传统腺病毒载体系统
复制缺陷型腺病毒载体(传统腺病毒载体系统)
目前用于基因治疗的载体多为此种腺病毒载体。顾名思义，这种腺病毒载体不能在除包装细胞系（293、911、PERC6等）以外的细胞中复制增殖。其共同特点是：缺失了腺病毒基因组中某些复制增殖所必需的基因，这部分基因的功能由辅助细胞或病毒提供。
第一代腺病毒载体：
为E1和/或E3区缺失的腺病毒，容许携带6.5~8kb的外源基因，外源基因表达盒（包括外源启动子、目的基因以及终止子）一般被插入到E1区所对应的部分。前面提到，E3区编码蛋白与腺病毒逃避宿主免疫监视有关，与病毒复制增殖的关系不大，因此在构建腺病毒载体时常常被去除，以扩大腺病毒载体的装载容量。E1区是腺病毒基因组进入细胞核后立早表达的基因，对后续其他基因的表达以及病毒复制起到至关重要的作用。但是如果腺病毒载体中保留E1区，当其感染细胞后会有大量的病毒蛋白表达，不仅对细胞有毒，还会引起很强的宿主抗病毒免疫反应。为解决这一矛盾，人们在一些细胞系的基因组中整合了腺病毒基因组左端一段包括E1区基因的序列，构建了所谓腺病毒包装细胞系（如293、911以及PERC6等），这些细胞系可以反式提供E1区的功能，使E1区缺失的腺病毒载体增殖并产生成熟的腺病毒颗粒。虽然体外实验表明这种方案是可行的，体内实验却发现第一代腺病毒载体仍会引起较强的免疫反应，使目的基因不能长效表达。造成这种现象的主要原因是：一方面许多细胞有E1样蛋白表达，即使是低水平的表达也会激活E2区基因的功能，导致病毒复制增殖和表达晚期蛋白，甚至会产生一些可复制的腺病毒（RCA, replication-competent adenovirus）；另一方面，研究发现当以较高的MOI（感染复数，病毒/细胞 Multiply Of Infection）感染细胞时，E2区对E1区功能上的依赖可以被忽略，病毒仍可以复制并表达晚期基因。另外，第一代非增殖型腺病毒载体最多只能装载约8kb的外源基因，这对于许多基因治疗方案来说仍是远远不够的。虽说存在着上述一些不足，第一代复制缺陷型腺病毒载体仍然是基因转移的一个非常好的工具，他的转基因能力适应于大多数的基因治疗方案，能够比较容易地获得高滴度的病毒。它不仅可以用于基因治疗，特别是肿瘤基因治疗，还可以用于表达重组蛋白质以获得基因疫苗，或是用于将目的基因转导入对其他转染方法不敏感的细胞株中。
第二代复制缺陷型腺病毒载体：
第二代复制缺陷型腺病毒载体在第一代的基础上，对E2 区（甚至包
括E4 区）基因的部分或全部进行了缺失突变。由于对腺病毒基因组进行了更多的缺失突变，第二代腺病毒载体的转基因容量更大，允许插入最大约14kb 的外源核苷酸序列。同时由于缺失了更多的腺病毒早期表达基因，
如E1 、E3 、DNA 聚合酶、IVa2 以及pTP等，病毒蛋白的表达被进一步降低，由第二代腺病毒载体所引起的宿主抗病毒免疫反应与第一代比较要弱很多，因此在靶细胞中更稳定，目的基因的表达时相也更长。与第一代腺病毒载体一样，第二代腺病毒载体的获得有赖于辅助细胞（或）病毒提供其所缺失的反式作用元件。人们已经建立了多个细胞株用作第二代腺病毒载体的辅助细胞，如可表达E2a 区的DNA 结合蛋白、E2b 区的DNA 聚合
酶、E2b 编码的末端蛋白以及可表达全部或大部分E4 区蛋白的细胞株。但是由于当腺病毒的一些反式作用元件共同出现在一个细胞株内时表现出较强的细胞毒性，而且编码这些蛋白的DNA 大都是以染色体外游离的形式存在，导致这些细胞株的稳定性较差，成熟腺病毒颗粒的产量较低，病毒滴度下降。另外，尽管动物实验已经证实第二代腺病毒载体所引起的机体免疫反应明显弱于第一代，但仍有少量的腺病毒晚期蛋白表达，这说明若要完全去除腺病毒晚期蛋白表达需对腺病毒载体进行更加深入的改造。
第三代腺病毒载体：
即所谓空壳载体（gutless or gutted adenovirus vectors ）或（hdAd, helper-dependent adenovirus vector ）。有关这种腺病毒载体的设想来源于对一些无感染能力的腺病毒颗粒的观察。研究发现，尽管这些无感染能力腺病毒颗粒的基因组成千差万别，但是它们都共同含有腺病毒基因组最左端的一段序列，即包装信号（ψ）。因此人们设想：构建一种腺病毒载体，仅保留包括左右端ITR 以及包装信号的约500bp 的顺式作用元件，去除腺病毒基因组中全部的反式作用元件，而这部分功能由辅助病毒提供。这无疑是防止腺病毒晚期蛋白表达最简单、直接也是最有效的方法。它在保留了第一代新病毒载体基因转在效率高等一些优点的同时，外源基因的装载容量扩大到约37kb 。由于去除了全部的腺病毒蛋白编码序列，安全性进一步提高，引起机体免疫反应的可能性降低，因此外源基因的表达时相明显延长，有报道称可达一年以上。另外，由
于hdAd 的主要特点之一是载体的血清型是由辅助病毒决定的，只需采用不同的辅助病毒，就很容易包装出不同血清型的空壳载体，实现血清型转换（serotype switching ），因此hdAd 可以反复经系统途径给药，而无需担心机体抗腺病毒中和抗体的影响。虽然hdAd 有以上种种优点，但其目前还
只限于临床前研究阶段，主要是因为有以下两个技术上的难题需要解决。首先是如何去除辅助病毒的污染。用作辅助病毒多为第一代腺病毒载体，很难用常规的方法将其与hdAd 完全分开。已有几种方案用于这方面的研究，其中以拿大
的Graham 教授等人提出的用Cre/LoxP 系统剪切辅助腺病毒包装信号的
方法最为可行，应用也最为广泛。具体方法是在辅助腺病毒包装信号的两侧分别插入一段同向排列的LoxP 序列（P1 噬菌体Cre 重组酶的特异性识别位点）。这种修饰对腺病毒在293 细胞内复制增殖不会造成影响，然而这种经修饰的辅助腺病毒一旦感染293 来源的可稳定表达Cre 重组酶
的293Cre 细胞，Cre 酶会对包装信号两侧的LoxP 位点进行剪切，这种失去了包装信号的辅助病毒仍然可以反式提供hdAd 所需的各种腺病毒蛋白，却不能包装成成熟的腺病毒颗粒。借助高效特异的Cre/LoxP 重组系
统，hdAd 与辅助腺病毒在共转染293Cre 细胞并传过几代之后，混杂的辅助腺病毒将降到0.1~0.01% 左右。另一个需要解决的是hdAd DNA 大小和填充物（stuffer ）的问题。我们知道，腺病毒颗粒的有效包装下限是野生型腺病毒基因组长度的75% ，（即约28kb ）。若低于此限，则需额外插入适当的DNA 充当填充物使其达到28kb 以上，否则不被包装或DNA 分子发生重排。然而，DNA 填充物的选择对hdAd 的功能非常重要。比如，以一段22kb 长的λ噬菌体DNA 为填充物的hdAd ，在体外实验时目的基因的表达量非常低，当经静脉途径注入小鼠体内时会引起明显的针对λ噬菌
