微生物实验
实验一常用玻璃器皿的清洗及包扎
一.目的与要求
（一）熟悉微生物实验所需各种常用器皿的名称和规格。
（二）学会正确的清洗玻璃器皿的方法和包扎方法
二.原理
为了包装实验顺利进行，要求把实验用器皿清洗干净，保持灭菌后无菌状态，需要对培养皿、吸管等进行妥善包扎，试管和三角瓶要做棉塞。清洗方法根据实验目的、器皿的种类、所盛放的物品、洗净剂的类别和沾污程度等的不同而有所不同，不同的器皿包扎方法也不同。三.材料与仪器
（一）常用的各种玻璃器皿。
（二）洗涤工具和去污粉、肥皂、洗涤液。
四.操作步骤
（一）清洗
1.新玻璃器皿的清洗
新购置的玻璃器皿均含有游离碱，故应先将其浸于洗液或2%的盐酸溶液中数小时，再用自来水冲洗干净。
2.用过的玻璃器皿的清洗
（1）试管、培养皿、三角烧瓶、烧杯可用瓶刷或海绵沾上肥皂、洗衣粉或去污粉等洗涤剂刷洗，然后在用自来水充分冲洗干净。经洗涤后，若内壁的水均匀分布在一薄层，表示油垢完全洗净，若挂有水珠，则需用洗涤液（或洗液）浸泡数小时，再用自来水充分冲洗，洗涤干净的器皿倒置与铁丝框内或有空心格子木架上，室内晾干。
（2）玻璃吸管、滴管一般用完后应立即用清水和蒸馏水浸泡（或冲洗），免得干燥后难以冲洗干净，如附有污物可用洗液浸泡。
（3）载玻片与盖玻片带有油污的应擦去有无后用热乙醇、丙酮、二甲苯等溶液浸泡10~15min，溶液油垢然后用水冲洗，再用洗涤液浸泡、冲洗，干后置于95%乙醇中保存备用。
（二）玻璃器皿的包扎
1.培养皿常用旧报纸或牛皮纸包紧，一般以5~10套培养皿作一包。包好后进行干热或湿热灭菌，如将培养皿放入金属（不锈钢）筒内进行热灭，则不必用纸包。
2.试管和三角瓶
试管管口和三角瓶都需要塞以棉花塞（或泡膜塑料塞），棉花塞的作用是起过滤作用，避免空气中的微生物进入试管或三角瓶。棉花塞的制作要求使用棉花塞紧贴玻璃壁，没有皱纹和缝隙，不能过紧也不能过松，长度不少于管口直径的二倍，约2/3塞进管口。若干支试管用绳扎在一起，在棉塞部分外包裹牛皮纸或2层旧报纸，再扎好。
三角瓶每个单独用牛皮纸或旧报纸包扎棉塞。
3.吸管洗净烘干后的吸管，在口吸的一端月0.5cm处，用尖头镊子或针塞入少许脱脂棉，以免使用时将杂菌吹入其中，或不慎将微生物吸出管外，棉花要塞得松紧恰当。然后分别将每支吸管尖端斜放在旧报纸的近左端，以45度左右的角度螺旋形卷起来，右端多余的报纸大一小结，不使散开。
五、实验报告
（一）结果检查实验效果
（二）思考题
1.能否用橡皮塞、木塞来代替棉塞，为什么？
2.玻璃器皿清洗时应注意什么？
实验二普通光学显微镜的构造和使用
一、目的与要求
（一）学习普通光学显微镜的结构、部分功能及使用方法。
（二）学习并掌握油镜的原理的使用方法。
二、原理
普通光学显微镜由机械装置和光学系统2大部分构成。在光学系统中物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。而在普通光学显微镜中配置的几种物镜以油镜的放大倍数最大，与其他物镜相比，使用较特殊，需在载玻片与镜头之间加滴镜油，以增加照明亮度和提高分辨率。
三、材料与仪器
（一）菌种金黄色葡萄球菌及枯草杆菌染色玻片标本，啤酒酵母水浸片。
（二）其他香柏油、二甲苯、显微镜、擦镜纸。
四、操作步骤
（一）显微镜的安置置显微镜于平整的实验台上，镜座距实验台边缘3~4cm，镜检时姿势要端正。
（二）调节光源安装在镜座内的光源灯可通过调节电压以获得适当的照明亮度，而使用反光镜采集自然光或灯光作为照明光源时，应根据光源的强度及所用物镜的放大倍数选用凹面或平面反光镜并调节其角度，使视野内的光线均匀，亮度适宜。
（三）低倍镜观察将标本玻片置于载物台上，用标本夹夹住，移动推进器使观察对象处在物镜的正下方，下降10×物镜，使其接近标本，用粗调节器（粗调螺旋）慢慢升起镜筒，出现图像后，再用细调节器（细调螺旋）调节图像至清晰。通过标本夹推进器慢慢移动玻片，认真观察标本各部位，找到合适目的物，仔细观察。
（四）高倍镜观察在低倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心后，转动物镜转换器将高倍镜移至工作位置，对聚光器光圈及视野亮度进行适当调节后微调细调节器使物象清晰，利用推进器移动标本仔细观察并记录。
（五）油镜观察在低倍镜或高倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升高约2cm，然后在待观察区域滴加1~2滴香柏油，将油镜转到工作位置，从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接，将聚光器升至最高位置并开足光圈，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中出现物象并用细调节器使其清晰为止。（六）显微镜用后处理
1.上升镜筒，取下载玻片。
2.用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，然后擦镜纸蘸少许二甲苯擦去镜头上的残留的油迹，然后再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。
3.用擦镜纸清洁其他物镜和目镜，用绸布清洁显微镜的金属部件。
4.将各部分还原，反光镜垂于镜座，将物镜转成“八字形“再向下旋，同时把聚光镜降下，以免物镜与聚光镜发生碰撞危险。
五、实验报告
（一）结果分别绘出在不同物镜下观察到的不同菌种的形态，同时注明放大倍数。（二）思考题
1.油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意什么？
2.显微镜中调节光线强弱的装置有哪些？
实验三酵母菌形态观察
一、目的与要求
观察酵母菌的形态及出芽繁殖方式。
二、原理
大小通常比细菌大几倍甚至于十几倍，大多数的酵母以出芽方式进行无性繁殖，有的二分裂繁殖。用美兰支制成的水浸片，可观察酵母的形态和出芽繁殖方式以及进行死活细胞的鉴别（染成蓝色的为死细胞，无色的为活细胞）、
三、材料与仪器
（一）啤酒酵母，假丝酵母，汉逊酵母。
（二）显微镜，载玻片，盖玻片，接种针，酒精灯。
（三）吕氏美蓝染液。
四、操作步骤
（一）在干净载玻片中央加一滴吕氏美蓝染色液，以无菌操作接种环挑取少量酵母菌体放于美蓝液中，混合均匀。
（二）取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下（以免产生气泡），使其盖在菌液上，将多余菌液用吸水纸吸干。
（三）将盖玻片置于载物台上，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母的形态和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。
（四）染色约0.5h后再进行观察，注意四细胞数量是否增加。
五、实验报告
(一) 结果绘图说明你所观察到的酵母形态特征。
(二) 思考题
1. 在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别于一般细菌？
2. 酵母水浸片制作室应注意什么？
实验十三培养基的制备
一、目的与要求
(一) 学习制备培养基的基本技术。
(二) 制备牛肉膏蛋白琼脂培养基。
二、原理
牛肉膏蛋白培养基时一种应用最广泛和最普通的细菌培养基，这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，可供繁殖之用。制作固体培养基时须加2%琼脂，培养细菌时，应用烯酸或稀碱将PH调至中性或微碱性。牛肉膏蛋白培养基的配方：牛肉膏0.%5 蛋白胨1% NaCL0.5% pH7.4~7.6.
三、材料与仪器
（一）试剂牛肉膏，蛋白胨，Nacl，琼脂1mol/L;NaoH1 mol/L HCL
（二）其他试管，三角烧杯，烧杯，量筒，漏斗，乳胶管，弹簧夹，纱布，棉花，牛皮纸，线绳，pH试纸，电炉，台秤。
四、操作步骤
(一) 称量根据用量按比例依次称取各种成分，牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水熔化后倒入烧杯，蛋白胨易吸湿，称量时要迅速。
(二) 溶解在烧杯中加入少于所需要的水量，加热，逐一加入各成分，使其溶解，琼脂在溶液煮沸后加入，融化过程需要不断搅拌。加热时应注意火力，勿使培养基烧焦或溢出。溶好后，不足所需水分。
(三) 调PH 用1 mol/L NaoH把pH调至所需范围。
(四) 过滤趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利于某些实验结果的观察，如无特殊要求时可省去此步骤。
(五) 分装按实验要求，可将配置的培养基分装入试管内或三角瓶内，分装装置如实验图-8 所示：分装时注意，勿使培养基沾染在容器口上，以免沾污棉塞引起污染。
1．液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜，分装三角瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的1/2为宜。
2．固体分装分装试管，其装量不超过量筒的1/5，灭菌后制成斜面，斜面长度不超过管长的1/2。分装三角瓶，以不超过容积的1/2为宜。
3.半固体分装装置以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝
（六）加棉塞分装完毕后，在试管或三角瓶口塞上棉塞（或泡沫塑料塞及试管帽等），以阻止外界微生物进入培养基而造成污染，并保证有良好的通气性能。
（七）包扎棉塞头上包一层牛皮纸，扎紧，即可进行灭菌。
（八）保存灭菌后的培养基放入37℃培养箱中培养24h，以检验灭菌的效果，无污染方可使用。
五、实验报告
（一）结果说明你配置培养基过程中的情况。
（思考题）
1. 培养基配置时应注意什么问题？为什么？
2. 分装培养基时为什么要使用弹簧夹？
3. 培养基配好后，为什么要立即灭菌？
实验四干热灭菌及高压蒸汽灭菌
一、目的与要求
二、原理
干热灭菌时利用高温使微生物细胞内的蛋白凝固变形而达到灭菌的目的，细胞内的蛋白质凝固性与其本省的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固越块，反之含水量越小，则凝固越慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高（160~170℃），时间长（1~2h）.高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放入一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅内水沸腾产生蒸汽，水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续温度，导致菌体蛋白质凝固变形而达到灭菌的目的。
一般培养及用0.1MPa(相当于15Ib/In2或1.05kg/cm2)121.5℃。
15~30min可达到彻底灭菌，灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。
三、材料与仪器
吸管，培养皿，试管，电热干燥箱，手提式高压灭菌蒸汽灭菌锅，牛肉膏蛋白胨培养基、蒸馏水。
四、操作步骤
（一）干热灭菌法，适用于空的、干燥的玻璃器皿的灭菌。培养基不适用。
1. 将包好的待灭菌物品（培养皿、试管、吸管等）放入电热干燥箱（注意留一定间隙），管好箱门。
2. 接通电源，打开排气孔，使箱内湿空气能逸出，旋动恒温调节器，保持加热升温状态，至箱内达到100℃时关闭排气孔。
3. 当温度升到160~170℃时，借恒温调节器的自动控制，保持此温度2h。
4. 切断电源，冷却至70℃时，打开箱门，取出灭菌物品（未将至70℃以前，切勿打开箱门，否则温度骤降导致玻璃器皿炸裂）、
（二）高压蒸汽灭菌
1. 首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。
2. 放回内层锅，并装入待灭菌物品（内装培养基或小的三角瓶），不要装的太挤，以免妨碍蒸汽流通过影响灭菌效果，三角瓶口部要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。加盖，旋紧。
3. 打开排气阀，使水沸腾以排除锅的冷空气，待冷空气排尽后，关上排气阀让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升，当锅内达到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。一般灭菌采用121摄氏度保存20-30分钟。
4. 停止加热，待压力表的压力至零位时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。注意，当压力不为零时，不能开盖取物，否则由于压力突然下降，容器内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染而发生污染，甚至灼伤操作者。
5. 高压灭菌锅上的安全阀，是保障安全使用的重要机构，不得随意调节。
五、实验报告
（一）结果检查灭菌是否彻底。
（二）思考题
1. 干热灭菌操作过程中应注意哪些问题，为什么？
2. 为什么干热灭菌所需温度要比湿热灭菌高?
