细胞培养protocol(实操版完美)

Cell Culture Protocol

一、准备

1.配制培养所用的解剖液(PBS替代)、H(+)、H(-)

2.细胞培养多孔板：提前一天准备好，每孔加入一片玻璃片（实验需要时），24孔板每孔加入200uL的多聚赖氨酸，CO2培养箱，37℃包被2h，或过夜，3-5天存放都可以，多聚赖氨酸可回收。使用前，用无菌milliQ洗去多聚赖氨酸，加入细胞培养液Hik-BME，每孔930uL（24孔，每孔1mL的总体积，70uL细胞悬浮液），CO2培养箱，37℃，平衡

2-3h或过夜。

二、取材

1.把配好的解剖液、H(+)、H(-)经酒精消毒表面后放入生物安全柜，酒精消毒手套和操作台。

2.取两只小的细胞培养皿，一只1.5mL的离心管，在离心管中加入H(+) 1mL，在培养皿中各加入解剖液或PBS 2mL，带到取组织操作显微镜旁。

3.取两只大的玻璃培养皿装满冰，用于保持操作环境低温状态，一只放于显微镜下，一只放于旁边，用于解剖取组织，分别把两只小的细胞培养皿放到其上面。

4.取鼠，6-8天（小脑颗粒细胞），剪下小鼠脑部，剪开脑部外皮，从脑部前端剪开，用镊子撕开头骨，取出脑，放入小培养皿中，取出小脑，放于显微镜下。小脑是长条状。

5.在显微镜下，使用专用镊子，把小脑表面的膜撕去，除去小脑中的血管，正反两面，完成后，小脑是雪白的。注意操作环境的低温，尽量在少菌环境下操作。

6.把处理好的小脑放入H(+)的离心管中，可以两个一起放置。带到细胞房。取材过程在保证组织活性的情况下越快越好。

三、消化

1.取3只1.5mL的离心管，各加入H(+)，前2只加入1mL，第3只加入0.5mL。

2.清洗组织，把组织从1，2，3号离心管中逐次清洗，时间各1min，在3号管中，用灭菌过的直头剪刀，剪碎组织至1mm的片段。

3.放置，沉淀，去上清，加入H(-) 1mL，转至15mL离心管中。

4.放置，沉淀，去上清。

5.加入2-3mL的H(-)，用移液枪吹打数次，放置，沉淀，去上清；重复1-2次。

6.加入1mL的消化液，37℃水浴，2min，取出，摇匀，重复水浴，总共3次，每次2min，第三次摇匀后，水浴1min即可。

7.加入H(+) 2mL，终止反应。

8.用H（-）清洗2-3次，沉淀，去上清。

9.加入培养液2.5mL，用移液枪吹打，枪头使用1mL枪头套上200uL的枪头，30次，避免有气泡产生。

10.离心，5min，1000rbm，去上清。

11.加入培养液，24孔板是70uL/孔，即24*70=1.68mL，用步骤9的方法吹打30次。

12.分装到24孔板中，70uL/孔。

四、培养

1.放到37℃，CO2培养箱，培养4h后，更换培养液。

2.24h后，可以转染。

3.以后72h更换培养液，半量更换，即吸出500uL，加入500uL。

动物细胞培养基本操作

实验一动物细胞培养 细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织(或器官)取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养．使其不断地生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。 细胞培养的突出优点，一是便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的影响；二是细胞培养便于人们对细胞内结构(如细胞骨架等)、细胞生长及发育等过程的观察。因而细胞培养是探索和指示细胞生命活动规律的—种简便易行的实验技术，同时我们也不可忽略的另一个因素，那就是它脱离乐生物机体后的—些变化。 细胞培养技术目前已广泛地被应用于生物学的各个领域。如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿痛学及病毒学等 为此有必要使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，对原代细胞与传代细胞有一个基本概念。 本实验分两次进行．即清洗与消毒和传代细胞的培养与观察。 Ⅰ清洗与灭菌 一、实验目的 能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。 二、实验原理 清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。细胞养不好与清洗不彻底有很大关系。清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无油迹，而且不能残留任何物质。如有毒的化学物质，哪怕残留0．1个，也可能影响细胞生长。灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围。 三、实验材料、用品

