细胞存活率的检测

MTT测定细胞的存活率

MTT测定细胞的存活率 实验材料： 1）试剂： MTT、DMSO、DMEM、PBS。 2）材料： 15mL离心管、1.5mL EP管、1mL和200μL枪头、排槽，在实验前准备好，121℃30min灭菌后置于超净台中。 96孔培养板为一次性塑料制品。 3）仪器： 超净台、CO2培养箱、显微镜、离心机、单道及八道移液枪、细胞计数板，酶标仪等。 实验操作： 1）种板： a.准备工作：保证超净台中有15mL的离心管和1mL枪头，将细胞计数板和盖玻片用擦镜纸擦干净； b.使用移液枪将培养皿中的细胞吹下来，转移到15mL离心管中，1000rpm离心5min； c.离心完后用移液枪吸去上清，加入3mL新鲜培养基，轻轻吹打50下，使细胞在培养基中分布均匀成为单细胞悬液，从中取出20μL 稀释到200μL，在从中取出20μL加到细胞计数板上进行细胞计数，所得的数据乘以10即为细胞的浓度； d.以96孔板上每孔1×104个细胞，每孔150μL计算细胞浓度，将细胞悬液稀释到所需的浓度，放到排槽中，用八道移液枪加样，注意为了消除边缘效应，周围一圈的孔都不加样，而倒数第二排加入培养基作为对照，这样只需在2~11列，B~F排加入细胞悬液； e.细胞加好后，轻轻晃动培养板使细胞分别均匀，然后在周围一圈的孔中加入200μL PBS，在显微镜下观察后，置入培养箱中。 2）加药： 细胞在培养箱中培养24小时后就可以加药诱导了。 a. 准备工作：保证超净台中有1.5mL EP管和1mL及200μL枪头， b.配药：因为现在每孔是150μL培养基，加入50μL的药物总体积为200μL，故配药的浓度为最终浓度的4倍，按浓度梯度使用1.5mL EP管配制不同浓度的药物， c.加板：然后使用200μL的移液枪将配好的药物加入培养板中，

利用流式细胞仪分析细胞存活率、细胞周期、 ROS

利用流式细胞仪分析细胞存活率、细胞周期、ROS （以6孔板为例） 测定细胞存活率 1.取对数生长期的细胞,以4×105/ml密度接种于6孔细胞培养板上； 2.培养过夜后，用于相应实验处理； 3.收集处理后的细胞培养液至流式专用管； 4.加1ml PBS缓冲液清洗一次，清洗液加入管中； 5.胰酶消化收集细胞于上述管中； 6.1ml PBS缓冲液清洗剩余细胞一次，清洗液加入离心管； 注：3－6步都收集于同一流式专用管。 7.800g离心6min，去上清； 8.加1ml PBS缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清； 9.最后重悬细胞于500μl含5μg/ml碘化丙啶(propidium iodide,PI)的PBS缓冲液 中； 10.避光冰上孵育10min,用流式细胞仪测定细胞存活率； 11.PI可结合DNA，在一定波长的激发光作用下可发出荧光，其强度与DNA含量成 正比，但其不能透过完整的细胞膜。而FS（前向散射）则是指示细胞大小的参数。因此，我们以FS为横坐标，PI的荧光值的对数（log PI）为纵坐标，就可将不同大小和不同荧光强度的细胞区分开：活细胞表现出较大的FS值和较弱的荧光强度；坏死的细胞碎片，由于丢失部分DNA，具有较小的FS值和较弱的荧光性；凋亡细胞的细胞膜具有通透性，细胞虽然聚缩变小，但核保持完整，所以显示出较小的FS值和较强的荧光强度。通过计算活细胞占所有细胞的百分率，即可得知细胞存活率。 测定细胞周期 1.细胞的处理及收集同测定细胞存活率方法的第1-8步； 2.用300μl的PBS重悬细胞，将细胞逐滴加入700μl预冷的无水乙醇中，乙醇 终浓度为70%，4℃避光固定过夜； 3.800g离心10min，去上清；

细胞生长状况有关指标的检测方法

细胞生长状况有关指标的检测方法 一、细胞计数 这是细胞培养中常用的基本技术之一。所用材料为细胞计数板。巴氏吸管和显微镜。步骤如下。 l 取清洁计数板和专用盖玻片，用丝绸布轻轻擦干。 l 取细胞悬液0.3ml，加入0.9结晶紫染液，混匀后滴半滴于细胞计数板内，以充满不外溢为宜。也可直接将细胞悬液在一侧滴加到盖玻片中，不要溢出，也不要过少或出现气泡。 l 在显微镜下用10X物镜观察计数四角大方格中的细胞数。代入下式得出细胞密度。 细胞数（ml）=（4大格细胞数之和/4）×104×稀释倍数 台盼蓝染色法可计算出活细胞和死细胞数以测定细胞存活百分率。一般0.5%-1.0%的台盼蓝染液可使死细胞染成蓝色，活细胞不着色。此外还可用0.02%的藻红b染液将死细胞或受损细胞染成红色，或用0.05%的苯胺黑染液将死细胞染成黑丝。 细胞存活率=[4大格活细胞数/（4大格活细胞数+4大格死细胞数）]×100% 在进行细胞计数操作时，必须把细胞悬液准备好，细胞应分散良好，并充分混匀，若出现较多细胞团或细胞数少于200个/10mm2或多于500个/100mm2时，需重制细胞悬液，重新计数。 二、细胞生长曲线和生长倍数 细胞生长曲线是细胞培养实验中最基本的指标，是测定细胞绝对增值数值和生长繁殖基本规律常用的简便方法。常用的方法为：在同一规格的培养瓶中，接种等量的同一代细胞，经培养后每隔24h取出几瓶细胞进行计数，以培养时间为横坐标，不同时刻的细胞数的对数为纵坐标，标出各点并连成线，即为该细胞的生长曲线，可反映出细胞生长的动态。 测定生长曲线的另一种方法是用96孔/24孔细胞培养板，分7组，每组3孔，培养1周（7天），期间逐日检测一组，计数，最后把7天中的细胞数值绘成图，即为细胞生长曲线。 也可采用MTT法来进行生长曲线测定。 标准的细胞生长曲线近似“S”形，一般在传代后第一天细胞数有所减少，经过一段时间的潜伏期，再进入对数生长期，达到平台期后生长稳定，最后衰老。