3. 高压蒸汽灭菌时，为什么要排尽锅内的冷空气？
实验十七微生物的平板菌落基数法
一，目的与要求
掌握用平板菌落计数法来测定一定数量样品中微生物细胞数目。
二，原理
平板菌落计数法是通过将样品制成一系列不同的稀释液，使样品中微生物个体分散成当个细胞状态。再取一定量的稀释液接种，使其均匀分部于培养皿中培养基上。培养后统计菌落数目，一般认为每一个菌落是由一个细胞增殖后形成，所以可计算出样品的含菌量。
三，材料与仪器
（一）样品，无菌水。
（二）培养基普通营养琼脂培养基。
（三）培养皿，恒温培养箱等。
四，实验步骤
（一）样品处理
1，在无菌的条件下，精确称取10g固体样品或量取10mL 液体样品。
2将10g固体样品迅速倒入已灭菌的装有玻璃珠和90mL无菌水的三角瓶中，充分振荡15—30min,制成稀释10倍的菌悬液，10ml液体样品依稀释10倍。
3，用1支试管吸取1mL稀释10倍的菌液，加入第一支有9ml无菌水的试管中，摇匀后得稀释100倍的菌液。换用一支试管依次稀释到103、10……10、10倍，稀释程度以样品中可能含有的活菌数多少而定。
（制平板）
1.混合平板培养计数法上述样品稀释好后，用吸管取适当稀释倍数的样品稀释液1mL,放入已灭菌的培养皿中，再迅速倒入约15mL融化而冷却至50℃左右的琼脂培养基，将培养皿按顺、反时针方向旋转摇动，使样品稀释液和培养基混匀，放平，冷却凝固后倒转放置，在被测微生物最适温度下培养（每一个稀释样品各做三个培养皿），当出现菌落后，用计数器进行计数。
2.涂抹平板培养计数法先将融化并冷却至50℃左右的15ML琼脂培养基注入已灭菌的培养皿中。放平冷却凝固后，将不同稀释度的样品液0.2mL于培养皿中央，并用玻璃棒均匀地涂抹在平板表面，同意浓度可用一个玻璃棒连续涂抹。否则，需灭菌后再用。涂抹后的培养皿，暂放几小时，待稀释液中的水分干后将培养皿倒置保温培养，菌落长出后，用计数器进行计数。
五、实验报告
（一）结果
2.计算
混合平板培养计算公式：
每克样品菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数X稀释倍数涂抹平板培养计算公式：每克样品菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数X稀释倍数X5
（思考题）
平板技术法的优缺点是什么？
AYUI;09RA qweLO 6EZSGD3A5RTG
试验五酵母菌形态观察
一、目的与要求
观察酵母菌的形态及出芽繁殖方式。
二、原理
大小通常比细菌大几倍甚至于十几倍，大多数的酵母以出芽方式进行无性繁殖，有的二分裂繁殖。用美兰支制成的水浸片，可观察酵母的形态和出芽繁殖方式以及进行死活细
胞的鉴别（染成蓝色的为死细胞，无色的为活细胞）、
三、材料与仪器
（一）啤酒酵母，假丝酵母，汉逊酵母。
（二）显微镜，载玻片，盖玻片，接种针，酒精灯。
（三）吕氏美蓝染液。
四、操作步骤
（一）在干净载玻片中央加一滴吕氏美蓝染色液，以无菌操作接种环挑取少量酵母菌体放于美蓝液中，混合均匀。
（二）取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下（以免产生气泡），使其盖在菌液上，将多余菌液用吸水纸吸干。
（三）将盖玻片置于载物台上，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母的形态和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。
（四）染色约0.5h后再进行观察，注意四细胞数量是否增加。
五、实验报告
(一)结果绘图说明你所观察到的酵母形态特征。
(二)思考题
1.在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别于一般细菌？
2.酵母水浸片制作室应注意什么？
实验十三培养基的制备
一、目的与要求
(一)学习制备培养基的基本技术。
(二)制备牛肉膏蛋白琼脂培养基。
二、原理
牛肉膏蛋白培养基时一种应用最广泛和最普通的细菌培养基，这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，可供繁殖之用。制作固体培养基时须加2%琼脂，培养细菌时，应用烯酸或稀碱将PH调至中性或微碱性。牛肉膏蛋白培养基的配方：牛肉膏0.%5 蛋白胨1% NaCL0.5% pH7.4~7.6.
三、材料与仪器
（一）试剂牛肉膏，蛋白胨，Nacl，琼脂1mol/L;NaoH1 mol/L HCL
（二）其他试管，三角烧杯，烧杯，量筒，漏斗，乳胶管，弹簧夹，纱布，棉花，牛皮纸，线绳，pH试纸，电炉，台秤。
四、操作步骤
(一)称量根据用量按比例依次称取各种成分，牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表
面皿中称量，用热水熔化后倒入烧杯，蛋白胨易吸湿，称量时要迅速。
(二)溶解在烧杯中加入少于所需要的水量，加热，逐一加入各成分，使其溶解，
琼脂在溶液煮沸后加入，融化过程需要不断搅拌。加热时应注意火力，勿使培养基
烧焦或溢出。溶好后，不足所需水分。
(三)调PH 用1 mol/L NaoH把pH调至所需范围。
(四)过滤趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利于某些实验结果的观察，如无特殊要求
时可省去此步骤。
(五)分装按实验要求，可将配置的培养基分装入试管内或三角瓶内，分装装置如实
验图-8 所示：分装时注意，勿使培养基沾染在容器口上，以免沾污棉塞引起污染。
1．液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜，分装三角瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的1/2为宜。
2．固体分装分装试管，其装量不超过量筒的1/5，灭菌后制成斜面，斜面长度不超过管长的1/2。分装三角瓶，以不超过容积的1/2为宜。
3.半固体分装装置以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝
（六）加棉塞分装完毕后，在试管或三角瓶口塞上棉塞（或泡沫塑料塞及试管帽等），以阻止外界微生物进入培养基而造成污染，并保证有良好的通气性能。
（七）包扎棉塞头上包一层牛皮纸，扎紧，即可进行灭菌。
（八）保存灭菌后的培养基放入37℃培养箱中培养24h，以检验灭菌的效果，无污染方可使用。
五、实验报告
（一）结果说明你配置培养基过程中的情况。
（思考题）
1.培养基配置时应注意什么问题？为什么？
2.分装培养基时为什么要使用弹簧夹？
3.培养基配好后，为什么要立即灭菌？
实验十三干热灭菌及高压蒸汽灭菌
一、目的与要求
二、原理
干热灭菌时利用高温使微生物细胞内的蛋白凝固变形而达到灭菌的目的，细胞内的蛋白质凝固性与其本省的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固越块，反之含水量越小，则凝固越慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高（160~170℃），时间长（1~2h）.高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放入一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅内水沸腾产生蒸汽，水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续温度，导致菌体蛋白质凝固变形而达到灭菌的目的。
一般培养及用0.1MPa(相当于15Ib/In2或1.05kg/cm2)121.5℃。
15~30min可达到彻底灭菌，灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。
三、材料与仪器
吸管，培养皿，试管，电热干燥箱，手提式高压灭菌蒸汽灭菌锅，牛肉膏蛋白胨培养基、蒸馏水。
四、操作步骤
（一）干热灭菌法，适用于空的、干燥的玻璃器皿的灭菌。培养基不适用。
1.将包好的待灭菌物品（培养皿、试管、吸管等）放入电热干燥箱（注意留
一定间隙），管好箱门。
2.接通电源，打开排气孔，使箱内湿空气能逸出，旋动恒温调节器，保持加
热升温状态，至箱内达到100℃时关闭排气孔。
3.当温度升到160~170℃时，借恒温调节器的自动控制，保持此温度2h。
4.切断电源，冷却至70℃时，打开箱门，取出灭菌物品（未将至70℃以前，
切勿打开箱门，否则温度骤降导致玻璃器皿炸裂）、
（二）高压蒸汽灭菌
1.首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平
为宜。
2.放回内层锅，并装入待灭菌物品（内装培养基或小的三角瓶），不要装的
太挤，以免妨碍蒸汽流通过影响灭菌效果，三角瓶口部要与桶壁接触，
以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。加盖，并将盖上的排气软管插入
内层锅的排气槽内，再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使
螺栓松紧一致，勿使漏气。
3.用电炉或其他方法加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅的冷空气，
待冷空气排尽后，关上排气阀让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升，
当锅内达到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。
4.停止加热，待压力表的压力至零位时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，
取出灭菌物品。注意，当压力不为零时，不能开盖取物，否则由于压力
突然下降，容器内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染
而发生污染，甚至灼伤操作者。
5.高压灭菌锅上的安全阀，是保障安全使用的重要机构，不得随意调节。
五、实验报告
（一）结果检查灭菌是否彻底。
（二）思考题
1.干热灭菌操作过程中应注意哪些问题，为什么？
2.为什么干热灭菌所需温度要比湿热灭菌高?