细胞培养试剂及操作流程

实验规范化流程 一、细胞培养所需 1、10%FBS 1640培养液。 2、10%FBS DMEF/12培养液。 3、10%FBS DMEM/High Glucose 培养液。 4、PBS ：商品化的粉末，一袋溶于2L 去离子水中，高压后4℃保存。 5、胰酶 6、冻存液：10%DMSO 、>10%FBS ，其余成分为1640 7、真核抗生素： G418: 50mg/ml MDA-MB-231 800ug/ml MCF-7 800ug/ml SK-BR3 100ug/ml T47D 400ug/ml) 嘌呤霉素（Puromycin ）:10mg/mL 、 MCF-7 4ug/ml T47D 1ug/ml MDA-MB-231 5ug/ml 潮霉素（Hygromycin B ）:50mg/mL T47D 200ug/ml MDA-MB-231 800ug/ml MCF-7 50ug/ml 8、原核抗生素：双抗（抗青霉素、链霉素）（使用浓度：1%原液） 环丙沙星 左氧氟沙星（储存浓度5mg/ml ，使用浓度5ug/ml ） 9、细胞因子：IL-6、EGF （10ug/ml ） 10、抗肿瘤药物：阿霉素（储存浓度50Mm,使用浓度0.01mM ） 一、细胞培养相关技术 1、细胞复苏 准备：37℃水浴锅、培养液、15ml 离心管、滴管、培养瓶或培养皿试验流程： （1）将细胞从-80℃或液氮取出，遵”慢冻速溶“的原则，迅速在37℃下使其液化。 （2）将融化的细胞悬液加入适量新鲜培养液稀释吹匀，转移到15ml 离心管内。 （3）将离心管以1000rpm 转速离心5min 。 （4）小心弃去上清，最好用枪头除尽，加入新鲜的培养液6ml ，重选吹匀后转移到细胞培养瓶或培养皿，放入37℃、5%CO2细胞培养箱内培养。 2、细胞传代

细胞培养集锦(一个培养300多种细胞人的经验总结)

细胞培养集锦(一个培养300多种细胞人的经验总结) 一、消化与吹打 版上很多朋友讨论细胞培养问题，见到很多很好的经验总结，这里说一些我个人的经验，因为一些比较特殊的原因，我自己培养接触过近300种细胞，常用于做实验的，累积有百余种，可以说遇到过许多各式各样古怪的细胞。这里挑细胞消化开始做我的第一篇专题，并不是因为细胞消化最重要，而是近期看到大家频繁讨论这个话题，我就抛砖引玉，下面几点拙见，可能与其它朋友总结的一些经验有点出入，仅供大家参考。 许多同学对细胞消化做了许多研究，得出了很多有价值的经验，也见到很多人的困惑。其实细胞培养，尤其是细胞系的培养，就消化而言，不是太难，做得多了，善于总结经验，就能把细胞越养越好。一般的程序步骤，细节操作，我这里就不讲了，只讲一些基本操作背后的知识，如果不对之处，欢迎指正，一起讨论： 1，其实绝大部分细胞消化的时候是只要用胰酶润洗一遍即可，吸去胰酶后，残留的那些无法计算体积的附着在细胞表面的微量胰酶在37度一般不到2min足够消化细胞（绝大部分1min不到）。对于这些细胞原则上不要用胰酶孵育细胞，连续这样传代，对细胞伤害很大。简单的程序是PBS润洗吸去，胰酶润洗吸去，然后37度消化。 2，什么算是消化好了呢？不是细胞全部成间隔分布很离散的单个圆形才算消化好了，一般你肉眼观察贴壁细胞层，只要能移动了，多半呈沙壮移动，其实已经可以了，很多人喜欢把细胞消化或者吹打成完全分离细胞，这是没有必要的。一般能移动了，说明细胞与培养基质材料的附着已经消失了，细胞之间的附着也已经消失了，细胞已经独立分布了（虽然没有呈现很广的离散分布）。这个时候应该停止消化，不要等到看到镜下所有细胞都分离得非常好，间隙很大，才停止。细胞就是完全成单个细胞悬液，之后在贴壁的过程中仍然会聚集，这个是贴壁培养

细胞培养基础知识详解-细胞的复苏、传代和冻存

细胞培养基础知识详解 细胞的复苏、传代和冻存实验操作指导 整理：江耀伦李美娣 1 细胞复苏 细胞复苏的原则－快速融化：必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。 1.1实验前准备 （1）将水浴锅预热至37℃ （2）用75％酒精擦拭紫外线照射30min的生物安全柜内部台面。 （3）在生物安全柜中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。 1.2 细胞复苏培养 （1）根据细胞冻存记录取出需要复苏的细胞。 （2）迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。 （3）约1-2 min后冻存管内液体完全溶解，取出放入离心机中以1000 rpm/min速度离心3~5 min。 （4）用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入生物安全柜内。吸弃上清液，向离心管内加入1 mL培养液，吹打制成细胞悬液。 （5）将细胞悬液分装入培养瓶或者培养皿内，将培养瓶/培养皿放入37℃，5％ CO2的培养箱内过夜后换液继续培养，换液的时间由细胞情况而定。 1.3 初学者易犯错误 （1）水浴锅未预热或者未预热到37℃。 （2）水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。 （3）离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。 （4）一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。 1.4 细胞传代 1.4.1 传代前准备 （1）预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶

子放入37℃水浴锅内预热。 （2）用75％酒精擦拭经过紫外线照射的生物安全柜内台面和双手。 （3）正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。 1.4.2 细胞传代 （1）取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入生物安全柜内。 （2）从培养箱内取出细胞：注意培养瓶取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。 （3）将培养瓶放入生物安全柜后打开瓶口，同时用酒精棉擦拭瓶口消毒。 （4）加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。 （5）显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。 （6）弃去胰蛋白酶液，加入新鲜的培养液终止反应。小心吹打成细胞悬液。 （7）将细胞悬液吸入10 mL离心管中。平衡后将离心管放入离心机中，以1000 rpm/min离心5 min。 （8）弃去上清液，加入适当体积的培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。 （9）将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。 （10）显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要时计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/mL。最后要做好标记。 （11）继续培养：用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养，传代细胞2-4 h后开始贴附在瓶壁上。 1.4.3 注意事项 （1）严格的无菌操作 （2）适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，

