基因工程名词解释
★基因工程概念（狭义）是在分子生物学和分子遗传学等学科综合发展的基础上，于上世纪70年代诞生的一门崭新的生物技术科学。应用基因工程技术完全打破生物界物种的界限，在体外对大分子DNA进行剪切、加工、重组后引入细胞中表达，使其具有新的遗传特性，从而定向改造生物。广义：指DNA重组技术的产业化设计与应用，包括上下游技术。上游技术指外源基因重组、克隆和表达载体构建；下游技术则涉及含有重组外源基因的生物细胞的大规模培养以及外源基因表达产物的分离、纯化过程。
★基因: 是一个含有特定遗传信息的核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。基因特点：基因是实体：DNA或RNA（如烟草花叶病毒）；基因是具有一定遗传效应的DNA分子中特定的核苷酸序列；基因是遗传信息传递和性状分化发育的依据；基因是可分的，根据其编码产物的功能，可分为编码蛋白质基因、tRNA和rRNA，以及不转录却有特定功能的DNA区段（如启动子、操作子基因等）。
★两个实验：首先用肺炎双球菌实验证明基因的化学本质DNA分子的是美国著名微生物学家O.T. Avery于1944年发表；1952美国冷泉港喀内基遗传学实验室的A.D.Hershey用35S和32P分别标记噬菌体外壳蛋白质与DNA，感染大肠杆菌，证明了Avery的结论。
★顺反子：在现代的遗传学文献中，顺反子和基因这两个术语是相互通用的，一般说来，一个顺反子就是一个基因，大约含有1500个核苷酸对，是由一群突变单位和重组单位组成的线性结构。因此，基因不是最小单位，它仍然是可分的；并非所有的DNA序列都是编码基因，而只有其中某一特定的多核苷酸区段才是基因的编码区。
★基因家族是真核生物基因组中来源相同，结构相似，功能相关的一组基因。★假基因：具有与功能基因相似的核苷酸序列，但由于有许多突变以致失去了原有的功能，所以是没有功能的基因，常以ψ表示。现已在大多数真核生物中发现了假基因。
★基因工程诞生：核酸限制性内切酶：1972年H. Y. Boyer发现EcoRI位点GAATTC。DNA连接酶：1970年H. G. Khorana发现T4ligase;
启动子：是一段供RNA聚合酶定位的DNA序列，通常位于基因上游，长度一般不超过200bp。
★启动子特点：序列特异性：组成型启动子的DNA序列中，一般约20bp是相对保守的，碱基变化影响转录速度；方向特异性；位置特异性：启动子与转录起始位点间的距离相对固定；种属特异性。
★启动子类型：组成型、诱导型、组织特异型。
★原核生物启动子组成---①Sextama盒：-35区，RNA聚合酶σ亚基识别位点②Pribow盒：-10区，RNA聚合酶结合位点，DNA解旋，转录开始③转★录起始位点多为CAT，以中间碱基为转录起始位点④间隔区：长度与二盒间互作程度相关。
★真核基因启动子。I型启动子：位于起始位点-50-30bp区，主要合成pre-rRNA;
II型启动子：编码蛋白质，结构复杂；III型启动子：合成5sRNA和tRNA 的启动子位于起始位点50-88bp区，属内源启动子；合成snRNA的启动子位于起始位点上游；
★操纵子基本组成。结构基因: 如糖代谢、转运蛋白等的编码基因。调节基因: 编码以控制其它基因表达RNA 或蛋白质产物的基因，分为正、负两类。操纵基因: 接受来自调节基因合成的调节蛋白的作用，使结构基因得以抑制的DNA区段，也称控制单元
★操纵子的调控模型。操纵子由启动子、操纵基因和它的结构基因共同组成一个基因的复合单位，是转录调控的基本单元。其调控是通过RNA聚合酶、启动子、调节蛋白和效应物相互作用实现的。
★根据调节蛋白来分：负控制系统：调节蛋白(阻遏蛋白)因子出现，关闭操纵子(相对安全，宁多勿缺) 正控制系统: 有调节蛋白(诱导子)因子，操纵子开放。
★根据小分子物质反应来分：可诱导型操纵子：小分子物质(诱导物)出现，操纵子关闭→开放.可阻遏型操纵子：小分子物质(阻遏物)出现，操纵子开放→关闭
★调节子：一种调节蛋白可控制一个至几个操纵子的调节系统；
★顺式作用元件：即与调控蛋白结合的特异DNA序列。它们不合成RNA或蛋白质，直接对基因表达产生调控作用，与结构基因位于DNA分子或同一染色体上，如启动子、增强子、沉默子。
★刺激子：对同一环境刺激因子反应的操纵子群。
★反式作用因子：由特定的DNA序列编码的蛋白质或RNA，通过与启动子序列结合以及转录起始复合物相互作用，以间接方式调控基因的表达，如普遍性转录因子、转录激活因子。
★转录因子：结合到特异的顺势作用元件上的反势作用蛋白。转录因子包含2个结构域：识别和结合顺势作用元件目标位点结构域；组织其他参予转录激活的附加蛋白的结构域。有些转录因子必须和其他蛋白质相互作用，形成转录起始复合体(transcription initiation complex)在结合到启动子上。
★基因的反义控制：主要用于基因表达功能的研究以及基因定位和表达量的监测，为肿瘤病、病毒性疾病等的预防和治疗提供了重要的武器。反义RNA 与引物RNA互补，抑制DNA复制；反义RNA与mRNA互补，阻止RNA 翻译，促进RNA降解。
★真核生物基因表达调控模式：真核生物基因表达调控可分为DNA水平，转录后水平、转录后RNA的加工水平和翻译水平等多个层次。1.细胞分化是基因表达调控的结果，并不涉及遗传物质的丧失。2.一些基因受到发育程序的严格控制，并且只在特定的组织或器官中有活性；3. 一些基因环境控制，只在某种特定的环境条件下才有活性。4. 基因中的顺势作用元件帮助协调基因表达；5.转录因子和启动子元件相互作用促进转录。
★感受应答调控模式的基本原理两种方式。构成基因的重复结构：不同类型的细胞有选择地表达重复基因的特定拷贝，将拷贝置于细胞特异性表达调控网络中。
★感受应答模型(Britten-Davidson模型)：是真核生物基因表达调控的基本特征。形成单一拷贝基因的复合控制，参与真核基因表达调控的转录调控。蛋白因子经内源或外源信号分子诱导激活后，特异性地与单拷贝基因的上游顺式调控元件结合，从而以某种方式大幅度提高转录启动频率。★RNA聚合酶II复合体结构。各种通用的转录因子必须顺序结合到基因的启动子上，形成RNA聚合酶II复合体才可以启动转录。
★调节基因：远离结构基因。受信号分子调控，编码产物为转录调控因子。★应答元件：一个或多个，在启动子和增强子上游，与具有活性的转录调控因子识别并结合。
★感受位点：在调节基因上游，一个或多个，负责接受细胞内信号分子的信息传递。
★酶：是细胞产生的，具有催化能力的生物催化剂。酶分为6类：氧化还原酶类、转移酶类、水解酶类、裂合酶类、异构酶类和连接酶类。
★核酸水解酶通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核苷酸链发生水解断裂的蛋白酶。