3.高压蒸汽灭菌时，为什么要排尽锅内的冷空气？
实验十七微生物的平板菌落基数法
一，目的与要求
掌握用平板菌落计数法来测定一定数量样品中微生物细胞数目。
二，原理
平板菌落计数法是通过将样品制成一系列不同的稀释液，使样品中微生物个体分散成当个细胞状态。再取一定量的稀释液接种，使其均匀分部于培养皿中培养基上。培养后统计菌落数目，一般认为每一个菌落是由一个细胞增殖后形成，所以可计算出样品的含菌量。
三，材料与仪器
（一）样品，无菌水。
（二）培养基普通营养琼脂培养基。
（三）培养皿，恒温培养箱等。
四，实验步骤
（一）样品处理
1，在无菌的条件下，精确称取10g固体样品或量取10mL 液体样品。
2将10g固体样品迅速倒入已灭菌的装有玻璃珠和90mL无菌水的三角瓶中，充分振荡15—30min,制成稀释10倍的菌悬液，10ml液体样品依稀释10倍。
3，用1支试管吸取1mL稀释10倍的菌液，加入第一支有9ml无菌水的试管中，摇匀后得稀释100倍的菌液。换用一支试管依次稀释到103、10……10、10倍，稀释程度以样品中可能含有的活菌数多少而定。
（制平板）
1.混合平板培养计数法上述样品稀释好后，用吸管取适当稀释倍数的样品稀释液1mL,放入已灭菌的培养皿中，再迅速倒入约15mL融化而冷却至50℃左右的琼脂培养基，将培养皿按顺、反时针方向旋转摇动，使样品稀释液和培养基混匀，放平，冷却凝固后倒转放置，在被测微生物最适温度下培养（每一个稀释样品各做三个培养皿），当出现菌落后，用计数器进行计数。
2.涂抹平板培养计数法先将融化并冷却至50℃左右的15ML琼脂培养基注入已灭菌的培养皿中。放平冷却凝固后，将不同稀释度的样品液0.2mL于培养皿中央，并用玻璃棒均匀
地涂抹在平板表面，同意浓度可用一个玻璃棒连续涂抹。否则，需灭菌后再用。涂抹后的培养皿，暂放几小时，待稀释液中的水分干后将培养皿倒置保温培养，菌落长出后，用计数器进行计数。
五、实验报告
（一）结果
2.计算
混合平板培养计算公式：
每克样品菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数X稀释倍数涂抹平板培养计算公式：每克样品菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数X稀释倍数X5
（思考题）
平板技术法的优缺点是什么？
实验二普通光学显微镜的构造和使用
一、目的与要求
（一）学习普通光学显微镜的结构、部分功能及使用方法。
（二）学习并掌握油镜的原理的使用方法。
二、原理
普通光学显微镜由机械装置和光学系统2大部分构成。在光学系统中物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。而在普通光学显微镜中配置的几种物镜以油镜的放大倍数最大，与其他物镜相比，使用较特殊，需在载玻片与镜头之间加滴镜油，以增加照明亮度和提高分辨率。
三、材料与仪器
（一）菌种金黄色葡萄球菌及枯草杆菌染色玻片标本，啤酒酵母水浸片。
（二）其他香柏油、二甲苯、显微镜、擦镜纸。
四、操作步骤
（一）显微镜的安置置显微镜于平整的实验台上，镜座距实验台边缘3~4cm，镜检时姿势要端正。
（二）调节光源安装在镜座内的光源灯可通过调节电压以获得适当的照明亮度，而使用反光镜采集自然光或灯光作为照明光源时，应根据光源的强度及所用物镜的放大倍数选用凹面或平面反光镜并调节其角度，使视野内的光线均匀，亮度适宜。
（三）低倍镜观察将标本玻片置于载物台上，用标本夹夹住，移动推进器使观察对象处在物镜的正下方，下降10×物镜，使其接近标本，用粗调节器（粗调螺旋）慢慢升起镜筒，出现图像后，再用细调节器（细调螺旋）调节图像至清晰。通过标本夹推进器慢慢移动玻片，认真观察标本各部位，找到合适目的物，仔细观察。
（四）高倍镜观察在低倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心后，转动物镜转换器将高倍镜移至工作位置，对聚光器光圈及视野亮度进行适当调节后微调细调节器使物象清晰，利用推进器移动标本仔细观察并记录。
（五）油镜观察在低倍镜或高倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升高约2cm，然后在待观察区域滴加1~2滴香柏油，将油镜转到工作位置，从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接，将聚光器升至最高位置并开足光圈，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中出现物象并用细调节器使其清晰为止。
（六）显微镜用后处理
1.上升镜筒，取下载玻片。
2.用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，然后擦镜纸蘸少许二甲苯擦去镜头上的残留的油迹，然后再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。
3.用擦镜纸清洁其他物镜和目镜，用绸布清洁显微镜的金属部件。
4.将各部分还原，反光镜垂于镜座，将物镜转成“八字形“再向下旋，同时把聚光镜降下，以免物镜与聚光镜发生碰撞危险。
五、实验报告
（一）结果分别绘出在不同物镜下观察到的不同菌种的形态，同时注明放大倍数。（二）思考题
1.油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意什么？
2.显微镜中调节光线强弱的装置有哪些？
试验五酵母菌形态观察
一、目的与要求
观察酵母菌的形态及出芽繁殖方式。
二、原理
大小通常比细菌大几倍甚至于十几倍，大多数的酵母以出芽方式进行无性繁殖，有的二分裂繁殖。用美兰支制成的水浸片，可观察酵母的形态和出芽繁殖方式以及进行死活细胞的鉴别（染成蓝色的为死细胞，无色的为活细胞）、
三、材料与仪器
（一）啤酒酵母，假丝酵母，汉逊酵母。
（二）显微镜，载玻片，盖玻片，接种针，酒精灯。
（三）吕氏美蓝染液。
四、操作步骤
（一）在干净载玻片中央加一滴吕氏美蓝染色液，以无菌操作接种环挑取少量酵母菌体放于美蓝液中，混合均匀。
（二）取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下（以免产生气泡），使其盖在菌液上，将多余菌液用吸水纸吸干。
（三）将盖玻片置于载物台上，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母的形态和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。
（四）染色约0.5h后再进行观察，注意四细胞数量是否增加。
五、实验报告
(一) 结果绘图说明你所观察到的酵母形态特征。
(二) 思考题
1. 在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别于一般细菌？
2. 酵母水浸片制作室应注意什么？
实验十三培养基的制备
一、目的与要求
(一) 学习制备培养基的基本技术。
(二) 制备牛肉膏蛋白琼脂培养基。
二、原理
牛肉膏蛋白培养基时一种应用最广泛和最普通的细菌培养基，这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，可供繁殖之用。制作固体培养基时须加2%琼脂，培养
细菌时，应用烯酸或稀碱将PH调至中性或微碱性。牛肉膏蛋白培养基的配方：牛肉膏0.%5 蛋白胨1% NaCL0.5% pH7.4~7.6.
三、材料与仪器
（一）试剂牛肉膏，蛋白胨，Nacl，琼脂1mol/L;NaoH1 mol/L HCL
（二）其他试管，三角烧杯，烧杯，量筒，漏斗，乳胶管，弹簧夹，纱布，棉花，牛皮纸，线绳，pH试纸，电炉，台秤。
四、操作步骤
(一) 称量根据用量按比例依次称取各种成分，牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水熔化后倒入烧杯，蛋白胨易吸湿，称量时要迅速。
(二) 溶解在烧杯中加入少于所需要的水量，加热，逐一加入各成分，使其溶解，琼脂在溶液煮沸后加入，融化过程需要不断搅拌。加热时应注意火力，勿使培养基烧焦或溢出。溶好后，不足所需水分。
(三) 调PH 用1 mol/L NaoH把pH调至所需范围。
(四) 过滤趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利于某些实验结果的观察，如无特殊要求时可省去此步骤。
(五) 分装按实验要求，可将配置的培养基分装入试管内或三角瓶内，分装装置如实验图-8 所示：分装时注意，勿使培养基沾染在容器口上，以免沾污棉塞引起污染。
1．液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜，分装三角瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的1/2为宜。
2．固体分装分装试管，其装量不超过量筒的1/5，灭菌后制成斜面，斜面长度不超过管长的1/2。分装三角瓶，以不超过容积的1/2为宜。
3.半固体分装装置以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝
（六）加棉塞分装完毕后，在试管或三角瓶口塞上棉塞（或泡沫塑料塞及试管帽等），以阻止外界微生物进入培养基而造成污染，并保证有良好的通气性能。
（七）包扎棉塞头上包一层牛皮纸，扎紧，即可进行灭菌。
（八）保存灭菌后的培养基放入37℃培养箱中培养24h，以检验灭菌的效果，无污染方可使用。
五、实验报告
（一）结果说明你配置培养基过程中的情况。
（思考题）
1. 培养基配置时应注意什么问题？为什么？
2. 分装培养基时为什么要使用弹簧夹？
3. 培养基配好后，为什么要立即灭菌？
实验十三干热灭菌及高压蒸汽灭菌
一、目的与要求
二、原理
干热灭菌时利用高温使微生物细胞内的蛋白凝固变形而达到灭菌的目的，细胞内的蛋白质凝固性与其本省的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固越块，反之含水量越小，则凝固越慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高（160~170℃），时间长（1~2h）.高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放入一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅内水沸腾产生蒸汽，水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续温度，导致菌体蛋白质凝固变形而达到灭菌的目的。
一般培养及用0.1MPa(相当于15Ib/In2或1.05kg/cm2)121.5℃。
15~30min可达到彻底灭菌，灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况
而有所改变。
三、材料与仪器
吸管，培养皿，试管，电热干燥箱，手提式高压灭菌蒸汽灭菌锅，牛肉膏蛋白胨培养基、蒸馏水。
四、操作步骤
（一）干热灭菌法，适用于空的、干燥的玻璃器皿的灭菌。培养基不适用。
1. 将包好的待灭菌物品（培养皿、试管、吸管等）放入电热干燥箱（注意留一定间隙），管好箱门。
2. 接通电源，打开排气孔，使箱内湿空气能逸出，旋动恒温调节器，保持加热升温状态，至箱内达到100℃时关闭排气孔。
3. 当温度升到160~170℃时，借恒温调节器的自动控制，保持此温度2h。
4. 切断电源，冷却至70℃时，打开箱门，取出灭菌物品（未将至70℃以前，切勿打开箱门，否则温度骤降导致玻璃器皿炸裂）、
（二）高压蒸汽灭菌
1. 首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。
2. 放回内层锅，并装入待灭菌物品（内装培养基或小的三角瓶），不要装的太挤，以免妨碍蒸汽流通过影响灭菌效果，三角瓶口部要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内，再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。
3. 用电炉或其他方法加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅的冷空气，待冷空气排尽后，关上排气阀让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升，当锅内达到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。
4. 停止加热，待压力表的压力至零位时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。注意，当压力不为零时，不能开盖取物，否则由于压力突然下降，容器内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染而发生污染，甚至灼伤操作者。
5. 高压灭菌锅上的安全阀，是保障安全使用的重要机构，不得随意调节。
五、实验报告
（一）结果检查灭菌是否彻底。
（二）思考题
1. 干热灭菌操作过程中应注意哪些问题，为什么？
2. 为什么干热灭菌所需温度要比湿热灭菌高?