Ca法转染-制备慢病毒和感染细胞protocol(完整版)

2×HBS (ul)配方：8g NaCl ，0.14g Na2HPO4?2H2O 或0.2g Na2HPO4?7H2O ，6.5g HEPS ，调节pH 值7.0， 最终溶于500ml 双蒸水中,4℃保存。 2MCacl 2配方：87.6g Cacl 2·6H 2O 溶于200ml 双蒸水中，用0.22μm 滤器过滤除 菌，4℃保存，不可冻牢凝固。 ^^^Day 1 1、在转染前24小时，在10cm dish 中（面积约为78.5cm 2）中铺3.6 x106 293T 细胞，于9ml DMEM （hyclone 高糖）+10%FBS+PS ，待次日细胞汇合度达到70%。 ^^^Day 2 2、早上10：00转染，此时转染前无需换液。 浓度过高，混合均匀。 4、将混合好的复合物RT 5min ，加入到细胞培养液中。 5、晚上5：00换液，将培养液换成新鲜的6ml DMEM+10%FBS+PS 。 ^^^Day 3 6、观察24h 荧光。 ^^^Day 4 7、早上10：00观察48h 荧光，此时可以收集病毒，也可以到下午3：00-4：00再收集病毒(高压离心管和EP 管)。 Ooo 感染细胞 ^^^Day 1 1、感染细胞前，消化目的细胞，此时培养液用1640+10FBS+PS\DMEM +10%FBS+PS ，铺种在6孔板中，1 x105 cell/well ，使感染前细胞汇合到20-30%，37℃，5%CO2孵箱过夜。

在蛋白质测序中也有一定作用。具有可高温高压灭菌特性。用双蒸水配制，－20℃储存，注意分装，反复冻融三次以上将大大降低效果) 3、将细胞放入37℃，5%CO2孵箱，4-5h后换液2Ml 1640\DMEM +10%FBS+PS。过夜。 ^^^Day 3 4、早上换2ml新鲜的1640\DMEM +10%FBS+PS。 ^^^Day 4 5、晚上观察48h荧光率。（由于慢病毒表达过程比较慢，到48h才能观察到荧光）开始药筛。 6、药筛：用嘌呤霉素（puro） Puro:储存浓度：10mg\ml(－20度保存)，使用浓度：2ug\ml。 7、药筛48h后观察48h荧光率，之后可以用2ug\ml维持培养一周后改用1ug\ml puro的培养基培养。

细胞培养技术个人总结

总结---细胞培养 一．基本理论概论 原代培养: 也叫初代培养，指直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养。 传代培养：将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶即称为传代或传代培养。 细胞系：原代培养物成功传代后，则称之为细胞系。(如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系。) 细胞株：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物称为细胞株。 培养类型：细胞培养，组织培养，器官培养。 细胞生长的方式：贴附生长，悬浮生长 培养细胞的形态（形态不一定，环境改变形态可能改变）：成纤维性型细胞，上皮型细胞（单层膜样生长），游走性细胞（游散生长，常有伪足跟突起） 二．培养过程及要点（切记无菌操作） （一）工作环境的处理 1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 % 酒精擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % 酒精擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。 2. 实验用品以70 %酒精擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。 3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。吸管口切勿碰到容器瓶口 4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒 感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。 5. 定期检测下列项目： CO2 钢瓶之CO2 压力。CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300 小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。 6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。 （二）试验用玻璃塑料用品清洗及其消毒灭菌 清洗： （1）玻璃器皿的清洗（酸液由重铬酸钾，浓硫酸，蒸馏水配置） 浸泡—刷洗—浸酸—冲洗 （2）胶塞的清洗 刚买回的常含滑石粉等杂质，先用自来水冲洗后再按常规方法处理。2%NaoH或洗衣粉煮沸10-20分钟---1%稀Hcl浸泡30分钟或蒸馏水冲洗后再煮沸10-20分钟—晾干备用 （3）塑料制品的清洗 2%NaoH浸泡过夜—自来水冲洗--5%稀Hcl浸泡30分钟—自来水和蒸馏水冲干备用。

细胞培养基本操作技能

细胞培养基本操作技能 无菌操作基本技术 1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。 2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70 % ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。 3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。 4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。 5. 定期检测下列项目： 5.1. CO2 钢瓶之CO2 压力 5.2. CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。 5.3. 无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300 小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。 6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。 实验用品 1. 种类︰ 1.1. 细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器与pasteur pipet 外，其它均为塑料无菌制品。 1.2. TC 级培养盘表面均有coating 高分子物质以让细胞吸附，培养容器种类有Tflask, plates, dishes, roller bottle 等，依实验需要使用。 1.3. plastic sterile pipet: 1 ml, 2 ml,5 ml, 10 ml, 25 ml 1.4. 塑料离心管: 15 ml, 50 ml，均有2 种不同材质，其中polypropylene (PP) 为不透 明材质，polystyrene (PS) 为透明材质，可依实验需要而选择适合材质之离心管。 1.5. glass pastuer pipet: 9 inch，用以抽掉废弃培养液等。 1.6. 玻璃血清瓶(Pyrex or Duran glassware)：100 ml, 250 ml,500 ml,1000 ml 2. 清洗︰ 2.1. 新购玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡数小时，洗净后才开始使用。 2.2. 用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗干净，勿加清洁剂清洗。 3. 灭菌︰ 3.1. 实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌121 oC, 15 lb, 20 分钟，置于