细胞活性测定

细胞活性测定方法 细胞活性指标通常包括细胞膜对核酸染料的通透性，代谢活性，膜电位等。核酸染料有多种，如EB带有单个自由正电荷，能通过完整细胞膜。而PI，TO—PRO—1，TO-PRO-3等等带一个有四铵基团和两个或两个以上正电荷的染料是不能通过完整细胞膜进入细胞内的。因而吸收了这些多电荷染料的细胞被认为是非活性的。另外，一些酸性染料，如上面提到的台盼兰，曙红等都是膜非通透性。 代谢活性是另一重要指标，它通过细胞内的酶的活性来判定。使用细胞某种酶的底物，它能通过（或是不能通过）完整细胞膜，在细胞内被酶切而产生荧光性，膜不通透性产物，能在细胞膜完好的细胞内存留，在细胞膜不完整的细胞内散失很快。通过检测荧光强度就可知细胞代谢活性。FDA(fluorescein diacetate)和CTC（5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride）是常用的两种底物。前者虽然透过细胞膜的速度较慢，但它的产物基本不往外通透。后者经细胞内脱氢酶催化而具有荧光性，能提供细胞呼吸代谢系统活性和细胞膜完整性信息。 正常细胞的细胞膜两侧维持着一个胞内为负的膜电位为梯度，带正电的亲脂性染料，如Cyanines类能因电梯度而通过细胞的脂双层膜聚积在活细胞内，带负电的亲脂性染料如oxonols会被排除在外。不再维持着膜电位梯度的细胞里，则会吸收更多Oxonols类染料。 用流式细胞仪测量的方法优点是，灵敏，荧光强度精确定量，快速高通量的检测逐个细胞，可同时检测细胞的多个活性指标，提高可信度，结果具有统计意义。缺点是，实验较MTT等复杂，费用较高。 常用的细胞活性测定方法有台盼蓝染色法、克隆（集落）形成法、3H放射性同位素掺入法、MTT法等。其中MTT法以其快速简便，不需要特殊检测仪器、无放射性同位素、适合大批量检测的特点而得到广泛的应用。但MTT法形成的Formazan为水不溶性的，需要加有机溶剂溶解，由于在去上清操作时会有可能带走小部分的Formazan，故有时重复性略差。为了解决这个问题，研究人员又开发了很多种水溶性的四氮唑盐类：如XTT、CCK-8（WST-8）等。 1．MTT法 MTT：化学名：3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。 缺点：由于MTT经还原所产生的甲臜产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲臜的有机溶剂对实验者也有损害。

MTT法检测细胞存活及生长

【分享】MTT法检测细胞存活及生长 什么是MTT? MTT全称为-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。 什么是MTT法? 又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的 蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。 MTT 溶液的配制方法通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm 滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃ 避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。 需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。 MTT一般最好现用现配，过滤后4℃避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml 保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉. 配制MTT时用用PBS溶解,也有人用生理盐水配，60℃水浴助溶。 PBS配方：Nacl 8gKcl 0.2gNa2HPO4 1.44gKH2PO4 0.24g 调pH 7.4定容1L MTT法实验步骤 （一）贴壁细胞 1、收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。 2.、5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况 3.、5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。

SRB法检测细胞存活率或抑制率详细步骤SOP15

Standard Operation Protocol（SOP）●技术方法名称: SRB法检测细胞存活率或抑制率详细步骤 ●基本原理: SRB是一种蛋白质结合染料，可与生物大分于中的碱性氨基酸结合，其颜色的变化与活细胞中的蛋白成正比。 ●溶液的配制: SRB溶液：以1%乙酸稀释SRB粉，至浓度为0.4%。 洗脱液：乙酸用单蒸水配制至1%浓度。 Tris base液：Tris base用单蒸水配制至10mmol浓度，调pH值为10.5。 ●操作步骤: 1数种药物分别配成20X溶液. 2取培养瓶中细胞，调整细胞密度至105-107个/L，180μL/孔接种至96孔板。 3预培养24h后，每孔加药物20μL(终浓度为配制浓度的1/10)，每种药物设3个复孔，每孔总液量为200μL。 4在培养箱内培养48h，吸去培养液，用PBS小心洗涤一次（勿冲洗，因细胞未固定）。

