生物制药专业综合实验讲解

生物技术制药实验课程实习讲义人表皮生长因子（hEGF）在大肠杆菌中的表达与纯化

生物与制药工程学院制

2016年6月2日

目录

第一节引言 (2)

1.1表皮生长因子(EGF)概述 (2)

1.2 表皮生长因子(EGF)的结构与性质 (2)

1.3 EGF的生物学效应及应用 (3)

1.4 本实验课程设计的目的与内容 (4)

第二节EGF基因的合成与转化表达 (5)

1.实验原理 (5)

2.实验材料与方法 (5)

2.1 实验材料及仪器 (5)

2.1.1 试剂材料及试剂 (5)

2.1.2 仪器设备 (6)

2.2 实验方法 (6)

2.2.1 试剂及培养基配制方法 (6)

2.2.2目的基因hEGF的设计与合成 (7)

2.2.4 电泳检测质粒DNA (8)

2.2.5大肠杆菌感受态细胞的制备 (8)

2.2.6转化重组质粒进感受态大肠杆菌BL21(DE3） (9)

2.2.7检测转化是否成功 (9)

2.2.8双酶切并检测 (9)

2.2.9 EGF基因的PCR扩增验证 (9)

2.2.10 目的基因的诱导表达及基因表达产物的SDS-PAGE检测 (10)

第三节EGF表达蛋白的纯化与检测 (15)

3.1 实验原理 (15)

3.2 可溶性6xHis重组蛋白纯化实验方法 (15)

3.3 6xHis重组蛋白包涵体纯化与复性 (17)

第一节引言

1.1表皮生长因子(EGF)概述

生长因子在人体中的信号传导部分起着关键的作用，它可通过与细胞表面的蛋白质受体结合，参与细胞的各种生命活动。生长因子可以是维生素，碱基，多肽等。所研究的表皮生长因子( Epidemal growth factor，EGF)，就是一种人机体细胞合成的一种多肽。在生物体内，每个细胞的生长状态不同，在不同组织中的细胞的表皮生长因子参与生长、增值、死亡等过程。

目前，表皮生长因子已得到广泛应用。在许多公司已经开始研发甚至是生产出EGF，多种疾病的诱发原因很多，我们可以用EGF来进行详细的诊断。之后致病的查出原因，给病人减少心理的压力，带来一线生机。在经过强烈的光刺激后，尤其是激光，人们的眼部会有很大的损伤，最严重的就是眼角膜损伤，无法修复。人体在经过紫外线的照射下皮肤的损伤以及高温、蒸气、火等造成的皮肤大面积与原来的不一样的皮肤。对于这些伤害，我们可使用含有可促进人体表皮细胞的新陈代谢EGF的药膏或者是化妆品，使皮肤变得如初[1]。

在最早研究表皮生长因子的时候就只是证明是多肽，还没有命名。是由Cohen在1960年，在提取神经生长因子时，意外发现除此种物质以外的一种多肽[2]。多个科学家对其充满好奇心，在之后的十年内，Savage真正的研究清楚，命名此种多肽为表皮生长因子[3]。

1.2 表皮生长因子(EGF)的结构与性质

不同的生物中，表皮生长因子的蛋白一级结构不同。研究表明家族成员一般在多于50个氨基酸，而少于80个氨基酸，与我们所熟悉的胰岛素一样，表皮生长因子是由前体加工成的成熟的多肽，在具有生物活性[4]。如人体中的表皮生长因子是由53个氨基酸组成[5]。

整个hEGF分子由两个结构域组成。残基1～33，形成N一端结构域；34～53为C一端结构域；成熟hEGF 的序列位于单链多肽的C一末端附近，由53个氨基酸残基组成，并且其C一端和N一端分别由Arg ／Asp ／Arg ／His邻接，故成熟的EGF分子，可以经专一性Arg内肽酶的作用，从前体释放[6]。二级结构上存在着反平行β片层结构是EGF骨架的常见结构，N一端和C一端在

整个三维结构中不会发生什么变动，维持此结构的是由三个二硫键[7]（由于6个半胱氨酸的存在），因此分子在一定的条件下生物活性表现“顽强”[8]。我们知道同一种酶在不同的生物中有不同的生物效应，同时不同的酶在不同的生物中会有相同的生物效应，hEGF也会有此种现象。hEGF-β和hEGF-γ是hEGF的两种形式，在分子结构和同源性中相似度高，在蛋白中一级结构中即使是在C 末端的某个位置上仅仅只有一个Arg的差别，当它们作用于不同细胞中的同一个受体，在生物体中的作用是一样的[9]。

与许多古细菌中的酶一样如生活在温泉中古细菌，人体表皮生长因子在100℃煮沸达到30 min，仍然能保持结构、活性等稳定性；许多蛋白质在具有强列的催化效率的酶如胰蛋白酶作用下肽链被断掉，而表皮生长因子耐它的消化[10]。EGF在狭小的活性微环境中，由于常见的丙氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸[11]会提供作用基团，表皮生长因子才能与受体结合反应。多肽具有N端和C端，有的在生物活性中不起作用，有的是至少有一段起作用，据研究表明，表皮生长因子结构的两端在细胞的生长中都很重要。

1.3 EGF的生物学效应及应用

细胞通过在信号传导的过程中有多种方式包括直接或间接的接触。自分泌或旁分泌是hEGF作用的方式，在生物体内它亦可以与其他的因子结合作用于细胞。EGF生物效应很多，如下所述：

1.来源于人体的不同种组织的上皮细胞为了适应人体的需要，从基因上赋予它很高分裂效率。EGF在其中起着关键性的作用。首先人体的皮肤表层会产生脱皮现象，证明有大量的细胞死亡。同样，皮肤的表面受到伤害在愈合的过程会结痂，新的皮肤又长出来了。EGF在创伤修复中起着功不可没的作用，在肝脏、肠道、角膜、胃等多种组织创伤的恢复的试验研究[12]取得重大的突破，在临床上已经运用于烧伤、烫伤、创伤及外科手术伤口的愈合，使病人的痛苦少一点。

2.眼睛是我们重要的部分，眼睛的部分受到伤害特别是眼角膜，是我们最担心的。在现实生活中，很多病人由于眼角膜的伤害再加上眼角膜的捐献者少之

又少无法得到修复。实验研究结果表明，适宜浓度的hEGF滴眼液，能通过刺激角膜上皮细胞及基质成纤维细胞的增生与迁移和促进细胞外基质与胶原纤维增生，使损伤修复速度加快，从而辅助修复角膜[13]。

3. 研究表明，多数肿瘤的发生、发展，与EGF之间存在一定的关系。细胞中存在原癌基因和抑癌基因，癌变可能由于这些基因的突变细胞，使细胞生长不受控制。肿瘤细胞表面的EGF受体属于多聚体受体，多个EGF的表达之后与受体结合，使细胞不停的生长，这样，与胃癌、乳腺瘤、黑色素瘤的恶性程度增加[14]。

4.是药三分毒，我们吃的要中有些药对人的胃刺激很大。实验表明：在人的胃溃疡中受损伤的细胞与保护药硫酸铝相结合，可以使溃疡有较高浓度的内源性EGF表达，从而促进溃疡愈合[15]。

1.4 本实验课程设计的目的与内容

1.实验课程设计目的：

本实验课程设计重在学生自己动手设计实验，老师起辅助指导作用，旨在训练学生对专业综合知识的运用。学生需查阅文献和数据库来设计与理解设计方案，主要考察学生对基因分子克隆、表达、发酵和蛋白分离知识的理解与应用，以培养学生的专业综合知识应用与实验动手操作能力。

2.实验课程设计内容：

以表皮生长因子（EGF）为例，让学生从基因的设计入手，合成出完整的EGF基因，然后表达并纯化出该EGF蛋白。主要内容简述如下：（1）通过NCBI数据库网站设计出完整的EGF基因，并设计出引物；

（2）pET-28a衍生质粒为载体、将EGF基因转化如大肠杆菌BL21（DE3）宿主菌中，并通过双酶切和PCR挑选验证转化子；

（3）诱导重组大肠杆菌表达hEGF 蛋白；

（4）经超声破碎提取、SDS-PAGE电泳检测

（5）采用镍柱纯化，进而获取hEGF 蛋白纯品。

第二节EGF基因的合成与转化表达

1.实验原理

人源表皮生长因子（hEGF）来源大致有三个方向：一是来源于人体代谢物的提取；二是来源于化学合成；三是来源于基因工程生产技术，这也是近些年来可以大量生产获得hEGF的方法。前两种方式得到的产品都只有很低的纯度，并不能在实际应用中发挥很大的价值。。

目前已知的研究中，hEGF基因在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母以及动植物等宿主系统中已经成功克隆表达。以pET 等衍生质粒为载体、以BL21(DE3)为表达宿主菌的表达系统是发展较成熟的大肠杆菌表达系统之一, 它采用T7 强启动子, 在IPTG 诱导下, 启动外源基因的高转录。pET载体有pET32a（±）和pET28a（±）等系列。下图1为PET28a质粒载体的物理图谱。

2.