细胞培养基本实验操作一般培养试剂介绍常用培养基及基本特性 HBSS的配制和使用攻略

常用培养基及基本特性 1、RPMI-1640 Medium RPMI-1640广泛应用于哺乳动物、特殊造血细胞、正常或恶性增生的白细胞，杂交瘤细胞的培养，是目前应用十分广泛的培养基。主要用于悬浮细胞培养。其它像K-562、HL-60、Jurkat、Daudi、IM-9等成淋巴细胞、T细胞淋巴瘤细胞以及HCT-15上皮细胞等均可参考使用。 2、Minimum Essential Medium（MEM） 也称最低必需培养基，它仅含有12种必需氨基酸、谷氨酰胺和8种维生素。成分简单，可广泛适应各种已建成细胞系和不同地方的哺乳动物细胞类型的培养。MEM-Alpha一般用于培养一些难培养细胞类型，而其它没有特殊之处的细胞株则几乎均可采用MEM来培养。 3、DMEM-高糖（标准型）是一种应用十分广泛的培养基，可用于许多哺乳动物细胞培养,更适合高密度悬浮细胞培养。适用于附着性较差，但又不希望它脱离原来生长点的克隆培养，也可用于杂交瘤中骨髓瘤细胞和DNA转染的转化细胞的培养。 4、DMEM-低糖（标准型）是一种应用十分广泛的培养基，可用于许多哺乳动物细胞培养。低糖适于依赖性贴壁细胞培养，特别适用于生长速度快、附着性较差的肿瘤细胞培养。 5、DMEM/F12 DMEM/F12培养基适于克隆密度的培养。F12培养基成分复杂，含有多种微量元素，和DMEM以1：1结合，称为DMEM/F12培养基（DME/F12medium），作为开发无血清配方的基础，以利用F12含有较丰富的成分和DMEM含有较高浓度的营养成分为优点。该培养基适用于血清含量较低条件下哺乳动物细胞培养。为了增强该培养基的缓冲能力，改良之一是在DMEM/F12（1：1）中加入15mM HEPES缓冲液。 6、McCoy’s 5A McCoy’s 5A Medium 主要为肉瘤细胞的培养所设计，可支持多种（如骨髓、皮肤、肺和脾脏等）的原代移植物的生长，除适于一般的原代细胞培养外，主要用于作组织活检培养、一些淋巴细胞培养以及一些难培养细胞的生长支持。例如Jensen大鼠肉瘤成纤维细胞、人淋巴细胞、HT-29、BHL-100等上皮细胞。 7、Iscove’s Modified Dulbecco Medium (IMDM) Guilber 和Iscove将Dulbecco’Medium 改良为Iscove’s Medium，用于培养红细胞和巨噬细胞前体。此种培养液含有硒、额外的氨基酸和维生素、丙酮酸钠和HEPES。并用硝酸钾取代了硝酸铁。IMDM还能够促进小鼠B淋巴细胞，LPS刺激的B细胞，骨髓造血细胞，T细胞和淋巴瘤细胞的生长。IMDM为营养非常丰富的培养液，因此可以用于高密度细胞的快速增殖培养。 8、M-199 Medium

细胞培养基本操作

细胞复苏是将休眠的细胞重新活化，使之重新生长，进入细胞周期，进而分裂产生子细 胞的过程。细胞复苏后，可进入细胞周期，重新获得细胞类型特异的生物学功能。 一、实验前准备 实验开始前，水浴箱调节至36度恒温。取细胞完全培养基，放于水浴箱中预热。 消毒双手和超净台。取约1ml 细胞完全培养基放于15ml 离心管中。 水浴箱调节至40度恒温，由液氮中取出冻存的细胞，迅速将冻存管投入到已经预热到40度的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，注意管口处高于水面，以免进入导致污染。整个解冻过程最好在1分钟以内，以防融化过程中产生大量冰晶损伤细胞，约1min后冻存管内液体完全溶解，用酒精喷拭冻存管的外壁，立即拿入超净台内。 注：解冻到0度时（即冻存管里还有最后一点冰）立刻转移到含培养基的离心管中。然后用5ml的热培养基以0.5ml的加入量逐步将细胞内的DMSO渗透出来，之后补全生于的培养基到细胞瓶中。 二、制备细胞悬液 吸取细胞冻存液，置于已放入细胞完全培养基的离心管中，吸取1ml培养液加入冻存管，将剩余细胞全部吸入离心管中。上下吹打5次，使冻存液与完全培养基充分混匀，尽量减少冻存液中DMSO 的浓度，减轻细胞损伤。 离心：1000rpm，室温离心3min。 注：细胞复苏后最好等几分钟再离心，因为冻存前加了胰酶消化，对细胞造成一定损伤，复苏后立即离心对细胞造成损伤较大。 三、细胞培养 离心后，倒掉上清液，缓慢操作，不要倒掉底部的细胞沉淀。向离心管内的细胞沉淀加入1ml 细胞完全培养基，反复吹打制成细胞悬液。培养瓶内加入4ml 完全培养基，细胞悬液加入培养瓶内，左右前后轻轻摇动培养瓶，把细胞摇均匀，将培养瓶放入37℃，5％CO2 的培养箱中培养。24-48 小时后换液或传代继续培养，换液传代的时间由细胞情况而定。 四、注意事项 1、解冻速度要快 在常温下，冻存液中的DMSO 对细胞的毒副作较大，因此，必须在一到两分钟内使冻 存液完全融化。如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤。 2、一次复苏细胞不宜过多 细胞在解冻时，需要迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。并且一次复苏细胞过多，容易忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。 3、培养瓶上注明细胞类型，日期，人名。