广东药学院药科学院新药筛选与药效评价中心 5每孔加冰冷500g/L三氯乙酸（即贴壁细胞所用浓度为5 0%，若为悬浮细胞用80%浓度三氯乙酸））50μL，4℃固定60min。 6去离子水洗4～5次，风干。 7每孔加4g/L SRB溶液100μL作用室温染色30min,10 mL/L乙酸（1%）轻洗5次,风干。 9每孔加10mmol Tris base（pH=10.5）100μL摇动混匀，在平板振荡器上振荡5min。 10在酶联免疫检测仪测定A值，用空白对照调零，所用波长为490nm. 11将所获细胞生长抑制率定义为药物对细胞的体外抑制率.抑制率（%）=（无药细胞对照孔A值平均值-用药孔A值平均值）/无药细胞对照孔A值平均值×100%.

死活细胞的鉴定方法[1]

死活细胞的鉴定方法 活细胞的鉴定在生物学和医学上具有很重要的意义.细胞培养过程中要随时记录细胞的生长情况，需要经常测定细胞的存活率；在肿瘤细胞的研究中，为了检验各种药物对肿瘤细胞的杀伤力，也需要测定肿瘤细胞的存活率。在临床医学中死活细胞的鉴定也有很大的应用，例如为了检测某一男子的生育能力,测定精子细胞的存活力是比较常用的办法. 死活细胞的鉴定方法有很多种,常用的有染色法和仪器分析法。染色法是常用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作。但是通过直接的形态观察来鉴别细胞死活，实验结果很容易受操作者的主观因素的影响，存在一定的误差，所以，在实际操作中也常采用一些仪器来进行精确的批量检测. 不同的死活细胞鉴定方法有各自不同具体的反应机理，但无论采用何种办法，都是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异。 常用的方法包括染色法和仪器分析法。 1 染色法

染色法分化学染色法和荧光染色法，根据染色机理的不同，染料或使死细胞着色，或使活细胞着色。死活细胞在生理机能和性质上的差异主要包括: 死活细胞细胞膜通透性的差异:活细胞的细胞膜是一种选择性膜,对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性的通过；而细胞死亡之后，细胞膜受损,通透性增加。常用的以台盼蓝鉴别细胞死活的方法就是利用了这一性质.台盼蓝，又称锥蓝，是一种阴离子型染料，不能透过完整的细胞膜。所以经台盼蓝染色后只能使死细胞着色，而活细胞不被着色。甲基蓝有类似的染色机理。植物细胞的质壁分离也可鉴定死活....感谢聆听... 死活细胞在代谢上的差异:是采用美蓝染料鉴定酵母细胞死活的依据。美蓝是一种无毒染料，氧化型为蓝色,还原型为无色.由于活细胞中新陈代谢的作用,使细胞内具有较强的还原能力,能使美蓝从蓝色的氧化性变为无色的还原型，因此美蓝染色后活的酵母细胞无色;而死细胞或代谢缓慢的老细胞,则因它们的无还原能力或还原能力极弱，使美蓝处于氧化态，从而被染成蓝色或淡蓝色。...感谢聆听... 荧光素双醋酸酯(FDA）是一种常用的培养动植物细胞以及植物细胞原生质体的生活力鉴定染料，其染色

细胞复苏及存活率测定

细胞工程实验报告 实验课程：细胞工程 实验内容：细胞复苏及存活率测定 一实验目的 1、掌握细胞快速复苏的原理，学习冻存细胞快速复苏的实验方法。 2、掌握染料排除法鉴定细胞死活的原理。 3、学习用血球计数板进行细胞计数测定细胞的存活率的方法。 二实验原理 在显微镜下从形态上很难区分死、活细胞。但是，死细胞可被某些染料如台盼蓝、伊红和苯胺黑等染上相应的颜色，而活细胞则不会被染色。因此，可根据细胞是否被染料着色来区分细胞的死活。 血球计数板： 血球计数板是一块上面刻有“H”型凹槽的特制的厚玻璃板。H 型凹槽在玻璃板中间围成上下两个平台，而且中间这两个平台比两侧平台要低0.1 mm。

计数室： 每一大方格面积为1 mm×1 mm，由于有0.1mm的凹度空隙，因此盖上盖玻片后容积为0.1 mm3，（0.1ul） 三、主要仪器试剂 设备：血球计数板、滴管、试管、倒置显微镜、超净工作台、改良吸管、加样器、培养瓶（玻璃、塑料）、二氧化碳培养箱、恒温水浴锅、