★RNAase：专门水解断裂RNA分子的叫核糖核酸酶；DNAase：特异性水解断裂DNA分子的为脱氧核糖核酸酶；
★Exonuclease：核酸外切酶，从核酸分子的末端开始，逐个水解核酸分子，降解多核苷酸链；
★Endonuclease：核酸内切酶，从核酸内部切割磷酸二酯键，使多核苷酸链断裂为小片段。
★核酸限制性内切酶：是一类能够识别DNA双链分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。主要从原核生物中分离纯化。发现两种：核酸内切酶，甲基转移酶。
★核酸内切酶：破坏外源DNA，使之迅速降解；
★甲基转移酶：保护自身DNA不受限制。
★核酸限制性内切酶的命名法如E co R I四部分分别代表：属名第一个字母。种名头两个字母。菌株;同一寄主菌株不同R/M体系。划线为寄主物种名。
★II型核酸内切酶的基本特征（3个）：1.有特异的DNA识别序列：连续—GATC，不连续—GANTC ；2.识别序列一般为4-8bp的回文序列，富含GC：PstI 5’-CTGCAG-3’，3’-GACGAG-5’；3.识别序列中碱基被甲基化修饰后，会影响部分酶的切割作用。
★核酸内切酶的切割方式。II型酶切割序列大多位于识别序列中，就其切割位置产生的末端，可分为3类：5’-黏端、平端和3’-黏端。
★根据其识别位点和切割方式之间的关系，可分为4类：1.识别序列不同，切割方式不同；2.识别序列不同，产生黏端相同，称作同尾酶，如BamHI、BclI、Sau3A和XhoI产生均GATC黏端，它们产生的黏端通过互补可形成杂种位点.3.识别序列相同，切割方式不同，如SmaI、XbaI CCCGGG .4.识别序列相同，切割方式相同，称为同裂酶，如BamHI和BglII、HpaII和MspI
★影响核酸内切酶活性的因素。DNA纯度与结构；DNA甲基化程度；反应温度；反应缓冲液；反应体积和甘油浓度
★DNA聚合酶：将脱氧核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3’- OH 末端，催化核苷酸的聚合。
★依赖于RNA的DNA聚合酶：也称为RNA指导的DNA聚合酶或反转录酶。已从许多RNA肿瘤病毒中分离，目前最常用的是来源于鸟类骨髓细胞瘤病毒(avian myeloblastosis virus, AMV)的反转录酶。主要用于DNA互补链的合成。DNA连接酶(ligase):催化2条链3’-OH和5’-P之间形成磷酸二酯键。能封闭nick，而非gap；反应温度：37℃为最佳温度，26℃反应4小时，4℃过夜；连接方式：黏性末端DNA片段的连接；
★DNA连接酶(ligase):催化2条链3’-OH和5’-P之间形成磷酸二酯键。分子内连接方式。
★平末端DNA片段的连接—同聚物加尾法：采用末端脱氧核苷酸转移酶，不需要模板，在反应体系中加入一种脱氧核苷酸，即可在3’-OH形成poly(dN)尾巴。衔接物(linker)连接法：采用化学合成法合成一段由10-12个核苷酸组成，具有一个或数个酶切位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。双衔接物(linker)连接法：DNA片段两端分别连接含有不同酶切位点的接头。适用于量少片段，具有基因定向插入、防止自连和方便以后的克隆操作等优点。★DNA接头连接法：DNA片段自身含有与接头相同的酶切位点的。）
★碱性磷酸酶：去除DNA、RNA、NTP、dNTP的5’-P，可防止片段自身环化，常用的有细菌碱性磷酸酶BAP与小牛肠碱性磷酸酶CIAP。（去磷酸化）★末端脱氧核苷酸转移酶：1.同聚物加尾。2.DNA测序时，在DNA末端加如同位素标记的双脱氧核苷酸进行DNA片段3’-末端标记，并终止链的延伸。
（不依赖模板）。
★S1核酸酶：底物ssDNA ，ssRNA，用途—去除黏端产生平端、打开发夹结构。
★核酸杂交原理：带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混在一起，相应的同源区段将会退火形成双链结构。1，Southern blotting（DNA+DNA）2，Northern blotting（RNA+DNA）3，Eastern blotting( 蛋白质)
4，斑点(dot)印迹杂交和狭线(slot)印迹杂交5，菌落或噬菌斑杂交6，原位杂交7，DNA芯片杂交
★细菌转化：一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株DNA，而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。供体菌株：提供转化DNA的菌株.受体菌株：接受转化DNA的菌株
★大肠杆菌的转化原理：正在生长的大肠杆菌在0℃加入到低渗CaCl2溶液中，细胞膨胀形成原生质球，同转化混合物DNA形成一种粘在细胞表面对DNAase抗性的复合物。42℃热刺激期间，复合物被细胞吸收。在富营养培养基中生长一段时间使抗生素抗性基因表达后，再涂布到选择培养基中筛选转化子。
★Sanger双脱氧链终止法原理:DNA聚合酶以ssDNA为模版，合成互补链；以2’，3’-ddNTP为底物，加到3’末端，从而终止链的生长。
★Maxam-Gilbert化学修饰法原理：用化学试剂处理DNA末端具有放射性标记DNA片段，造成碱基特异性切割，由此产生一组具有各种不同长度DNA链反应化混合物，经电泳大小分离和放射自显影后，可根据X-光片显示相应谱带，直接读序即可。
★DNA测序的自动化（分析与读片）原理：基于Sanger双脱氧链终止法，用4种不同的荧光染料分别标记不同的双脱氧核苷酸碱基，通过毛细管进行电泳，然后通过激光激发荧光，进行测序。程序：待测序DNA+测序引物+dNTP+Bigdye标记的dNTP-PCR-产物纯化-上样测序寡核酸的生物合成:用klenow大片段，以ssDNA为模板，加入dNTP条件下合成。用于合成特定序列的寡核苷酸探针。
★寡核苷酸化学合成的实际用途: 1.合成基因：在了解蛋白质序列的前提下进行，如人生长激素、干扰素、胰岛素等。2.合成探针：用于筛库、基因芯片。
3.合成引物：PCR、分子标记。
4.合成衔接物和接头。
★基因扩增包括：1.在体外应用PCR技术，迅速大量扩增特定基因；2.通过体外重组，将目的基因插入高拷贝质粒，并转入相应细胞，从而目的基因随质粒拷贝数的增多而扩增；3.外界因子的胁迫下导致真核生物细胞保卫基因明显扩增；4.真核生物在特定发育阶段进行程序性基因扩增；5.在生物进化过程中发生基因的加倍和扩增，产生基因簇(clusters).
