛋 四、实验步骤
(完整版)细胞实验技术
（一）干扰引物（shRNA）设计： 1、NCBI上下载基因序列 2、在sigema网站输入基因号设计一对21个碱基的干扰引物（上下游） 3、从起始密码（ATG）下游25bp开始； 4、GC含量介于40%~60% 5、干扰引物至少一个在SDS区，一个在3’UTR区 6、选择脱靶率低的 （二）、干扰载体构建 1、引物退火（引物加水看标签X 50,弹匀，瞬离） 退火体系： 上游：5ul 下游：5ul 10X M buffer 5ul H2O 35ul 水浴锅100℃2min，锅里隔夜 （三）、酶切plko.1载体 1、AgeI 酶切，反应体系： plko.1载体4ug AgeI 2ul 10X AgeI buffer 5ul H2O 39ul 37℃水浴2~3h 2、切胶回收AgeI 酶切产物，30ul 水洗脱 3、EcoRI酶切，反应体系： AgeI 酶切产物30ul EcoRI 2ul 10X H buffer 5ul H2O 13ul 37℃水浴2~3h 切胶回收，30ul 水洗脱，测浓度 （四）、连接 连接体系：T4连接： 退火引物2ul 退火引物5ul 酶切载体1ul 酶切载体1ul Solution I 5ul T4连接酶1ul H2O 2ul T4连接酶Buffer 1ul H2O 2ul 室温下连接4h。 （五）、转化 -80℃取感受态细胞于冰上融化，在1.5ml离心管加33ul感受态，将连接产物加入，冰上放置30min，42℃水浴60~90s，冰上放置2min，加入无氨苄培养基，37℃摇床1h，涂布在氨苄平板上，37℃，16h。 （六）、挑菌 用枪头挑取5个菌落（可送测序）扩大培养，加有氨苄的培养基，37℃过夜培养。 （七）、提质粒
体外细胞培养
第一讲体外细胞培养的基本技术 ●体外细胞培养条件和基本技术 ●体外细胞培养 ●体外培养物的生长生物学 ●细胞系和细胞株 ●培养物的冷冻与复苏 ●培养物的污染、检测和排除 ●一、体外细胞培养条件和基本技术 体外细胞培养的优缺点 优点：简化细胞的生长环境，方便施加实验因素，便于观测实验结果，便于获得均一细胞群，能够进行大规模生物制品的生产。 体外细胞培养不足之处：培养对象脱离了机体的整体支配和调控，细胞间在一定程度上失去组织联系及相互作用。体外培养条件下的生长发育情况与在体时的情况存在一定差异，分析实验结果时必须考虑这种差异。 一、体外细胞培养条件 （一）、体外培养实验室 1. 准备室 2. 培养室：基本条件要求：清洁、无菌、干燥、不通风，并具有适宜的光线。空气调节用中央空调或分体式空调机。室顶安装紫外灯等消毒装置。 3. 缓冲室 4. 其他实验室 （二）、体外培养的设备和器具 设备：1. 超静工作台，生物安全柜，净化室 2. 培养箱：温度，湿度，pH值 3. 倒置显微镜 4. 水净化装置：去离子水净化装置，石英玻璃蒸馏器， 超纯水装置 5. 冰箱 6. 离心机7. 冷冻保存装置 8. 高压蒸汽消毒装置：电热干燥箱，pH计，天平 培养器具：1. 过滤除菌装置：Zeiss 滤器，抽滤式玻璃简易型滤器， 针头式加压塑料小滤器 2. 培养器皿：（1）溶液瓶（2）培养瓶（3）培养皿 （4）多孔培养板（5）离心管 3. 移液器 4.筛网：金属筛网（不锈钢网、铜网），尼龙筛网 （三）培养用液 ?水和平衡盐溶液（balanced salt solution, BSS) 水：离子交换水，蒸馏水 平衡盐溶液：主要成分：无机盐和葡萄糖 常用BSS: PBS ，Ringer Earle ，D-Hanks，Hanks ?培养液：1.天然培养液：1）血清：小牛血清,胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）,马血清，2）水解乳蛋白，3）胚胎渗出液 2.合成培养液：合成培养基的种类MEM，RPMI 1640，McCoy 5A，HAM F12等
植物生理学实验指导
植物生理学实验指导 Prepared on 24 November 2020
植物生理学实验指导