离心管等。 试剂： MEM+10%小牛血清液、胰蛋白酶、PE液、0.4%台盼蓝等。 四实验步骤 （复苏） ●从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入36～37℃恒温水浴中， 不时轻轻摇动，使其在40～60秒内尽快解冻。 ●用75%酒精擦拭消毒细胞冻存管，在超净工作台上打开盖，将 细胞悬液倒入培养瓶中，快速加3ml MEM血清培养液，摇匀 后静置，→30min后在显微镜下检查贴壁情况→大部分细胞 贴壁后，从侧面轻轻吸出培养液2ml MEM血清培养液置培养 箱中培养→从侧面加入新培养液，培养，一周后观察。 （细胞死活鉴定及计数） 用95%酒精冲洗血球计数板及盖玻片，用电吹风吹干。把盖玻片覆在计数板上面，露出计数板台面少许，以便滴加细胞悬液。 取吸管一支，伸入培养瓶中，吸取细胞悬液向一小试管中滴入6滴，再滴入0.4%台盼蓝3滴，混匀，染色2-3分钟。 如果细胞悬液含细胞过多，可先用MEM培养液稀释，稀释倍数视情况而定，然后再进行染色。 向计数板边缘处轻轻滴加1-2滴已染色的细胞悬液，使之充满计数板和盖玻片间的空隙。 显微镜下观察和计数。

活细胞的鉴定在生物学和医学上具有很重要的意义。细胞培养过程中

活细胞的鉴定在生物学和医学上具有很重要的意义。细胞培养过程中要随时记录细胞的生长情况，需要经常测定细胞的存活率；在肿瘤细胞的研究中，为了检验各种药物对肿瘤细胞的杀伤力，也需要测定肿瘤细胞的存活率。在临床医学中死活细胞的鉴定也有很大的应用，例如为了检测某一男子的生育能力，测定精子细胞的存活力是比较常用的办法。 ???死活细胞的鉴定方法有很多种，常用的有染色法和仪器分析法。染色法是常用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作。但是通过直接的形态观察来鉴别细胞死活，实验结果很容易受操作者的主 ??? ??? 1 ??? ??? 膜。植物 ??? 能使美蓝从蓝色的氧化性变为无色的还原型，因此美蓝染色后活的酵母细胞无色；而死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们的无还原能力或还原能力极弱，使美蓝处于氧化态，从而被染成蓝色或淡蓝色。 ???荧光素双醋酸酯（FDA）是一种常用的培养动植物细胞以及植物细胞原生质体的生活力鉴定染料，其染色机理也利用了死活细胞在代谢上的差异：FDA本身不产生荧光，也无极性，能自由渗透出入完整的细胞膜。当FDA进入活细胞后，被细胞内的脂酶分解，生成有极性的、能产生荧光的物质——

荧光素，该物质不能自由透过活的细胞膜，积累在细胞膜内，因而使有活力的细胞产生绿色荧光；而无活力的细胞因不能使FDA分解，而无法产生荧光。 ???除此之外，还有一些细胞器的专有染料。如液泡系的专有染料中性红。中性红是一种低毒性染料，可以使活细胞液泡着红色，而细胞质和细胞核不被着色；死细胞的液泡不被着色或浅染，染料弥散于整个细胞中，细胞核和细胞质被染成红色。有时侯为了增加染色效果可以将两种染料结合使用，如甲基蓝-中性红混合染色法。 2 ??? ??? 工作站软 ；细胞存活率）； 图 ??? 失， 凋亡与坏死检测试剂盒则含有Hoechst33342和碘化丙啶(PropidiumIodide，PI)两种荧光染料。细胞发生凋亡时，染色质会固缩，Hoechst33342可以穿透细胞膜，染色后凋亡细胞荧光会比正常细胞明显增强。上述两种染料双染后，使用流式细胞仪或荧光显微镜检测时，正常细胞为弱红色荧光＋弱蓝色荧光，凋亡细胞为弱红色荧光＋强蓝色荧光，坏死细胞为强红色荧光＋强蓝色荧光。 此外，还可以用植物细胞的质壁分离试验来对植物细胞的死活进行见证，还可以通过观察细胞质的流动性进行细 胞的死活鉴定。

alamar blue测定细胞存活率增殖中文方法步骤

Alamar Blue测细胞增殖及相关细胞毒性检测 一、实验原理 AlamarBlue是一种安全、稳定、易溶于水、且对细胞无毒的新型染料，可通过荧光产生或颜色变化指示细胞的代谢。已被用于检测淋巴细胞、贴壁或不贴壁的人及动物细胞株、细菌及真菌的增殖;多种化学物质的细胞毒性试验;细胞凋亡的量化以及细胞介导的细胞毒性试验。避光储存于2-8℃，20个月。 活细胞能够将蓝色的氧化形式AlamarBlue变成红色的还原形式,同时发生可量化的荧光变化,无活性的细胞不能还原AlamarBlue。荧光的强度或红色的强度反映了细胞增殖的程度。其颜色变化可用酶标仪测定，由于氧化和还原的吸收光谱可形成重叠,需测定570nm(还原)和620nm(氧化)两个波长处的OD值,OD570减去OD620得到的吸收值即反映了试验中细胞增殖的相对水平；其荧光变化可用荧光测定仪检测,激发波长530nm,散射波长590nm,使用荧光方法敏感性更好。 二、实验试剂 ①AlamarBlue； ②3% SDS（配制：pH 7.4, 3% SDS 用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解） 三、实验材料 ①细胞。（适宜的培养基培养） ②培养板（96-/384孔培养板） 四、实验步骤 药物处理完成后进行alamarBlue试验。 备注：96孔板中，将alamarblue和培养基1:9混合后直接加入细胞中，（90uL含药培养基+10uLAB）/well，或者先换成无血清培养基40uL+AB10uL，孵育6h以上，再加入培养基50uL，作用n小时后开始上机检测。细胞数2500-5000/well最好，54h终点。 2、37℃，5%CO2，培养1-4h，注意避光；待培养基的颜色由靛蓝青开始变成粉红色即可进入下一步。（也有说2-6h，且为增加灵敏度可延长至24h，HepG2孵育6h以上；培养时间因细胞不同有所差异，alamarblue法可以在多个时间点观察，实验人员可自行摸索） 3、测定荧光或吸光度，吸光度和荧光强度与活细胞数成正比。方法如下： （1）荧光测定：激发波长 540–570 nm (最大吸收570 nm)；发射波长580-610nm（最大吸收585nm）。检测用激发波长530nm，发射波长590nm，记录相对荧光单位（RFU）。 （2）吸光度测定：测定570nm和600nm的OD值，600nm作为参考波长。 4、绘制标准曲线或细胞生成曲线：纵坐标（Y轴）为相对荧光单位（RFU），横坐标（X轴）为细胞数或时间点或药物浓度。 计算公式：