实验材料与方法

2.1 实验材料及仪器

2.1.1 试剂材料及试剂

琼脂粉、NaCl、蛋白胨、酵母浸粉、1 mol/L NaOH溶液、双蒸水、10 mg/mlKana

图1 PET28a质粒载体

母液、PET-28a菌种、E.coli DE3菌种、酒精、含质粒载体的PET-28a菌液、小型质粒快速提取试剂盒（离心柱型）、Goldview、BIOWEST AGAROSE、loading buffer（6×）、Hind ⅢDNA Marker、TAE电泳缓冲液（1×）、0.1 mol/L CaCl2溶液、Zde I酶(10U/μl)及其10×Buffer、Xhol酶(10U/μl)及其Buffer D 10×、GenClean 柱式琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、5 U/μlTaqDNA聚合酶、PCR缓冲液（10×，含Mgcl2）、dNTP混合物、上游引物、下游引物、无菌双蒸水、1 mol/l 的异丙基硫代半乳糖苷（TPTG）、PBS（1×）、SDS-PAGE蛋白凝胶配制试剂盒：30% Acr-Bis（29:1）、1.5 M Tris-Hcl，pH 8.8、10% SDS、10% 过硫酸铵(AP)溶液、TEMED、1 M Tris-Hcl，pH6 .8；2×上样缓冲液、1× Tris-甘氨酸电泳缓冲液、考马斯亮蓝染色液、脱色液Ⅰ（45% 甲醇：10% 乙酸：45% 蒸馏水）、脱色液Ⅱ（5% 甲醇：7% 乙酸：88% 蒸馏水），双蒸水

2.1.2 仪器设备

试管、量筒、天平、药匙、称量纸、培养皿、高压蒸汽灭菌锅、恒温生化培养箱、涂棒、接种环、酒精灯、pH试纸、记号笔、麻绳、棉花、报纸、镊子、滴管、10 ml移液管、恒温摇床、Eppendorf管、微量移液器、枪头、高速离心机、电泳仪、电泳槽、水平凝胶电泳槽和梳子以及其制胶模块、250 ml锥形瓶、微波炉、凝胶成像系统、分光光度计、制冰机、冰盒、恒温水浴锅、超净工作台、水漂、0.2 mlPCR微量管、双面微量离心管架、PCR仪、紫外检测仪、脱色摇床、台式冷冻离心机、垂直电泳槽及配套的玻璃和密封条、梳子、1.5 ml微量离心管、搪瓷盘

2.2 实验方法

2.2.1 试剂及培养基配制方法

1. 卡那霉素母液（10 mg/mL）的配制：称取10 mg卡那霉素溶解于1ml无菌水中，然后采用无菌过滤器过滤后分装于Eppendorf小管中。

2. 培养基的配制

（1）LB培养基：配方(固体培养基加琼脂粉）

（2）

含卡

那霉素（Kana ）LB 固体培养基：将配好的LB 固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右，加入Kana 储存液，使终浓度为50μg/ml ，摇匀后铺板。

（3）含Kana 的LB 液体培养基：每15mL LB 液体培养基分装至试管中，高压灭菌后冷却至60℃ 左右，加入Kana 母液，使终浓度为50μg/ml ）

2.2.2目的基因hEGF 的设计与合成

hEGF 的cDNA 序列自NCBI 上查阅文献得到其编号(NM_001963.2)[21],在NCBI 的数据库中查获其序列为：

根据其序列和限制性酶切位点XhoI 和NdeI 引入其上下游引物分别为： F ：5’-AGTGACTCTCAATGTCCC-3’；

R: 5’-TTCCCACCACTTCAGGTCTC-3’。

委托上海捷瑞生物工程有限责任公司合成目的基因hEGF 序列，并将其插入到质粒载体PET28a 的限制性酶切位点XhoI 和NdeI 之间。公司将含有目的基因序列的重组质粒PET28a-hEGF 保存在穿刺菌细胞XL10中寄回。

2.2.3提取重组质粒

（1）在灭菌后的无菌操作台中，取15ml 分装至试管中的、灭菌后 的LB 液体培养基，加入卡那霉素母液150μL ，保证它在培养基中为50μg/mL 。

（2）将含目的基因的重组质粒的穿刺菌XL10接种无菌LB 培养基（含50μl/mL 卡那霉素），37.C 摇床过夜培养（不能超过15h ）。

（3）取收取的2ml 的菌液于2mlEp 管中，用于提取质粒。

（4）提取质粒，按质粒小量制备试剂盒操作说明书操作。

2.2.4 电泳检测质粒DNA

（1）称取0.3g琼脂粉BIOWEST AGAROSE，放入三角瓶中，加入30ml TAE 电泳缓冲液（1×），制成1%的胶，在微波炉中烧开。

（2）待彻底熔化后，停止加热。

（3）取出三角瓶，自然冷却至不烫手，加入1.7μlGoldview染液。

（4）插入梳子后缓缓倒入胶液，至模具的矮边缘即可，平放等待彻底凝固。

（5）在电泳槽里加满1×TAE缓冲液，调电压至140V（10V/cm）。

(6)胶全凝固后，小心拔出梳子，放入电泳槽中，凝胶要没入缓冲液中。(7）在塑料片上，点5μl（6×）loading buffer，再加入1μl上述质粒DNA 提取产物，混合均匀。

（8）在凝胶上选择相邻的加样孔，用吸液头分别将管中的样品和DNA Marker加入凝胶的加样孔中。

（9）打开电源，样品以蓝色的横带泳动，电泳约30min。

（10）当蓝色泳动到凝胶边缘1cm时，关掉电源。取出模具和凝胶放入成像系统中，观察结果图，并保存。

2.2.5大肠杆菌感受态细胞的制备

（1）宿主菌的培养

挑取新活化的E. coli BL21（DE3）单菌落,接种于4ml LB 液体培养基中,37℃下恒温发酵培养12 小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液1ml接种于100mlLB 液体培养基中,37℃摇床培养3～4小时至OD590＝0.4～0.5左右。（2）制备感受态细胞( CaCl2法)

I、将发酵后的菌液转入2mL预冷、无菌的离心管中,冰置10 分钟,4℃5000rmp离心10分钟。

Ⅱ、弃去上清,用预冷的0.1mol/L 的CaCl2溶液1ml 轻轻悬浮细胞,冰置30分钟后,4℃，5000rmp，10 分钟离心。

Ⅲ、弃去上清,加入1ml 预冷0.1mol/L 的CaCl2溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置30分钟。

Ⅳ、在离心机中4℃下5000rmp离心10 分钟，保留沉淀，200μL预冷的

0.1mol/L的CaCl2溶液重新悬浮，无菌操作台中将其分装成100μL的小份,在冰

上放置2小时以上，便可直接用作宿主菌的转化实验。

2.2.6转化重组质粒进感受态大肠杆菌BL21(DE3）

I、在超净工作台上，取上述感受态大肠杆菌BL21（DE3）菌液，加入PET28a 质粒DNA 溶液5μl,轻轻摇匀,置于冰上放30 分钟.

Ⅱ、在42℃水浴锅中热击90s,迅速在冰上冷却5 分钟。

Ⅲ、往试管中加入1ml LB 液体培养基(不含kan),37℃摇床发酵1 小时。

Ⅳ、将上述菌液摇匀后取100μL涂布于含Kan的固体LB平板上,正面朝上上放置半小时到一个小时待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃条件恒温培养箱中培养16-24小时。

设置对照: 以相同体积的无菌双蒸水代替质粒样品溶液,其它操作与上述相同。此对照正常情况下应无菌落出现。

2.2.7检测转化是否成功

提取转化后大肠杆菌的质粒并进行琼脂糖凝胶电泳检测：参见前面质粒提取以及琼脂糖凝胶电泳检测的方法。将两次提取的质粒在同一块凝胶中电泳，对

比其电泳条带。

2.2.8双酶切并检测

（1）先准备一个冰盒并放入一定量的冰块。从-20℃冰柜中取出限制性内切酶，立即插入冰块中。

（2）用20μl的反应体系进行双酶切：无菌双蒸水14μl、10× H Buffer 2μl、BSA 1μl质粒1μl混匀，限制性内切酶XhoI、NdeI各1μl。

（3）混匀离心管使管中的溶液。在离心机中5000rpm离心30秒。取出后插到水漂的孔中，37.C水浴酶切2 h。

（4）酶切后取酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳（方法参照上述），制1.5%的琼脂糖凝胶，电泳以确认切下的片断是否为自己想要的片断。

2.2.9 EGF基因的PCR扩增验证

取无菌的0.2 ml PCR管，置于冰中，在其中添加如下成分如表3：

表3 PCR反应体系

混匀后，稍作离心（如果利用非热盖型PCR 仪器，应添加30 μl 石蜡油于反应管中，防止样品水分的蒸发）[17]。将反应管放入PCR 仪，按下列条件设定反应程序，进行PCR 反应，如表4：

表4 PCR 反应过程

94℃预变性 5 min

变性 94 ℃ 30 s

退火 55 ℃

循环25次

延伸 72 ℃ 30 s

最后在 72 ℃ 保温10 min

PCR 反应结束后，取5-10 μl 反应液做电泳检测，鉴定PCR 反应产物是否存在，及其大小。电泳确认后，PCR 产物即可用于下一步操作或冰箱保存。

2.2.10 目的基因的诱导表达及基因表达产物的SDS-PAGE 检测

2.2.10.1 目的基因的诱导表达

重组菌的扩增：接种转化了pET-28a-hEGF 的Ecoli DE3于含Kana (50μg/mL)的LB 液体培养基中，37 ℃，200 rpm ，振荡培养过夜。转接100μL 过夜培养物，无菌水

17μl 10× PCR 缓冲液（含Mgcl 2）

2.5μl dNTP 混合物

2μl 上游引物

1μl 下游引物

1μl 待扩增DNA 模板

1μl Taq DNA 聚合酶（5 U/μl ）

0.5μl 终体积

25μl

于100mL的LB液体培养基，于37 ℃，200 rpm，振荡培养至OD 600值在0.7-1.0。从中取出1.0 ml菌液，离心，弃去上清，40 μL PBS悬浮，备用于后面SDS-PAGE 电泳操作。

重组菌外源基因的诱导表达：向扩大培养的培养基中加入1000 μL 0.1mol/L IPTG(至终浓度1 mmol／L)，于37 ℃振荡培养3-4h。

蛋白样品的抽提：将诱导后菌液，4.0 ℃，5000 rpm/min，离心10 min，弃去上清。将所得的菌体沉淀，用PBS溶液悬浮，并转移到10 ml离心管中，向管中继续加入PBS至适宜采用超声破碎仪破碎为止，大约5 ml。用移液器吹打，充分悬浮细胞后，将离心管放到盛有的冰块的烧杯中。清洗并擦拭超声破碎仪的金属杆，然后将超声破碎仪的金属杆插入到离心管中，调整好位置，关上超声破碎仪的门，打开电源，设置程序，开始对细菌经行超声破碎[17]。破碎设置：功率400 W左右；工作2 s；间隔8 s；破碎时间10 min。破碎处理后的细菌细胞，10000 rpm/min 离心10 min。取出离心管，吸取上清液至新的离心管中，此即为所抽提的蛋白样品，可用于后续操作[17]。把离心的沉淀用40 μL PBS悬浮，亦备用于后续SDS-PAGE 电泳操作。