3. 高压蒸汽灭菌时，为什么要排尽锅内的冷空气？
实验十七微生物的平板菌落基数法
一，目的与要求
掌握用平板菌落计数法来测定一定数量样品中微生物细胞数目。
二，原理
平板菌落计数法是通过将样品制成一系列不同的稀释液，使样品中微生物个体分散成当个细胞状态。再取一定量的稀释液接种，使其均匀分部于培养皿中培养基上。
培养后统计菌落数目，一般认为每一个菌落是由一个细胞增殖后形成，所以可计算出样品的含菌量。
三，材料与仪器
（一）样品，无菌水。
（二）培养基普通营养琼脂培养基。
（三）培养皿，恒温培养箱等。
四，实验步骤
（一）样品处理
1，在无菌的条件下，精确称取10g固体样品或量取10mL 液体样品。
2将10g固体样品迅速倒入已灭菌的装有玻璃珠和90mL无菌水的三角瓶中，充分振荡15—30min,制成稀释10倍的菌悬液，10ml液体样品依稀释10倍。
3，用1支试管吸取1mL稀释10倍的菌液，加入第一支有9ml无菌水的试管中，摇匀后得稀释100倍的菌液。换用一支试管依次稀释到103、10……10、10倍，稀释程度以样品中可能含有的活菌数多少而定。
（制平板）
1.混合平板培养计数法上述样品稀释好后，用吸管取适当稀释倍数的样品稀释液1mL,放入已灭菌的培养皿中，再迅速倒入约15mL融化而冷却至50℃左右的琼脂培养基，将培养皿按顺、反时针方向旋转摇动，使样品稀释液和培养基混匀，放平，冷却凝固后倒转放置，在被测微生物最适温度下培养（每一个稀释样品各做三个培养皿），当出现菌落后，用计数器进行计数。
2.涂抹平板培养计数法先将融化并冷却至50℃左右的15ML琼脂培养基注入已灭菌的培养皿中。放平冷却凝固后，将不同稀释度的样品液0.2mL于培养皿中央，并用玻璃棒均匀地涂抹在平板表面，同意浓度可用一个玻璃棒连续涂抹。否则，需灭菌后再用。涂抹后的培养皿，暂放几小时，待稀释液中的水分干后将培养皿倒置保温培养，菌落长出后，用计数器进行计数。
五、实验报告
（一）结果
2.计算
混合平板培养计算公式：
每克样品菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数X稀释倍数涂抹平板培养计算公式：每克样品菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数X稀释倍数X5
（思考题）
平板技术法的优缺点是什么？
AYUI;09RA qweLO 6EZSGD3A5RTG
微生物实验报告(微生物形态观察、分布、灭菌消毒)
微生物实验 微生物实验 细菌形态观察 细菌分布 消毒灭菌
细菌形态观察 一、实验目的 1.掌握光学显微镜（油镜）的使用及日常维护 2.掌握细菌的三种形态 3.掌握临床常见细菌的形态及染色 4.掌握细菌的特殊结构 5.了解支原体、衣原体、立克次氏体、螺旋体及真菌的结构特点 二、实验原理 1. 普通光学显微镜（油镜）的使用 1. 在标本欲检部位滴一滴香柏油，然后转换油镜头 2. 从侧面观察并慢慢转动粗调节器，使油镜头浸没在油滴内，当油镜头几乎接触玻片时 停止转动，以免碰撞玻片，用双眼观察目镜，同时调节细调节器，直至细菌清晰 3. 根据需要调节显微镜亮度 2. 普通光学显微镜的维护 1.移动显微镜时，用右手持镜壁，左手托镜座，平端于胸前 2.油镜用毕后，要立即用擦镜纸擦去香柏油；再用滴有二甲苯的擦镜纸擦油镜头；最 后，用干净擦镜纸将镜头上的二甲苯擦去，以免损伤油镜头 3.镜头擦净后，降低接物镜并将其转成八字形，罩好镜罩放入柜内 4.做好使用记录 3．微生物知识 1．细菌按形态分类： 球菌：球形（包括双球菌、四联球菌、八叠球菌、葡萄球菌、链球菌等） 杆菌：杆状（包括单杆菌、双杆菌、链杆菌、分枝杆菌、双歧杆菌等） 螺旋菌：螺旋状（包括螺旋菌、弧菌等） 2．细菌的基本结构 细胞壁、细胞膜、细胞质、核质、核蛋白体 3．细菌的特殊结构 荚膜：如肺炎双球菌 鞭毛：又分单毛菌、双毛菌、丛毛菌、周毛菌。如：变形杆菌为周毛菌 菌毛 芽胞：如破伤风梭菌、炭疽芽胞杆菌、肉毒梭菌 4．微生物是一切肉眼看不见或看不清的微小生物的总称，包括原核类、真核类和非细胞类。 原核类：细菌、放线菌、蓝藻、衣原体、支原体、立克次氏体 真核类：真菌、原生动物、显微藻类 非细胞类：病毒、亚病毒 5．真菌 单细胞：圆形、芽生孢子。如：酵母菌
微生物试验
四、名词解释 1. 消毒（disinfection）：指杀死物体上病原微生物的方法，并不一定能杀死含芽胞的细菌或非病原微生物。 2. 灭菌（sterilization）：杀灭物体上所有微生物的方法，包括杀灭细菌芽胞在内的全部病原微生物和非病原微生物。 3. 无菌（asepsis）：指不存在活菌的意思。防止细菌进入人体或其他物品的操作技术，称为无菌操作。 4. 防腐（antisepsis）：防止或抑制体外细菌生长繁殖的方法。细菌一般不死亡。使用同一种化学药品在高浓度时为消毒剂，低浓度时常为防腐剂。 5. 抑菌（bacteriostasis）：抑制体内或体外细菌的生长繁殖。常用的抑菌剂为各种抗生素，可在体内抑制细菌的繁殖，或在体外用于抑菌试验以检测细菌对抗生素的敏感性。 8. 抗链球菌溶血素O试验（antistreptolysin O test, ASO test）：是用已知的链球菌“O”溶血毒素抗原检测患者血清中是否有相应链球菌溶血素O抗体的中和试验。它常用于辅助诊断急性风湿热的风湿活动期。其效价大于1：400以上有参考意义。 9. 肥达试验（Widal test）：利用已知的伤寒沙门菌菌体(O)抗原和鞭毛(H)抗原以及甲型、乙型、丙型副伤寒沙门菌鞭毛（H）抗原分别与不同稀释度的患者血清做定量凝集试验。根据抗体的动态变化，用于辅助诊断伤寒和副伤寒。 10. 外斐试验(Weil-Felix test)：是指某些普通变形杆菌X19、X2和Xk菌株含有的菌体(O)抗原，可与斑疹伤寒立克次体和恙虫病立克次体的部分抗原发生交叉反应，故可用以代替立克次体作为抗原与患者的血清进行凝集反应，此称为外斐试验，用以辅助诊断有关的立克次体病。 11. 锡克试验（Schick test）：用少量毒素测定机体内有无抗毒素免疫的一种方法。在一侧皮内注射白喉毒素0.1ml，若无任何反应，表示机体对白喉有免疫力；若24h－48h注射部位开始出现红肿，直径1cm-2cm，表示机体对白喉易感，无免疫力，血液中无抗毒素中和毒素。 12. 结核菌素试验（tuberculin test）：属于迟发型超敏反应，用结核菌素试剂做皮肤试验测定机体是否感染过结核分枝杆菌的一种迟发型超敏反应性试验。感染过结核分枝杆菌或接种过卡介苗者，一般都出现阳性反应。 13. 鲍－金培养基（B－G培养基）：含甘油、马铃薯和血液的营养培养基，用百日咳杆菌分离培养。 14. 卫星现象：流感嗜血杆菌生长时需V因子和X因子，将其流感杆菌分区划线在巧克力平板或血平板上，然后点种金黄色葡萄球菌。因金黄色葡萄球菌能合成V因子，置于37℃，培养18h－24h后观察菌落特点，凡是靠近金黄色葡萄球菌的流感杆菌生长得较好，形成菌落较大；而远离金黄色葡萄球菌越远的流感杆菌菌落越小，此现象称为卫星现象。这有助于对流感嗜血杆菌的鉴定。 15. 二相性真菌（dimorphic fungus）：有些真菌可因环境条件的改变，而使两种形态发生互变，称为二相性。如球孢子菌、组织胞浆菌等在含有动物蛋白的培养基上37℃培养时，呈酵母菌型；在普通培养基上25℃培养时，呈丝状菌 18. CPE（cytopathic effect,CPE）：病毒在细胞内增殖造成细胞破坏死亡的作用称其为杀细胞效应，这种效应在体外组织培养时可观察到细胞变园、聚集、脱落等，称为致细胞病变作用（CPE）。主要见于无包膜病毒，如肠道病毒等。 20. 血清学诊断：用已知抗原检测病人的血清中是否有相应抗体以及抗体效价的动态变化血清学诊断可作为某些传染性疾病的辅助诊断。此试验一般取病人血清进行试验，故通常称之为血清学诊断。 五、问答题 1. 革兰氏染色法的方法、步骤、结果和意义是什么? 2. 答：革兰染色法的操作与步骤如下： （1）标本片制作：取材涂片干燥固定 （2）染色步骤： 第一液碱性结晶紫，初染1min，水洗；
完整版防腐挑战实验
第一部分防腐挑战实验调研结果1实验样品 样本要求新鲜，没有被微生物污染，一般每个样本为300go 2微生物挑战性实验 2.1实验菌株 不同国家、组织、企业对挑战实验选择的测试菌种有一定差异（如表 国化妆品、香精和洗涤剂协会（CTFA）推荐的菌种（因其较具代表性，如表更为恰当。（注意菌株来源问题：同属一个种的细菌来源不同，菌株不同，表1 某些国家、组织、企业用于化妆品微生物挑战试验的测试菌株 美国美国英国德国菌株 （药典）（ISP公司）（药典）（Henkel公司）白假丝酵母V V V V 黑曲霉V V V V 红色青霉V 绿色木霉V 绳状青霉 大肠埃希氏菌V V V 镉绿假单胞菌V V V 金黄色葡萄球菌V V V V 粪肠球菌V 产气肠杆菌V 表皮葡萄球菌1）,国内参照美2所示），所以MIC值不同） 德国 （S&M公
日勾维肠杆菌洋葱假单胞菌
肺炎克雷伯氏菌 恶臭假单胞菌 荧光假单胞菌 表2 CTFA化妆品微生物挑战试验的菌株选择 种类菌株数量 革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌 至少选一种 发酵革兰氏阴性杆菌表皮葡萄球菌肺炎克雷伯氏菌 阴沟肠杆菌 大肠埃希氏菌 至少选两种 非发酵革兰氏阴性杆菌 变形菌属 日勾维肠杆菌铜绿假单胞菌洋 葱假单胞菌荧光假单胞菌 至少选一种 酵母 恶臭假单胞菌 黄杆菌属不动杆菌属白假丝酵母 至少选一种 霉菌近平滑假丝酵母 黑曲霉 至少选一种 产芽砲菌 黄绿青霉 枯草芽砲杆菌 供选用 生产现场分离菌适当菌株—*种以上2.2培养基 牛肉膏蛋白月东培养基、琼脂培养基