★PCR引物：引物1即Waston与正义链；引物2即Click与反义链即模版链。
★PCR技术的特点。指导特定DNA序列的合成。特定DNA序列迅速大量扩增；30个循环，理论上可达109，实际106-107
★PCR产物克隆方法。平端连接：由于Taq酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，能在DNA分子3’段额外加A。因此可采用：T-vector；补平或切平，在采用平端连接法。
★黏端连接：设计引物时加上酶切位点：引物中部或5’端定点突变，设计酶切位点；5’端加长3-4bp，以利于内切酶与PCR产物稳定结合。
★RT-PCR与RNA分析。原理：假设反映产物量同反应其始模版量成正比。因此根据琼脂糖凝胶电泳中样品条带强度比较，即可确定PCR产物及模版间的数量关系。作用：用于mRNA定量分析，较northern杂交而言，灵敏度高，所需mRNA量少，可进行低丰度的mRNA分析。可以分析不同组织、相同组织不同发育阶段某基因的表达活性，用于研究低表达活性基因mRNA 生理变化动态。
★生物学标记：形态学标记：表型。细胞学标记：核型，带型，染色体变异★同工酶即催化同一反应但具有不同分子形式的酶
★DNA分子标记：利用DNA水平上的多态性进行，实质是特定DNA序列，可用于构建遗传图谱；基因定位、生物进化、分类研究。标记基于自然变异。★RFLP ：即限制性片段长度多态性。原理：限制性内切酶的特异性酶切位点，长度不一DNA片段。同源序列杂交（即探针，来自随机基因组和cDNA 克隆）。
★DNA指纹：对于特定DNA/限制性内切酶组所产生的片段特异性。
★RAPD ：即随机扩增多态。原理：10bp随机引物进行PCR扩增。流程：DNA-PCR扩增-电泳-分析。
★AFLP：即扩增片段长度多态。原理：AFLP和RAPD技术结合
★SSR：即简单重复序列，又称微卫星(microsatellite DNA)，是一类由几个核苷酸（1-6个）为重复单位基因簇集而成的长达几十个串联重复序列。原理：SSR重复次数不同，DNA片段长度不同根据侧翼保守序列设计特异性引物。引物来源：1.从数据库或有关文章查询2.使用近缘物种的引物3.构建核基因组文库，筛选SSR 4.试剂盒。流程：设计引物--PCR--电泳--分析。作用：1.构建遗传图谱2.致病基因诊断3.法医鉴定
★DNA分子标记优点：标记基于自然变异；不依赖于基因表达；不依赖于基因互作；不受表型效应影响；不受环境、生理因素、组织器官和发育阶段影响。根据目的分为：研究基因编码区的氨基酸序列或在原核系统中表达的真核基因—cDNA.研究目的基因表达调控有关序列或mRNA中没有的序列—DNA。★基因组DNA的片段化。双酶消化：如HaeIII + AluI。单酶局部消化：Sau3A 机械切割：超声波、高速搅拌
★基因工程常用载体。克隆载体: 主要用于克隆基因，可实现基因插入、扩增与保存；表达载体:主要用于基因表达研究，实现基因插入、表达；共整合载体:用于基因插入基因组。质粒载体：在细菌中能独立于染色体外进行自我复制的双链环状DNA分子。
（近来研究发现也可为链状、有些甚至是RNA 分子。）特点：分子量尽可能小（转化效率高）；具有复制起点（使质粒在体外复制）；高拷贝（便于扩增）；标记基因（区分转化子，非转化子；筛选重组子，非重组子）；多克隆位点MCS（便于基因插入）。
★标记基因: 新陈代谢特性, 如LacZ, 在IPTG诱导下表达β-半乳糖苷酶，催化X-gal形成一种蓝色化合物。
★重要的大肠杆菌载体。pSC101（9.09kb）：第一个成功用于克隆真核DNA 的大肠杆菌质粒载体。pBR322质粒载体：分子量小，4363bp；可克隆6kb 以内DNA片段；具有两个选择标记；拷贝数高，可达1000-3000。pUC系列质粒载体：分子量更小，2686bp；更高拷贝数；具有MCS；适于组织化学法检测重组体。
★穿梭质粒载体: 一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可在两种不同寄主细胞（真核和原核）中存活和复制的质粒载体。
★柯斯质粒载体(cosmid):是一类由人工构建的含有λ－DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体；特点：噬菌体特性，可侵染细菌；质粒特性，在寄主细胞中复制；常具抗性基因；高容量克隆能力(30kb 与同源序列的质粒可重组． ★YAC载体(酵母人工染色体)：将酵母人工染色体的复制与分离所需序列与大片段目的DNA连接而成，可大于1M, 如pYAC3。 成分：ARS（复制序列）；CRS（着丝粒）；TEL（端粒） ★表达载体:启动子；终止子；ORF；RBS ★基因文库: 某一生物类型全部基因的集合。 ★cDNA文库：研究基因编码区的氨基酸序列或在原核系统中表达的真核基因 ★基因组文库：当需了解基因的结构和一个基因编码序列以及顺势作用元件时，需构建基因组文库。理想的基因组文库应具备：克隆数不宜过大；载体装载量必须大于绝大多数基因的长度；含有相邻DNA片段的克隆间必须具有重叠序列；克隆片段易于从载体上卸下；重组克隆能稳定保存，扩增和筛选．★目的基因分离与克隆：DNA水平；RNA水平；氨基酸水平。1，DNA水平--目的基因同源克隆: 利用GenBank查找感兴趣基因，根据保守序列设计引物，通过PCR即可获得目标片段；利用基因芯片技术；利用消减文库；利用插入突变技术；利用图位克隆技术；利用酵母双杂交系统（基本原理：许多真核基因的转录激活因子(transcriptional activitor)由两个结构可以分开、功能上相互独立的结构域(domain)组成：N端DNA-BD：识别其效应基因的上游激活序列UAS，并结合；C端DAN-BD：与其它成分结合，启动UAS下游基因表达。