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植物材料的采集、处理与保存 植物生理实验使用的材料非常广泛，根据来源可划分为天然的植物材料（如植物幼苗、根、茎、叶、花等器官或组织等）和人工培养、选育的植物材料（如杂交种、诱导突变种、植物组织培养突变型细胞、愈伤组织、酵母等）两大类；按其水分状况、生理状态可划分为新鲜植物材料（如苹果、梨、桃果肉，蔬菜叶片，绿豆、豌豆芽下胚轴，麦芽、谷芽，鳞茎、花椰菜等）和干材料（小麦面粉，玉米粉，大豆粉，根、茎、叶干粉，干酵母等）两大类，因实验目的和条件不同，而加以选择。 植物材料的采集和处理，是植物生理研究测定中的重要环节。在实际工作中，往往容易把注意力集中在具体的仪器测定上，而对于如何正确地采集和处理样品却不够注意，结果导致了较大的实验误差，甚至造成整个测定结果的失败。因此，必须对样品的采集、处理与保存给予足够的重视。 一、原始样品及平均样品的采取、处理 植物生理研究测定结果的可靠性（或准确性），首先取决于试材对总体的代表性，如果采样缺乏代表性，那么测定所得数据再精确也没有意义。所以，样品的采集除必须遵循田间试验抽样技术的一般原则外，还要根据不同测定项目的具体要求，正确采集所需试材。目前，随着研究技术的不断发展，应该不断提高采样技术的水平。 在作物苗期的许多生理测定项目中都需要采集整株的试材样品，在作物中后期的一些生理测定项目中，如作物群体物质生产的研究，也需要采集整株的试材样品，有时虽然是测定植株的部分器官，但为了维持器官的正常生理状态，也需要进行整株采样。 除研究作物群体物质生产外，对于作物生理过程的研究来说，许多生理指标测定中的整株采样，也只是对地上部分的采样，没有必要连根采样，当然对根系的研究测定例外。采样时间因研究目的而不同，如按生育时期或某一特殊需要的时间进行。除逆境生理研究等特殊需要外，所取植株应是能代表试验小区正常生育无损伤的健康植株。
细胞培养实验报告
动物细胞培养 一、试验目的。 1、掌握无菌操作技术。 2、掌握原代和传代细胞培养。 3、掌握细胞冷冻和复苏技术。 4、了解培养成纤维细胞的形态。 二、试验原理。 将动物机体的组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 对具有移动特性的稳定细胞系或细胞株进行长期保存，一方面可以作为细胞研究的试验材料，另一方面可以做细胞制品的生产材料。目前广泛应用的细胞保存方法是低温冷冻保存法，。细胞的冷冻保存的原则是慢冻快融，这样做是为了防止细胞由于冷冻过程中产生了冰晶而发生细胞破裂。 三、实验器材及药品。 器材：怀孕的小白鼠、培养箱、培养瓶、培养皿、移液器、眼科剪、镊子、酒精 培养箱、超净工作台、离心管、灯、离心机、水浴锅、倒置显微镜、CO 2 高压灭菌锅、试管架等。 药品：小牛血清、DMEM合成培养基、抗生素、DMSO冷冻剂、胰酶、PBS缓冲液等。 四、实验操作。 1、消毒灭菌。 将实验所需用到的工具（如枪头、培养皿、眼科剪、镊子以及每个人的实验服等）集中灭菌、烘干。配制75%的酒精以备实验时所需。
2、培养基的配制。 分别取10ml的小牛血清、90ml的DMEM合成培养基，将两种培养基混合在一起，再向其中加入1ml的抗生素，吹打混匀就得到了细胞培养的培养液。 3、原代培养。 （1）、准备。将实验过程中会用到的工具以及药品全部放在超净工作台上进行紫外消毒灭菌。实验开始前带好乳胶手套，用酒精对手进行消毒。将怀孕的小白鼠放在酒精中杀死，取出子宫内的胚胎组织。 （2）、剪切与消化。将胚胎组织放于平板中，用眼科剪将组织块剪碎，剪得越碎越好。将剪碎的组织块放于离心管中，加入大约200μl的胰酶进行消化。也可将其置于37度恒温箱中进行消化。 （3）、分离细胞。消化到一定时间时，如果离心管中的溶液中出现了明显的浑浊，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，则应该加入与胰酶等量的培养液终止消化。离心管于离心机中离心，弃上清液，得到分散的细胞。 （4）、转移细胞并培养。向含有分散细胞的离心管中加入配制好的培养液，吹打 箱培养，瓶口少少混匀，将培养液用移液器移到细胞培养瓶中。置于℃恒温CO 2 拧的松一点。 4、传代培养。 （1）、倒置显微镜下观察细胞的形态。倒置显微镜下观察培养细胞的长势及密度，根据细胞密度决定传代的稀释倍数。 （2）、收集原代培养的细胞。吸出培养瓶中的旧培养液，并用PBS冲洗两遍。然后向培养瓶中加入200μl的胰酶进行消化。消化一段时间后用配置好的培养液等比例终止消化。然后离心，收集到原代培养的细胞。 （3）、传代细胞的培养。向离心管内加入大约7—8ml的培养液，吹打混匀。将培养液转移到培养瓶中，置于37度恒温CO 培养箱中培养。培养1—2天后于显 2 微镜下观察细胞的形态。 5、细胞冷冻保存。 （1）、收集细胞。吸出培养瓶中的旧培养液，并用PBS冲洗两遍。然后向培养瓶中加入200μl的胰酶进行消化。消化一段时间后用配置好的培养液等比例终止
