泛素融合蛋白表达系统真核表

为了研究哺乳动物蛋白的生理功能，我们常常利用哺乳动物的细胞系来表达它们，但是构建稳定表达的细胞系却是一件费时费力的事。最近，德国康斯坦茨大学的研究人员利用N端结合泛素的目的蛋白能被泛素特异的蛋白酶（USP）切割的特性，开发出新的表达系统，能轻松、高效地筛选出表达目的蛋白的哺乳动物细胞。

蛋白表达一般通过转染表达载体来实现，载体上的表达盒由组成型或诱导型的启动子来控制。表达策略有两种：瞬时转染和稳定表达。瞬时转染能实现目的蛋白的短期表达。与之相对，用抗生素进行筛选是稳定表达的前提条件。在稳定的细胞系中，表达载体的一个或多个拷贝整合进入基因组，能长期稳定表达转基因，不过这个基因不能是细胞毒性的。在大部分表达系统中，抗性基因和目的蛋白是通过不同的启动子控制的。这样，就存在一个缺点，只有一部分筛选出的细胞表达目的蛋白，尤其当蛋白是细胞毒性的。于是，我们不得不同时进行细胞筛选和蛋白表达分析，尽管它非常费力。

为了解决这个问题，表达载体有了一些修改，增加了核糖体内部结合位点（IRES）元件。这样，目的蛋白和抗性基因就能从同一个转录本中表达。有抗性的细胞也会表达目的蛋白。不过，因为它们是单独翻译，所以两种蛋白的表达速率不同，有可能差异很大。例如目的蛋白的翻译起始速率可能会显著低于IRES介导的抗性基因的翻译起始速率。

20多年前，Varshavsky及同事发现将泛素融合到另一蛋白的N端，会导致泛素特异蛋白酶的有效切割，释放出泛素和目的蛋白。德国康斯坦茨大学的Scheffner就利用了泛素融合蛋白的方法，设计出一种真核表达载体。他在嘌呤霉素N-乙酰转移酶（puror）上加了血细胞凝集素表位（HA）标签，并融合到泛素的N端（HA-puror-ubi），再整个融合到目的蛋白的N端。这种表达载体的优势是对嘌呤霉素有抗性的细胞一定能表达目的蛋白，而且它们的比例是1：1，另外，USP的切割会产生无标签的目的蛋白。

为了验证这种方法的可行性，他们利用HA-puror-ubi表达载体表达了两种蛋白：Flag标记的EGFP和E6AP（一种泛素连接酶）。然后，他们验证了这些融合蛋白在体外和细胞内是否能有效加工，是否具有功能。

他们将重组的表达载体分别用体外表达系统（兔网织红细胞裂解液）和不同的细胞系（H1299、RKO、MCF-7和HeLa）进行表达，并用western blot进行分析，最终都检测到了HA-puror-ubi、Flag-EGFP和Flag-E6AP，加工效率接近100%。为了说明加工后的HA-puror-ubi蛋白是否让细胞具有嘌呤霉素的抗性，他们将重组的表达载体转染细胞，并用递增量的嘌呤霉素筛选48小时。结果表明HA-puror-ubi至少是部分活性的，转染后的细胞能耐受高浓度的嘌呤霉素（8-12 ug/ml；通常1 ug/ml已足够杀死未转染的H1299细胞）。有趣的是，EGFP和E6AP的表达水平也随嘌呤霉素递增，说明通过改变选择压力，能调节系统中目的蛋白的表达量。

与传统的表达系统相比，HA-puror-ubi表达系统表现出三大优势。一、所有筛选出的细胞表达目的蛋白；二、目的蛋白的最终表达水平可由选择压力如抗生素的浓度来控制；三、无需构建单克隆。另外，与IRES表达载体相比，目的蛋白的表达水平提高了5-10倍。

（生物通余亮）

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