2.3试验用菌液的配置 （1）标准悬液的配制 1%硫酸9.9ml与1%氯化锁0.1ml,混合后配制成的悬液浓度为3X108clu/ml , 此悬液再做3倍稀释。 （2）细菌菌悬液的配制 实验前将菌株接种到各个培养基斜面上，36摄氏度恒温培养48小时。将己培养好的活性菌种，用灭菌生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀。用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作稀释，浊度和标准悬液的浊度（ 3X 108cfu/ml）相同为止； 此时的稀释菌液再做3倍稀释，即为所需的1 X108cfu/ml的菌悬液，做细菌总数确定细菌数。 （3）霉菌菌悬液的配制 将已培养好的活性菌种，用灭菌的生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡 摇匀；用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作依次的10倍稀释，每次的稀释用血球计 数板计数，必须5个中格的霉菌总数在190?210,落在此范围内的菌悬液为我们所需的1 X 108cfo/ml的霉菌菌悬液，做霉菌总数确定霉菌数。 2.4接种 2.4.1接种方式 （1）单菌接种：每种测试菌株单独做一个挑战试验。这种方法的优点是容易了解每种微生物对防腐体系的敏感性，在筛选产品的防腐体系时有较好的参考价值，但工作量大、费时、费工，和产品的实际污染菌情况也有差距（因来自自然界的微生物常常不是单一的种类）。 （2）混合菌接种：西欧、德国等的许多国家和企业多采用这种方式，除了
微生物实验室要求
微生物检验实验室操作技术要求 第一节实验室管理制度 一、实验室管理制度 1．实验室应制定仪器配备管理、使用制度，药品管理、使用制度，玻璃器皿管理，使用制度，并根据安全制度和环境条件的要求，本室工作人员应严格掌握，认真执行。 2．进入实验室必须穿工作服，进入无菌室换无菌衣、帽、鞋，戴好口罩，非实验室人员不得进入实验室，严格执行安全操作规程。 3．实验室内物品摆放整齐，试剂定期检查并有明晰标签，仪器定期检查、保养、检修, 严禁在冰箱内存放和加工私人食品。 4．各种器材应建立请领消耗记录，贵重仪器有使用记录，破损遗失应填写报告；药品、器材、菌种不经批准不得擅自外借和转让，更不得私自拿出，应严格执行《菌种保管制度》。 5．禁止在实验室内吸烟、进餐、会客、喧哗，实验室内不得带入私人物品，离开实验室前认真检查水、电、暖气、门窗，对于有毒、有害、易燃、污染、腐蚀的物品和废弃物品应按有关要求执行。 6．科、室负责人督促本制度严格执行，根据情况给于奖惩，出现问题立即报告，造成病原扩散等责任事故者，应视情节直至追究法律责任。 二、仪器配备、管理使用制度 1．食品微生物实验室应具备下列仪器：培养箱、高压锅、普通冰箱、低温冰箱、厌氧培养设备、显微镜、离心机、超净台、振荡器、
普通天平、千分之一天平、烤箱、冷冻干燥设备、匀质器、恒温水浴箱、菌落计数器、生化培养箱，电位pH计、高速离心机。 2．实验室所使用的仪器、容器应符合标准要求，保证准确可靠，凡计量器具须经计量部门检定合格方能使用。 3．实验室仪器安放合理，贵重仪器有专人保管，建立仪器档案，并备有操作方法，保养、维修、说明书及使用登记本，做到经常维护、保养和检查，精密仪器不得随意移动，若有损坏需要修理时，不得私自拆动、应写出报告、通知管理人员，经科室负责人同意填报修理申请、送仪器维修部门。 4．各种仪器（冰箱、温箱除外），使用完毕后要立即切断电源，旋钮复原归位，待仔细检查后，方可离去。 5．一切仪器设备未经设备管理人员同意，不得外借，使用后按登记本的内容进行登记。 6．仪器设备应保持清洁，一般应有仪器套罩。 7．使用仪器时，应严格按操作规程进行，对违反操作规程的因管理不善致使仪器械损坏，要追究当事者责任。 三、药品管理、使用制度 1．依据本室检测任务，制定各种药品试剂采购计划，写清品名、单位、数量、纯度、包装规格，出厂日期等，领回后建立帐目，专人管理，每半年做出消耗表，并清点剩余药品。 2．药品试剂陈列整齐，放置有序、避光、防潮、通风干燥，瓶签完整，剧毒药品加锁存放、易燃、挥发、腐蚀品种单独贮存。
(完整word版)微生物挑战性实验方法
微生物挑战性实验方法 1.0目的 新产品防腐效果的测试 2.0 范围 公司新产品 3.0参考： 4 材料与方法 4. 1化妆品中常用的防腐体系[ 6] 营养琼脂培养基、改良马丁琼脂培养基、营养肉汤培养基、 0.9%氯化钠溶液、平皿、接种环、培养箱等 4. 2微生物挑战性实验 4. 2. 1受试用微生物 测试用细菌和霉菌均由浙江省食品和药品检验所提供。细菌包括: 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、巨大芽胞杆菌、绿脓杆菌。霉菌包括: 黑曲霉、黄曲霉、变色曲霉、桔青霉、拟青霉、腊叶芽枝霉、球毛壳霉、绿色木霉。 实验前，将各菌种接种于合适的培养基中, 于37℃( 细菌) 或28℃( 霉菌) 下培养。细菌培养在2天后, 霉菌培养在3-5 天后，挑选适量菌落于灭菌的生理盐水中，制成一定浓度的混合细菌( 1×108个/ ml) 或混合霉菌悬液( 1×107个/ ml) , 置于4℃贮放备用。 4. 2. 2一次加菌的28 天微生物挑战试验 此方法参照美国药典( 第2 1 版) 上微生物挑战性 试验检测防腐剂效果的方法。称取各受试样品30g, 加入混合细菌或混合霉菌悬液, 每克受检膏霜最终含菌量分别为5×106个细菌和3 ×105个霉菌。然后
充分混匀, 置于28℃下。在接菌的0、7、14、2 1 和28天取样分析: 准确称取3g样品, 加到含有玻璃小珠的灭菌锥形瓶内, 加入27ml灭菌生理盐水, 充分震荡混匀, 此悬液为1∶10稀释液；然后再用灭菌生理盐水按10倍依次稀释。按平板倾注法计数受试品中含菌量, 细菌培养是37 ℃下24h～48h，霉菌培养为28℃下3～5 天。此实验用以评判防腐剂的有效与否。评判标准为: 当每克样品中一次接菌( 1×106细菌和1×105霉菌) 后, 在第14天存活菌量减少至不高于起始浓度的0. 1%, 以后逐渐减少, 在28 天为0 。符合标准为防腐剂有效( 通过测试) , 不符合为防腐剂无效(不通过测试)。 分析与检测 4. 2. 3重复3 次加菌的微生物挑战试验此方法参照国际CT FA（国际化妆品、香精和洗涤剂协会）推荐的微生物挑战性试验。称取受试样品30g , 每隔2 周加菌一次( 即实验的第1、3 和5 周) , 每次加细菌量为1 ×106 ～1 ×107个/ g 样品和霉菌1×105个/ g～1×106 个/ g 样品。在加菌后的0 天、7 天和14 天( 后一次加菌前) 采样分析样品中含菌量, 方法同前。此方法可将受检样品分为三类: ( 1)防腐效果优良( W) , 即三次加菌后, 在每次加菌后的第7 天或14 天时, 存活菌量减少至不高于起始浓度的0. 01% ( 即≤100 个/ g或ml）样品, 通过测试) 。 ( 2)防腐效果尚可( M ) , 即三次加菌后, 在每次加菌后的第7 天或14 天时, 存活菌量减少至不高于起始浓度的0. 1%, ( 即≤1000 个/ g 或mL 样品, 通过测试) 。 ( 3)防腐效果差( P) , 即三次加菌后, 在每次加菌后的第7天或14 天时, 存活菌量>mL样品(不通过测试) 。 5、结果判断 受试样品一次加菌和3 次加菌后, 在检测时间内细菌和霉菌的抗腐能力见表1～4。根据两种方法评判标准, 将8 种防腐体系的防腐效果评判列于表5 。从结果看, 两种加菌方法对防腐体系的评判结果基本一致, 三次加菌还可对有效的防腐体系作出程度之区别: 防腐优良( W: We pr eser vative) 和防腐尚可( M :M ar gina preserv ative) 。此外, 在一次加菌后1～2 周内能将样品中含菌量降低至加入菌量的0. 1%, 可通过3 次加菌实验, 如防腐体系5 和8 对细菌
微生物实验室的要求
微生物实验室的基本要求 实验室总体面积应在70平米以上，要求水、电供应充足，畅通，排污设施与安全措施齐备。 一、选址： 1. 实验室应选择在清洁安静的场所，远离生活区，锅炉房与交通要道； 2. 实验室应选择在光线充足，通风良好的场所，要与生产加工车间有一定距离； 3. 实验室应选择在方便取样与检验，距离车间较近的工作场所。 二、结构和布局： 应设置细菌与理化检验兼有的综合实验室，主要包括以下三大部分：细菌实验室、理化实验室、办公室。 1. 办公室 2. 理化分析实验室：（或者和细菌检验操作室合并） ①理化分析室（兼作感观检验室） ②仪器室（兼放细菌室显微镜等少量仪器） 3．细菌实验室： ①细菌检验操作室； ②无菌室； ③培养基制作室； ④洗涮消毒室； 一般布局要求如下： 1. 办公室：办公室是化验人员进行原始记录等各项工作的场所，是与非化验室人员交往较多的场所，因此，应设在整体综合化验室的最外层，只需有桌、椅等简单设施即可。 2. 细菌检验操作室（常规操作）细菌检验操作室是细菌培养与检验主要操作室，主要设施是实验台。 对实验台的要求： a.实验台面积一般不小于2.4×1.3m； b.实验台位置应在实验室中心位置，要有充足光线；也可以做边台。