2.2.10.2 SDS-PAGE 电泳检测

1.分别将未诱导前的菌体悬液、诱导破碎后的菌体上清和诱导破碎后的沉淀悬浮液分别和一部分过柱纯化洗脱好的蛋白与5×上样缓冲液按4:1混匀于微量离心管中。

2.将上述四个微量离心管插入水漂，沸水中煮5 min。然后立即插入冰中。样品冷却到室温，5000 rmp 离心5 min。

3.按要求组装电泳装置，并验漏。

4. 配制分离胶及浓缩胶：

根据目的蛋白的分子量大小，选择合适的凝胶浓度。不同浓度的SDS-PAGE 分离胶的最佳分离范围，如表5：

（1）SDS-PAGE分离胶，如表6：

配制12% 分离胶，按顺序和量（注意体积单位！）取下列溶液，在50 ml 的小烧杯中混合（注意Tris 为pH 8.8）。

加完试剂后，拿起烧杯轻轻晃动底部，将溶液混匀后，立即用1000 μL移液器，缓缓把胶液注入玻璃夹缝，每次余部分胶液于枪头内，以免产生气泡。然后在上界面用200 μL移液器轻轻地沿玻璃壁均匀地加蒸馏水，从左到右，以免造成胶面不平整，两液面的交界处呈波浪形，然后静置30 min。倒出蒸馏水，并倒置玻璃装置，尽可能把水倒尽，然后用滤纸吸去残留的水。

（2）SDS-PAGE浓缩胶：见表7。

配制5% 分离胶，按顺序和量（注意体积单位！）取下列溶液，在一个50 ml 的小烧杯中混匀（注意Tris 为pH 6.8）。

加完后，拿起烧杯轻轻晃动，将溶液混匀后，立刻用1000 μL移液器缓缓注入玻璃夹缝中，液面与玻璃上边缘齐平。然后再慢慢插入梳子，静置约20 min。

5. 小心地垂直拔出梳子，用蒸馏水冲洗加样孔2次，然后用滤纸吸干。电泳槽的上部倒满电泳缓冲液（约250 ml，淹没过加样槽的液面），电泳槽的下部倒入一半电泳缓冲液（约180 ml）【19】。

6. 选取形态好的加样孔，在一张空白纸上做好对应的标记，用微量移液器在靠边缘的一个加样槽中加入5 μL蛋白Marker，其它槽中加入30 μL自己制作的样品。

7. 接好电极，将电压调至80 V,待溴酚蓝移到分离胶后，再调电压至120 V，电泳约2 h。期间注意观察电泳槽上部的电泳液是否有泄漏（泄漏导致液面下降，电流中断）。当溴酚蓝移到距底部≤ 0.5 cm时，切断电源。8. 在一个大的培养

皿里，准备适量的考马斯亮蓝染液。9.倒掉电泳槽中的电泳液，取下玻璃板，用刀片轻轻撬开，用刀片沿分离胶与浓缩胶的交接处，将分离胶切下，并在分离胶的左上角切掉一小角，以标记样品顺序【19】。然后用水稍微冲一下玻璃板，戴手套用梳子小心地把分离胶从玻璃板上剥离到培养皿中，盖上盖，在脱色摇床上染色45 min。10. 染色后，将染液回收，以备重复使用。在培养皿中加脱色液Ⅰ，摇床上脱色45 min。倒掉脱色液Ⅰ，更换为脱色液Ⅱ，摇床上脱色45 min。更换新的脱色液Ⅱ，脱色摇床上脱色过夜，至大部分蓝色褪尽。11. 观察脱色后电泳胶中的蓝色带纹。对照、寻找异常粗的带纹，并比较其分子量，判断是否为预期目的基因的产物。

第三节EGF表达蛋白的纯化与检测

--------镍离子金属螯合亲和层析

3.1 实验原理

金属螯合亲和层析(Immobilized Metal-ion Affinity Chromatography)，其纯化原理是：组氨酸（His）的侧链带有1个咪唑基团,咪唑基团pKa值在6左右,在pH ＞7的条件下,咪唑基团带负电,容易与Ni2+离子结合，尤其是带有6个组氨酸（6xHis）标签的重组蛋白对Ni2+离子具有极好的亲和力。通过介质固定Ni离子能够选择性地纯化含有多个组氨酸的蛋白以及多肽；吸附在Ni2+离子上的蛋白可以使用咪唑进行竞争洗脱分离。

常用于Ni2+离子金属螯合亲和层析的介质为NTA（Nitilotriacetic acid）。镍离子有六个螯合价位，NTA螯合了四价，剩余两价与蛋白质上的组氨酸结合（如下图所示）。

3.2 可溶性6xHis重组蛋白纯化实验方法

3.2.1 缓冲液配制（使用0.45 μm 滤器过滤）

①.缓冲液A（平衡缓冲液）：1 L

20 mM Na2HPO4.2H2O 3.56 g

500 mM NaCl 29.2 g

20 mM Imidazole 2.04 g

用HCl（6M）调节pH至7.4，定容至1 L。

②.缓冲液B（洗脱缓冲液）：0.5 L

20 mM Na2HPO4.2H2O 1.78 g

500 mM NaCl 14.6 g

500 mM Imidazole 17.02 g

用HCl（6M）调节pH至7.4，定容至0.5 L。

3.2.2 样品制备

①.菌体收集：5000转/分钟离心10分钟，收集菌体，弃上清液；

②.菌体重悬：加入10-20 ml的缓冲液A（每升培养液约加15 ml），通过震荡

充分悬浮细胞；

③.超声波破碎：将细胞混悬液置于一个合适的小烧杯（也可用其它合适的器皿）

中，在冰上超声波破碎（约500 W，破2s 停2s，总时长15分钟）；

④.菌体破碎后，13000转/分钟离心30分钟，收集上清液（弃沉淀），使用0.45

μm 滤器过滤后用于镍柱纯化（取10 μl样品用于之后的SDS-PAGE检测）。

3.2.3 Ni-NTA预装柱纯化6xHis重组蛋白

①.取一根Ni-NTA预装柱（1 ml），分别用10 ml三蒸水和10 ml缓冲液A洗涤

柱子，流速为1-2 ml/min；

②.将过滤好的细胞上清液以0.5 ml/min流速上样到镍柱中（期间，取10 μl穿

柱液样品用于之后的SDS-PAGE检测）；

③.用15 ml缓冲液A洗去未吸附的样品，流速1-2 ml/min；

④.用5 ml缓冲液B洗脱重组蛋白，流速1 ml/min，1 ml/管收集洗脱液（将每

个收集管编号并每管取10 μl样品用于之后的SDS-PAGE检测）；

⑤.用5 ml缓冲液A再次洗涤柱子

⑥.用5 ml三蒸水洗涤柱子；

⑦.用2 ml20%乙醇洗涤柱子，封闭，以备下次使用。

注：此方法是通用的方法，但是未必能得到较好的纯化效果，可选择使用咪唑浓度梯度进行洗脱（如分别含有50 mM，100 mM，300 mM，500 mM咪唑的缓冲液B）或者使用?KTA蛋白纯化系统进行更为精确的梯度洗脱。

3.2.4 SDS-PAGE检测纯化效果

配制10-15%的SDS-PAGE,对上述收集的样品进行检测；根据检测结果，将重组蛋白纯度和浓度较高的收集管中的样品标记保存。

3.3 6xHis重组蛋白包涵体纯化与复性

某些重组蛋白在表达的过程中由于缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或环境不适，无法形成正确的次级键（一级结构正确，高级结构错误），从而水不溶性且致密地集聚在细胞内，这种形式称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。包涵体主要含有重组蛋白，但同时含有一些细菌成分，如核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白、质粒DNA、以及脂体、脂多糖等。

较强的变性剂如尿素（8 M）、盐酸胍（GdnHCl 6M）通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种次级键，使多肽伸展而溶于水中。如果重组蛋白是以包涵体的形式表达，则将包涵体变性溶解后（加入>=6 M盐酸胍或>=8 M尿素）进行镍离子金属螯合亲和纯化。此纯化过程与可溶性6xHis 重组蛋白的纯化方法相同，只是在缓冲液A和B中都加入同样浓度的变性剂（6 M盐酸胍或8 M尿素）。要得到有活性的重组蛋白，必须对纯化得到的变性重组蛋白进行复性，但复性过程的收率往往很低。一般说来，蛋白质的复性效率在20%左右。

包涵体的纯化通常包括包涵体的分离、洗涤、溶解、镍柱亲和纯化以及蛋白质复性等步骤（注：也可在变复性之后进行亲和纯化）。

3.3.1 缓冲液配制（使用0.45 μm滤器过滤）

①.包涵体洗涤缓冲液: 100 ml

20 mM Na2HPO4.2H2O 0.356 g

500 mM NaCl 2.92 g

2 M 尿素12 g

1 mM EDTA 0.03 g

Triton X-100 (2%) 2 ml

用HCl（6M）调节pH至7.4，定容至100 ml。

②.变性缓冲液A（平衡缓冲液,也作为包涵体溶解缓冲液）：100 ml

20 mM Na2HPO4.2H2O 0.356 g

500 mM NaCl 2.92 g

20 mM Imidazole 0.2 g

8 M 尿素48 g

用HCl（6M）调节pH至7.4，定容至100 ml。

③.变性缓冲液B（洗脱缓冲液）：50 ml

20 mM Na2HPO4·2H2O 0.178 g

500 mM NaCl 1.46 g

500 mM Imidazole 1.7 g

8 M 尿素24 g

用HCl（6M）调节pH至7.4，定容至50 ml。

3.3.2 包涵体的分离、洗涤、溶解

①.菌体收集：5000转/分钟离心10分钟，收集细胞，弃上清；

②.菌体重悬：加入10-20 ml的包涵体洗涤缓冲液（每升培养液约加15 ml），

通过震荡充分悬浮细胞；

③.超声波破碎：将细胞混悬液置于一个合适的小烧杯（也可用其它器皿）中，

在冰上超声波破碎（约500 W，破2s 停2s，总时长15分钟）；

④.菌体破碎后，13000转/分钟离心30分钟，收集沉淀（弃上清液，沉淀为包

涵体）；

⑤.包涵体的洗涤：加入10-20 ml的包涵体洗涤缓冲液震荡重悬包涵体，13000

转/分钟离心30分钟，收集沉淀（弃上清液）；

⑥.包涵体的溶解：加入10-20 ml的包涵体溶解缓冲液（变性缓冲液A）震荡重

悬沉淀，室温搅拌（磁力搅拌器）5-6小时或过夜；

⑦.包涵体充分溶解后，13000转/分钟离心30分钟，收集上清液（弃沉淀），使

用0.45 μm 滤器过滤上清液后用于镍柱纯化（取10 μl样品用于之后的SDS-PAGE检测）。

3.3.3 Ni-NTA预装柱纯化6xHis变性重组蛋白

此实验流程与2.3中可溶性重组蛋白的纯化方法一致，但使用变性缓冲液A 和B分别代替2.3中的缓冲液A和B。

3.3.4 变性重组蛋白的复性

复性：通过缓慢去除变性剂（避免折叠中间体重新聚集）使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构。一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M左右时结束。蛋白质的性质不同，所处的环境不同，使其复性条件大不相同，任何一个蛋白质都有一个最佳的复性条件。可加入复性添加剂，如还原/氧化型谷胱甘肽（10:1～3:1）、L-精氨酸或甘氨酸（0.5 M）以及分子伴侣（硫氧还蛋白二硫键异构酶、肽酰一辅氨酰顺反异构酶等）可能会提高复性的效率。