2，RNA水平--利用DDRT-PCR。3，氨基酸水平（氨基酸序列分析）。 ★功能蛋白组技术：双向电泳由第一向等电聚焦(IEF)电泳和第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)组成，第一向使等电点不同的蛋白得到分离，第二向使分子量不同的蛋白得到分离，两向结合便得到高分辨率的蛋白图谱。 ★cDNA文库的构建流程。纯化mRNA流程；cDNA第一链和第二链的合成； 目的基因克隆到载体并转化。 ★RNaseH法：能获得包括mRNA5’端全部的或者绝大部分的长序列cDNA 分子 ★质粒文库：便于重组子鉴定、文库扩增、保存和改造，但克隆效率低，是噬菌体的1/10至1/50． ★λ噬菌体文库：克隆效率高，达107clones/μg cDNA，但重组子鉴定和筛选较为麻烦． ★噬菌粒载体：集以上两者之优，YAC和BAC文库。 ★基因组文库步骤：制备DNA片段；克隆载体；转化。作用：构建基因文库不但使生物的遗传信息以稳定的重组体形式贮存起来，更重要的是它是分离和克隆目的基因的主要途径。 ★染色体步行用于克隆位于目的基因外侧的未知序列。利用反向PCR则可进行染色体步行，但距离较短。 ★筛选文库克隆全长基因方法DNA探针筛选；用抗体筛选目的cDNA（表达文库）；功能结合法。 ★大肠杆菌表达体系优点：基础生物学、遗传学、分子生物学以及基因表达调控了解深刻；安全的基因工程实验体系；具有不同的菌株和载体；实验证明许多真核基因可在大肠杆菌中表达；培养方便、操作简单、成本低、易于工业化生产。 ★大肠杆菌表达体系缺点：真核基因结构差异；转录信号差异；mRNA分子结构差异；真核生物蛋白质一般需翻译后修饰；细菌的蛋白酶往往会降解真核蛋白质． ★启动子:强启动子,外源蛋白占10-30%以上;低限的基础转录水平;诱导型启动子。 ★转录终止子：采用强终止子，对于一些终止作用较弱的终止子，常采用二聚体终止子的特殊结构。 ★RBS:mRNA的翻译启示效率主要由其5’端的结构序列所决定，称为核糖 体结合位点，主要由4部分组成。SD序列：5‘UAAGGAGG3‘，位于起始密码子6-8bp，与核糖体16RsRNA的碱基3’AUUCCUCC5‘互补；起始密码子：AUG>GUG>UUG ；SD与起始密码子的距离及碱基组成：6-8bp，７bp时最高；AAAA or UUUU>CCCC>GGGG；基因编码区5’序列：尽量避免与RBS 互补．转录增强子:T4噬菌体基因10的前导序列大肠杆菌atpE基因的mRNA分子5’-UTR端富含U的区段转译终止子：常采用安装3个终止密码子,大肠杆菌偏爱UAAU. ★常用的大肠杆菌表达载体。LacZ启动子的表达载体在诱导物乳糖或IPTG 诱导下,启动表达。trp启动子的表达载体被IAA和3-吲哚丙烯酸诱导；PL 启动子的表达载体：受温度诱导. ★外源蛋白在E. coli中的表达部位：细胞质中表达。外源基因高表达时一般形成包涵体:存在于细胞质中的一种由不可溶性蛋白聚集折叠而成的晶体结构。周质中表达。周质：指大肠杆菌一类革兰氏阴性细菌中位于内膜和外膜间的细胞结构部分。胞外表达。 ★融合蛋白表达。fusion gene：通过自发突变时间或通过DNA体外重组技术构建的一类具有来自两个以上不同基因的核苷酸序列的新型基因。fusion protein：克隆在一起的两个或数个不同基因的编码序列组成的融合基因，转译产生的单一多肽序列，也称hybrid protein 或chimeric protein。 ★表达融合蛋白的策略的优点： RBS和编码起点的核苷酸序列由天然大肠杆菌序列构成外源基因有效转译；存在大肠杆菌多肽片段，蛋白质可免受蛋白酶的降解，产物稳定，产率提高；存在大肠杆菌多肽片段，有可能作为信号肽指导运输； 存在大肠杆菌多肽片段，可用亲和层析技术分离和纯化蛋白。 ★融合蛋白的切割：化学切割：溴化氰；甲酸；羟胺。酶催切割：胶原酶；Xa因子；凝血酶；胰蛋白酶；枯草蛋白酶 ★酵母菌的宿主系统 酵母属（酿酒酵母）克鲁维克酵母属（乳酸克鲁维克酵母）毕赤酵母属（巴斯德毕赤酵母）裂殖酵母属（非洲酒裂殖酵母）；汉逊酵母属（多态汉逊酵母）★酵母菌载体系统。分类：整合型，如巴斯德毕赤酵母、多态汉逊酵母表达载体；附加型，如酿酒酵母 ★标记基因（营养缺陷型：包括营养成分合成基因；） ★常规酵母表达系统--重组质粒不稳定（拷贝数与产量）；工业化生产时，产量较低；蛋白质过度糖基化，引起抗性；不能表达所有蛋白。指酿酒酵母和栗酒裂殖酵母；非常规酵母表达系统--甲醇酵母；多形汉逊酵母；克鲁维克酵母. ★YAC文库：由Murray等于1983首次构建，1987Burke等首次构建了人基因组的YAC分子克隆文库。真核生物基因组制图；人类致病基因克隆与分离；直接转化哺乳动物细胞，研究基因的表达与调节。 ★酵母双杂交系统--也称为相互作用陷井，是于上世纪90年代初期发展的一种敏感的体内鉴定基因的方法。它可以高效分离能与一种已知靶蛋白(target protein)相互作用的蛋白质的编码基因。基本原理：许多真核基因的转录激活因子(transcriptional activitor)由两个结构可以分开、功能上相互独立的结构域(domain)组成：N端DNA-BD：识别其效应基因的上游激活序列UAS，并结合；C端DAN-BD：与其它成分结合，启动UAS下游基因表达。酵母双杂交体系的宿主菌株及质粒载体-目前酵母双杂交体系一般采用酵母：真核细胞，表达的蛋白可在细胞核相互作用；酵母容易转化，操作简单；能同时容纳两种质粒，提取质粒比较方便；有很多营养缺陷型菌株，筛选转化子容易；通过lacZ进行蓝白筛选。常采用GAL4缺陷型菌株，如SFY526、HF7C，带有特定的报告基因LacZ、HIS3和LEU4。质粒载体-两种穿梭载体：pGBT9（DNA-BD质粒载体）-杂种蛋白1；pGAD424（AD质粒载体）--杂种蛋白2。 ★转基因动物：由人工方法将外源基因导入动物细胞，使外源基因与动物染色体整合，并随细胞的分裂而增殖，从而外源基因稳定地遗传给下一代的工程化动物。 ★转基因：指在外源DNA操作过程中整合到动植物受体细胞染色体上的外源基因，也指整个遗传转化过程。 ★转基因生物制品：含有转基因并被其修饰了的动植物个体。 ★动物转基因的结构。基因组片段，小基因，融合基因，靶基因，插入基因，置换基因 ★动物转基因的表达特性。转基因的时空特异性表达；转基因的可控性表达；转基因的抑制效应 ★共抑制效应：当受体细胞染色体上含有转基因的同源基因时，二者表达均受到抑制。具有以下特征：只发生在目的基因和同源基因间；如转基因与体内同源基因发生重组，共抑制效应消失;共抑制发生与结构基因编码区有关，不依赖于启动子；两个相同的转基因间也发生共抑制。 ★动物转基因的生物学效应。1研究基因的结构、功能和调控：以报告基因为转基因探测动物或人类基因组中的时空特异性表达调控序列；以反义基因为转基因灭活相关的内源基因，构建基因表达—功能丧失的动物模型，以筛选鉴定人类功能性基因，为基因药物提供实验实体；以同源基因为转基因，体内检测其表达特性及产物的生物效应。2动物改良；3 动物反应器；4提供异种器官 ★转基因导入动物体内的方法。1 转基因的动物体细胞系统 2 遗传选择标记3 动物细胞的物理转化法4 动物病毒转染法电穿孔(electroporatior)DNA 转移技术。原理：在高压脉冲作用下是细胞膜出现微小的孔洞，促使细胞吸收外源DNA。 ★脂质体是一种人造的脂质小泡，外周为脂双层。内部是水腔。 ★脂质体转载法由脂质体介导将外源DNA导入细胞的方法，即为脂质体转载法，也叫脂质体转染法。 ★动物病毒转染法 通过病毒感染的方式将外源DNA导入动物细胞内是一种最常用的转基因方法，具有：动物病毒启动子能被真核生物识别，有效启动；许多病毒可持续复制，基因数相当高；有些病毒具有控制自我复制的顺势作用元件和反势作用因子；有些病毒能稳定整合于寄主染色体上；病毒的外壳蛋白能识别细胞接受器，可将DNA高效注入寄主细胞。 ★哺乳动物表达载体应具有：动物细胞中的复制起点；筛选标记；外源基因表达的全部顺势作用元件；MCS；细菌质粒复制起点和抗性基因 ★工程胚胎干细胞法（细胞介导法）多效性胚胎干细胞(ES): 小鼠胚胎发育至卵泡阶段，细胞可在体外培养基上增殖后，重新输回胚胎后，仍具有分化能力。 ★转基因纯合体的扩增方法：常规育种法；胚胎切割法；体细胞克隆法。 ★利用同源基因灭活细胞内源基因作用：基因打靶；动物改良；人体基因治疗 ★基因打靶是一项高新生物技术，是指在生物体内诱发精确、定向的基因删除或替代，而不累及其他基因，即基因剔除和基因替换。分子基础：两条具有同样或类似核苷酸序列的同源DNA分子间发生的遗传信息的重组事件。★利用反义基因抑制细胞基因表达 方法一分离靶mRNA | 细菌RNA聚合酶 反义RNA | 注入细胞 形成dsRNA | 促进mRNA降解 方法二靶基因DNA序列 | 一小段反义DNA | 与mRNA 5’端互补 | 抑制翻译 受体鼠供体鼠外源基因 \ / \ / 转染 卵母细胞体细胞 | | 去核挑选阳性细胞，取核 \ / 核卵重组，电激活 | 体外培养 | 植入假孕小鼠 | 转基因克隆鼠 | 重复克隆 ★体细胞克隆技术：又称为核移植或无性繁殖技术，是通过特定的人工手段（显微操作、电融合等），对特定发育阶段的核供体（胚胎分裂球或体细胞核）及相应的核受体，不经过有性繁殖过程，进行体外重构，通过重构胚的胚胎移植，从而达到扩大和繁殖同基因型哺乳动物种群的目的。 ★动物反应器：即动物个体表达系统，用于生产生物大分子的转基因动物。★基因治疗的基本战略思想：用正常基因取代病人细胞（生殖细胞和体细胞）中的缺陷基因。基本内容分为：基因诊断；基因分离；载体构建；基因转移。体内疗法：各种组织、器官、血液等感染或直接注射缺陷型重组病毒；重组DNA 分子直接注射横纹肌，如骨骼肌和心肌等；由呼吸道直接吸入气溶胶；基因枪轰击器官、组织和细胞等；电穿孔导入。 体外疗法：病变细胞 | 体外培养重组病毒 \ / 转化，进行遗传修饰 | 检测 | 输回患者体内 ★基因治疗的分子机制 正常基因：同源置换病变基因；反义基因：mRNA互补； 自杀基因：编码产物为自杀酶，可将无毒代谢物转化为有毒物质，杀死细胞。★目的基因类别：抗虫基因、抗病基因、抗除草剂基因、改良木质素基因、抗逆基因、抗环境污染基因等。 主要用于植物遗传转化的抗虫基因主要有：Bt毒蛋白基因、植物蛋白酶抑制剂基因、昆虫特异性神经毒素基因。 ★植物基因转化受体系统，是指用于转化的外植体通过组织培养途径或其他非组织培养途径，能高效、稳定地再生无性系，并能接受外源DNA整合，对转化选择抗生素敏感的再生系统。 ★植物基因转化受体系统的类型及其特性。植物基因转化受体主要是器官发生和体胚发生。器官发生是指植物外植体或细胞团直接再生为完整的植株。而体胚发生则是从单个细胞诱导为胚性细胞，进而成为胚，再生为完整植株，与种子萌发相似，因此被称为人工种子。 ★愈伤组织再生系统：外植体经脱分化培养诱导愈伤组织，并通过分化培养获得再生植株的受体系统。特点：脱分化的分生细胞易于接受外源基因，转化率较高；扩繁量大，可获得较多的转化植株；多种组织、器官均可诱导愈伤；通过该系统获得的再生植株变异大，外源基因稳定性较差；嵌合体多。★原生质体再生系统。原生质体是“裸露”的植物细胞，具全能性，在适当的条件下可再生植株。特点：无细胞壁，可直接高效吸收外源DNA；单细胞起源，嵌合体少；易于同等控制条件下进行准确的转化与鉴定；适用于多种转化系统；经历繁复操作，遗传稳定性更差；建立相当困难。 ★生殖细胞受体系统。花粉粒、卵细胞为受体，主要以两个途径进行转化：利用组培技术进行单倍体培养，诱导胚性细胞或愈伤；直接利用花粉和卵细胞受精过程进行转化，如花粉管导入法、花粉粒浸泡法和子房微注射法。