细胞增殖及细胞活力检测方法

细胞增殖及细胞活力检测方法 目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法。一种是直接的方法，通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。另一种是间接的方法，即细胞活力（cell viability）检测方法，通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力。显然，细胞活力检测法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序，但药物的干扰可抑制凋亡的发生；这时若采用细胞活力检测法，显然可以区分两种条件下的细胞数量，但我们并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物可促进细胞增殖的结论。所以最直接的证据应该采用方法一。 用于检测细胞增殖能力最经典的方法是用氚标记的胸腺嘧啶核苷处理细胞，再检测DNA链中氚含量。若细胞具有增殖能力，DNA合成过程中将会采用氚标记的胸腺嘧啶核苷作为合成原料，因此检测细胞DNA链内标记核苷酸的量可判断细胞是否进行DNA的合成。 但更为常用的方法是BrdU检测法。用BrdU预处理的细胞中，BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的DNA双链中，而且这种置换可以稳定存在，并带到子代细胞中。细胞经过固定和变性处理后，可用免疫学方法检测DNA中BrdU的含量（如采用鼠抗BrdU单克隆抗体特异识别BrdU,再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG二抗标记，最后用比色法或荧光的方法进行定量测定），从而判断细胞的增殖能力。 Calbiochem/EMD公司提供一种BrdU检测试剂盒，以微孔板的形式，合并所有清洗、固定、变性的步骤以单一试剂当中。比色检测在一抗二抗标记后在450nm下读数，所有操作在3小时内结束。而且该试剂盒的灵敏度与市场上其他同类产品相比是最强的。1000个细胞以上水平的检测只需用BrdU预孵育2小时，100个细胞则采用过夜预孵育，即可检测细胞的增殖能力。 BrdU法的一个缺点是需要固定和变性等破坏DNA的处理。有些情况下，研究者可能希望在测定细胞增殖能力的同时检测细胞的总DNA含量，然而，在变性条件下，DNA的双链结构将被破坏，DAPI和Hoechest 33342等核酸标记探针就不再能识别DNA，因而也无法估计DNA总量。Molecular Probes公司的Click-iT EdU检测试剂盒可以解决这个问题。这种方法不需要变性步骤，因为荧光探针标记的叠氮化物小分子，而不是庞大的抗体分子，可以很轻易的识别并结合未变性DNA双链中的EdU分子。 采用BrdU方法时，你必须非常小心的去对DNA进行变性，才能一方面使BrdU抗体进入细胞，另一方面又保留足够的双链DNA分子来进行细胞周期的分析。有了EdU后则不同，由于你不再需要变性，这一切都很简单了；另外，常常用于DNA变性的HCl，可能破细胞内坏蛋白的抗原识别位点，因而限制了BrdU检测法中同时检测其他蛋白的应用，但这种情况在EdU法中不存在。

台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒

台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒 产品简介： 台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒(Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit），是利用正常的健康细胞能够排斥台盼蓝不被染色，而丧失细胞膜完整性的细胞可以被台盼蓝染色的原理研制而成。 严格来说，台盼蓝染色检测的是细胞膜的完整性，通常认为细胞膜丧失完整性，即可认为细胞已经死亡。台盼蓝染色后，通过显微镜下直接计数或显微镜下拍照后计数，就可以对细胞存活率进行比较精确的计算。 主要成分： 试剂(A): 主要由台盼蓝组成，过滤除菌。 试剂(B): 主要由磷酸盐等组成，高压灭菌。 自备材料： 1、显微镜 2、血细胞计数板 操作步骤（仅供参考）： 1、收集细胞： 如果收集贴壁细胞，应用胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞，收集细胞。如果收集悬浮细胞，则可以直接收集细胞。把收集的细胞在1000～2000g离心1min，弃上清，用1ml或适当试剂(B)重新悬浮起细胞沉淀。 2. 台盼蓝染色： 吸取100μl重悬的细胞到常规1.5ml或0.5ml离心管内， 加入100μl Trypan Blue stain轻轻混匀，染色3min（染色时间可适当延长，但不宜超过10min)。 3. 计数： 吸取少量经过染色后的细胞，用血细胞计数板计数。通常如果要比较精确地进行定量，