通常蛋白质复性的方法有：稀释复性、透析复性、超滤复性、亲和柱复性等。

透析复性：通过逐渐降低外透液中变性剂的浓度来控制变性剂去除速度。将亲和纯化得到的变性重组蛋白装入透析袋（透析袋的截留分子量视重组蛋白质的大小而定），在4℃下将透析袋浸入下列溶液依次透析。

以下均为1 L 透析液的配方。

20 mM Na2HPO4.2H2O 3.56 g

150 mM NaCl 8.7 g

0.4 M L-Arginine 69.6 g

4 M 尿素240 g

溶液pH调节到7.5

透析24小时

20 mM Na2HPO4.2H2O 3.56 g

150 mM NaCl 8.7 g

生物制药工艺学

三、名词解释 1. 生物制品（Biological Products）生物制品是以微生物、细胞、动物或人源组织和体液等为原料，应用传统技术或现代生物技术制成，用于人类疾病的预防、治疗和诊断。人用生物制品包括：细菌类疫苗(含类毒素) 、病毒类疫苗、抗毒素及抗血清、血液制品、细胞因子、生长因子、酶体内以及体外诊断制品，以及其他生物活性制剂，如毒素、抗原、变态反应原、单克隆抗体、抗原抗体复合物、免疫调节剂及微生态制剂等。 2. 分叉中间体在微生物代谢过程中，一些中间代谢产物既可以被微生物用来合成初级代谢产物，也可以被用来合成次级代谢产物，这样的中间体被称为分叉中间体。 3. 热阻和相对热阻热阻是指微生物在某一种特定条件下（温度和加热方式）的致死时间。 相对热阻是指某一种微生物在某一条件下的致死时间与另一种微生物在相同条件下的致死时间之比。 4. 种子（广义和狭义）广义种子: 从菌种开始，到发酵罐接种之前的所有生产过程。 狭义种子：种子罐中的种子。 5. 摄氧率单位体积发酵液每小时消耗氧的量。 6. 呼吸强度单位重量的菌体（折干）每小时消耗氧的量。 7. 呼吸临界氧浓在溶氧浓度低时，呼吸强度随溶氧浓度增加而增加，当溶氧浓度达到某一值后，呼吸强度不再随溶氧浓度的增加而变化，此时的溶氧度称为呼吸临界氧浓度。影响因素：微生物的种类、培养温度以及生长阶段。 8. 凝聚价或凝聚值电解质的凝聚能力可用凝聚价或凝聚值表示，定义为使胶粒产生凝聚作用的最小电解质浓度。化合价越高，凝聚能力越强。凝聚能力：Al3+>Fe 3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+ >Na+>Li+ 常用的凝聚剂：Al 2(SO 4 ) 3 ·18H 2 O、AlCl 3 ·6H 2 O、FeCl 3 、ZnSO 4 、MgCO 3 等 9. 凝聚作用在某些电解质作用下，使扩散双电层的排列电位降低，破坏胶体系统的分散状态，而使之凝聚的过程。影响凝聚作用的主要因素是无机盐的种类、化合价以及无机盐的用量。 10. 絮凝作用某些高分子絮凝剂存在下，在悬浮粒子之间产生架桥作用而使胶粒形成粗大的絮凝团的过程。 11. 多级错流萃取料液经萃取后的萃余液再用新鲜萃取剂进行萃取的方法。 12. 多级逆流萃取在第一级中加入料液，萃余液顺序作为后一级的料液，而在最后一级加入萃取剂，萃取液顺序作为前一级的萃取剂。 13. 超临界流体抗溶剂法（Supercritical Fluid Anti-solvent，SAS）先用有机溶剂溶解溶质，再加入超临界流体作抗溶剂，使溶质的溶解度大大下降，溶质从溶液中结晶析出。 14. 超临界溶液快速膨胀法（Rapid Expansion of Supercritical Solution, RESS）是利用高密度的超临界流体溶解固体溶质，通过喷嘴快速泄压至1个大气压的低密度气体，溶质的溶解度急剧减小至万分之一以下，造成固体溶质结晶析出。 15. 道南电位由于带电荷粒子在不同相间的分布不同而产生的相间电位差即为道南电位。 16. 吸附等温线当固体吸附剂从溶液中吸附溶质达到平衡时，其吸附量与溶液浓度和温度有关。当温度一定时，吸附量与浓度之间的函数关系称为吸附等温线。 17. 批一次性投入料液，不补料，直到放罐。(或许） 18. 浓差极化当溶剂透过膜而溶质留在膜上时，它使得膜面上溶质浓度增大而高于主体中溶质浓度，这种现象称为浓差极化。为避免浓差极化现象，通常采用错流过滤。 19. 亲和色谱（Affinity Chromatography）具有很高的选择和分离性能以及较大的载量，纯化倍数高，并能保持较高的活性。 20. 疏水相互作用色谱（Hydrophobic Interaction Chromatography）利用蛋白质表面存有的疏水性部位，与带有疏水性配基的载体在高盐浓度时结合，洗脱时将盐浓度逐渐降低，蛋白质因疏水性不同而逐个地先后被洗脱而分离。该法中蛋白质与固定相结合力较弱，利于保持活性。 21. 膨胀床色谱传统色谱的最大缺点是不能处理含固体颗粒的料液。色谱吸附剂直接与原料液在搅拌罐中混合来吸附目标产物或流化床吸附。膨胀床色谱操作过程：被处理的料液从膨胀床底部泵入，床内的吸附剂将不同程度地向上膨胀，料液中的固体颗粒可以顺利地通过床层，目标产物在膨胀床内可被吸附剂吸附，从而可达到从料液中吸附和初步纯化目标化合物的目的。原理：吸附介质颗粒在向上流动液体的作用下膨胀起来，液体中的目

生物制药工艺学实验

生物制药工艺学实验指导 （12个实验，36学时） 焦飞 生物技术教研室

实验一健胃消食片配方及片剂的制备 一、实验目的 1.掌握压片机压片的方法及影响片剂成型的主要因素； 2.学会片剂处方的调配。 二、实验材料和仪器 太子参，陈皮，山药，麦芽（炒），山楂，蔗糖粉，糊精，硬脂 酸镁，粉碎机，干燥箱，制片机 三、实验原理 健胃消食片为内科伤食类非处方药品，主治健胃消食，用于 脾胃虚弱，消化不良，脾胃虚弱所致的食积，症见不思饮食，暖 腐酸臭，脘腹胀痛。健胃消食片的配方如下，太子参228.6g，陈皮22.9g，山药171.4g，麦芽（炒）171.4g，山楂114.3g，蔗糖糊精适量，值得片剂为淡棕黄色的片或薄薄膜片，气略香，味微甜，酸。制作方法：太子参半量与山药粉碎成细粉，其余陈皮三味药 及剩余的太子参置于烧杯，加3倍量水，煎煮1小时，滤过，合并两次煎液，减压浓缩至浸膏，干燥。将蔗糖粉糊精和生药粉以 3：1：1的混合粉与浸膏混合制成软材，软材的软硬应适当，以“手握成团，轻压则散”为宜。采用挤出制粒的方法制成颗粒， 颗粒在60-80摄氏度干燥，干燥时应逐渐升温，以免因颗粒表面 干燥过快结成硬壳而影响内部水分的蒸发。颗粒整粒后加入1％硬脂酸镁混合后压片。 四、实验步骤

1.称取太子参2 2.8g，陈皮 2.3g，山药17.1g，山药17.1g，麦芽 17.1g，山楂11.4g 2.太子参山药用粉碎机粉成细粉。 3.将上述药材放入烧杯中，加入3倍量的水，煎煮半小时，重复 两次，将上清液合并，减压浓缩至浸膏，将所得浸膏放入烘 箱中80度干燥。 4.将蔗糖粉糊精和干燥后的粉末以3：1：1的比例混合制成颗粒 软材，将软材放入烘箱中逐渐升温干燥。 5.干燥后的软材加入1％硬脂酸镁放入压片机中压片。 实验二溶菌酶结晶的制备 一、实验目的 1.掌握盐析法提取蛋白质的原理和过程； 2.学会溶菌酶的结晶和精制方法。 二、实验材料与仪器 新鲜鸡蛋，氯化钠， 1 氢氧化钠溶液，醋酸缓冲液，烧杯，玻璃棒，布氏漏斗，干燥箱。 三、实验原理 溶菌酶又称细胞壁质酶或N—乙酰胞壁质聚糖水解酶，是一种国内外很紧销的生化物质，广泛应用于医学临床。具有多种药理作用，能抗感染、消炎、消肿、增强体内免疫反应等，有抗菌 的作用，常用于五官科多种粘膜炎症，皮肤带状疮疹等疾病。是

Removed_生物制药实验(1)

实验一芦丁的提取精制与鉴定 芦丁（Rutin）亦称芸香苷（Rutinoside），在植物界广泛存在，其中以槐米、荞麦叶、蒲公英和烟叶中含量较多，可作为提取芦丁的原料。 槐花米系豆科植物Sophora japonica 的未开放花蕾，具有调节毛细血管渗透性之作用，临床用作毛细血管止血药，如复方芦丁，也作为高血压的辅助治疗药物。除此之外，还可作为制药原料，用于制造槲皮素（Quercetin）、羧乙基槲皮素、羧乙基芦丁、二羧丙基芦丁、β-乙基吗啡芦丁、6-而乙基氨基芦丁等。 槐花米中芦丁的含量高达12%~16%,另含少量皂苷。芦丁水解后得到槲皮素，皂苷水解后可得到白桦酯醇（Betulin）及槐花二醇（Sophoradiol）。 芦丁为淡黄色细小针状结晶，含三个结晶水，熔点177~178℃。；芦丁溶于热水（1:200），难容于冷水（1:8000）；溶于热甲醇（1:7），冷甲醇（1:100）；热乙醇（1:30），冷乙醇（1:300），难溶于乙酸乙酯、丙酮，不溶于苯、三氯甲烷、乙醚及石油醚等溶剂。易溶于碱液中呈黄色，酸化后又析出。 其结构如下图： 一、实验目的 1、通过芦丁的提取与精制掌握碱酸法提取黄酮类化合物的原理及操作。 2、通过芦丁的结构检识，了解苷类结构研究的一般程序和方法 二、实验原理 芦丁为浅黄色粉末或极细的针状结晶，含有三分子的结晶水。溶解度：冷水1:10000；热水1:200；冷乙醇1:650；热乙醇1:60；冷吡啶1:12。微溶于丙酮、乙酸乙酯，不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚，溶于碱而呈黄色。 芦丁为黄酮苷，分子中具有酚羟基，显酸性，可溶于稀碱液中，在酸液中沉淀析出，可利用此性质进行提取分离。利用芦丁易溶于热水、热乙醇，较难溶于冷水、冷乙醇的性质选择重结晶方法进行精制。三、实验器材 研钵，500mL烧杯，广泛试纸，四层纱布，滤纸，漏斗，10mL试管，5mL移液管，波棒，洗耳球，温控烘箱