体DNA 所产生的蛋白质的CTL （cytotoxic T-lymphocytes ）杀伤。相反，若是插入一段相似的人次黄嘌呤- 鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT ）则不仅会明显地提高目的基因的表达，而且不会引起明显的CTL 杀伤。因此可以说，去除腺病毒所有的编码序列本身并不能保证目的基因的长效表达，同时也说明填充物的选择必须非常慎重，一般应遵守以下原则：人源化、无重复序列、无已知基因并且有与腺病毒基因组相似的GC 含量。
腺病毒中文操作手册
腺病毒载体操作手册中文版 腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章 AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 4.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体 5 4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生 5 4.2.1 共转化的一般原则 5 4.2.2 共转化方法 5 4.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 6 4.4.1 细胞铺板 6 4.4.2 磷酸钙转化技术 7 第五章常用技术 8 5.1 QBI-293A细胞培养 8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖 8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存 8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生 9 5.2.1 感染QBI-293A细胞 9 5.2.2 病毒空斑形成 9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞 9 5.3 MOI测定 10 5.4 腺病毒感染力测定 10
5.4.1 X-Gal染色 11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化 11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送 11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12 5.5.3 Western杂交 13 5.5.4 Southern杂交和点杂交 13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 14 5.5.6 免疫测定 14 5.5.7 功能测定 14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增 15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒 16 5.7.1 不连续密度梯度离心 17 5.7.2 连续密度梯度离心 17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集 17 5.8 病毒滴度测定 18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19 5.8.2 空斑测定法 20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法 20 第六章疑难解答 22 6.1 QBI-293A细胞培养 22 6.2 感染力测定 22 6.3 转移载体克隆 23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组24 6.5 转染QBI-293A细胞 25 6.6 筛选和测定 25 6.7 在QBI-293A细胞中表达 26 6.8 重组腺病毒的扩增 26 6.9 纯化 26 6.10 病毒滴度测定 27 缩写英文全称中文全称 Ad Adenovirus 腺病毒 Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒 AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素 β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶 bp Base Pair 碱基对
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腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介1 第二章应用重组腺病毒的优点2 第三章AdEasyTM技术3 3.1技术概况3 3.2AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3 第四章主要流程4 4.1将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 4.1.1 缩写英文全称中文全称 AdAdenovirus腺病毒 Ad5Adenovirusserotype5血清5型腺病毒AdVAdenoviralVector腺病毒载体 AmpAmpicillin氨苄青霉素 β-Galβ-Galactosidaseβ-半乳糖苷酶 bpBasePair碱基对 BSABovineSerumAlbumin小牛血清白蛋白cDNAComplementaryDNA互补DNA cccDNAClosedCircularCoiledDNA闭环螺旋DNA CPECytopathicEffect细胞病理效应CsClCesiumChloride氯化铯 DMEMDulbecco’sModifiedEagleMediumDMEM培养基DMSODimethylSulfoxide二甲基亚砜DTTDithiothreitol二硫苏糖醇EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid乙二胺四乙酸EtBrEthidiumBromide溴化乙锭FBSFetalBovineSerum胎牛血清 HrHour小时 ITRInvertedTerminalRepeat反向末端重复KanKanamycin卡那霉素 kbKilobases千碱基对 KDaKiloDaltons千道尔顿LBLuria-Bertani(broth)LB培养基MCSMultipleCloningSite多克隆位点 MinMinute分钟 MOIMultiplicityofInfection(Virus/Cell)感染复数mRNAMessengerRNA信使RNA