大鼠神经干细胞分离培养鉴定标准化protocol

大鼠神经干细胞分离培养鉴定标准化protocol 一、大鼠神经干细胞分离和传代步骤 手术前准备 1. 水浴锅温度调至37°C。 2.组织解离液置95%O2 5%CO2 培养箱中10min。 3. 用95%乙醇消毒解剖区。 4. 用消毒溶液消毒解剖器械（戊二醛，后用无菌dH2O 冲洗，浸泡在95%乙醇中）。 5.在3 个60 ×15 mm 皿中各加3ml 的组织解离液。提示：除无菌显微解剖器材外，还要三套消毒器械，分别用于剥离皮肤、颅骨和脑，减少用手污染的机会。消毒过的解剖器械可以浸泡在无菌组织剥离液中，以避免乙醇接触组织。 分离脑组织 6.新生SD大鼠(出生48h内)直接断头。 7.剃去头顶的毛发。 8.用浸泡过聚维酮碘消毒的纱布擦洗头部并且去除松散的毛发。 9.用泡过95％乙醇消毒纱布擦洗头部。 10.用手术刀片延中线全长切开头皮。 11.掀开皮肤显现出头盖骨。 12.从双耳后切开头皮暴露头盖骨侧面。 13.用小剪刀在两边切开头盖骨（打开头盖骨上部，避免损伤脑组织）。 14.用镊子掀开头盖骨。注意：不能用表面有乙醇的解剖工具接触脑组织。乙醇能使组织固定。 15.用弯镊在脑底部滑动以切断连接脑底部的脊髓、血管和颅神经。提示：用弯镊时轻微

向下用力抵住脑下面的颅底。来回滑动松动脑组织。 16.取脑组织，D-Hanks液充分漂洗后. 17.用同一个弯镊将脑移到盛有解离液的60mm 皿中。 18.剥离大脑表面的脑膜，冲洗干净，把脑放入第二个盛有解离液的60mm 皿中。提示：在解剖显微镜下很容易剥离脑膜。 19.解剖镜下，沿中线切开大脑，精细镊分离海马。 20.将分离组织放置于第三个盛有解离液的60mm 皿中。 21.用10 号弯头手术刀将组织切成小块（约1 mm3） 分散脑组织 22.将盛有小块组织的培养皿移到超净台，然后用移液管将组织块移到5ml 的圆底聚丙烯管中。 23.250g 离心1min。 24.弃上清，加入酶混合液（1ml）。 25.将试管水浴至少40min，每隔20 分钟用移液管适当吹打。 26. 250g 离心5min，弃上清。 27.加入4ml 蛋白酶抑制剂。 28.用移液管吹打10 次以分散沉淀，注意尽量别产生气泡。 29. 水浴10min。 30. 500g 离心5min，弃上清。 31.用0.5ml SFM 重悬细胞，充分吹打以产生单细胞悬液。提示：建议用火焰钝化的小抢头制备单细胞悬液。 接种细胞