c.实验台两侧安装小盆与水龙头； d.实验台中间设置试剂架，架上装有日光灯与插座； e.实验台材料要以耐热、耐酸碱为宜； f. 实验室围护结构采用彩钢板材料，表面光滑、耐腐蚀、防水，所有缝隙可靠密封，便于清洁消毒，且防震、防火； g. 墙面、吊顶：彩钢板：钢板厚度0.426，15克覆膜。 3. 无菌室：无菌室是处理样品和接种培养的主要工作间，应与细菌检验操作室紧密相连。为满足无菌室无菌要求，无菌间应满足以下布局： a.入口避开走廊，设在细菌检验操作室内； b.与操作室用两道缓冲间隔开； c.无菌室与缓冲间均装有紫外灯，要求每3平米安装30ｗ紫外灯一盏； d.无菌室内设有工作台（中心与边台皆可），紫外灯距工作台面要小于1.5m； e. 微生物室结构应坚固、严密、防尘、光线明亮，地面应光滑，并应有缓冲间，设双层传递窗传递物件； f.门窗应是不锈钢的； g．室内温度18～26℃，相对湿度为45～65%，室内必须保持整洁； h．墙面、吊顶：彩钢板：钢板厚度0.426，15克覆膜； i. 地面采用PVC材料，防渗漏、无接缝、光洁、防滑。 4. 培养基制作室：培养基室是制作、配制微生物培养所需培养基及检验用试剂的场所，其主要设备应为边台与药品橱。 a.边台上要放置电炉，以满足熔化煮沸培养基时用； b.边台材料要耐高热、耐酸碱； c.药橱分门别类存放一些一般药品及试剂； d.危险、易腐易燃有毒有害药品单独设保险柜存放； e.边台上要放天平，以称取药品用。 5. 洗涮消毒室：洗涮消毒室用以消毒洗涮待用与已用之玻璃器皿，培养基及污物，其面积应大于10平米。 为满足洗涮消毒的功能，洗涮消毒室应设有： a.1-2个洗涮池，洗涮池上下水网要畅通；
化妆品微生物挑战试验
化妆品微生物挑战试验 刘树葆臧跃扬桂菊 （天津化妆品科学技术研究皖有强公司） 摘要：本文参照美国化妆品、盥洗用品和香精协会（ＣＴＦＡ）推荐的防腐体系效能评价方法，研究了不同产品在相同防腐条件下，微生物挑战试验结果的差异性。 关键词：防腐体系，微生物挑战试验，膏霜，乳液，水剂。 目前，化妆品琳琅满目，产品配方复杂多样，通常包含多种成分，尤其许多化妆品中的营养成分非常适合微生物的生长，而微生物存在于我们生活着的世界的每一个角落，从而为化妆品的生产和保存带来困难。微生物污染将导致产品在气味、颜色、粘度、性能上都会发生改变。因此化妆品微生物污染对产品质量、正常使用以及使用者健康来说是一个极大的冒险“’。为防止微生物污染，就对产品的防腐提出了挑战，所以必须建立很好的防腐体系，以保证产品的安全、稳定性“’，为消费者提供安全和高品质的产品。 评价化妆品质量的～个重要指标就是微生物是否达到化妆品卫生规范的要求，本实验参照美国化妆品、盥洗用品和香精协会（ＣＴＦＡ）推荐的防腐体系效能评价方法。’，对相同防腐体系不同功能的膏霜、乳液及水剂产品进行微生物挑战试验，以指导配方师合理添加防腐剂。 １．实验方法 ｉ．Ｉ．ＣＴＦＡ推荐的防腐单次挑战试验 ＣＴＦＡ推荐的经典的为期２８天的防腐单次挑战实验，是将防腐剂混入配方基质中，然后～次性接入若干种类、～定数量的微生物进行挑战，将样品存放于适当的温度下，定期抽样检测其中残存的微生物，并根据微生物的数量变化情况评价样品的抗菌效果。 １．２试验仪器 恒温培养箱：霉菌培养箱：显微镜：灭菌平皿：直径为９ｃｍ；ｐＨ计；高压灭菌锅；酒精灯：锥形烧瓶；量筒：灭菌刻度吸管：ｌＯｍｌ、２ｍｌ、ｉｍｌ；试管。 Ｉ．３．培养基和试剂 生理盐水：ＳＣＤＬＰ液体培养基：卵磷脂、吐温８０一营养培养基：乳糖胆盐培养基：蛋白胨水：靛基质试剂：十六烷三甲基溴化铵培养基；绿脓菌素测定用培养基：硝酸盐蛋白胨水培养基：普通琼脂斜面培养基：血琼脂培养基；甘露醇发酵培养基：血浆：孟加拉红培养基。 ｌ＿４挑战用微生物 测试用菌种由天津市卫生防病中心提供，霉菌和杂菌由实验室从污染产品中分离到的菌珠。 菌种包括：金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌。 实验前，将各菌种接种于合适的培养基中，于３７。Ｃ（细菌）和２８℃（霉菌）培养箱中培养。细菌培养４８小时，霉菌培养７２小时后，挑选典型的菌落于灭菌的液体培养基中制成～定浓度的细菌和霉菌混合悬液，置于冰箱冷藏备用。 １．５待测样品 选择了８种化妆品基质，其中膏霜２种、乳液２种、水剂２种。按相同的防腐体系常规方法加入基质中，在进行微生物挑战性实验前预先进行细菌总数及霉菌和酵母菌的测定，试验样品的菌落数均应小于１０，作为待测样品。 １．６接种的方式和数量 接种的方式：采用混合接种。因为自然界的微生物有混生杂居的特点，所以混合接种符合实际污染的情况。 接种的数量：将各菌种接种于合适的培养基中，于３７。Ｃ（细菌）和２８。Ｃ（霉菌培养箱中培养。
微生物学实验
微生物学实验 实验一常用培养基的制备、灭菌与消毒 一、实验目的 了解培养基的配制原理；掌握配制培养基的一般方法和步骤；了解常见灭菌、清毒基本原理及方法；掌握干热天菌、高压蒸汽灭菌及过滤除菌的操作方法。 二、实验原理 培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供微生物生长繁殖之用。 干热天菌、高压蒸汽灭菌方法主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。 三、试剂与器材 1.器材试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、培养基、分装器、天 平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH度纸、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、吸管、培养皿、电烘箱、注射器、微孔滤膜过滤器、镊子等。 2.试剂牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂 四、实验内容 1.称量→溶化→调pH→过滤→分装→加塞→包扎→灭菌→无菌检查 2.干热灭菌：装入待灭菌物品→升温→恒温→降温→开箱取物 3.高压蒸汽灭菌：加水→装物品→加盖→加热→排冷空气→加压→恒 压→降压回零→排汽→取物→无菌检查 4.过滤除菌：组装灭菌→连接→压滤→无菌检查→清洗灭菌 五、关键步骤及注意事项 1.要严格按配方配制。 2.调pH不要过头。
3.干热灭菌要注意物品不要堆放过紧，注意温度的时间控制，70oC 以下放物、取物。 4.高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零 取物。 5.过滤除菌要注意各部件灭菌，压滤时，压力要适当，不可太猛太快， 滤膜要注意清洗保存。 六、思考题 1.培养基配好后，为什么必须立即灭菌?如何检查灭菌后的培养基是 无菌的? 2.在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题?为什么? 3.培养微生物的培养基应具备哪些条件?为什么? 4.培养基的配制原则是什么? 实验二土壤中微生物分离纯化培养 一、实验目的 掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术；了解不同的微生物菌落在斜面上、半固体培养基和液体培养基中的生长特征；进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术；掌握微生物培养方法。 二、实验原理 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的分离、纯化方法：单细胞挑取法，稀释涂布平板法，稀释混合平板法，平板划线法稀释涂布平板法步骤：倒平板－制备土壤污水稀释液－涂布－培养－挑菌落；平板划线法步骤：倒平板－标记培养基名称－划线。 三、试剂与器材 1.器材盛9m1无菌水的试管、盛90m1无菌水并带有玻璃珠的三角 烧瓶、无菌玻璃涂棒、无菌吸管、接种环、酒精灯、无菌培养皿、显微镜、血细胞计数板等。 2.试剂牛肉膏蛋白胨培养基，高氏1号培养基，查氏培养基 四、实验内容
细菌截留验证指导程序
细菌截留验证程序和方案形成 应使用标准方法确证膜过滤器的微生物截留能力。然而，对于某种产品来说，仅证明缺陷假单胞菌在水溶液中被截留，而不是在特定产品中，不足以验证此产品的除菌过滤工艺。 为了确定正确的挑战测试方法，应将测试微生物直接接种在承载流体（产品或替代品）中以证明其生存性。微生物应以与挑战实验中使用的同等方式培养，以保留其生物形态特征和生理特征。用于生存性研究的测试暴露时间应该等于或超过实际工艺过滤时间。 当测试微生物在产品中的生存性已经完成测试，就应该形成挑战方法和方案了。细菌挑战实验的条件应模拟实际生产工艺。既然细菌挑战实验通常都在实验室里进行，那么方法的规模也应相应调整。通量应调整到每单位面积的流速，表示为基于滤芯表面积的形式(ml/min)/cm2。如果过滤过程按压差控制，则挑战实验压差至少等同于最大工艺压差。如果制订方案过程中遇到关于测试方法可接受性的问题，则建议联系相关管理机构以获取指导。图1列出了在为特定过滤器和产品/工艺组合选择合适的验证策略时需要考虑的关键步骤。 （1）非杀菌性的工艺和流体 直接在产品中接种测试微生物是测试除菌级过滤器微生物截留能力的首 选方法。当产品和工艺流体被证明在产品和工艺条件下没有杀菌效力的时候，这样是可行的。在这些工艺中，应使用足够浓度的挑战微生物在产品中接种，而且要在实际工艺条件下，包括时间、压差、流速和其它关键变量（例如温度），应尽量减少稀释，以避免不必要的产品改变。 （2）抑菌的/杀菌的/非分散的挑战流体 在杀菌性的产品中进行细菌截留测试，使得与验证相关的一些问题更难回答，例如：产品对过滤器有什么影响，产品对其中的生物菌落有什么影响。在杀菌性产品中或是在不利于微生物活性的条件（例如，温度上升）下进行的细菌截留测试不一定能得到正确的结果。 为了评估产品/工艺对过滤器的潜在影响，可以使用产品和实际的工艺条件，包括流速、压差、温度和时间，对过滤器进行预处理。这种预处理可在一个闭路系统中将产品循环通过测试过滤器或者单路通过测试过滤器，接着对滤
微生物大小的测定-实验四