MWCOMOIecularWeightCut-off PAGEPolyAcrylamideGelElectrophoresis聚丙烯凝胶电泳PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液PFUPlaqueFormingUnit空斑形成单位 piPostInfection感染后RCAReplicationCompetentAdenovirus增殖性腺病毒RITRRightInvertedTerminalRepeat右侧反向末端重复SDSSodiumDodecylSulfate十二烷基硫酸钠TBETrisBorate/EDTA三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸 TCID50TissueCultureInfectiousDose5050%组织培养感染剂量 TCPTotalCellularProtein细胞总蛋白 TETris/EDTATE溶液 wtWildType野生型 X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷 第一章简介 当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。人类基因组计划和正不断发展的基因治疗同样急需发展快速有效和治疗性的分析工具。为解决这一问题，基因输送技术(通常使用病毒载体如增殖缺陷的腺病毒)通过基因工程不断发展，致力于生产基因表型药物。重组腺病毒提供了一类在基因转移系统发展中有极大潜力的新的生物治疗剂。 1953年对普通感冒病因的探索和研究导致了腺病毒的发现。迄今为止已发现了40多种不同血清型和93种不同种类的腺病毒，它们通常感染眼、呼吸道或胃肠上皮（Fields等，1996）。1977年，FrankGraham博士建立了一种细胞株，可在无辅助病毒的情况下产生重组腺病毒（Graham等，1977）。此后，腺病毒载体作为极具潜力的哺乳动物基因转移载体而得到广
腺病毒载体的构建-体外连接法快速高效构建表达
体外连接法快速高效构建表达β-半乳糖苷酶的重组腺病毒载体 作者：王家宁, 王传成郭凌郧, 黄永章 [摘要] 目的: 采用体外连接法构建和制备重组腺病毒Adeno-X-LacZ，为构建具有治疗价值的重组腺病毒载体奠定基础。方法: PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ酶切pShuttle2-LacZ穿梭质粒，回收4.6 kb 的LacZ基因表达盒，与经过相同酶切的Adeno-X病毒DNA连接，连接产物用SwaⅠ酶切，最终产物转化DH5α。重组质粒用PCR法和PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ酶切鉴定。pAdeno-X-LacZ用PacⅠ线性化后，用脂质体介导其转染至AD293细胞内包装扩增出重组腺病毒颗粒，采用CsCl 密度梯度离心法纯化重组腺病毒Adeno-X-LacZ。采用X-gal染色观察Adeno-X-LacZ在AD293细胞内包装和HVSMC表达情况。结果: PCR扩增可见312 bp特异性条带，PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ酶切重组质粒后释放出4.6 kb LacZ基因表达盒。X-gal染色证实了在AD293细胞内成功扩增包装出重组腺病毒Adeno-X-LacZ和LacZ基因在HVSMC中得到有效表达。结论: 体外连接法是一种快速、简便、高效的构建重组腺病毒质粒的方法，本研究为构建具有治疗价值的重组腺病毒奠定了基础，Adeno-X-LacZ为研究腺病毒介导的基因转移提供了一良好的对照载体。 [关键词] 体外连接;腺病毒;β－半乳糖苷酶;PI-SceⅠ;I-CeuⅠ Abstract: Objective To construct recombinant adenoviral v ector expressing β-galactosidase by in vitro ligation and provide a basis for construction of recombinant adenovirus vector expressing therapeutic gene of interest.Methods pShuttle2-LacZ was digested with PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰand 4.6 Kb fragment of LacZ gene expression cassette was recovered .This fragment was ligated to predigested Adeno-X viral DNA with PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ. The ligated product was digested with Swa Ⅰ.The resultant DNA was transformed into E. Coli. DH5α.The correct recombinant plasmid, pAdeno-X-LacZ ,was identified by PCR and PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰdigestion. The Pac I-digested, linearized pAdeno-X-LacZ was transfected into AD293 cells by Lipofectamine. Recombinant adenovirus , Adeno-X-LacZ, was purified with CsCl density gradient ultracentrifugation. HVSMC was infected with Adeno-X-LacZ. X-gal staining was performed to monitor the expression of β-galactosidase gene. Results There was a specific band of 312bp when pAdeno-X-LacZ was amplified by PCR. PI-SceⅠ/I-CeuⅠdigestion of pAdeno-X-LacZ released 4.6Kb of LacZ gene fragment. X-gal staining confirmed