每个细胞样品至少数500个细胞，数出蓝色细胞和细胞总数。细胞存活率计算公式如下： 细胞存活率＝(细胞总数－蓝色细胞数)/细胞总数×100% 注意事项： 1、试剂(A)、试剂(B)都是无菌的，使用时最好在超净台内进行无菌操作，避免细菌污染。 2、台盼蓝对人体有害，请注意小心操作。 3、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 有效期：12个月有效。 相关产品： 产品编号 产品名称 CC0007磷酸缓冲盐溶液(10×PBS,无钙镁) CC0022D-Hanks平衡盐溶液(1×,含酚红) CC0033Hanks平衡盐溶液(1×HBSS,无酚红) CC0045Earle's平衡盐溶液(1×EBSS,无钙镁糖酚红) CC0130胰蛋白酶-EDTA溶液(0.25%:0.02%) DA0065台盼蓝染色液(0.4%)

台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒

台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒 简介： 台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒(Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit ）是利用正常的健康细胞能够排斥台盼蓝不被染色即拒染特性，而丧失细胞膜完整性的细胞可以被台盼蓝染色的原理研制而成。严格来说，台盼蓝染色检测的是细胞膜的完整性，通常认为细胞膜丧失完整性，即可认为细胞已经死亡。台盼蓝染色后，通过显微镜下直接计数或显微镜下拍照后计数，就可以对细胞存活率进行比较精确的计算。 Leagene 台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒主要由Trypan Blue stain 、细胞重悬液组成。 组成： 自备材料： 1、 胰蛋白酶消化液 2、 显微镜 3、 血细胞计数板 操作步骤(仅供参考)： 1、收集细胞： 收集贴壁细胞时应采用胰蛋白酶消化细胞，收集细胞。如果收集悬浮细胞，则可以直接收集细胞。把收集的细胞离心，弃上清，用适当试剂(B)重新悬浮起细胞沉淀。 2. 台盼蓝染色： 吸取重悬的细胞到常规离心管内， 加入Trypan Blue stain(2×)轻轻混匀，染色3min(染色时间可适当延长，但不宜超过10min)。 3. 计数： 吸取少量经过染色后的细胞，用血细胞计数板计数。通常如果要比较精确地进行定量，每个细胞样品至需要500个细胞，数出蓝色细胞和细胞总数。细胞存活率计算公式如下： 细胞存活率＝(细胞总数－蓝色细胞数)/细胞总数×100% 编号 名称 CT0030 100T Storage 试剂(A): Trypan Blue stain(2×) 10ml 4℃ 试剂(B): 细胞重悬液 100ml 4℃ 使用说明书 1份

CCK8测细胞存活率

CCK-8法测细胞存活率 1、在96孔板中配置100μL 的5000 CelL／mL细胞悬液。将培养板在培养箱预 ）。 培养24h（37℃，5% CO 2 2、向培养板加入10μL不同浓度的多肽1uM、2 uM 、5uM、10uM。每种多肽浓度设3个复孔，并设不加细胞液的调零孔和只加细胞液、不加肽液的空白对照孔。 3、将培养板在培养箱孵育一段适当的时间24h。 4、向每孔加入10μL CCK溶液（注意不要再孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。 5、将培养板在培养箱内孵育1-4h。 6、一般用酶标仪测定在450nm处的吸光度。 7、若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24h内测定，吸光度不会发生变化。 注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。 活力计算： 细胞活力*（％）=[A(加药)-A（空白）]/[A（0加药）-A（空白）] ×100 A（加药）：具有细胞、CCK溶液和药物溶液的孔的吸光度 A（空白）：具有培养基和CCK溶液而没有细胞的孔的吸光度 A（0加药）：具有细胞、CCK溶液而没有药物溶液的孔的吸光度 *细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力 多肽稀释：母液40uM 100ul 1000uM 4ul +96ul PBS 10uM 60ul 40uM 15ul +45ul PBS ５uM40ul40uM5ul +35ul PBS 2uM 40ul 10uM 8ul +32ul PBS 1uM 40ul 10uM 4ul +36ul PBS A=pisL9K20 A1-A4（10uM、5uM、2uM、1uM）= A5-A8 =A8-A12 B=pis L9K22TG C= pis L9K22WK D=GV21-2 E= 空白E1-E3 = 100ul培养基+10ul CCK 0加药E5-E7 = 100ul细胞+10ul CCK