生物制药工艺学思考题和答案解析

抗生素发酵生产工艺 1. 青霉素发酵工艺的建立对抗生素工业有何意义？ 青霉素是发现最早，最卓越的一种B-内酰胺类抗生素，它是抗生素工业的首要产品，青霉素是各种半合成抗生素的原料。青霉素的缺点是对酸不稳定，不能口服，排泄快，对革兰氏阴性菌无效。青霉素经过扩环后，形成头孢菌素母核，成为半合成头孢菌素的原料。2. 如何根据青霉素生产菌特性进行发酵过程控制？ 青霉素在深层培养条件下，经历7个不同的时期，每个时期有其菌体形态特性，在规定时间取样，通过显镜检查这些形态变化，用于工程控制。 第一期：分生孢子萌发，形成芽管，原生质未分化，具有小泡。 第二期：菌丝繁殖，原生质体具有嗜碱性，类脂肪小颗粒。 第三期：形成脂肪包含体，积累储蓄物，没有空洞，嗜碱性很强。 第四期：脂肪包含体形成小滴并减少，中小空泡，原生质体嗜碱性减弱，开始产生抗生素。 第五期：形成大空泡，有中性染色大颗粒，菌丝呈桶状。脂肪包含体消失，青霉素产量提高。 第六期：出现个别自溶细胞，细胞内无颗粒，仍然桶状，释放游离氨，pH上升。 第七期：菌丝完全自溶，仅有空细胞壁。一到四期为菌丝生长期，三期的菌体适宜为种子。 四到五期为生产期，生产能力最强，通过工艺措施，延长此期，获得高产。在第六期到来之前发束发酵。 3. 青霉素发酵工程的控制原理及其关键点是什么？ 控制原理：发酵过程需连续流加葡萄糖，硫酸铵以及前提物质苯乙酸盐，补糖率是最关键的控制指标，不同时期分段控制。在青霉素的生产中，及时调节各个因素减少对产量的影响，如培养基，补充碳源，氮源，无机盐流加控制，添加前体等；控制适宜的温度和ph，菌体浓度。最后要注意消沫，影响呼吸代谢。 4. 青霉素提炼工艺中采用了哪些单元操作？ 青霉素不稳定，发酵液预处理、提取和精制过程要条件温和、快速，防止降解。提炼工艺包括如下单元操作： ①预处理与过滤：在于浓缩青霉素，除去大部分杂质，改变发酵液的流变学特征，便于后续的分离纯化过程。 ②萃取：其原理是青霉素游离酸易溶于有机溶剂，而青霉素易溶于水。 ③脱色：萃取液中添加活性炭，除去色素，热源，过滤，除去活性炭。 ④结晶：青霉素钾盐在乙酸丁酯中溶解度很小，在乙酸丁酯萃取液中加入乙酸钾-乙醇溶液，青霉素钾盐可直接结晶析出。 氨基酸发酵工艺 1. 如何对谷氨酸发酵工艺过程进行调控？ 发酵过程流加铵盐、尿素、氨水等氮源，补充NH4+；生物素适量控制在2-5μg/L；pH 控制在中性或微碱性；供氧充足；磷酸盐适量。 2. 氨基酸生产菌有什么特性，为什么？ L-谷氨酸发酵微生物的优良菌株多在棒状杆菌属、小短杆菌属、节杆菌属和短杆菌属中。具有下述共同特性：①细胞形态为短杆至棒状；②无鞭毛，不运动；③不形成芽孢；④革兰氏阳性；⑤生物素缺陷型；⑥三羧酸循环、戊糖磷酸途径突变；⑦在通气培养条件下产生大量L-谷氨酸。 3. 生物素在谷氨酸发酵过程中的作用是什么？

生物制药工艺学题库

第一章生物药物概述 1、生物药物(biopharmaceuticals) 指运用生物学、医学、生物化学等的研究成果，从生物体、生物组织、细胞、体液或其代谢产物，综合利用化学、生物技术、分离纯化工程和药学等学科的原理和方法加工、制成的一类用于预防、治疗和诊断疾病的物质。 2、抗生素（antibiotics）： 抗生素是生物，包括微生物，植物和动物在内，在其生命活动过程中所产生的(或由其它方法获得的)，能在低微浓度下有选择地抑制或影响它种生物机能的化学物质”。 3、生化药品 从生物体分离纯化得到的一类结构上十分接近人体内的正常生理活性物质，具有调节人体生理功能，达到预防和治疗疾病的物质 4、生物制品（biological products） 是指用微生物（包括细菌、噬菌体、立克次体、病毒等）、微生物代谢产物、动物毒素、人或动物的血液或组织等直接加工制成，或用现代生物技术方法制成，作为预防、治疗、诊断特定传染病或其他有关疾病的免疫制剂。 5、基因工程药物 采用新的生物技术方法，利用细菌、酵母或哺乳动物细胞作为活性宿主，进行生产的作为治疗、诊断等用途的多肽和蛋白质类药物 6、生物药物分类 按生理功能和用途分类 （1）治疗药物：对疑难杂症如肿瘤、爱滋病、免疫性疾病、内分泌障碍等具有特殊的作用；（2）预防药物：对传染病的预防； （3）诊断药物：免疫诊断试剂、单克隆抗体诊断试剂、酶诊断试剂、放射性诊断药物和基因诊断药物等；某些生物活性物质亦是检测疾病的指标，如谷草转氨酶等； （4）其它生物医药用品：生物药物在其他方面应用也很广泛：如生化试剂、保健品、化妆品、食品、医用材料等。 按原料的来源分类 （1）人体组织来源的生物药物：主要有人血液制品类、人胎盘制品类、人尿制品类；（2）动物组织来源的生物药物：动物的脏器、其他小动物制得的药物如蛇毒、蜂毒等。（3）植物组织来源的生物药物：中草药、有效成分； （4）微生物来源的药物：抗生素、酶、氨基酸、维生素等； （5）海洋生物来源的药物； 7、生物药物的特性 （1）药理学特性 （2）在生产、制备中的特殊性 （3）检验上的特殊性 （4）剂型要求的特殊性 （5）保藏及运输的特殊性 第二章生物药物的质量管理与控制 1、生物药物质量检验的程序与方法 基本程序：取样、鉴别、检查、含量测定、写出检验报告 2、药物的ADME A: absorption，药物在生物体内的吸收； D: distribution, 药物在生物体内的分布； M: metabolism，药物在体内的代谢转化； E: excretion，药物及其代谢产物自体内的排除。 3、药物的三级质量标准 1. 国家药典：凡例、正文、附录三大部分； 2. 部颁药品标准：性质与药典相同，具有法律的约束力。收载《中国药典》未收载的，但常用的药品及制剂。 3. 地方药品标准：对药典以外的某地区常用的药品、制剂的规格和标准，常制定地区性的

中医药大学生物制药工艺试卷

山东***大学 专业 年级（ 科） 《生物制药工艺学》期末考试试卷（A 卷） 姓 名： 学 号： 班 级: 考试时间： 补（重）考：（否） 题号 一 二 三 四 五 六 七 八 总分 核分人 得分 －－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－ 说明：本试卷总计100分，全试卷共5页，完成答卷时间2小时。 －－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－ 一、填空题（本大题共10题，每题1分，共10分） 1．微生物的诱变育种常用的诱变剂有物理诱变剂、化学诱变剂和 。 2．工业生产中对大量培养基和发酵设备的灭菌，最有效最常用的方法是 。 3．微生物菌种的 是指利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理，通过 分离、筛选排除衰退型菌株，选择维持原有生产水平的菌株的过程。 4．在超临界流体萃取过程中，为提高溶解度小的物质的溶解能力，常加入 。 5．采用液氮超低温保藏法保藏菌种时，应将盛装菌种的安瓿管保藏在 ℃液 氮管中进行保存。 6．高分子聚合物沉淀法中应用最多的沉淀剂是 。 7．疏水相互作用色谱常用的分离载体为多聚糖和 。 8．较纯的固体一般有 和无定形沉淀两种状态。 9．抗生素包括天然抗生素、半合成抗生素和 。 10．需要通过工业发酵生产的维生素为 和 。 得分 阅卷人 （签全名）

二、单项选择题（本大题共10 题，每题1分，共10分） 1．采用冷冻干燥法保存菌种时常用的保护剂是（ ）。 A ．乙醇 B ．甘油 C.脱脂牛奶 D ．液体石蜡 E ．蛋白胨 2．蛋白质盐析常用的中性盐是（ ）。 A ．碳酸钙 B ．磷酸钠 C.氯化钠 D ．硫酸镁 E ．硫酸铵 3．采用有机溶剂沉淀法时，最重要的因素是（ ）。 A ．温度 B ．湿度 C.压力 D ．pH E ．金属离子 4．次级代谢产物的产生菌一般是（ ）。 A ．细菌 B ．放线菌 C.霉菌 D ．噬菌体 E ．真菌 5．利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法，称为（ ）。 A ．离子交换法 B ．等电点沉淀法 C.亲和色谱法 D ．双水相萃取法 E ．吸附法 6．聚电解质沉淀法中应用较多的沉淀剂为（ ）。 A ．聚乙二醇 B ．酸性多糖 C.EDTA D ．EDTA-Na E ．硫酸铅 7．下面属于β-内酰胺类抗生素的是（ ）。 A ．青霉素 B ．链霉素 C.红霉素 D ．土霉素 E ．金霉素 8．目前分辨率和选择性最好的凝胶过滤介质为（ ）。 A ．聚丙烯酰胺凝胶 B ．葡聚糖凝胶 C.琼脂糖凝胶 D ．聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶 E ．葡聚糖琼脂糖凝胶 9．结晶过程的推动力是（ ）。 A ．温度 B ．pH C.溶质溶度 D ．过饱和度 E ．时间 10．链霉素发酵生产的菌种为（ ）。 A ．产黄青霉菌 B ．灰色链霉菌 C.红色链霉菌 D ．金色链霉菌 E ．土壤细菌 三、多项选择题（本大题共10题，每题1分，共10分） 得分 阅卷人 （签全名） 得分 阅卷人 （签全名）