Adeno-X-LacZ was packaged successfully within AD293 cells and the expression of β-galactosidase gene in HVSMC. Conclusion In vitro ligation is a simple, rapid and efficient method for constructing recombinant adenoviral vector. This study provides a basis for construction of recombinant adenoviral vector carrying therapeutic gene of interest, Adeno-X-LacZ is also a useful control vector for the research of gene transfer mediated by recombinant adenovirus. K ey words: In vitro ligation; Adenovirus; β-galactosidase; PI-Sce Ⅰ; I-Ceu Ⅰ
腺病毒载体构建重组扩增纯化委托技术服务合同书(完整版)
合同编号：YT-FS-4484-56 腺病毒载体构建重组扩增纯化委托技术服务合同书 (完整版) Clarify Each Clause Under The Cooperation Framework, And Formulate It According To The Agreement Reached By The Parties Through Consensus, Which Is Legally Binding On The Parties. 互惠互利共同繁荣 Mutual Benefit And Common Prosperity
腺病毒载体构建重组扩增纯化委托技术服务合同书(完整版) 备注：该合同书文本主要阐明合作框架下每个条款，并根据当事人一致协商达成协议，同时也明确各方的权利和义务，对当事人具有法律约束力而制定。文档可根据实际情况进行修改和使用。 服务方（甲方）：_____ 地址：______ 邮编：______ 电话：______ 传真：______ e-mail：_____ 开户银行：_____ 帐号：______ 委托方（乙方）：_____ 地址：______ 邮编：______ 电话：______ 传真：______
甲乙双方根据《中华人民共和国合同法》等法律法规，在平等互利的原则下，经协商一致，订立本合同，以兹双方共同遵照执行。 第一条病毒名称 甲方接受乙方的委托，为其载体构建、重组、扩增和纯化_____腺病毒，腺病毒滴度_____pfu/ml。 第二条费用及价格（人民币） 1．病毒的载体构建、重组、扩增和纯化所需的原料由甲方自行购买； 2．合同总价_____元，（大写）_____。 第三条乙方责任 1．乙方所购买的甲方腺病毒产品及其一切复制品、衍生产品将只供乙方或乙方所能控制的实验组中进行实验研究，在任何情况下决不用于人类，决不用于以谋利（直接或间接）为目的的生物制药以及临床分析等方面。 2．未征得甲方授权或同意，乙方不能以任何名义将购买的腺病毒产品及其一切复制品、衍生产品转移、
腺病毒中文操作手册
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腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体 4 4.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体5 4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生5 4.2.1 共转化的一般原则 5 4.2.2 共转化方法 5 4.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 6 4.4.1 细胞铺板 6 4.4.2 磷酸钙转化技术7 第五章常见技术8 5.1 QBI-293A细胞培养8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2.1 感染QBI-293A细胞9 5.2.2 病毒空斑形成9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞9 5.3 MOI测定10 5.4 腺病毒感染力测定10
5.4.1 X-Gal染色11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表示和基因输送11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12 5.5.3 Western杂交13 5.5.4 Southern杂交和点杂交13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 14 5.5.6 免疫测定14 5.5.7 功能测定14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5.7.1 不连续密度梯度离心17 5.7.2 连续密度梯度离心17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集17 5.8 病毒滴度测定18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19 5.8.2 空斑测定法20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法20 第六章疑难解答22 6.1 QBI-293A细胞培养22 6.2 感染力测定22 6.3 转移载体克隆23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组24 6.5 转染QBI-293A细胞25 6.6 筛选和测定25 6.7 在QBI-293A细胞中表示26 6.8 重组腺病毒的扩增26 6.9 纯化26 6.10 病毒滴度测定 27 缩写英文全称中文全称 Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清
重组腺病毒构建的标准操作规程