特点：受体细胞具全能性，接受外源基因能力强，一劳永逸。单倍体受体，无现隐性影响，有利于性状选择，通过加倍后即为纯合体，缩短选育纯化过程；利用植物自身的授粉过程操作简单、方便，将现代分子育种和常规育种紧密结合，具有潜力；受季节限制，无性繁殖的植物不宜采用。 ★植物基因转化受体系统的条件高效稳定的再生能力；较高的遗传稳定性；具有稳定的外植体来源；对选择抗生素敏感；对农杆菌浸染有敏感性 ★器官发生受体系统特点：获得再生植株周期短，操作简单；体细胞无性系变异小；更适用于林木；建立较困难；嵌合体多。 ★体胚发生受体系统。接受外源DNA能力强，是理想的基因转化感受态细胞；繁殖量大，同步性好，转化后的胚性细胞即可发育成转基因的胚状体及完整的植株，因此此受体系统的转化率和转化效率都很高。 体胚发生多是单细胞起源，转化获得的转基因植株嵌合体少； 体胚发生具有两极性，即在发育过程中可同时分化出芽和根形成完整植株；个体间遗传背景一致，无性系变异小，胚的结构完整； 繁殖效率高、可通过生物反应器进行大规模生产，因此可利用转基因的体细胞胚生产人工种子，成苗快，数量大，有利于转基因植株的生产和推广。 ★高频再生系统建立。必要条件：1）具有再生完整植株的能力，最好直接分化芽；2）芽分化率达90%以上；3）易于离体培养，可重复；4）变异小。外植体的选择（幼年型、增殖能力强、萌动期、强再生能力的基因型、遗传稳定性好）；最佳培养基的确立 ★目前转基因技术大致可分为三大类：生物学方法主要有农杆菌介导、花粉管通道法等；物理法有基因枪、电激、显微注射、激光和碳化硅纤维等；化学法包括磷酸钙-DNA共沉淀、聚乙二醇（PGE）和脂质体等。 ★基因枪法将DNA包被在钨粉或金粉颗粒中，火药爆炸产生的动力将DNA 打入细胞。后来人们又相继设计出以高压气体和高压电容放电作为动能的基因枪，在高压下使金属颗粒喷射，高速穿透受体细胞或组织，使外源基因进入受体细胞的核中整合并表达，精度得以提高。 ★转基因方法比较：农杆菌介导法。经济、简便、高效，多为单拷贝整合；受体系统限制。基因枪法。适用范围广；昂贵、转化效率低、多拷贝。显微注射法。转基因植株为纯合体；费时、费力，技术要求高。电穿孔法。适用范围广；仪器昂贵，仅限原生质体。PEG法。经济；仅限原生质体。花粉管通道法。直接收获T1代种子；费时、工作量大。超声波辅助法。高效，适用范围广，多为单拷贝整合。 ★农杆菌介导的遗传转化载体系统分为根癌农杆菌和发根农杆菌两种。 ★转基因技术大致可分为三大类：生物学方法主要有农杆菌介导、花粉管通道法等；物理法有基因枪、电激、显微注射、激光和碳化硅纤维等；化学法包括磷酸钙-DNA共沉淀、聚乙二醇（PGE）和脂质体等。 ★植物表达载体一般结构植物基因转化载体是指用于目的基因导入植物细胞的载体，也有人称之为植物表达载体。最常用的载体是以质粒形式存在的，通常包含以下几个部分： ★宿主菌的复制子；多克隆位点；选择标记基因；报告基因；外源基因表达框：外源基因、启动子和终止子。 ★植物转化相关的边界DNA序列；顺式调控元件。 ★共整合载体系统是利用同源重组的方式，将目的基因插入到卸甲，即去除T-DNA的边界顺序间的致瘤基因)的Ti质粒上，形成共整合体，转化时由同一质粒上的vir基因序列表达，从而驱动目的基因序列的转移，将外源基因整合到植物细胞基因组中。目前常见的共整合载体系统有pGV3850，pGV3851，GV311-SE(C024)系统。 ★双元载体系统中，存在起辅助作用的卸甲的Ti质粒（寄生于农杆菌中，有vir基因而缺乏T-DNA区，可提供反式毒性功能）和双元载体或微型Ti质粒（含Ori-E．coli和Ori-Agro，可穿梭于大肠杆菌和农杆菌之间）。它无须同源重组，，相对较小，可容纳更长(10kb以上)的外源DNA。目前，绝大多数的农杆菌转化均用双元载体系统，较常用的有LBA4404(pBinl9 ,pBI121 等。★发根农杆菌介导的遗传转化载体系统。优点：Ri质粒可以不经“卸甲”直接进行转化；Ri质粒转化植物所产生的发状根来自于单细胞克隆；通过转化毛状根的扩大培养，获得重要的次生代谢物质；毛状根再生植株常会呈现特殊的外观形态，转化体筛选方便。 ★植物叶绿体转化载体系统。优越性：叶绿体具有基因拷贝数高等特点，可以大量地表达外源基因；叶绿体大多数基因的结构、转录与翻译系统均与原核生物类似；叶绿体遵循母系遗传规律，具有较大的安全性，同时后代将永远保持为纯系，不会因为有性杂交而发生分离；叶绿体基因组小，结构简单。★植物细胞直接转化载体系统。缺点：转化率低；转基因遗传不稳定；转化过程中各种条件和参数难以把握。优点：无单子叶与双子叶植物的限制；不受受体植物基因型的制约；载体来源广泛，构建相对简单；某些生殖器官直接导人外源基因避开了组织培养和植株再生过程。 ★病毒转化载体系统植物病毒载体系统是将外源基因插入到病毒基因组中，通过病毒对植物细胞的侵染将外源基因导入植物细胞，实现外源基因在植物细胞内的快速表达，从而在植物细胞中大量制造外源蛋白的一种系统。外源基因借助于病毒进入植物细胞，与病毒基因组的基因同步复制与表达，并不整合到植物基因组中，因此植物病毒载体系统并非是一种整合载体系统。 ★农杆菌介导法(Agrobacterium) 。植物冠瘿发生的分子机理：很久以前，人们就发现在自然界，根癌农杆菌(Agrobaterium tumerfaciens)能感染许多双子叶植物和少数几种单子叶植物的受伤部位，一个月内就能在受伤处长出一团帽状组织，即冠瘿瘤，严重危害植物生长的病害。为什么根癌农杆菌会诱发冠瘿呢? 原来，在农杆菌中存在着一类专一性诱瘤质粒，即Ti质粒(tumour inducing plasmid)。Ti质粒的性质、结构与功能。Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的环状双链DNA分子，160-799kb。在较高的温度下培养，Ti 质粒即能消失。 ★植物基因转化载体：是指用于目的基因导入植物细胞的载体，也有人称之为植物表达载体。最常用的载体是以质粒形式存在的，通常包含以下几个部分：宿主菌的复制子(replkon)；多克隆位点；选择标记基因(selectionmarkergene)；报告基因(reportergene)；外源基因表达框：外源基因、启动子和终止子。植物转化相关的边界DNA序列；顺式调控元件。 ★报告基因与标记基因植物遗传转化的目的就是将外源基因整合到受体树种的基因组中并使之有效地表达，因此涉及的基因有两类：一类被称作为报告基因或称为标记基因，另一类就是有一定经济价植的目的基因。 ★选择标记基因必须具备下列条件：具有显性作用；受体植物本身所不具有的；能够在培养阶段中，解除选择因子如抗菌素对转化细胞或组织的胁迫，准确地区分转化体与非转化体；便于检测。 ★报告基因的作用主要是提供基因调节和基因行为的遗传信息，在基因调控系统中起着选择标记(selection marker)和报告基因调控信息的双重作用。目前使用的报告基因主要有两大类：1）具有选择和标记作用的抗性基因，包括抗菌类、抗除草剂类和氨甲嘌呤（methotrexate）；2）编码催化特定显色反应的酶的基因，如β-葡聚糖酸酶基因gus（β-glucuronidase）、荧光素酶基因luc和绿色荧光蛋白酶基因gfp（green fluorescent protein）。 ★标记基因。1氯霉素乙酰转移酶基因Cat。最早使用的选择标记基因是氯霉素乙酰转移酶基因Cat，其编码的氯霉素乙酰转移酶可通过转酰作用使氯霉素酰基化而失去抗生素活性。一般植物细胞内非特异性Cat活性本底很低，适用于基因产物的定量分析。2新霉素磷酸转移酶基因。简称NPTII或A PH(3′)II，来源于细菌的转座子Tn5，是目前使用较为普遍的选择标记基因，其编码的酶蛋白可以抑制新霉素族的氨基糖苷类抗菌素如卡那霉素、新霉素及G418的活性。对卡那霉素过于敏感或不敏感的植物，则不宜采用NPTII 基因作为选择标记。3潮霉素磷酸转移酶Hpt。潮霉素磷酸转移酶Hpt发现较晚，由于一些针叶树含有内源氨基糖苷类化合物，因此在针叶树的遗传转化中，常用潮霉素作为选择标记。 ★报告基因。1GUS基因。又称β-葡糖苷酸酶基因，来源于大肠杆菌的UidA 位点，在植物中一般不存在，编码的β-葡聚糖酸酶，具有明显的蛋白特异性和良好的热稳定性。gus基因在细胞内短暂表达，因此可用于快速确定和优化各种影响转录的因子。 luc基因。luc基因是从萤火虫基因组中分离并克隆的一段编码荧光素酶的基因。Luc基因的产物为一种发光物质，其荧光强度可以用荧光计定量地进行活体测定分析，在筛选过程中无需使用抗生素，从而避免了转基因植物中抗性标记基因的安全性问题，因而作为一种报告基因在表达系统中使用。 ★gfp（green-fluorescent protien）基因。gfp基因是最近从水母中克隆的，该基因所编码的产物gfp在长紫外光395nm和蓝光490nm照射下会发出509nm绿色荧光，极易检测。gfp还具有gus无法比拟的优点：在检测时无需加入化合物，可直接检测；gfp可用于活体检测，可迅速筛选初始转化子，不影响转化植株再生；由于GFP的发光特性，当将gfp融合进研究者感兴趣的蛋白质阅读框中，就可对该蛋白各方面的行为作出无伤害性的分析。 ★外源基因整合的检测：PCR法与Southern杂交 基因工程：是遗传工程的重要组成部分，是在分子水平上进行的遗传操作，将一种或多种生物体的基因或基因组提取出来，或者人工合成基因，按照人们的愿望，经过设计、体外加工重组，转移到另一种生物体的细胞内，使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术。 基因工程载体：基因工程中携带外源基因进入受体细胞的“运载工具”。 cos位点:当λDNA进入细菌细胞后，便迅速通过黏性末端配对形成双链环状的DNA 分子，这种黏性末端结合形成双链的区域称为cos位点。 取代型λ载体：具有两个限制性核酸内切酶的酶切位点，它们之间的DNA区段可被外源DNA片段所取代，这类λ噬菌体派生载体即取代型λ载体。 DNA变性：加热或变性作用可以使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离，形成单链DNA。 DNA复性（退火）：解除变性条件之后，变性的单链可以重新结合起来形成双链。 受体细胞（宿主细胞，寄主细胞）：能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞。 转化：重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称之为转化。 细菌转化：是受体菌直接吸收来自供体菌的游离DNA片段，并在细胞中通过遗传交换将之组合到自身的基因组中，从而获得供体菌的相应遗传性状的过 程。 转化率：指DNA分子转化受体菌获得转化子的效率。有两种表示方式：一是以转化子数于转化处理的DNA分子数或质量的比率表示；二是以转化子数与用于 转化处理的受体细胞数的比率表示。 转染：将重组λ噬菌体DNA分子直接导入受体细胞中的过程。 转导：指通过λ噬菌体(病毒)颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA分子转移到受体细胞内的过程。 体外包装：指在体外模拟λ噬菌体DNA分子在受体细胞内发生的一系列特殊的包装反应过程，将重组λ噬菌体DNA分子包装为成熟的具有感染能力的λ噬 菌体颗粒的技术。 脱菌培养：指把共培养后的外植体转移到含有抗生素的培养基上继续培养生长的过程。 DNA的直接转移：指利用植物细胞的生物学特件、通过物理化学的方法将外源基因转入受体植物细胞的技术。 脂质体：由人工构建的磷脂双分子层组成的膜状结构。 