实验四 微生物大小的测定 一、实验目的 1．熟悉目测微尺和物测微尺的使用方法，掌握测定微生物大小的技能。 3．巩固光学显微镜的使用方法 二、实验要求 1．预习有关微生物大小测定等方面的知识； 2．遵守实验室安全制度，听从指导教师安排； 3．认真听讲，不懂就问； 4．完成实验报告 三、实验仪器和材料 目测微尺、物测微尺、光学显微镜、微生物标本片 四、实验原理及方法 1. 目测微尺： 目镜测微尺是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm 长度刻成50等分，或把10 mm 长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上(此处正好与物镜放大的中间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。 2. 物测微尺 中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将1mm 等分成100格，每格长0.01mm （即10μm ）。它并不直接测细胞的大小，而是用于校正目镜测微尺每格的相对长度。 五、实验步骤及内容 1．目测微尺的标定 两对重合线间镜台测微尺格数10 目镜测微尺每小格长度＝两对重合线间目镜测微尺格数
把物测微尺放在载物台上使刻度朝上。用低倍镜找到物测微尺的刻度，移动物测微尺和目测微尺使两者的第一条线重合，顺着刻度找出另一条重合线。再分别求出高倍镜和油镜下目测微尺每格的长度。 2．菌体大小的测量 将物测微尺取下，换上标本片，选择适当的物镜测量目的物的大小，分别找出菌体的长和宽占目测微尺的格数，再按目测微尺1格的长度算出菌体的长度和宽度。 六、实验结果 1.将目镜测微尺校正结果填入表1 表1 目镜测微尺校正结果 2. 在高倍镜下测量枯草芽孢杆菌大小，将结果填入表2
微生物实验报告
微生物实验报告 一环境中的微生物的检测和分离纯化 实验目的： 1 学习并掌握无菌操作技术原理和方法 2 学习用稀释涂布法分离微生物 3 认识微生物存在的普遍性，体会无菌操作的原理 实验材料： 1 土样溶液0.5ml，无菌生理盐水 2 取液器(1000μL一支，100μL一支)，培养箱，培养皿(12个)，无菌有帽试管，三角瓶，无菌涂棒，接种环，1000μL无菌吸头若干，记号笔，酒精灯，火柴，试管架 实验步骤： A培养基的制备(已提前制备好) B周围环境中的微生物的检测，在牛肉膏蛋白胨培养基平板上作如下实验 1 取三个平板，用100μL的取液器分别吸取100μL的河水、豆浆、豆奶，均匀加在三个培养基上，并用无菌玻璃涂棒涂布均匀(要多涂几次，时间约1-2分钟，使细菌均匀分布)。 2 再取三个平板，三个同学分别用手指(未洗过)在培养基上涂抹几秒钟，一个同学对应一个平板。 3 再取一个平板，其中一个同学将手用肥皂洗过后，再在培养基上涂抹。 4 再取一个平板，打开皿盖，一个同学对着培养基咳嗽，使口腔中的气流和飞沫落到培养基上。 5 再取一个平板，打开皿盖，在空气中放置10min左右，关上皿盖。 6 将上述9个平板放置在35℃的培养箱中培养24h。 C土壤中分离微生物 1 采土样，制备土壤稀释液(已准备好) 2 取三个平板，每个培养基上用取液器添加100μL的土壤稀释液，并用无菌玻璃涂棒涂布均匀(要多涂几次，时间约1-2分钟，使细菌均匀分布)。 3 将平板依旧放在35℃的培养箱中培养24h。 D菌落计数 培养24h后，取出培养平板，算出每个平板上的菌落数量。其中，土样中的微生物含量可用以下式子计算 土壤中的细菌含量(个/g土壤)=菌落平均数×10×稀释倍数 实验结果及数据： 实验结果如附图。
微生物方法学验证范本
编码：VP-C01-MM-01 XXXX软膏微生物限度检查 方法学验证方案 起草人：年月日 审核人：年月日 年月日 年月日 批准人：年月日 目录 1.验证立项表 2.验证内容 2.1验证目的 2.2验证范围 2.3 验证要求 2.4 验证方法 2.4.1.试验原料、稀释剂和标准微生物 2.4.2细菌、霉菌及酵母菌验证内容 2.4.3 金黄色葡萄球菌验证内容 2.4.4铜绿假单胞菌验证内容 3. 验证报告 验证立项表（REC） 立项题目 立项部门申请人
申请日期要求完成日期 验证类别负责部门 参与部门及人员 验证原因 质量部审核意见审核人：日期： 验证领导小组 审批人：日期：审批意见 备注 XXXX软膏微生物限度检查方法学验证方案 编码：VP-C01-MM-01品名验证依据2005版药典 规格验证日期年月日数量报告日期年月日验证项目细菌、霉菌及酵母菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌 1.验证目的XXXX软膏配方中含水杨酸、硼酸，该两种物质具有一定的抑菌性。根据《中国药典》（2005年版）微生物限度检查标准规定，对XXXX软膏进行细菌、霉菌及酵母菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌检查方法的验证试验，以确认供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性。 2.验证范围本公司XXXX软膏的微生物限度检测。
3.判定标准 3.1验证小组成员 姓名职务职责 组长负责验证方案、报告的批准 项目负责人负责验证方案、报告的起草与具体实施 验证小组成员负责验证试验及填写记录 3.2细菌、霉菌及酵母菌在3次平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%，试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70%；产品的试验组与阳性菌组的菌落数差异不超过30%，假定产品试验组的平均值与阳性菌组的平均值之比为Q，则0.7≤Q≤1.3。 3.3金黄色葡萄球菌在3次平行试验中，供试品组：结果应为阴性，未检出金黄色葡萄球菌；试验组：结果应为阳性，检出金黄色葡萄球菌；阴性对照组：结果应为阴性，未检出阴性对照菌；阳性对照组：结果应为阳性，检出金黄色葡萄球菌。 3.4铜绿假单胞菌在3次平行试验中，供试品组：结果应为阴性，未检出铜绿假单胞菌；试验组：结果应为阳性，检出铜绿假单胞菌；阴性对照组：结果应为阴性，未检出阴性对照菌；阳性对照组：结果应为阳性，检出铜绿假单胞菌。 4.验证方法 4.1.试验原料、稀释剂和标准微生物 4.1.1试验样品：XXXX软膏三批，批号为、、。4.1.2稀释剂：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。配法：照（05版药典附录XIII C）配制； 0.9%无菌氯化钠溶液的配制：取氯化钠9.0g，加1000ml使完全溶解，分装，灭菌。 4.1.3实验仪器：无菌培养皿（直径9.0cm）、净化室、灭菌锅、无菌刻度吸管（10ml、1ml）,水浴锅，试管（18×180）,具塞三角瓶。 4.1.4验证用培养基营养琼脂培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、溴化十六烷基三甲铵培养基、玫瑰红钠培养基。 4.1.5验证用微生物名称及编号 菌珠名称传代次数 大肠埃希菌MCC(B)44102 金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003 枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501
微生物实验操作注意事项
微生物实验注意事项 一、无菌操作要求 1.接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。 2.进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。 应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦干净。 3.接种食品样品时， 4.进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。 5.从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。 6.接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒。 7.接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的连接处，接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5min，再经火焰烧灼。 8.吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。 二、无菌间使用要求 1.无菌间通向外面的窗户应为双层玻璃，并要密封，不得随意打开，并设有与无菌间大小相应的缓冲间及推拉门，另设有 0.5- 0.7m2的小窗，以备进入无菌间后传递物品。
2.无菌间内应保持清洁，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与实验无关的物品。 打开紫外灯，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W 3.无菌间使用前后应将门关紧，紫外灯，距离在 1.0m处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。 4.处理和接种食品标本时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。 5.在无菌间内如需要安装空调时，则应有过滤装置 三、消毒灭菌要求微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等，必须经灭菌后方能使用。 （一）干热和湿热高压蒸气锅灭菌方法 1．灭菌前准备（1）所有需要灭菌的物品首先应清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用纸包装严密，如用金属筒应将上面通气孔打开。 （2）装培养基的三角瓶塞，用纸包好，试管盖好盖，注射器须将管芯抽出，用纱布包好。 2．装放（1）干热灭菌器： 装放物品不可过挤，且不能接触箱的四壁。 （2）大型高压蒸气锅： 放置灭菌物品分别包扎好，直接放入消毒筒内，物品之间不能过挤。 3．设备检查（1）检查门的开关是否灵活，橡皮圈有无损坏，是否平整。