重组腺病毒构建的标准操作规程（编号：048） 1、目的及适用范围 该SOP用于规范真核细胞表达重组蛋白的操作。 2、主要仪器及试剂 电转仪、Adeasy-1系统（穿梭载体pshuttle-cmv,pAdtrack-CMV）、骨架病毒（pAdeasy-1）、重组菌（BJ5183感受态）、包装细胞（293A）、Taq酶。限制性内切酶、碱裂解法提取质粒溶液I、II、III、酚、氯仿 3、操作步骤 3.1目的基因的克隆：引物设计时要GOI中有没有Pme I/EcoRI和PacI酶切位点。 3.1.1通过限制酶切分析/PCR/基因测序确认GOI克隆到穿梭载体，翻译方向跟启动子方向相同。 3.1.2如果采用pShuttle 或pAdTrack，必须提供启动子和多聚腺苷酸信号。所有的穿梭载体必须包括一个Kozak 信号序列。 3.1.3因为在转化和转染前，用Pme I/EcoRI和PacI酶，所以要避免GOI中有这些酶的酶切位点。如果有PacI酶酶切位点，建议通过点突变除去。 3.1.4如果表达多个基因，避免头对头的方向，采用头尾相接的方式。 3.1.5建议在穿梭载体中，通过瞬时转染检测GOI的表达。 3.2制备电转 BJ5183 感受态细胞：BJ5183为链霉素抗性，固体和液体LB加终浓度为30μg/mL 的链霉素培养。划线培养、挑单菌落摇床培养，转接到200-300mL液体培养基中，37℃摇床培养至A550约0.8，转移到无菌离心管中冰浴10～30min，4℃3000rpm离心10min，用50mL灭菌的超纯水配制的10%甘油重悬,重复两次离心重悬，4℃3000rpm离心10min，用10mLWB重悬，4℃3000rpm离心10min最后用0.5mL重悬。分装20μL/管，-80℃冻存。 3.3用卡那抗性培养基培养2mL含有GOI穿梭质粒的细菌培养过夜。提取质粒DNA。推荐使用碱裂解法提取质粒，保证穿梭质粒的完整性可以提高在BJ5183细菌中重组的效率。 3.4 用Pme I或EcoRI线性化穿梭质粒：必须保证酶切完全。0.1μg-0.5μgDNA用300U的酶100μL 体系。电泳检测酶切是否完全。 3.5乙醇沉淀法回收纯化线性化的穿梭载体。 3.6 冰上操作：向20μLBJ5183感受态细胞中加入pAdeasy-1腺病毒骨架质粒和线性化的穿梭质粒，混匀，总体积不超过30μL。 3.7 将感受态和DNA混合物转移到用冰预冷的电转杯中，电击转化。电击完成后加入预热的LB 101
pAAV-CMV-iRFP腺病毒载体说明(图)
pAAV--‐CMV--‐iRFP 编号 载体名称 北京华越洋VECT10016 pAAV--‐CMV--‐iRFP pAAV--‐CMV--‐iRFP载体基本信息 载体名称: pAAV--‐CMV--‐iRFP 质粒类型: 腺病毒载体；荧光蛋白报告载体 高拷贝/低拷贝: 高拷贝 克隆方法: 限制性内切酶，多克隆位点 启动子: CMV 载体大小: 5603 b p 5' 测序引物及序列: pCAX--‐F (CAGCTCCTGGGCAACGTGC) 3' 测序引物及序列: C--‐CMV--‐24 (TATTAGGACAAGGCTGGTGGGCAC) 载体标签: --‐--‐ 载体抗性: 氨苄青霉素 筛选标记: 红外荧光蛋白iRFP 克隆菌株: Stbl3 或 NEB S tble 宿主细胞（系）: 常规哺乳动物细胞系 备注: --‐--‐ 稳定性: 稳表达 组成型/诱导型: 组成型 病毒/非病毒: 腺病毒 pAAV--‐CMV--‐iRFP载体质粒图谱和多克隆位点信息
pAAV--‐CMV--‐iRFP载体序列: ORIGIN 1 C CTGCAGGCA G CTGCGCGCT C GCTCGCTCA C TGAGGCCGC C CGGGCGTCG G GCGACCTTT 61 G GTCGCCCGG C CTCAGTGAG C GAGCGAGCG C GCAGAGAGG G AGTGGCCAA C TCCATCACT 121 A GGGGTTCCT G CGGCCGCAC G CGTGGAGCT A GTTATTAAT A GTAATCAAT T ACGGGGTCA 181 T TAGTTCATA G CCCATATAT G GAGTTCCGC G TTACATAAC T TACGGTAAA T GGCCCGCCT 241 G GCTGACCGC C CAACGACCC C CGCCCATTG A CGTCAATAA T GACGTATGT T CCCATAGTA 301 A CGTCAATAG G GACTTTCCA T TGACGTCAA T GGGTGGAGT A TTTACGGTA A ACTGCCCAC 361 T TGGCAGTAC A TCAAGTGTA T CATATGCCA A GTACGCCCC C TATTGACGT C AATGACGGT 421 A AATGGCCCG C CTGGCATTA T GCCCAGTAC A TGACCTTAT G GGACTTTCC T ACTTGGCAG 481 T ACATCTACG T ATTAGTCAT C GCTATTACC A TGGTGATGC G GTTTTGGCA G TACATCAAT 541 G GGCGTGGAT A GCGGTTTGA C TCACGGGGA T TTCCAAGTC T CCACCCCAT T GACGTCAAT 601 G GGAGTTTGT T TTGCACCAA A ATCAACGGG A CTTTCCAAA A TGTCGTAAC A ACTCCGCCC 661 C ATTGACGCA A ATGGGCGGT A GGCGTGTAC G GTGGGAGGT C TATATAAGC A GAGCTCGTT 721 T AGTGAACCG T CAGATCGCC T GGAGACGCC A TCCACGCTG T TTTGACCTC C ATAGAAGAC 781 A CCGGGACCG A TCCAGCCTC C GCGGATTCG A ATCCCGGCC G GGAACGGTG C ATTGGAACG 841 C GGATTCCCC G TGCCAAGAG T GACGTAAGT A CCGCCTATA G AGTCTATAG G CCCACAAAA 901 A ATGCTTTCT T CTTTTAATA T ACTTTTTTG T TTATCTTAT T TCTAATACT T TCCCTAATC 961 T CTTTCTTTC A GGGCAATAA T GATACAATG T ATCATGCCT C TTTGCACCA T TCTAAAGAA 1021 T AACAGTGAT A ATTTCTGGG T TAAGGCAAT A GCAATATTT C TGCATATAA A TATTTCTGC 1081 A TATAAATTG T AACTGATGT A AGAGGTTTC A TATTGCTAA T AGCAGCTAC A ATCCAGCTA 1141 C CATTCTGCT T TTATTTTAT G GTTGGGATA A GGCTGGATT A