USP87细胞毒性体外试验
87 BIOLOGICAL REACTIVITY TESTS, IN VITRO The following tests are designed to determine the biological reactivity of mammalia n cell cultures followi ng con tact with the elastomeric plastics and other polymeric materials with direct or in direct patie nt con tact or of specific extracts prepared from the materials under test. It is essential that the tests be performed on the specified surface area. When the surface area of the specime n cannot be determ in ed, use 0.1 g of elastomer or 0.2 g of plastic or other material for every mL of extraction fluid. Exercise care in the preparation of the materials to preve nt con tam in ati on with microorga nisms and other foreign matter. Three tests are described (i.e., the Agar Diffusi on Test , the Direct Con tact Test and the Elution Test ).1 The decision as to which type of test or the number of tests to be performed to assess the potential biological response of a specific sample or extract depends upon the material, the final product, and its inten ded use. Other factors that may also affect the suitability of sample for a specific use are the polymeric composition; processing and cleaning procedures; con tact ing media; in ks; adhesives; absorptio n, adsorptio n, and permeability of preservatives; and con diti ons of storage. Evaluatio n of such factors should be made by appropriate additi onal specific tests before determining that a product made from a specific material is suitable for its in ten ded use. Materials that fail the in vitro tests are can didates for the in vivo tests described in Biological Reactivity Tests, In Vivo 88 . USP R EFERENCE S TANDARDS 11 —USP High-Density Polyethylene RS. USP Positive Bioreaction RS. Cell Culture Preparation —Prepare multiple cultures of L-929 (ATCC cell line CCL 1, NCTC clone 929; alternative cell lines obtained from a standard repository may be used with suitable validation) mammalian fibroblast cells in serum-suppleme nted minimum esse ntial medium hav ing a seedi ng den sity of about 10 5 cells per mL. Incubate the cultures at 37 1 一in a h±midified