生物制药工艺学名词解释

生物制药工艺学名词解释： 第一章： 1.药品：一定剂型和规格的药物并赋予一定的形式（如包装），而且经过有关部门的批准，有明确的作用用途。 药物：能影响机体生理、生化和病理过程，用以预防、诊断、治疗疾病和计划生育的化学物质。 2.生物药物Biopharmaceuticals：以生物体、生物组织或其成份为原料综合应用生物学、物理化学与现代药学的原理与方法加工制成的药物。 3.生物活性Biologicalactivity,Bioactivity：对活组织如疫苗有影响的特性。 4.酶工程enzymeengineering：酶学与工程学互相渗透结合，发展形成的生物技术，它是从应用目的出发，研究酶和应用酶的特异催化功能，并通过工程化过程将相应原料转化成所需产物的技术。 5.固定化酶immobilizedenzyme：是指借助于物理和化学的方法把酶束缚在一定空间内并具有催化活性的酶制剂。 6.组合生物合成combinatorialbiosynthesis（组合生物学combinatorialbiology）：应用基因重组技术重新组合微生物药物的基因簇，产生一些非天然的化合物。 7.药物基因组学：一门研究个人的基因遗传如何影响身体对药物反应的科学。

8.凝聚作用coagulation：指在电解质作用下，胶粒粒子的扩散双电子层排斥电位降低，破坏了胶体系统的分散状态，使胶体粒子发生聚集的过程。 9.萃取extraction：将物质从基质中分离出来的过程。一般指有机溶剂将物质从水相转移到有机相的过程。 10.反萃取stripping/backextraction：将萃取液与反萃取剂相接触，使某种被萃入有机相的溶质转入水相的过程。 11.萃取因素/萃取比：萃取溶质进入萃取相的总量与该溶质在萃余相中总量之比。 12.分离因素separationfactor：在同一萃取体系内两种溶质在同样条件下分配系数的比值。 13.双相萃取技术two-aqueousphaseextraction：利用不同的高分子溶液相互混合可产两相或多相系统，静置平衡后，分成互不相溶的两个水相，利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法。 14.超临界流体萃取技术：利用处于临界压力和临界温度以上的一些溶剂流体所具有特异增加物质溶解能力来进行分离纯化的技术。 15.固相析出分离法solidphasecrystallization：通过改变溶液条件，使溶质以固体形式从溶液中分出的操作技术。 16.盐析法saltprecipitation：利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使目的