TTCTGAGTC C AAGCTAGGC 1201 C CTTTTGCTA A TCATGTTCA T ACCTCTTAT C TTCCTCCCA C AGCTCCTGG G CAACGTGCT 1261 G GTCTGTGTG C TGGCCCATC A CTTTGGCAA A GAATTGGGA T TCGAACATC G ATTGAATTC 1321 C CCGGGGATC T GCCGCCACC A TGGCGGAAG G ATCCGTCGC C AGGCAGCCT G ACCTCTTGA 1381 C CTGCGACGA T GAGCCGATC C ATATCCCCG G TGCCATCCA A CCGCATGGA C TGCTGCTCG 1441 C CCTCGCCGC C GACATGACG A TCGTTGCCG G CAGCGACAA C CTTCCCGAA C TCACCGGAC 1501 T GGCGATCGG C GCCCTGATC G GCCGCTCTG C GGCCGATGT C TTCGACTCG G AGACGCACA 1561 A CCGTCTGAC G ATCGCCTTG G CCGAGCCCG G GGCGGCCGT C GGAGCACCG A TCACTGTCG 1621 G CTtCACGAT G CGAAAGgAC G CAGGCTTCA T CGGCTCCTG G CATCGCCAT G ATCAGCTCA 1681 T CTtccTCGA G CTCGAGCCT C CCCAGCGGG A CGTCgccga g ccgcaggcg t tcttccgcc 1741 g caCCAACAG C GCCATCCGC C GCCTGCAGG C CGCCGAAAC C TTGGAAAGC G CCTGCGCCG 1801 C CGCGGCGCA A GAGGTGCGG A AGATTACCG G CTTCGATCG G GTGATGATC T ATCGCTTCG 1861 C CTCCGACTT C AGCGGCGAA G TGATCGCAG A GGATCGGTG C GCCGAGGTC G AGTCAAAAC 1921 T AGGCCTGCA C TATCCTGCC T CAACCGTGC C GGCGCAGGC C CGTCGGCTC T ATACCATCA 1981 A CCCGGTACG G ATCATTCCC G ATATCAATT A TCGGCCGGT G CCGGTCACC C CAGACCTCA 2041 A TCCGGTCAC C GGGCGGCCG A TTGATCTTA G CTTCGCCAT C CTGCGCAGC G TCTCGCCCG 2101 T CCATCTGGA A TTCATGCGC A ACATAGGCA T GCACGGCAC G ATGTCGATC T CGATTTTGC 2161 G CGGCGAGCG A CTGTGGGGA T TGATCGTTT G CCATCACCG A ACGCCGTAC T ACGTCGATC 2221 T CGATGGCCG C CAAGCCTGC G AGCTAGTCG C CCAGGTTCT G GCCTGGCAG A TCGGCGTGA 2281 T GGAAGAGTG A GTCGACGCG G CCGCTCGAG C CTAAGCTTG C CTCGAGCAG C GCTGCTCGA 2341 G AGATCTACG G GTGGCATCC C TGTGACCCC T CCCCAGTGC C TCTCCTGGC C CTGGAAGTT
腺病毒载体疫苗
什么是腺病毒载体疫苗 腺病毒载体疫苗是指以腺病毒作为载体，将保护性抗原基因重组到腺病毒基因组中，使用能表达保护性抗原基因的重组腺病毒制成的疫苗。 腺病毒载体疫苗特点 研究发现，携带各种抗原的腺病毒载体能刺激机体产生很强的体液免疫或细胞免疫。此外，由于腺病毒载体能感染呼吸道和肠道细胞，可以方便地通过黏膜进行免疫，并能诱导机体产生黏膜和系统免疫应答。 腺病毒载体疫苗的临床研究 1、腺病毒载体诱导的天然免疫反应 腺病毒载体本身的病原相关分子模式与细胞表面模式识别受体结合，促进炎性细胞因子的分泌和未成熟树突状细胞分化为专职抗原呈递细胞，激活宿主的天然免疫系统。研究表明，通过静脉给小鼠注射大剂量的表达β-半乳糖苷酶的重组腺病毒，6h即可检测到IL-6、IL-1和TNF-α的分泌，脾脏边缘也有树突状细胞和巨噬细胞聚集，在恒河猴中也观察到类似现象。 2、腺病毒载体疫苗能迅速刺激机体产生高水平的体液免疫 很多疫苗是通过刺激机体产生中和抗体来发挥保护机体预防疾病作用的。腺病毒载体疫苗能有效产生针对相应靶抗原的高水平抗体。如携带狂犬病毒糖蛋白的复制缺陷型或复制型的5 型重组腺病毒载体疫苗，都能诱导高水平中和抗体，保护动物抵抗致死剂量狂犬病毒的攻击。 3、腺病毒载体疫苗能刺激机体产生很强的细胞免疫 特异性T细胞免疫在对抗寄生虫病、病毒性疾病及肿瘤治疗中都具有重要作用。大量的临床前和临床研究发现，腺病毒载体疫苗能刺激机体产生很强的针对外源基因的特异性T 细胞反应。有研究报道，携带恶性疟原虫抗原的腺病毒载体疫苗能刺激小鼠产生很强的CD8+T 细胞免疫反应，最高能达到92％的保护率。 4、腺病毒载体疫苗可方便地通过黏膜进行免疫 能通过黏膜免疫诱导局部或全身体液免疫反应是腺病毒载体疫苗的一个重要特点。黏膜免疫与全身免疫相比有许多不同，注射免疫诱导的全身免疫虽然可以清除其感染，但通常不能保护黏膜表面；而经黏膜接种疫苗可以非侵入性地诱导机体产生黏膜和系统免疫应答，从而可以保护机体免受通过黏膜表面和其他途径的感染。研究发现，在多种动物模型中，口服或滴鼻接种肺炎球菌、委内瑞拉马脑炎病毒、狂犬病毒、乙肝病毒的重组腺病毒载体疫苗，都能刺激机体产生很强的体液免疫和局部的黏膜反应，并保护机体免受相应病原的侵害。
腺病毒载体构建重组扩增纯化委托技术服务合同书样本
编号：JS-20213689 甲 方：______________________________ 乙 方：______________________________ 日 期：_________年________月_______日 腺病毒载体构建重组扩增纯化委托技 术服务合同书样本 Promises resulting from either express or an implied agreement can be enforced.
[标签:titlecontent] 服务方(甲方)：_________ 地址：_________ 邮编：_________ 电话：_________ 传真：_________ e-mail：_________ 开户银行：_________ 帐号：_________ 委托方(乙方)：_________ 地址：_________ 邮编：_________ 电话：_________ 传真：_________ 甲乙双方根据《中华人民共和国合同法》等法律法规，在平等互利的原则下，经协商一致，订立本合同，以兹双方共同遵照执行。 第一条病毒名称