细胞克隆形成实验
机密提醒：这份文件及其传真件、复印件所包含的机密或法律保护信息是只提供给这份文件上所指定的个人或机构。如果您不是预定接受者，我们提醒您严禁以披露、拷贝、散发或任何形式利用这份文件及其传真件、复印件的内容。如果您错误的接收到这份文件及其传真件、复印件，请立即通知我们以便我们可以安排文件及其传真件、复印件返还并不会让您负担任何费用。 第 1 页 共 1 页 细胞克隆形成实验 一、 当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。每个克隆含有50以上的细胞，大小在0.3-1.0mm 之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力。各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。[晶莱生物] 二、实验方法 平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验 (a)平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞 (b)软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。 三、注意事项 (a)琼脂对热和酸不稳定，若反复加热，容易降解而产生毒性，且硬度下降。因此高压灭菌后应进行分装； (b)细胞在进行克隆形成实验时要求有95%以上的分散度，否则结果的准确度会受到很大影响； (c)软琼脂与细胞混合时温度不能超过40℃，否则将会烫伤/死细胞； (d)接种时细胞密度适度，不可过高。 细胞在低密度、非贴壁状态条件下培养，生存率明显下降，永生细胞系/株克隆形成率可达到10%以上，但初代培养细胞和有限传代细胞系克隆形成率仅为0.5%-5%，甚至无法形成单个克隆。因此，为了提高克隆形成率，有时需要在培养基中添加胰岛素、地塞米松等促克隆形成物质。 细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大，一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。并且克隆形成率与接种密度有一定关系，做克隆形成率测定时，接种细胞一定要分散成单细胞悬液，直接接种在碟皿中，持续一周，随时检查，到细胞形成克隆时终止培养。 四、周期 1-2个月
细胞复苏实验指导
细胞复苏 细胞复苏是将休眠的细胞重新活化，使之重新生长，进入细胞周期，进而分裂产生子细胞的过程。细胞复苏后，可进入细胞周期，重新获得细胞类型特异的生物学功能。 一、实验前准备 实验开始前，将无菌培养瓶，15ml离心管、移液管、移液枪、枪头等放入无菌超净工作台，以紫外线照射30min。然后，采用通风机通风3min。以75%酒精擦拭操作台和双手。准备好冰盒。 将离心机调节至800rpm，5min。水浴箱调节至37度恒温。取细胞完全培养基，放于水浴箱中预热。 消毒双手和超净台。取约10ml细胞完全培养基放于15ml离心管中。 实验前备冰盒，快速由液氮中取出冻存的细胞，置于冰盒内。然后迅速将冻存管投入到已经预热到37度的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，注意管口处高于水面，以免进入导致污染。整个解冻过程最好在1分钟以内，以防融化过程中产生大量冰晶损伤细胞，约1min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精喷拭冻存管的外壁，立即拿入超净台内。 二、制备细胞悬液 以无菌枪头吸取细胞冻存液，置于已放入细胞完全培养基的离心管中，上下吹打5次，使冻存液与完全培养基充分混匀，尽量减少冻存液中DMSO的浓度，减轻细胞损伤。以封口膜封好管口。 配平离心：采用天平配平两端，800rpm，室温离心5min。 三、细胞计数 采用罗氏CASY-DT快速细胞计数及活率分析仪进行细胞计数。加入10ml CASY-ton至以标记viable的管子中，加入100ul细胞悬液，颠倒混匀三次，可进行细胞计数。可见每毫升悬液中有活细胞2乘10的5次方. 四、细胞培养 离心后，吸弃上清液，不要吸到底部的细胞沉淀。根据计数结果，向离心管内的细胞沉淀加入10ml细胞完全培养基，反复吹打制成细胞悬液，吹打过程中尽量不要产生气泡。