生物制药工艺学

生物制药工艺学：对生物药物进行研究、生产和制剂的一门综合学科。 生物制药是把生物体内的具有生物活性的基本物质，保持原来的结构和功能，又能在含多种物质的液相或固相中较高纯度的分离出来，它是一项严格，细致，复杂的工艺过程，涉及物化生工程等方面的知识和操作技术。 遗传与变异：是生命的基本特征，也是菌种选育的理论基础。 杂交育种：是指将两个基因型不同的菌株经吻合（或接合）使遗传物质重新结合，从只能分离和筛选出具有新性状菌株的过程。 原生质体融合：是指把两个亲株的原生质体混合在一起，在融合剂ＰＥＧ和Ｇａ离子的作用下，发生原生质体的融合，促使两亲本的遗传物质进行交换，从而实现遗传重组。 分批灭菌：将配置好的培养基输入发酵罐内，经过间接蒸汽预热，然后直接通入饱和蒸汽加热，使培养基和设备仪器灭菌，达到要求的温度和压力后维持一定时间，在冷却至发酵要求的温度，这一工艺过程称为。 连续灭菌：培养基在发酵罐外经过一套灭菌设备连续加热灭菌，冷却后送入已灭菌的发酵罐内，这种工艺称为。 萃取：液料与萃取剂接触后，液料中的溶质向萃取剂转移的过程。 超临界流体萃取技术是利用处于临界压力和临界温度以上的一些溶剂流体所具有特意增加物质溶解能力来进行分离纯化技术（温度３１.０６Ｃ，压力７３.９，密度０.４４８） 双水相萃取法又称水溶液两相分配技术，它是不同的高分子溶液相互混合产生两相或多项系统，利用物质在互不相容的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法。 吸附法：是利用适当的吸附剂，在一定Ｐｈ条件下，吸附生物样品中的生物药物，然后再以适当的洗脱剂将吸附的药物从吸附剂上解吸下来，达到浓缩和提纯的目的。 高分子聚合物沉淀法：某些水溶性非离子型高分子聚合物，如聚乙二醇等能使蛋白质水合作用减弱而发生沉淀。 过饱和溶液：溶液浓度等于溶解度时，该溶液称为饱和溶液。溶质只有在过饱和溶液中才有可能析出。 生物药物：是以生物体、生物组织、或其成分为原料（包括组织、器官、细胞器、细胞成分、代谢排泄物）综合应用生物学、物理化学与现代药学原理与方法加工制成的药物 现代生物技术药物：将生物体内生理活性物质的基因分离或人工合成，利用重组DNA技术加以改造，使其在细菌、酵母、动物细胞、转基因动物中间大量表达，通过这种方式获得的药物。 固体培养基：是加入一定量的凝固剂的培养基，适用于菌种的培养、分离、无菌试验、和菌种保藏工作。液体培养基是未加任何凝固剂的培养基 现代生物技术体系：主要的生物技术包括重组DNA技术、原生质体制备与原生质体融合技术、突变生物合成、组合生物合成、选择性生物催化合成、代谢途径工程、淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体、组织培养技术、基因治疗等。 微生物的初级代谢产物：包括氨基酸、蛋白质、核苷酸、核酸、酶类、糖类、脂类等 微生物的次级代谢产物：包括抗生素，色素，生物碱、酶的抑制剂、植物生长素等初级代谢：指的是与微生物的生长繁殖有密切关系的代谢活动，初级代谢产物指的是与微生物的生长繁殖有密切关系的代谢产物。 次级代谢：指的是与微生物的生长繁殖无关的代谢活动，次级代谢产物指的是与微生物的生长繁殖无关的代谢产物。 培养基：是人工配制的、供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的多种营养物质的混合物。 前体：在微生物药物的生物合成过程中，有些化合物能直接被微生物利用构成产物分子结构的一部分，而化合物本身的结构没有大的变化，这些物质称为前体。 生长因子：是微生物生长代谢必不可少，但不能用简单的碳源或氮源生物合成的一类特殊的营养物质。 促进剂：在发酵培养基中加入某些微量的化学物质，可促进目的代谢产物的合成，这些物质被称为促进剂。 抑制剂：在发酵过程中加入某些化学物质会抑制某些代谢途径的进行，同时会使另一代谢途径活跃，从而获得人们所需的某种代谢产物，或使正常代谢的中间产物积累起来，这种物质被称为抑制剂。 诱导物：一般是指一些特殊的小分子物质，在微生物发酵过程中添加这些小分子物质后，能够诱导代谢产物的生物合成，从而显著提高发酵产物的产量。 生理酸性物质：经微生物代谢作用后，能产生酸性物质的营养成分称为生理酸性物质。 生理碱性物质：经微生物代谢作用后，能产生碱性物质的营养成分称为生理碱性 物质。 速效碳源、迟效碳源：根据微生物利用碳 源速度的快慢可将碳源分为速效碳源和 迟效碳源。葡萄糖和蔗糖等被微生物利用 的速度较快，它们是速效碳源，而乳糖、 淀粉等被利用的速度相对较为缓慢，它们 是迟效碳源。 葡萄糖效应：在发酵过程中，如果葡萄糖 浓度过高会加快菌体的代谢，以致培养基 中的溶解氧不能满足菌体进行有氧呼吸 的需要，葡萄糖分解代谢就会进入不完全 氧化途径，一些酸性中间产物如丙酮酸、 乳酸、乙酸等积累在菌体或培养基中导致 Ｐｈ降低，影响某些酶的活性，从而抑制 微生物的生长和产物的合成，产生葡萄糖 效应。 生产种子的制备：指的是由保藏的菌种开 始，经过不断的扩大培养，使菌体数量达 到能满足发酵罐接种量的需要所涉及的 生产过程。 种子的制备：是将固体培养基上培养好的 孢子或菌体转入到液体培养基中培养，使 其繁殖成大量菌丝或菌体的过程。 诱变育种的基本过程：选择合适的出发菌 株→制备待处理的菌悬液→诱变处理→ 筛选→保藏和扩大试验 常用的诱变剂：1紫外线2亚硝基胍3硫 酸二乙酯4亚硝酸 杂交育种是将孢子（或摇瓶菌丝）接入的 体积较小的种子罐中，经培养后形成大量 的菌丝，该种子称为一级种子，把一级种 子转入到发酵罐内发酵称为二级发酵，如 果将一级种子接入到体积较大的种子罐 内，经过培养形成更多的菌丝体，这样制 备的种子称为二级种子，将二级种子转入 到发酵罐内发酵，称为三级发酵，同样道 理，使用三级种子的发酵称为四级发酵。 代谢曲线：根据发酵过程中代谢参数变化 绘制出的曲线，作用：可清楚的说明发酵 过程中的代谢变化，并反映出碳源，氮源 的利用和Ｐｈ、菌体浓度和产物浓度等参 数之间的相互关系。 为什么要绘制代谢曲线？分析研究代谢 曲线，有利于掌握发酵代谢变化的规律和 发现工艺控制中存在的问题，有助于改进 工艺，提高产物的产量。 膜分离法：又称为超滤法，包括微滤，超 滤和反渗透，是利用可截留一定分子量的 超滤膜进行溶质分离或浓缩。 渗透压冲击法：将细胞置于高渗溶液中 （例如一定浓度的蔗糖或甘油溶液中）， 由于渗透压的作用，细胞内的水分便向外 渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将 介质快速稀释或将细胞转入缓冲溶液中， 由于渗透压发生变化，胞外的水分迅速渗 入胞内，是细胞快速膨胀而破裂，使产物 释放到溶液中。 离子交换法：是应用合成的离子交换树脂 作为吸着剂，将溶液中的物质，依靠库伦 力吸着在树脂上，然后用合适的洗脱剂将 吸着物从树脂上洗脱下来，达到分离，浓 缩，提纯的目的。 离子交换树脂：是一种具有网状立体结构 的，含有活性基因而能与溶液中其他物质 进行交换或吸着的聚合物。 交换容量：是表征树脂活性基数量——交 换能力的重要参数，其表示方法有重量交 换容量交换容量体积法。 沉淀法：是利用某种沉淀剂或改变条件， 使所需提取的目的物在溶液中的溶解度 降低而形成无定形固体沉淀从而进行分 离的一种技术方法。 等电点沉淀法：利用大分子两性电解质在 等电点时溶解度最低的原理而建立的分 离法称为～ 凝胶层析（色谱）：是指以各种多孔凝胶 为固定相，利用流动相中所含各种组分的 相对分子质量不同而达到物质分离的一 种技术。 亲和层析（色谱法）：是利用生物大分子 与某些对应的专一特意识别和可逆结合 的特性而建立起来的一种分离生物大分 子的色谱方法。 重结晶：即将晶体用合适的溶剂溶解再次 结晶，能使纯度提高，因为杂质和结晶物 质不在同溶剂和不同温度下的溶解度不 同。 结晶：是制备纯物质的有效方法，溶液中 的溶质在一定条件下，因分子有规则的排 列而结合成晶体。 晶核：最先析出的微小颗粒是以后结晶的 中心，称为。 自然选育：是利用微生物在一定条件下产 生自发突变的原理，通过分离，筛选排除 衰退型菌株，从中选出维持或高于原有生 产水平菌株的过程。 诱变育种：是利用物理或化学诱变剂处理 均分散的微生物细胞群体，促使其突变率 大幅提高，然后采用简便，高效的筛选方 法，从中选出少数具有优良性状的突变菌 体。 孢子制备：一般采用琼脂斜面或其他固体 培养基，使菌种经过培养得以活化，并产 生数量足够，质量合格的孢子。 英汉互译：抗生素anti bioti cs 氨基酸 amino acid 维生素vitamin 多肽 polype ptide 蛋白质pr otein 蛋白质 的等电点isoelectric point pi 蛋白质的 变性denaturation 胸腺肽al thymosin al 人绒毛膜促性腺激素 human chorionic gonadotropin （HCG）生 物转化biotra nsformati on 基因工程 genetic engineering 基因工程药物 genetically engineered drug 简答： 生物制药的工艺过程？菌种→斜面培养 →种子制备→发酵→发酵液预处理→提 取→精制→成品检验→成品→包装 生物制药产品的类别包括哪些？举例说 明：（一）微生物发酵产物1.微生物菌体 药物：如，酵母菌体，单细胞蛋白，灵芝， 冬虫夏草，茯苓菌等2.微生物酶抑制：如 蛋白酶，淀粉酶，糖化酶，青霉素酰化酶 3.酶活性调节剂：包括酶激活剂和酶的抑 制剂，如血管紧张素转化酶抑制剂，胆固 醇合成酶抑制剂4.微生物代谢产物：如初 级代谢产物氨基酸，次级代谢产物抗生素 等（二）生物转化药物，如激素，维生素， 抗生素，生物碱（三）基因工程药物：如 人胰岛素，人生长因子，白介素，干扰素 （四）动植物细胞培养药物。 生物制药与中医药的关系：①中药鉴定、 识别假冒伪劣药材（DNA芯片技术）②发 现新中药品种③发酵液中提取中药（高效、 结构改善）④利用基因工程产生之植物此 生代谢产物（黄酮素，糖苷，生物碱等） ⑤利用转基因动物生产动物类药材（基因 芯片植入动物→表达→从分泌物（麝香） 或组织中（鹿茸）提取活性物质。 培养基的组成、分类方法、设计注意问题： 培养基成分主要包括碳源、氮源、磷源、 硫源、无机离子（包括微量元素）、生长 因子、前体、促进剂、抑制剂和水分。分 类方法：按培养基组成物质的来源，可分 为合成培养基和复合培养基（天然培养基） 按物理状态可分为固体培养基和液体培 养基及半固体培养基；按工业发酵中的用 途可分为孢子培养基、种子培养基、发酵 培养基和补料培养基。注意问题：①确定 培养基的基本组成②确定培养基成分的 基本配比和浓度（a碳源和氮源的配比和 浓度b生理酸性物质和生理碱性物质的 比例c无机盐浓度d其他培养基成分的浓 度）③具有经济性。 培养基筛选方法：①单因子实验法②正交 试验和均匀设计试验等数学方法。 影响培养基的因素：原材料质量、水质、 培养基的灭菌（一般在121度下灭菌20 到30分钟，含糖培养基112度灭菌15到 30分钟）和黏度 菌种保藏的目的、原理及方法：菌种保藏 的目的是尽可能保持菌种的存活率和优 良性能，保证菌种经过较长时间的保藏后 仍保持存活和生产能力。菌种保藏对于基 础研究和实际应用具有重要意义。 菌种保藏的原理：是根据微生物的生理特 性，人为地创造条件，使微生物处于代谢 不活跃，生长繁殖受抑制的休眠状态，以 减少菌种的变异。有利于微生物休眠的条 件是低温、干燥、缺氧和缺乏营养物质等。 菌种保藏的方法： 1）斜面保藏法，广泛应用于细菌、放线 菌、酵母菌等菌种的短期保存。为了长期 保持菌体存活，每间隔一定时间需重新移 植培养一次。 该方法的优点是简便易行，成本低，能随 时观察菌株是否死亡、变异、退化或染菌。 缺点是由于斜面含有营养和水分，菌种生 长和繁殖还没有完全停止，代谢活动尚能 微弱进行，因此存在自发突变的可能；短 期内多次传代易引起菌种发生变异和引 起退变，污染杂菌的机会也会随之增多。 2）液体石蜡保藏法：在无菌条件下，将 液体石蜡倾注或用无菌吸管移入生长成 熟、丰满的斜面菌种上，使液体石蜡高出 斜面顶端1cm左右，加塞并用固体石蜡封 口，将其直立放在试管架上低温保藏。 3）沙土管保藏法：孢子或芽孢，在干燥 环境中抵抗力强，不易死亡。干燥能使这 些微生物的代谢活动水平降低但不会死 亡，而处于休眠状态。保藏时间可达数年。 4）麸皮保藏法： 5）冷冻干燥法：目前较理想的保藏方法， 也是各类菌种保藏机构广泛采用的主要 保藏方法。最常用的保护剂是脱脂牛奶， 脱脂牛奶可由新鲜的牛奶制备。 6）液氮超低温保藏法：该法保藏菌种的 效果好，方法简单，保藏对象也最为广泛， 几乎所有微生物及动植物细胞等均可采 用该方法。该法的另一优点是可利用各种 培养形式的微生物进行保藏，不论使用孢 子或菌体、液体培养物或固体培养物均可 采用该法。因此被认为是当前最有效、最 可靠的一种长期保存菌种的方法之一。 7）甘油保藏法 8）孢子滤纸保藏法 菌种选育目的：①生产方面：a提高发酵 产量b改进菌种的性能c产生新的发酵产 物d去除多余的组分②科研方面：a了解 菌种遗传背景b提供分子遗传学研究材 料c获得带遗传标记的菌株d生物合成途 径的研究e生物合成机制的研究 发酵过程工艺参数有哪些？（1）物理参 数：①温度②压力③搅拌转速④搅拌功率 ⑤空气流量⑥表观粘度（2）化学参数： ①Ph②基质浓度a糖浓度的测定b氮浓度 的测定c磷酸盐含量的测定d产物浓度的 测定e溶解氧浓度的测定f废气中氧含量 g废气中二氧化碳含量（3）生物参数： ①菌体浓度②菌丝形态 微生物的发酵类型：（1）按投料方式分类： ①分批发酵②补料分批发酵③连续发酵 （2）按与氧的关系分类：①需氧发酵② 厌氧发酵（3）按发酵动力学参数的关系 分类：①生长偶连型②部分生长偶连型③ 非生长偶连型 细胞破碎的方法：一机械法：①液体裁切： 超声波，机械搅拌，压力②固体裁切：研 磨，压力。二非机械法：①干燥：空气干 燥，真空干燥，冷冻干燥，喷雾干燥②溶 胞：物理法，化学法，酶法。 沉淀法有哪些？盐析法；有机溶剂沉淀法； 等电点沉淀法；高分子聚合物沉淀法；聚 电解质沉淀法；不可逆的沉淀去除法 温度对发酵的影响：1温度影响酶的活性 2温度影响发酵液的物理性质3温度影响 代谢产物的合成方向；PH对发酵的影响 1PH影响酶的活性2PH影响基质或中间产 物的解离状态3PH影响发酵产物的稳定 性 育种方法：自然育种，诱变育种，杂交育 种，原生质体融合育种。 主要灭菌和除菌方式：高温灭菌：A1干 热灭菌2湿热灭菌B过滤灭菌C化学物质 消毒和灭菌D其他方式灭菌1辐射灭菌2 臭氧灭菌3静电除菌 生产种子的制备：两个阶段：实验室种子 制备和生产车间种子制备 消除泡沫的方法：机械消除和消沫剂消除 影响孢子质量的因素：培养基、培养温度、 温度、培养时间、冷藏时间、接种量 分离纯化的特点：培养液（或发酵液）中 所含欲分离的生物物质浓度很低；欲分离 的生物或新物质通常很不稳定；发酵或培 养都是分批操作、生物变异性大，各批发 酵液不尽相同，这要求分离有一定弹性， 发酵液的放罐时间、发酵过程中泡沫剂的 加入对分离都有影响；用作医药的生物产 物与人类生命息息相关 影响溶剂萃取的因素：①PH的影响2温 度与萃取时间的影响3盐析作用的影响4 溶剂种类、用量及萃取方式的选择 离子交换速度的影响因素：1颗粒大小2 交联度3温度4离子化合物5离子大小6 搅拌速度7溶液浓度 影响吸附过程的因素：1吸附剂的性质2 被吸附物的性质3溶剂的影响4溶液PH 值的影响5温度的影响6其他组分的影响 常用吸附剂按其化学结构可分为两大类： 一类是有机吸附剂，如活性炭、维生素、 大孔吸附树脂等。另一类是无机吸附，如 白土、氧化铝、硅胶、硅藻土等。 盐析法的影响因素：1盐的性质2PH值3 盐的饱和度4蛋白质浓度5温度 有机溶剂沉淀法的影响因素：1温度2PH 值3蛋白质浓度4无机盐离子的强度5金 属离子 膜分离机制:利用可截留一定分子量的超 滤膜进行溶质的分离或浓缩，小于截留值 的分子能通过膜，而大于截留值的分子不 能通过膜，因而达到分离。 凝胶色谱分离法的原理：凝胶色谱柱中， 当含有各组分的混合溶液流经凝胶层析 住时，各组分在层析柱内同时进行两种不 同的运动，一种是随着溶液流动而进行的 垂直直下的移动，另一种是不定向的分子 扩散运动（布朗运动）。大分子物质由于 分子直径较大，不能进入凝胶的微孔，只 能分布于凝胶颗粒的间隙中，已较快的速 度流过凝胶剂；较小的分子能进入凝胶的 微孔中，不断地进出于一个个颗粒的微孔 内外，这就使小分子物质向下移动的速度 比大分子的速度慢，从而使混合溶液中各 组分按照Mr由大到小的顺序先后流出层 析柱，大到分离的目的。 凝胶色谱分离法的特点：操作条件温和， 简单易行；分离Mr范围广；离效果一般 不受缓冲液组成的影响；进行一次操作后 无需再生处理就可进行下一次的分离 凝胶色谱分离法的应用：1盐脱2分级分 离3大分子物质的分子量测定 亲和色谱的操作：吸附、冲洗、洗脱、平 衡 饱和溶液形成的条件：蒸发法、冷却法、 化学反应结晶法、盐析结晶法、等电点法、 复合法、共沸蒸馏结晶法 影响晶体大小的因素：过饱和度、温度、 搅拌速度、晶种 改变晶体形状的方法：控制晶体生长速度、 过饱和度、结晶温度、选择不同的溶剂、 调节溶液的PH值和有目的的加入某种能 改变晶形的杂质 工业生产实例：1化学反应结晶2利用温 度差结晶3利用湿度差结晶4盐析结晶5 利用等电点结晶6盐析和冷却结晶7冷却 和化学反应并结晶8共沸蒸馏结晶9重结 晶 氨基酸的制备方法:1水解法a酸水解法b 碱水解法c酶水解法2微生物发酵法3化 学合成法4酶促合成法 氨基酸的分离方法：1基于溶解度或等电 点不同分离2加入特殊沉淀剂沉淀分离3 用离子交换剂分离4用电渗析法分离 维生素的发酵生产工艺路线：1斜面种子 培养2一级种子培养3二级种子培养4发 酵培养