微生物学实验复习题及其答案
微生物学实验复习题 一、选择题 1.革兰氏染色的关键操作步骤是： A. 结晶紫染色 B. 碘液固定 C. 酒精脱色 D. 复染 2.放线菌印片染色的关键操作是： A. 印片时不能移动 B. 染色 C. 染色后不能吸干 D. A和C 3.高氏培养基用来培养： A. 细菌 B. 真菌 C. 放线菌 4.肉汤培养基用来培养: A. 酵母菌 B. 霉菌 C. 细菌 5.无氮培养基用来培养: A. 自生固氮菌。 B. 硅酸盐细菌 C. 根瘤菌 D. A、B 均可培养 E. A、B、C 均可培养 6.在使用显微镜油镜时，为了提高分辨力，通常在镜头和盖玻片之间滴加: A. 二甲苯 B. 水 C. 香柏油 7.常用的消毒酒精浓度为: A. 75% B. 50% C. 90% 8.用甲醛进行空气熏蒸消毒的用量是: A. 20ml/M3 B. 6ml/M3 C. 1ml/M3 9.实验室培养基高压蒸汽灭菌的工艺条件是: A. 121℃/30min B. 115℃/30min C. 130℃/30min
10.巴氏消毒的工艺条件是: A. 62-63℃/30min B. 71-72℃/15min C. A.B. 均可 11.半固体培养基的主要用途是: A. 检查细菌的运动性 B. 检查细菌的好氧性 C. A.B. 两项 12.半固体培养基的琼脂加入量通常是: A. 1% B. 0.5% C. 0.1% 13.使用手提式灭菌锅灭菌的关键操作是: A. 排冷气彻底 B. 保温时间适当 C. 灭菌完后排气不能太快 D. A-C 14.目镜头上的“K”字母表示: A. 广视野目镜 B. 惠更斯目镜 C. 补偿目镜 15.目镜头上的“P”字母表示: A. 平场目镜 B. 广视野目镜 C. 平场补偿目镜 16.物镜头上的“PL”字母表示: A.正低相差物镜 B.正高相差物镜 C.负高相差物镜 17.物镜头上的“UVFL”字母表示。 A. 无荧光物镜 B. 照相物镜 C. 相差物镜 18.镜头上标有“TC”字母的镜头是: A. 相差调整望远镜 B. 摄影目镜 C. 相差目镜 19. “PA”表示: A. 马铃薯培养基 B. 高氏培养基 C. 肉汤培养基 20.无菌室空气灭菌常用方法是: A. 甲醛熏蒸 B. 紫外灯照射
(完整版)防腐挑战实验.doc
第一部分防腐挑战实验调研结果 1实验样品 样本要求新鲜，没有被微生物污染，一般每个样本为300g。 2微生物挑战性实验 2.1 实验菌株 不同国家、组织、企业对挑战实验选择的测试菌种有一定差异（如表1），国内参照美国化妆品、香精和洗涤剂协会（CTFA ）推荐的菌种（因其较具代表性，如表 2 所示），所以更为恰当。（注意菌株来源问题：同属一个种的细菌来源不同，菌株不同，MIC 值不同）表 1 某些国家、组织、企业用于化妆品微生物挑战试验的测试菌株 美国美国英国德国德国菌株 (药典 ) (ISP 公司 ) (药典 ) (Henkel 公司 ) (S&M 公司 ) 白假丝酵母√√√√√ 黑曲霉√√√√√ 红色青霉√ 绿色木霉√ 绳状青霉√ 大肠埃希氏菌√√√√ 镉绿假单胞菌√√√√ 金黄色葡萄球菌√√√√√粪肠球菌√ 产气肠杆菌√ 表皮葡萄球菌√ 日勾维肠杆菌√ 洋葱假单胞菌√√
肺炎克雷伯氏菌√恶臭假单胞菌√荧光假单胞菌√ 表 2 CTFA 化妆品微生物挑战试验的菌株选择 种类菌株数量 金黄色葡萄球菌 革兰氏阳性菌至少选一种 表皮葡萄球菌 肺炎克雷伯氏菌 阴沟肠杆菌 发酵革兰氏阴性杆菌大肠埃希氏菌至少选两种 变形菌属 日勾维肠杆菌 铜绿假单胞菌 洋葱假单胞菌 荧光假单胞菌 非发酵革兰氏阴性杆菌至少选一种 恶臭假单胞菌 黄杆菌属 不动杆菌属 白假丝酵母 酵母至少选一种 近平滑假丝酵母 黑曲霉 霉菌至少选一种 黄绿青霉 产芽孢菌枯草芽孢杆菌供选用生产现场分离菌适当菌株一种以上
2.2 培养基 牛肉膏蛋白胨培养基、琼脂培养基 2.3 试验用菌液的配置 （1）标准悬液的配制 1%硫酸 9.9ml 与 1%氯化钡 0.1ml，混合后配制成的悬液浓度为3×108cfu/ml ，此悬液再做 3 倍稀释。 （2）细菌菌悬液的配制 实验前将菌株接种到各个培养基斜面上，36 摄氏度恒温培养48 小时。将已培养好的活性菌种，用灭菌生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀。用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作稀释，浊度和标准悬液的浊度（3× 108cfu/ml ）相同为止； 此时的稀释菌液再做 3 倍稀释，即为所需的 1×108cfu/ml 的菌悬液，做细菌 总数确定细菌数。 （3）霉菌菌悬液的配制 将已培养好的活性菌种，用灭菌的生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀；用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作依次的10 倍稀释，每次的稀释用血球计 数板计数，必须 5 个中格的霉菌总数在190～ 210，落在此范围内的菌悬液为我 们所需的 1×108cfu/ml 的霉菌菌悬液，做霉菌总数确定霉菌数。 2.4 接种 2.4.1 接种方式 （1）单菌接种：每种测试菌株单独做一个挑战试验。这种方法的优点是容 易了解每种微生物对防腐体系的敏感性，在筛选产品的防腐体系时有较好的参考 价值，但工作量大、费时、费工，和产品的实际污染菌情况也有差距（因来自自 然界的微生物常常不是单一的种类）。 （2）混合菌接种：西欧、德国等的许多国家和企业多采用这种方式，除了
微生物学实验报告.
微生物学实验报告 实验一普通光学显微镜的使用及细菌染色与形态观察 第一部分：显微镜的使用 一、目的要求 1．熟悉普通光学显微镜的构造、油镜的使用原理和显微镜的维护方法。 2．学会正确使用油镜观察细菌的基本形态和特殊构造。 3．了解各种显微镜的主要特征。 二、实验原理 （一）光学显微镜的构造 微生物实验室中最常用的是普通光学显微镜，它的构造可分为机械部分和光学部分。 1、机械部分 普通复式光学显微镜的机械部分通常包括以下几个部分：目镜、镜筒、基座回转器、物镜、载物台、光圈、聚光器、光源、镜臂、细调节器、粗调节器等。 2、光学部分：目镜、物镜、聚光器、光圈、光源。 （二）放大倍数 标本首先经物镜放大，在目镜的焦距平面上形成一个实像，再经过目镜放大成最终的虚像。总的放大倍数是物镜放大倍数与目镜放大倍数的乘积。 物镜的放大倍数愈大，其工作距离（物镜镜头到标本片之间的距离）愈短，这时光圈就要打开得愈大。 显微镜的性能受物镜的分辨距离或分辨力所限制。分辨距离即透镜所能分辨的两个物点之间的最小距离，分辨距离愈小，透镜的分辨力愈高，物像也就愈清晰。因此常以分辨距离来衡量显微镜的分辨力。 R=0.61λ/N.A 式中：R-----分辨距离； λ------作用光的波长； N.A------数值口径。 一些介质的折射率
介质折射率 空气 水玻璃香柏油 1 13 55 1.56 三、实验内容 （一）材料：显微镜，香柏油，擦镜纸。 （二）方法： 细菌很小，须使用油镜方可观察到。油镜是显微镜上最重要的部件之一，观察时与玻片非常接近，稍不小心即可压碎玻片，更严重的是损坏镜头，故必须极其仔细地学习油镜的使用方法： 1、为使低倍镜取得最适之光源，可将低倍镜头调节到离载物台约1cm的高度，将聚光器提高，光圈完全打开，然后调节电压旋钮至视野最合适。 2、滴一滴香柏油，固定于载物台上，用推动器调节到载物台正中。在双目侧视下，下旋粗调节器，使油镜头浸入油中几乎与标本片相接触。然后眼睛从目镜观察（如光线不足，可适当增大电源电压），徐徐上旋粗调节器至看到模糊物像之后，再用细调节器调节以使物像清晰。如镜头已离开油面还未看到物像，则再重新操作。 3、更换标本时应先提高油镜头，再更换玻片，切勿随意移动显微镜的位置。 4、油镜观察完毕后，按“显微镜保护”中（6）项处理。 5、最后将油镜各部分还原，聚光器下降，反光镜垂直于镜座，镜头转成八字形， 以免与聚光器发生碰撞。 四、思考题 1、使用显微镜时为何调节下列构造？反光镜，光圈，聚光器，粗调节器，细调节器，镜头回转器。 答：聚光器的位置之升降可影响视野的明亮度，上升则视野明亮，下降则光线减弱。光圈的放大或缩小也可控制视野明亮程度。粗调节器和细调节器均是调节焦距的装置。镜头回转器为装置物镜和转换物镜之用。 2、使用不同放大倍数的物镜时，工作距离与光圈的关系。如何利用这一原理用好显微镜？ 答：物镜的放大倍数愈大，其工作距离（物镜镜头到标本片之间的距离）愈短。标本首先经物镜放大，在目镜的焦距平面上形成一个实像，再经过目镜放大成最终的虚像。总的放大倍数是物镜放大倍数与目镜放大倍数的乘积。 3、为何要选用与玻璃折射率相似的香柏油作为油镜的介质？油镜的原理是什么？ 答：香柏油只在使用油镜头时（100倍物镜）使用，因为当镜与装片之间的介质为空气时，由于空气（n= 1.52）的折射率不同，光线会发生折射，不仅使进入物镜的光线减少，降低了视野的照明度，而且会减少镜口角。当以香柏油（n=1.515）为介质时，由于它的折射率与玻璃相近，光线经过载玻片后可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射，不仅增加了视野的照明度，更重要的是通过增加数值孔径达到提高分辨率的目的。可见光的波长平均为0.55μm。当使用数值孔径为0.65的高倍镜时，它能辨别两点之间的距离为0.42μm；而使用数值孔径为1.25的