细胞生物学小鼠细胞培养实验报告
广州大学 综合设计性实验报告 学院生命科学学院 课程细胞生物学实验 实验项目细胞培养 实验题目小鼠肝细胞的原代培养 专业生物技术 年级、班别生技142 姓名徐嘉宽 学号 1414300030 任课教师陈鲲
细胞培养 ——小鼠细胞的原代培养 摘要目的探讨体外分离和培养小鼠肾、脑、心肌细胞的方法。方法采用脱臼法处死新生小鼠，结合酶消化法和组织块法对新生小鼠肾、脑、心肌细胞进行了体外分离、培养。（用眼科剪把新生小鼠心肌细胞组织剪成小于1mm3大小的植块，然后用胰蛋白酶消化5~10min，最后将心肌组织块接种于培养瓶中进行体外培养。脑和肾直接进行组织块培养。）结果比较成功地进行了原代肾、脑、心肌细胞培养，并进行了形态学观察。结论采用该方法能够实现对小鼠心肌、肾、脑细胞的体外原代培养，较好观察到心肌、脑、肾细胞的形态。 关键词原代培养小鼠细胞组织块法酶消化法 1前言 初步了解动物细胞原代培养的基本方法、原理和基本操作过程，初步掌握无菌操作方法。学习植块培养法、营养液的配置及酸碱度的调节。细胞培养是当前细胞生物学乃至整个生命科学研究与生物工程中最基本的实验技术。当前，细胞培养技术广泛应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，已发展成为一种重要的生物技术。了解动物细胞培养的技术的基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，并对原代培养有一个基本概念。结合酶消化法和组织块法通过无菌操作培养新生小鼠细胞。 2实验原理 原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），用植块培养法或酶解法，在人工培养下，使其不断地生长及繁殖。 细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要是细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。 3实验用品 3.1器材 解剖剪、镊1套；眼科剪7把、眼科镊6把；吸管直、弯头各7支，2 ml刻度吸管5支；吸管胶头：小18个、大6个；细胞培养瓶5个；青霉素瓶及瓶塞：6个（其中一个用于分装胰酶液）；培养皿(用于解剖取材)：大、小各1套。烧杯：5～10ml 2个、100 ml 1个。用于无菌操作：解剖镊1把，广口瓶大、小各1个（装消毒棉球），医用棉花、纱布，有盖白瓷盘1个、消毒盒3个、牛皮纸、棉绳。小培养皿(装盖玻片)1个。
细胞划痕实验指导
细胞划痕 细胞划痕实验是指将细胞培养在培养皿或平板上，待细胞融合后用枪头或其他硬物在中央区域画一条线，这条线内的细胞被机械力去除掉了，然后将细胞继续培养，观察细胞向无细胞的划痕区域迁移的情况，来判断细胞的迁移能力。其意义在于：价格低廉，操作简单，还有很重要的一点在于细胞外围环境简单、单纯，容易控制，是肿瘤细胞最基本的研究方法。 一、实验前准备 实验开始前，将离心管、吸管筒、移液枪、枪头，直尺等放入无菌超净工作台，以紫外线照射30min。然后，采用通风机通风3min。 取出无菌6孔板，用黑色记号笔在6孔板底部，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔，每孔至少穿过3条线。每条黑线的上下缘与划痕交叉点作为观察点，这样一方面便于观察另一方面可以一次取多个观察点，最终可以获得多个数据。 画好横线后，在板上分别做好标记。 取下试剂瓶和离心管上的封口膜，且将每个试剂瓶和离心管拧松，方便后续试验的操作。 二、细胞准备 取出处于对数生长期的健康细胞，吸掉原来的培养液，用无菌PBS清洗细胞。加入1ml 胰酶消化液消化细胞，显微镜下观察所有细胞完全皱缩变圆后加入完全培养基终止消化。收集细胞悬液于15ml离心管中，800rpm/min室温离心5min。用罗氏CASY快速细胞计数及活率分析仪进行细胞计数，弃去上清，加入培养基重悬细胞。，以每孔1~4×105细胞的密度接种到6孔培养板上，在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养一天。具体数量因细胞种类不同而不同，掌握为过夜能铺满。 三、直线划痕 取出铺满六孔板的细胞，用200ul枪头垂直于细胞表面，由孔一端划向另一端。尽量垂直于背面的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。此时可在培养皿的表面清晰看到细胞表面呈#字形划痕。