BHK细胞培养小结

BHK细胞培养小结 报告人： 1、细胞培养 （1）培养基：DMEM培养基+10%无支原体新生牛血清+100U/ml青/链霉素 （2）细胞传代：细胞长满瓶壁90%-95%时，将上清倒掉，用D-Hanks液洗2-3遍细胞，加1ml0.25%胰酶37℃温箱消化3-5分钟后，加入3ml培养基将细胞吹下来，转移至15ml离心管，1000转离心5分钟，倒掉上清，加入3ml新鲜培养基重悬细胞，将细胞吹打均匀后按1：2或1：3的比例接种于新的培养瓶中，加入5ml新鲜培养基，放入培养箱培养。 2、细胞冻存及复苏 （1）细胞冻存液：90%无支原体新生牛血清+10%DMSO （2）细胞冻存方法：细胞长满瓶壁90%后，细胞消化离心，弃上清，加入配制好的冻存培养液（含10%DMSO），重悬细胞，或者用细胞计数板计数细胞浓度，将细胞浓度调至106个/ml，将细胞转移至冻存管，每管1ml，用棉花包住冻存管放入-80℃冰箱，2天后将冻存管放入液氮冻存。 （3）细胞复苏：先准备一支15ml离心管，加入5-8ml新鲜培养基，再从液氮取出细胞后立刻放入37-40℃水浴，在1min内融化，然后将细胞转移至装有培养基的离心管，1000转离心5分钟，倒掉上清，加入2ml新鲜培养基重悬，再转移到1个新的培养瓶中，加入4ml新鲜培养基放入培养箱培养，1天后细胞贴壁，换液。 3、注意事项 （1）如果细胞生长太慢可选用含20%无支原体血清的DMEM培养基培养，可加快细胞生长； （2）细胞传代时必须先离心后再重悬，如果不离心直接吹打后传代细胞不能吹打成单个细胞悬液，传代细胞成堆生长，影响细胞状态； （3）细胞传代时不能传得太稀，如果传代时细胞浓度太低的细胞生长速度会很慢，而且细胞容易成堆生长； （4）胰酶在使用前最好预热到37度。由于胰酶平时保存在4度，反复预热对胰酶的活性不好，可以将胰酶进行分装，尽可能避免胰酶反复冷却加热； （5）BHK还是比较好消化的，2-3min应该足够了，消化时间太长对细胞不利。可以在显微镜下观察消化情况，必要时可以拍打培养瓶帮助细胞分散，消化结束后直接加入培养基即可，胰酶会被血清灭活； （6）细胞冻存时要选细胞状态好的细胞冻存，否则细胞不容易复苏。

细胞培养操作步骤

培养基的配置：基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml 冻存液的配置：DMSO18ml+胎牛血清2ml。 依次比例酌量配置。 超净工作台常规配置 移液器1套（2.5μl、20μl、200μl、1ml），酒精灯1盏，液器1台，斜架1台，酒精喷壶1个，酒精棉球缸1个，污缸1个， 常规耗材：培养瓶（50㎝2），定量移液管（5ml、10ml），枪头（1ml、200μl、10μl），培养皿，6/24/48/96孔板，医用脱脂棉球，保种管 所需试剂：gibco高糖培养基，胎牛血清，双抗，DMSO，胰酶，苯扎溴氨，75%酒精…… 实验前准备： 所需的各项高压后的耗材放于超净工作台内，用酒精喷壶喷洒实验台面，并关闭工作台打开紫外灯照射30min后开始实验操作。 首次传代前细胞的复苏，首先用一大烧杯盛满37℃的温水放于液氮罐旁边，待细胞株取出后留上端1/3于37℃水面上尽最大速摇动管使其在2min内迅速融化。若种管顶部含有冻存的细胞液在摇动期间用力甩动使其降于管底后再摇动。这一过程可在超净工作台外操作。 实验步骤 一、原代细胞的培养 1.紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作 者的双手。 2.将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶 口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。 3.取1个高压后的新培养瓶，瓶口在酒精灯上消毒2-3次，旋开后分别再次消 毒瓶口和瓶盖2-3次分别放于酒精灯两侧，把保种管在超净台外用酒精棉球擦拭下2/3后拿进超净台内在酒精灯上消毒保种管口2-3次放于台面左手边，取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取保种管内的细胞液，悬空移入培养瓶内。 4.拿出1支高压后的5ml定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于电动移液器 上，再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3次，悬空进入培养基瓶内吸取4ml培养基再悬空移入培养瓶内，将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒2-3次后拧紧平放，在瓶身做好实验标记。 5.将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出 实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。 6.将培养瓶放于28℃,5%CO2的培养箱内培养，旋开瓶口少许。注意整个培养箱 底托盘内一定要放高压后的水，且定期更换确保无菌。 在CO2培养箱内培养10-12h，瓶盖拧紧后拿出培养箱，置于荧光倒置显微镜下观察细胞贴壁情况，及细胞形态。最后更换培养液。 二、培养液的更换

动物细胞培养常用方法

一.细胞增殖周期（cell proliferatinal cycle）概念 细胞周期是描述细胞增殖和分化交替发生变化的概念。而细胞增殖周期主要是从细胞增殖角度赋予细胞活动的概念，两者不应混为一谈。细胞增殖周期是指细胞从一次分裂结束开始生长，到下一次分裂结束所经历的过程。根据细胞增殖周期不同时期的生化特点，划分为四个连续的时期，即G 1 期（DNA合成前期），S 期（DNA合成期），G 2期（DNA合成后期），M期（有丝分裂期）。如以G 1 期为起点， 那么细胞增殖周期的各时期应循着G 1-S-G 2 -M的顺序进行，G 1 、S、G 2 三期合称为 细胞间期，此期完成细胞生长过程。M期完成遗传物质的分配。 因此，细胞增殖周期=间期（G 1期+S期+G 2 期）+分裂期（M期）。 二.培养细胞生命期（life span of culture cells） 很多细胞特别是正常细胞，在体外的生存不是无限的，而是具有一个生命期。索维培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。培养细胞的生命期与细胞的种类、性状和原供体的年龄、健康等情况有关。人胚二倍体成纤维细胞，在不冻存和反复传代条件下，科传30~50代，相当于150~300个细胞增殖周期，能维持1年左右的生存时间，最后衰老凋亡。如供体为成体或衰老个体，则生存时间较短；其他细胞如肝细胞或肾细胞，生存时间更短，仅能传几代或十几代。只有当细胞发生遗传性改变，如获永生性或恶性转化时，细胞的生存期才可能发生改变。正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞生命的全过程中，大致都经历以下三个阶段：原代培养期、传代期、衰退期。 三.培养细胞一代生存期 培养细胞的生存空间和营养是有限的，当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代（Passage或Subculture）。每次传代以后，细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞的数量和细胞增殖的速度