细胞计数和存活率的测定

细胞计数和存活率的测定 目的学会细胞计数和鉴别细胞死活的方法。 实验前的思考体外培养细胞常常需要测定细胞的培养密度，即单位体积内的细胞数，同时还需要鉴别细胞的死活，从而了解细胞的存活情况。细胞密度测定最常用的工具是血球计数板，细胞死活测定的最简单方法是染料排斥法，常用鉴别染料为台酚蓝。 材料器具蟾蜍或小白鼠的骨髓细胞；显微镜，血球计数板，吸管，培养皿，试管，软布或擦镜纸；%台酚蓝染液，两栖动物生理盐水（%氯化钠溶液）或哺乳动物生理盐水（%氯化钠溶液）。 步骤 1.制备骨髓细胞悬液具体方法参见第660页实验“赡蜍骨髓细胞染色体的制备”。 2.细胞计数准备取一副血球计数板，用软布或擦镜纸擦净，把盖玻片盖在血球计数板中央的计数室上。把上述制得骨髓细胞悬液摇匀，用吸管吸取少量细胞悬液轻轻地滴在计数室边缘的斜面上，让它自然地流入盖玻片下的空隙，均匀地充满在计数室内。悬液不能过多或过少，过多会使盖玻片浮起，过少会出现空隙或气泡。如果有上述现象必须洗去，擦干重做，否则会影响计数准确性。 3.细胞计数方法静置2～3分钟，待细胞在计数室下沉后，在低倍镜下计数（详见本书第777页实验《血细胞的计数》。 4.细胞存活力鉴别取毫升骨髓细胞悬液放入小试管里，再加%台酚蓝染液毫升，用吸管轻轻吹打混匀，染色2～3分钟。然后把悬液摇匀，吸取悬液滴一滴在干净载玻片上，加盖玻片，在低倍镜下，随机计数上、下、左、中、右五个视野内的细胞总数和被染成蓝色的细胞数，蓝色细胞为死细胞，按以下公式计算细胞存活率：

上述细胞计数和细胞存活力测定也可以合并在一起做。 分析和讨论 1.细胞计数时，应该先调焦，看清计数板上的格线。细胞密度太高时，计数不便，应该先把原液稀释若干倍后再计数，随后把测得结果乘以稀释倍数即为原液细胞密度。计数时，以每大格点数在几十到一百多为宜。 2.台酚蓝染液一般不能渗透到活细胞里，所以活细胞不会着色。但是如果延长染色时间或提高染液的浓度，造成活细胞膜损伤时，活细胞也可着色。所以，使用中应该掌握好有关条件。

动物细胞的死活鉴定和存活率的测定

（二）、动物细胞的死活鉴定和存活率的测定 一、实验目的及原理 1、掌握染料排除法鉴定细胞死活的原理。 2、学习用血球计数板进行细胞计数，以测定动物细胞存活率的方法。 原理：在显微镜下，从形态上很难区分死、活细胞。但是，死细胞可被某些染料如台盼蓝、伊红和苯胺黑等染上相应的颜色，而活细胞则不会被染色。因此，可根据细胞是否被染料着色来区分细胞的死活。 二、实验材料试剂 血球计数板、滴管、试管、倒置显微镜、超净工作台、电吹风、0.25%胰蛋白酶液、PE液、MEM+小牛血清培养液、0.4%台盼蓝 三、主要操作步骤 （一）细胞悬液的准备 1、75%酒精棉球消毒双手、工作台面、培养瓶和试管等。 2、将前一实验传代培养的细胞培养液倒入一个小试管中，暂存。 3、向培养瓶内加入5ml PE液，平放轻摇，放置2～5分钟后倒掉。 4、向培养瓶内加入0.5～o.8ml的0.25%胰蛋白酶消化液，放置2～４分钟后倒掉。拍打悬浮后，再将暂存的细胞培养液倒入，制备成单细胞悬液, （内含活细胞和死细胞）。 （二）细胞死活鉴定及计数 1、用95%酒精冲洗血球计数板及盖玻片，用电吹风吹干。把盖玻片覆在计数板上面，露出计数板台面少许，以便滴加细胞悬液。 2、取吸管一支，伸入培养瓶中，吸取细胞悬液向一小试管中滴入6滴，再滴入0.4%台盼蓝3滴，混匀，染色2-3分钟。 如果细胞悬液含细胞过多，可先用MEM培养液稀释，稀释倍数视情况而定，然后再进行染色。 3、向计数板边缘处轻轻滴加1-2滴已染色的细胞悬液，使之充满计数板和盖玻片间的空隙。 4、显微镜下观察和计数。 活细胞不着色，死细胞被染上蓝色。 分别统计角上的4个大方格内的活细胞和死细胞数，两个平台共8个大方格。 （三）数据的统计 活（死）细胞数（个/ml）=8个大方格中的活（或死）细胞总数/8 ?104?稀释倍数 细胞存活率%=（活细胞数/细胞总数）?% 四、实验结果 第一个平台，四个角的活细胞数分别为9,10,7,12；死细胞数分别为2,2,3,1. 第二个平台，四个角的活细胞数分别为11,7,9，10；死细胞数分别为3,2,2,2. 五、思考题解答与讨论 计算培养瓶中活（死）细胞数（个/ml），计算细胞存活率%。 活细胞数=（9+10+7+12+11+7+9+10）/8*10^4=93750 死细胞数=（2+2+3+1+3+2+2+2）/8*10^4=21250 细胞存活率=21250/(93750+21250)=18.48%

细胞生长检测方法

细胞生长检测方法 -------MTT法 MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。 一、基本原理：其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT 结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。 需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。 二、MTT 溶液的配制方法 MTT全称：3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide 汉语化学名：3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐 商品名：噻唑蓝，是一种黄颜色的染料。 MTT 溶液的配制方法： 通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml

的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。 注意： 1.在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住，实验的时候一般关闭超净台上的日光灯来避光）。 2. 配制MTT时用PBS（ph=7.4）溶解， PBS配方：Nacl 8g ＋Kcl 0.2g ＋Na2HPO4 1.44g ＋KH2PO4 0.24g调pH 7.4,定容1L。 3.MTT一般最好现用现配，过滤后4oC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml 保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。（我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了）。 4.MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT 需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉. 三、普通MTT法实验步骤： 1：接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul. 2: 培养细胞：同一般培养条件，培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。 3：呈色：培养3-5天后，每孔加MTT（噻唑蓝）溶液（5mg/ml用PBS配制，

srb测细胞存活率

1、准备物品： 1.1、96孔板 1.2、化合物10mM，96孔板中 1.3、10μL、100μL排枪 1.4、阳性对照：紫杉醇（100μmol/L） 1.5、无菌水 1.6、培养基 1.7、0.4%(w/v)的SRB染液(1%的乙酸配制) 1.8、TCA溶液(30%，w/v) 1.9、1%的乙酸 1.10、Tris-base碱液(10mM，pH=10.5) 2、细胞种板 肿瘤细胞以每孔3000个种于96孔平底板，过夜贴壁。 3、化合物配制 3.1 样品化合物用培养基配置成100μmol/L。 3.2以同样体积的DMSO用培养基配置，作为阴性对照。 3.3紫杉醇用培养基配置成10-100n mol/L，作为阳性对照。 4. 加药 4.1、弃培养基，加入含有化合物的培养基，每孔100μL。 4.2、以含有等体积DMSO的培养基为阴性对照。 4.3、孵育72小时。 5、SRB方法检测 5.1、细胞固定：每孔加入50μL4℃预冷的TCA溶液(30%，w/v)固定细胞，TCA溶液的终浓度为10%。静置5 min移入4℃冰箱中固定1 h，取出用去离子水冲洗5遍，室温晾干。5.2、染色：待96孔板室温下晾干后，每孔加入0.4%(w/v)的SRB染液(1%的乙酸配制)70μL，染色30 min后倒掉染液，用1%(v/v)乙酸冲洗4次，去除未结合的染料，室温晾干。 5.3、检测：用100μL非缓冲Tris-base碱液(10mM，pH=10.5)溶解与细胞蛋白结合的染料，水平摇床上振荡20min，采用酶标仪540nm处测定光吸收值。 6、SRB检测的计算公式 PG=100×(T0-Tx)/T0 其中，T0：药物作用前的细胞经过固定、染色后测得平均吸光值； Tx：药物作用终点时细胞经过固定、染色后测得平均吸光值。 PG即Percentage Growth，是指药物作用的样品孔与阴性对照孔中细胞增殖量的百分率。

动物细胞计数及存活率的测定

动物细胞计数及存活率的测定 一、【实验目的】 1、掌握染料排除法鉴定细胞死活的原理。 2、学习用血球计数板进行细胞计数测定细胞的存活率的方法。 二、【实验原理】 在显微镜下从形态上很难区分死、活细胞。但是，死细胞可被某些染料如台盼蓝、伊红和苯胺黑等染上相应的颜色，而活细胞则不会被染色。因此，可根据细胞是否被染料着色来区分细胞的死活。 血球计数板 血球计数板是一块上面刻有“H”型凹槽的特制的厚玻璃板。H型凹槽在玻璃板中间围成上下两个平台，而且中间这两个平台比两侧平台要低0.1 mm 血球计数板的计数室 每一大方格面积为 1 mm×1 mm，由于有0.1mm的凹度空隙，因此 盖上盖玻片后容积为0.1 mm3，（0.1ul） 三、【实验仪器与试剂】 仪器与器材：显微镜、血球计数板、吸管、培养皿、试管、软布或擦镜子 试剂：0.4%台酚蓝染液，生理盐水，酒精

四、【实验步骤】 细胞死活的鉴定及计数 1、用95%酒精冲洗血球计数板及盖玻片，用电吹风吹干。把盖玻片覆在计数板上面，露出计数板台面少许，以便滴加细胞悬液。 2、取吸管一支，伸入培养瓶中，吸取细胞悬液向一小试管中滴入6滴，再滴入0.4%台盼蓝3滴，混匀，染色2-3分钟。如果细胞悬液含细胞过多，可先用MEM培养液稀释，稀释倍数视情况而定，然后再进行染色。 3、向计数板边缘处轻轻滴加1-2滴已染色的细胞悬液，使之充满计数板和盖玻片间的空隙。 4、显微镜下观察和计数，活细胞不着色，死细胞被染上蓝色。 5、分别统计角上的4个大方格内的活细胞和死细胞数，两个平台共8个大方格。 计算公式 活（死）细胞数（个/ml）=8个大方格中的活（或死）细胞总数/8 ?104?稀释倍数 细胞存活率%=（活细胞数/细胞总数）?% 五、【实验结果及讨论】 通过观察实验结果如下 1、活（死）细胞数（个/ml）=8个大方格中的活（或死）细胞总数/8 ?104?稀释倍数 =60/8 ?104?1 =780（个）------------未经稀释处理 2、细胞存活率%=（活细胞数/细胞总数）?100% =60/90?100% 血球计数板方格 活细胞 死细胞 =66.67% 图中，空心圆圈代表未被染色的透明活细胞，实心圆圈代表被染色的死细胞。