体外活性实验
体外活性试验相关知识 以健康人外周血单核细胞为前体细胞，体外诱导其为树突状细胞（DC ），分别负载多肽抗原，产生特异性细胞毒性T 淋巴细胞（CTL ），以探讨其对靶细胞的杀伤作用。 抗原肽诱导CTL 制备： ① 外周血单核细胞（PBMC ）的分离： 分别选取（经BCG 免疫，PPD 阳性）HLA-A2.1+、HLA-A3+ 人抗凝外周全血，通过淋巴细胞分离液分离获得PBMC 。 ② 树突状细胞的诱导： 将PBMC 在24孔板中贴壁培养，分离贴壁的单核细胞，每孔加含FBS 、GM-CSF 和IL-4的1640培养基，于37℃、5%CO2孵箱中，培养至第5天加LPS 诱导成熟，用相差显微镜观察DC 诱导培养过程中的细胞形态学变化。通过流式细胞术检测CD1a 、CD83、CD80、HLA-DR 的表达。 ③ 细胞毒T 淋巴细胞（CTL ）的体外诱导： DC 诱导至第5天，加入待测肽，第7天收获DC 。于24孔板中加入用免疫磁珠分选的CD8+ T 淋巴细胞作为反应细胞，DC 作为刺激细胞，第2天加IL-2，置37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养。用肽负载的DC 按前述方法再重复刺激3次。收获CTL 用于检测。 细胞毒性分析：
④细胞毒活性检测： CTL杀伤实验用MTT法和4小时51Cr释放法。以抗原肽诱导CTL为效应细胞(E)，负载抗原肽的T2细胞作为靶细胞(T)。 MTT法 按效靶比20:1加入96孔板中，靶细胞每孔1×103个，设单独靶细胞孔和单独CTL孔，每组3复孔，每孔200 μL。37 ℃、5 %CO2孵育48 h后,加入MTT 0.2 mg/孔，继续培养4-6 h，去上清，加入DMSO 100 μL/孔，显色，酶标仪于波长570 nm下读数。按以下公式计算杀伤率。同时以不相关肽诱导的CTL作为阴性对照。 杀伤率=[1－（试验孔A值-效应细胞孔A值）/靶细胞孔A值]×100% 4h51Cr释放法 MTT 实验中与阴性对照比较杀伤作用存在显著性差异的候选肽使用更精确的4h51Cr 释放法来验证。RPMI1640 培养液洗涤2×106靶细胞，去上清液。用0.5 mL完全培养液悬浮细胞，加入100 μCi(3.7 MBq) Na251CrO4（即按200 μCi/mL），37 ℃水浴中标记1 h，每5-10 min摇晃一次，混匀细胞。用RPMI1640 培养液洗涤细胞三次，每次1000 rpm10 min。再用RPMI-1640 培养液悬浮细胞，置37 ℃水浴30 min，以减少非特异的自然释放。离心1000 rpm 10 min，去上清液。小心用RPMI-1640 培养液悬浮细胞，尽量减少振荡引起的细胞损伤以降低靶细胞的自然释放率，将细胞浓度调整为1×105/ mL 备用。在96孔板中加入51Cr 标记的靶细胞，每孔加100 μL（约为1×104个/孔）。向各孔加100 μL 效应细胞，设定不同效应细胞与靶细胞的比例（效靶比，E:T），同时另一组用不同的肽浓度(Peptide concentration)。阴性对照孔（自然释放）不加效应细胞只加100 μL完全培养液，阳性对照孔（最大释放）中加100 μL 1%NP40（或2%SDS，或1 mol/L盐酸或10 mg/mL Triton X-100 100 μL）每个实验置两个复孔。稍稍离心(1000 rpm 3 min)后，置37 ℃ 5% CO2的二氧化碳培养箱中培养4 h。离心培养板(1000 rpm 10min)，每孔吸出100 μL上清液置一次性使用的检测管中，在γ-计数仪上（或液闪计数仪上）测定上清液中的每min放射性活性（cpm值）。特异性杀伤活性的计算：细胞毒性(%)＝[（实验组cpm－自然释放组cpm）/（最大释放组cpm－自然释放组cpm）]×100%