《生物制药技术》实验指导-实验三、四

《生物制药技术》实验指导 实验三四环素、金霉素的薄层层析鉴定（验证型） 实验目的： 掌握薄层层析的原理，四环素族抗生素的定性鉴定方法。 实验原理： 层析（色谱，chromatograpby）是相当重要、且相当常见的一种技术，在把微细分散的固体或是附着于固体表面的液体作为固定相，把液体（与上述液体不相混合的）或气体作为移动相的系统中（根据移动相种类的不同，分为液相层析和气相层析二种），使试料混合物中的各成分边保持向两相分布的平衡状态边移动，利用各成分对固定相亲和力不同所引起的移动速度差，将它们彼此分离开的定性与定量分析方法，称为层析，亦称色谱法。用作固定相的有硅胶、活性炭、氧化铝、离子交换树脂、离子交换纤维等，或是在硅藻土和纤维素那样的无活性的载体上附着适当的液体。将作为固定相的微细粉末状物质装入细长形圆筒中进行的层析称为柱层析（column chromatography），在玻璃板上涂上一层薄而均的支持物（硅胶、纤维素和淀粉等）作为固定相的称为薄层层析（thin layer chromatography），或者用滤纸作为固定相的纸上层析。层析根据固定相与溶质（试料）间亲和力的差异分为吸附型、分配型、离子交换型层析等类型。但这并不是很严格的，有时常见到其中间类型。此外，近来也应用亲和层析，即将与基质类似的化合物（通常为共价键）结合到固定相上，再利用其特异的亲和性沉淀与其对应的特定的酶或蛋白质。 分配层析在支持物上形成部分互溶的两相系统。一般是水相和有机溶剂相。常用支持物是硅胶、纤维素和淀粉等亲水物质，这些物质能储留相当量的水。被分离物质在两相中都能溶解，但分配系数不同，展层时就会形成以不同速度向前移动的区带。一种溶质在两种互不混溶的溶剂系统中分配时，在一定温度下达到平衡后，溶质在固定相和流动相溶剂中的浓度之比为一常数，称为分配系数。当欲被分离的各种物质在固定相和流动相中的分配系数不同时，它们就能被分离开。分配系数大的移动快（阻力小）。 薄层层析是以薄层材料为支持物，在密闭容器中，样品在其上展开。当斑点不易为肉眼观察时，可利用适当的显色剂，或通过紫外灯下产生荧光的方法进行观察。通过这种展开操作，各成分呈斑点状移动到各自的位置上，再根据Rf值的测定进行鉴定。薄层色谱法具有分离与鉴定的双重功能，通过薄层图谱与对照品的图谱相比较，除了能鉴出有效成分或特征成分外，还以完整的色谱图作为一个整体对制剂加以鉴别。薄层色谱分析法由于简便、快速，能有效地、直观地反映药品地真实性、稳定性，现已成为药物制剂的鉴别和质量控制的行之有效的方法之一。薄层层析是鉴别抗生素的方法之一，层析后进行显色，并绘制层析图谱，根据层析图谱对抗生素进行鉴定。本实验以四环素、金霉素标准品溶液作为对照对发酵液进行鉴定。 材料、试剂和器材： 仪器和设备： 玻璃层析缸；层析板（薄层层析硅胶烟台芝罘区黄务硅胶开发实验厂有售）；吹风机；紫外投射仪；离心机（1.5ml转子） 试剂：

生物制药工艺处理学考试2013-12(A卷)

中国药科大学 生物制药工艺学 期末试卷A卷 2013-2014学年第一学期 专业班级学号姓名 题号一二三四总分 得分 核分人： 得分评卷人一、填空题（每空0.5分，共30分） 1、细胞破碎包括哪三大类方法、和。 2、萃取因素也称萃取比，其定义为被萃取溶质进入的总量与该溶质在 中总量之比。 3、晶体的质量主要是指晶体的大小、形状和纯度，其中影响晶体大小的主要因素有 ， ， ， 。 4、大孔网状聚合物吸附剂是在树脂聚合时加入 致孔剂，待网格骨架固化和链结构单元形成后，用溶剂萃取或蒸馏水洗将致孔剂去掉，形成不受外界环境条件影响的 ，其孔径远大于2～4nm，可达 ，故称“大孔”。 5、在作分级分离时，为了提高分辨率，多采用比样品体积大倍的柱体积， 的柱比，较吸液量、较粒的凝胶固定相。 6、写出下列离子交换剂类型：732 ，724 ，717 ，CM-C , DEAE-C ，PBE94 。 7、请写出下列药物英文的中文全称：IFN（Interferon）、 第1页（共8页）

IL(Interleukin) 、 CSF（Colony Stimulating Factor）、rhGH（Recombinant Human Growth Hormone）、Ins（Insulin）。 8、生物药物的分类：、、、 。 9、在生化制药工艺中干燥的方法主要包括：、 、。 10、疫苗制备时，可用 、 和 方法扩增病毒。 11、各向异性膜分为两层，一层是，厚度为0.1~1μm，决定了膜的 性质，另一层是，厚度约0.1mm，作用是。 12、制备型高效液相色谱的重要参数有、、 、。 13、密度梯度离心常用的介质有、 、。 14、用100μmol/L NADH使乳酸脱氢酶吸附在固定化丙酮酸类似物上，若NADH从洗脱液中去除，则脱氢酶被洗脱，这种洗脱方法称为。 15、生化药物的主要资源有 、 、 和 。 16、粘多糖是一类含有 和 的多糖。 17、铜绿假单胞菌(绿脓杆菌)脂质是 ，临床应用效果 ，原因是 。从发现年代上看,该物质 于青霉素被发现。 第2页（共8页）

生物制药工艺学

《生物制药工艺学》四年制本科课程教学大纲 一、课程基本信息 课程编号：0705060 课程名称：生物制药工艺学 英文名称：Bio-pharmaceuticals 课程性质：专业课 总学时：48学时（理论学时：36学时） 学分：2.5学分 适用专业：药学、药物制剂专业 预修课程：有机化学、药理学、生物化学、分子生物学 建议教材：《生物制药工艺学》（吴梧桐主编，中国医药出版社出版） 课程简介： 生物制药工艺学是药学专业的一门专业课,是从事各种生物药物的研究、生产、制剂的综合性应用技术科学。根据药学专业培养的目 标和要求,本课程的主要内容是介绍当前生物制药所需的基本理论和 技术,重点讨论各类生物药品的来源、结构、性质、用途、制造原理、工艺过程与生产方法。在教学过程中,旨在着重培养学生具备从事生 物药品研究、生产和开发的基本知识、基本理论和基本技能。通过本 课程的学习,应使学生达到以下要求: 1. 掌握生物制药所需的基本理论和技术

2. 掌握各类生物药品提取分离的基本原理和技能 3. 熟悉各类生物药品的来源、结构、性质、用途 4. 了解本学科的成就、新进展 本课程总教学时数为 48 学时,其中理论课教学为 36 学时,实验课教学为 12 学时。 大纲的使用说明:凡本大纲所列各章节项目中划有横线“”的,表示必需掌握熟识的重点内容.注明“*”的,一般课堂上不作讲授,供学生参阅或学有余力的自学提高,其余均为应当了解的理论和知识. 二、教学内容与要求 第一篇生物制药工艺基础 第一章生物药物概述 （一）目的要求： 掌握生物药物的含义及特点；熟悉生物药物的分类；了解生物药物研究范围，用途和研究趋势。 （二）学时安排：理论课：2学时 （三）教学内容 1、基本概念或关键词：生物制药；生物药物；特性；分类 2、主要教学内容： （1）概述生物制药的含义 （2）生物药物的研究范围。 （3）生物药物的特性、分类与用途 （4）生物制药的研究发展前景 第二章生物制药工艺技术基础 （一）目的要求： 掌握生物材料的来源，生物活性物质的提取方法及生化物质分离纯化的基本