免疫荧光protocol

细胞免疫荧光步骤 1.在24孔板里加500微升培养基，放爬片，接种细胞（做实验以30-50%汇合度较好。10000-30000左右 2.给药处理24h。 3.PBS洗三遍。 4. 4％冷的多聚甲醛固定15分钟，PBS洗三遍，每次5min，摇床。（避光） 5.0.5％Triton X－100（PBS配）破膜15min，PBS洗三遍，每次5min，摇床。 6.5%BSA（牛血清白蛋白，PBS配）封闭60分钟,不用洗。 7.加一抗孵育（5%BSA配），4℃摇床过夜。 8. 收集一抗，PBS洗三遍，每次5min，摇床。孵育二抗Alexa Fluor 488（1:1000 ）,室温60min（避光） 9.回收二抗，PBS洗三遍，摇床，每次5min。 10.0.5ug/mLDAPI（5%BSA配，2滴/ml）染核15min。（避光） 11. PBS洗三遍，每次5min，摇床。 12.取载玻片，滴加10uL抗荧光衰减封片剂，将爬片有细胞面盖在封片剂上，指甲油封片子的对角线。 All steps usually at RT. 1)Remove culture medium and fix cells (a common fixative is 4% formaldehyde in PBS, for 15 minutes) 2)Wash well in PBS (3 x 5 minutes is typical) 3)Permeabilize the cells (a common permeabilization reagent is 0.2% Triton X-100 in PBS for 30 minutes) 4)Wash well in PBS 5)(optional: Block for non-specific dye binding using the Image-iT FX Image Enhancer Solution, I36933) 6)Block for non-specific antibody binding 30-60 minutes (a common blocking solution would be 3-6% bovine serum albumin / 5% normal goat serum / PBS, or commercial blocking reagents like our BlockAid, product B10710)

细胞培养总结

细胞培养学习总结 --贴壁细胞培养技术 一、细胞培养一般流程： ㈠、复苏： 1、实验前做好相关准备工作（水浴锅37℃；超净工作台的无菌环境；准备 好实验相关仪器和试剂）。 2、把冻存管从液氮灌中取出来，立即投入37℃（≦40℃）水浴锅中，晃动 冻存管，使液体在1min以内全部融解（关键步骤），用酒精棉擦拭其外壁，放到超净工作台里。 3、把上述细胞悬液吸到15ml的离心管中，加入适量培养基，(用培养基把 冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来，转移时不要直接倒，以防污染)，1000转离心1-3min（可根据所培养细胞调整）。 4、吸弃上清液，加适量培养基把细胞吹散成细胞悬液，转移到培养瓶中， 加适量完全培养基（常为覆盖培养瓶底面即可）。 5、标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到CO2培养箱中培养，细胞贴 壁后再换培养基。 6、注意观察细胞生长状态，及时换液或传代。 ㈡、换液： 1、实验前做好相关准备工作（超净工作台的无菌环境；准备好实验相关仪 器和试剂）。 2、取出培养瓶，用75%酒精消毒后放入超净实验台。 3、吸弃旧培养液，用适量（如2ml）PBS（磷酸盐缓冲液）清洗细胞（可根 据细胞状态洗1-2遍，一般从没有细胞的那一侧倒掉）。 4、加入适量新鲜完全培养基，放回培养箱继续培养。 ㈢、传代：

1、实验前做好相关准备工作（超净工作台的无菌环境；准备好实验相关仪 器和试剂）。 2、取出培养瓶，用75%酒精消毒后放入超净实验台。 3、吸弃旧培养液，用适量（如2ml）PBS（磷酸盐缓冲液）清洗细胞（可根 据细胞状态洗1-2遍）。（前面步骤同换液） 4、加适当的胰蛋白酶（0.05%）(能覆盖细胞就行)，放入细胞培养箱中消化 1-2min（根据不同类型细胞而定）。 5、细胞都变圆后加如入等体积的完全培养基终止消化。 6、用滴管缓慢吹打细胞，使细胞都悬浮起来成细胞悬液，吸到15ml的离心 管中，1000转离心1-3min。 7、倒掉上清液，加1-2ml完全培养基，将细胞吹散成单个细胞。 8、根据细胞浓度把细胞传到几个培养瓶中，加入适量完全培养基（一般癌 细胞一个培养瓶分2个），放回培养箱中继续培养。 ㈣、冻存： 1、实验前做好相关准备工作（预先配置好冻存液放入4℃保存，常为 10%DMSO+90%血清，配制过程中加入DMSO要缓慢，且边滴边摇；超净工作台的无菌环境；准备好实验相关仪器和试剂）。 2、取出培养瓶，用75%酒精消毒后放入超净实验台。 3、吸弃旧培养液，用适量（如2ml）PBS（磷酸盐缓冲液）清洗细胞（可根 据细胞状态洗1-2遍）。 4、加适当的胰蛋白酶（0.05%）(能覆盖细胞就行)，放入细胞培养箱中消化 1-2min（根据不同类型细胞而定）。 5、细胞都变圆后加入等体积的完全培养基终止消化。 6、用滴管缓慢吹打细胞，把细胞都悬浮起来成细胞悬液，吸到15ml的离心 管中，1000转离心1-3min。（同细胞传代中步骤） 7、倒掉上清液，加入预制的冻存液制成细胞悬液，分装到灭菌的冻存管中， （注意不要加满，预留其结冰后的空间，一般1.8ml的冻存管加入≦1.5ml 的细胞悬液）。