甲方接受乙方的委托，为其载体构建、重组、扩增和纯化_________腺病毒，腺病毒滴度_________pfu/ml。 第二条费用及价格(人民币) 1.病毒的载体构建、重组、扩增和纯化所需的原料由甲方自行购买; 2.合同总价_________元，(大写)_________。 第三条乙方责任 1.乙方所购买的甲方腺病毒产品及其一切复制品、衍生产品将只供乙方或乙方所能控制的实验组中进行实验研究，在任何情况下决不用于人类，决不用于以谋利(直接或间接)为目的的生物制药以及临床分析等方面。 2.未征得甲方授权或同意，乙方不能以任何名义将购买的腺病毒产品及其一切复制品、衍生产品转移、出售或租借给他人使用。 3.保证乙方应用甲方腺病毒产品及其一切复制品、衍生产品进行的研究符合现行的法律法规，不得应用甲方腺病毒产品进行有损于人类安全或其它非法目的的研究。 4.所有在研究过程中经本产品及其一切复制、衍生产品处理过之动物、植物、蛋类以及乳制品等均应妥善处理，决不可食用或出售。 5.乙方及乙方的课题组在发表文章中注明该重组腺病毒购自甲方，并将已发表文章复印一份给甲方。 6.甲方的腺病毒产品是由人5型腺病毒改造而来，在特殊情况下仍可能具有一定的致病性，乙方必须遵守国家安全使用腺病毒原则。
pAAV-CAG-GFP腺病毒载体说明(图)
pAAV--‐CAG--‐GFP 编号 载体名称 北京华越洋VECT10004 pAAV--‐CAG--‐GFP pAAV--‐CAG--‐GFP载体基本信息 载体名称: pAAV--‐CAG--‐GFP 质粒类型: 腺病毒载体；荧光蛋白报告载体 高拷贝/低拷贝: 低拷贝 克隆方法: 限制性内切酶，多克隆位点 启动子: CAG (CMV e nhancer/chicken β--‐actin p romoter) 载体大小: 5439 b p 5' 测序引物及序列: pCAG f wd p rimer 5’CAACGTGCTGGTTATTGTG 3’ 3' 测序引物及序列: cggcttctggcgtgtgac 载体标签: --‐--‐ 载体抗性: 氨苄青霉素 筛选标记: EGFP 克隆菌株: Stbl3 或 NEB S tble 宿主细胞（系）: 常规哺乳动物细胞系 备注: --‐--‐ 稳定性: 稳表达 组成型/诱导型: 组成型 病毒/非病毒: 腺病毒 pAAV--‐CAG--‐GFP载体质粒图谱和多克隆位点信息
pAAV--‐CAG--‐GFP载体序列: ORIGIN 1 C TTCCGCTTC C TCGCTCACT G ACTCGCTGC G CTCGGTCGT T CGGCTGCGG C GAGCGGTAT 61 C AGCTCACTC A AAGGCGGTA A TACGGTTAT C CACAGAATC A GGGGATAAC G CAGGAAAGA 121 A CATGTGAGC A AAAGGCCAG C AAAAGGCCA G GAACCGTAA A AAGGCCGCG T TGCTGGCGT 181 T TTTCCATAG G CTCCGCCCC C CTGACGAGC A TCACAAAAA T CGACGCTCA A GTCAGAGGT 241 G GCGAAACCC G ACAGGACTA T AAAGATACC A GGCGTTTCC C CCTGGAAGC T CCCTCGTGC 301 G CTCTCCTGT T CCGACCCTG C CGCTTACCG G ATACCTGTC C GCCTTTCTC C CTTCGGGAA 361 G CGTGGCGCT T TCTCATAGC T CACGCTGTA G GTATCTCAG T TCGGTGTAG G TCGTTCGCT 421 C CAAGCTGGG C TGTGTGCAC G AACCCCCCG T TCAGCCCGA C CGCTGCGCC T TATCCGGTA 481 A CTATCGTCT T GAGTCCAAC C CGGTAAGAC A CGACTTATC G CCACTGGCA G CAGCCACTG 541 G TAACAGGAT T AGCAGAGCG A GGTATGTAG G CGGTGCTAC A GAGTTCTTG A AGTGGTGGC 601 C TAACTACGG C TACACTAGA A GAACAGTAT T TGGTATCTG C GCTCTGCTG A AGCCAGTTA 661 C CTTCGGAAA A AGAGTTGGT A GCTCTTGAT C CGGCAAACA A ACCACCGCT G GTAGCGGTG 721 G TTTTTTTGT T TGCAAGCAG C AGATTACGC G CAGAAAAAA A GGATCTCAA G AAGATCCTT 781 T GATCTTTTC T ACGGGGTCT G ACGCTCAGT G GAACGAAAA C TCACGTTAA G GGATTTTGG 841 T CATGAGATT A TCAAAAAGG A TCTTCACCT A GATCCTTTT A AATTAAAAA T GAAGTTTTA 901 A ATCAATCTA A AGTATATAT G AGTAAACTT G GTCTGACAG T TACCAATGC T TAATCAGTG 961 A GGCACCTAT C TCAGCGATC T GTCTATTTC G TTCATCCAT A GTTGCCTGA C TCCCCGTCG 1021 T GTAGATAAC T ACGATACGG G AGGGCTTAC C ATCTGGCCC C AGTGCTGCA A TGATACCGC 1081 G AGACCCACG C TCACCGGCT C CAGATTTAT C AGCAATAAA C CAGCCAGCC G GAAGGGCCG 1141 A GCGCAGAAG T GGTCCTGCA A CTTTATCCG C CTCCATCCA G TCTATTAAT T GTTGCCGGG 1201 A AGCTAGAGT A AGTAGTTCG C CAGTTAATA G TTTGCGCAA C GTTGTTGCC A TTGCTACAG 1261 G CATCGTGGT G TCACGCTCG T CGTTTGGTA T GGCTTCATT C AGCTCCGGT T CCCAACGAT 1321 C AAGGCGAGT T ACATGATCC C CCATGTTGT G CAAAAAAGC G GTTAGCTCC T TCGGTCCTC 1381 C GATCGTTGT C AGAAGTAAG T TGGCCGCAG T GTTATCACT C ATGGTTATG G CAGCACTGC 1441 A TAATTCTCT T ACTGTCATG C CATCCGTAA G ATGCTTTTC T GTGACTGGT G AGTACTCAA 1501 C CAAGTCATT C TGAGAATAG T GTATGCGGC G ACCGAGTTG C TCTTGCCCG G CGTCAATAC 1561 G GGATAATAC C GCGCCACAT A GCAGAACTT T AAAAGTGCT C ATCATTGGA A AACGTTCTT 1621 C GGGGCGAAA A CTCTCAAGG A TCTTACCGC T GTTGAGATC C AGTTCGATG T AACCCACTC 1681 G TGCACCCAA C TGATCTTCA G CATCTTTTA C TTTCACCAG C GTTTCTGGG T GAGCAAAAA 1741 C AGGAAGGCA A AATGCCGCA A AAAAGGGAA T AAGGGCGAC A CGGAAATGT T GAATACTCA 1801 T ACTCTTCCT T TTTCAATAT T ATTGAAGCA T TTATCAGGG T TATTGTCTC A TGAGCGGAT 1861 A CATATTTGA A TGTATTTAG A AAAATAAAC A AATAGGGGT T CCGCGCACA T TTCCCCGAA 1921 A AGTGCCACC T AAATTGTAA G CGTTAATAT T TTGTTAAAA T TCGCGTTAA A TTTTTGTTA 1981 A ATCAGCTCA T TTTTTAACC A ATAGGCCGA A ATCGGCAAA A TCCCTTATA A ATCAAAAGA 2041 A TAGACCGAG A TAGGGTTGA G TGTTGTTCC A GTTTGGAAC A AGAGTCCAC T ATTAAAGAA 2101 C GTGGACTCC A ACGTCAAAG G GCGAAAAAC C GTCTATCAG G GCGATGGCC C ACTACGTGA 2161 A CCATCACCC T AATCAAGTT T TTTGGGGTC G AGGTGCCGT A AAGCACTAA A TCGGAACCC 2221 T AAAGGGAGC C CCCGATTTA G AGCTTGACG G GGAAAGCCG G CGAACGTGG C GAGAAAGGA 2281 A GGGAAGAAA G CGAAAGGAG C GGGCGCTAG G GCGCTGGCA A GTGTAGCGG T CACGCTGCG 2341 C GTAACCACC A CACCCGCCG C GCTTAATGC G CCGCTACAG G GCGCGTCCC A TTCGCCATT 2401 C AGGCTGCGC A ACTGTTGGG A AGGGCGATC G GTGCGGGCC T CTTCGCTAT T ACGCCAGCT 2461 G CGCGCTCGC T CGCTCACTG A GGCCGCCCG G GCAAAGCCC G GGCGTCGGG C GACCTTTGG
重组腺病毒生产技术研究进展
2004 年 10月The Chinese Journal of Process Engineering Oct. 2004 重组腺病毒生产技术研究进展 祁丽，顾铭，丛威 (中国科学院过程工程所生化工程国家重点实验室，北京 100080) 摘要：目前基因治疗，尤其是对癌症的基因治疗越来越多地得到人们的关注. 随着基因工程技术 的发展，对癌症在基因水平上的认识不断深化，发现了很多对治疗癌症有帮助的基因，但临床面 临的最大问题就是如何建立一个安全、高效、实用、可重复的基因转移系统，将这些治疗基因有 效地导入靶细胞. 人们构建了各种载体，重组腺病毒就是基因治疗的重要载体之一. 能否生产出大 量高质量的腺病毒载体是制约体外实验和临床实验的关键因素. 本文从感染机制、生产和纯化计数 等几个方面讨论生产重组腺病毒载体的进展. 关键词：基因治疗；重组腺病毒载体 中图分类号：Q952 文献标识码：A 文章编号：1009?606X(2004)05?0475?06 1 前言 基因治疗是近年来兴起的一种针对单基因和多基因遗传病、心血管疾病、恶性肿瘤和一些传染病的新的治疗模式，目的是将外源治疗基因导入靶细胞，在体内产生疗效. 基因导入系统是基因治疗的核心技术，可分为病毒载体系统和非病毒载体系统. 到目前为止，病毒载体在基因治疗中仍然是最有效的基因导入系统[1]. 腺病毒就是已经用于基因治疗的载体之一，与其它病毒载体相比，腺病毒载体一个主要优势是在包装细胞中能获得较高的病毒滴度，能感染分裂期和非分裂期的细胞，目前应用最多的是Ad5[2]. 用外源DNA置换出一定长度的病毒基因片断及获得重组的腺病毒，根据腺病毒载体中的病毒基因置换程度，可将其分为第一代、第二代和第三代. 第一代腺病毒载体去除了基因序列中的E1和E3区，包装外源基因的能力较小，在8.5 kb以内，主要用于单基因疾病的治疗[3]，缺点是导入基因的表达时间短和引起宿主的免疫反应，导致直接的细胞致病变作用(Cytopathic Effects，CPE)，另外，在293细胞内同源重组作用导致野生腺病毒(Replicative Competent Adenovirus，RCA)的产生[4]. 为了避免上述缺点，第二代腺病毒载体进一步去除了E2a, E2b或E4，载体的容量和安全性比第一代有所改进，但是其介导的外源基因的转染和表达时间并没有明显延长，而且产生重组病毒滴度低，另外保留的病毒基因仍有低水平的表达并引起细胞免疫反应[5,6].第三代腺病毒缺失全部或大部分腺病毒基因，或者包装腺病毒微染色体系统，这种载体缺失了病毒蛋白，所以很大程度上降低了细胞的免疫源性，并且外源基因的表达时间明显延长，但对包装细胞的要求很高，分离辅助病毒困难. 至今在临床中应用的腺病毒载体主要是第一代腺病毒载体. 重组腺病毒的生产过程主要包括包装细胞的培养、病毒感染、病毒的分离纯化和病毒计数及滴度测定等几个主要步骤. 以下从腺病毒的感染机制、生产和纯化计数几个方面论述重组腺病毒载体的生产技术. 收稿日期：2003?09?28，修回日期：2003?11?05 基金项目：国家高技术研究发展计划(863计划)资助项目(编号: 2001AA217121) 作者简介：祁丽(1979?)，女，河南省原阳县人，硕士研究生，生物工程专业；丛威，通讯联系人，E-mail: weicong@https://www.wendangku.net/doc/cc16095916.html,.