分子克隆及细胞培养基本实验方法

分子克隆及细胞培养基本实验方法 1.载体构建实用操作技术 1.1菌种的保存—20%甘油菌 2体积菌液与1体积70%的甘油混合后，储存于-20℃或-70℃备用。（甘油菌中甘油的浓度为20-30%均可） 1.2甘油菌复苏、培养 方法一、挑取甘油菌一环，接种在含100ug/ml Amp的LB固体培养基上（活化菌种），37℃培养过夜（约16小时）；挑取一个菌落转接在含100ug/ml Amp 的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 方法二、直接吸取10~20ul甘油菌，接种在含100ug/ml Amp的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 1.3小规模制备质粒DNA（QIA miniprep kit ） 适于从1~5ml 菌液中制备20ug高拷贝质粒 ⑴收集菌液，离心1000rpm，１分，弃上清 ⑵以250ul P1重悬细菌（P1中已加RNase） ⑶加入250ul P2，颠倒4~6次轻混，约2~3分（轻混以免剪切基因组DNA，并免 长时间消化） ⑷加入350ul N3，迅速颠倒4~6次轻混；离心10分，13 000rpm ⑸上清入QIAprep柱，离心30~60秒，滤液弃之 ⑹加入0.5ml PB洗，离心30~60秒 ⑺加入0.75ml PE洗，离心30~60秒，弃滤液，再离心1分 ⑻换新管，加入50ul EB，静置1分（EB 37℃预热），离心1分。 1.4酶切反应 ⑴体系构成（反应体系尽可能小！） pGEM3ZF-huCTLA4-Ig（ul）pAdTrack-CMV（ul）

①dd.H2O 17 17 ②10×NEbuff 2 3 3 ③10×BSA 3 3 ④底物DNA 5 5 ⑤内切酶HindⅢ 1 1 XbaⅠ 1 1 Total : 30 ul 30ul ⑵37℃水浴1~2小时，必要时延长酶切时间至12小时 ⑶酶切2小时后，取5-10ul 电泳观察酶解是否完全 ⑷65℃灭活内切酶 ⑸-20℃保存备用 1.5回收目的片段（QIAquick Gel extraction Protocol） ⑴胶，尽可能去除多余的胶，称重； ⑵加入适量buff QG（300ul QG /100mg胶）；>2%的胶，应加大QG用量（600ul QG /100mg）； ⑶水浴50℃，10min，每2-3min混匀一次，使胶完全溶解！必要时延长水浴时间， 胶完全溶解后混合物颜色应为黄色，与buff QG 相似； ⑷当DNA片段在<500bp或>4kb时，应加入异戊醇100ul/100mg胶，以提高产物 量。此步不离心。DNA片段在500bp~4kb时，加入异戊醇并不能提高产量； ⑸结合：将混合物转入QIAquick柱，离心13000rpm，1min；（柱容量800ul/次）； ⑹洗：0.75ml buff PE，离心13000rpm，1min；（DNA用于盐敏感操作时，如平 端连接、直接测序，加入PE后静置2-5min）；弃离心液，再离心13000rpm， 1min，以去除剩余的乙醇； ⑺将QIAquick柱置于一清洁的1.5ml Ep管，加入30~50ul buff EB或H2O （滴 于QIAquick 膜上！），静置1min，离心15000rpm，1min； ⑻-20℃保存备用。 1.6连接反应

细胞培养常见问题及其解决

细胞培养常见问题及其解决 1. 如何选用特殊细胞系培养基？ 培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始，其中美国MP Biomedicals公司提供了最全的培养基系列，例如BME DMEM F10/F12 MEM RPMI1640（液态/粉末）。 2. 何时须更换培养基？ 视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。 3. 可否使用与原先培养条件不同之培养基？ 不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。 4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？ 不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。 5 何谓FBS, FCS, CS, HS ? FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思，两者都是指胎牛血清，FCS 乃错误的使用字眼，请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。 6 培养细胞时应使用5 % 或10% CO2？或根本没有影响？ 一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统，而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时，细胞培养时应使用10 % CO2；当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时，则应使用5 % CO2 培养细胞。 7.Hank's 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？Hank's 平衡盐溶液(HBS)和Earle's平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别？ HBS和EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles 液，。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。MP Biomedicals 公司具有众多的平衡液，