克隆子：将摄取外源DNA分子并能使该分子在其中稳定维持的受体细胞统称为克隆子。 基因表达：指结构基因在调控序列的作用下转录成mRNA，经加工后在核糖体的协助下又转译出相应的基因产物——蛋白质，再在受体细胞环境中经修饰而显示出相应的功能。 启动子：是一段提供RNA聚合酶识别和结合的DNA序列。 增强子：是能够增强启动子转录活性的DNA顺式作用序列，又称强化子。 衰减子：是位于mRNA分子前导序列中的一段控制蛋白质合成起始速率的调节区，亦即发生弱化作用的转录终止信号序列，又称弱化子。 反义RNA：同某种天然mRNA反向互补的RNA分子称为反义RNA。 反义子：编码反义RNA的DNA称为反义子。 外源基因表达系统：泛指目的基因与表达载体重组后，导入合适的受体细胞，并能在其中有效表达，产生目的基因产物（目的蛋白）。 复制子：是一段包含复制起始位点（ori）和反式因子作用区在内的DNA片段。 启动子：是一段能被宿主RNA聚合酶特异性识别和结合并指导目的基因转录的DNA 序列，是基因表达调控的重要元件。 转录终止子：是一段终止RNA聚合酶转录的DNA序列。 核糖体结合位点：是指原核基因转录起始位点下游的一段DNA序列，即Shine-Dalgarno序列（简称SD序列）。 包涵体：在一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密地集中在一起形成无膜的裸露结构，这种结构称为包涵体。 融合蛋白：将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，但不改变两个基因的阅读框，以这种方式表达的蛋白称为融合蛋白。 寡聚型外源蛋白：在构建外源蛋白表达载体时，将多个外源目的蛋白基因串连在一起，克隆在质粒载体上，以这种方式表达的外源蛋白。 整合型外源蛋白：将要表达的外源基因整合到染色体的非必需编码区上，使之成为染色体结构的一部分而稳定地遗传，以此种方式表达的外源蛋白。 分泌型外源蛋白：外源基因的表达产物，通过运输或分泌的方式穿过细胞的外膜进入培养基中，即为分泌型外源蛋白。 转座子：存在于染色体DNA上可自主复制和移位的基本单位.转座子是基因组内相对独立的、可移动序列，它们不必借用噬菌体或质粒的形式就可以从基因组的一部位直接转移到另一部位，这个过程称转座 克隆子：将摄取外源DNA分子并能使该分子在其中稳定维持的受体细胞统称为克隆子。 重组子、阳性克隆子或期望重组子：含有重组DNA分子的克隆子被称为重组子，如果重组子中含有外源目的基因则又称为阳性克隆子或期望重组子。 转化子：把采用各种转化方法或转导方法获得的克隆子叫做转化子（导入外源DNA 分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子） 克隆子的筛选：经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得所需阳性克隆子的过程称为 α-互补：lacZ 基因上缺失操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性突变体之间实现互补，这种互补现象称为α-互补 报告基因：系指其编码产物能够被快速地测定，常用来判断外源基因是否已经成功地导入寄主细胞（器官或组织）并检测其表达活性的一类特殊用途的基因。 基因工程期末试题复习要点整理 基因工程是70年代出现的一门科学，是生物学最具生命力和最引人注目的前沿科学之一，是现代生物技术的代表，是生命科学类专业中的一门重要的专业课。本课程主要介绍基因工程概述、重组DNA基本技术及原理、基因克隆、基因的分离及鉴定、基因工程的表达系统、基因工程的应用等。通过本课程的学习，使学生掌握基因工程技术的基本原理和了解该技术在动物、植物和微生物等方面的应用，为今后从事生物学教学、生物技术研究和产品开发，或进一步的研究生学习科研打下坚实的理论及专业基础。扬州大学试题纸 一、名词解释：共10题，每题2分，共20分。 1. 基因: 是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。 2. 定位克隆: 获取基因在染色体上的位置信息，然后采用各种方法对该基因进行定位和克隆 3. 融合基因: 是指应用DNA体外重组技术构建的一类具有来自两个或两个以上的不同基因核苷酸序列的新型基因。 4. 转化子: 导入外源DNA后获得了新遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞，又称重组体。 5. 人工接头：是人工合成的具有一个或数个特定限制性内切酶识别和切割序列的双股平端DNA短序列。 6. RT-PCR: 是指以mRNA在反转录酶作用下合成cDNA第一链为模板进行的PCR。 7. ORF : 起始于AUG、止于UAA、UGA、UAG的连续的密码子区域，是潜在的编码区。 8. MCS: 指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制核酸内切酶的酶切位点的DNA片段。 9. gene targeting : 基因工程中利用活细胞染色体DNA可与外源DNA的同源性DNA序列发生重组的性质，来进行定点修饰改造染色体上某一目的基因的技术 10. 5’RACE: 是一种通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，是以mRNA为模板反转录成cDNA第一链后用PCR技术扩增出某个特异位点到5’端之间未知序列的方法。 四、简答题：共4题，共20分。 1．简述获得目的基因常用的几种方法。（5分） 1基因工程定义：是将一种生物细胞的基因分离出来，在体外进行酶切和连接并插入载体分子，构成遗传物质的新组合，引入另一种宿主细胞后使目的基因得以复制和表达的技术。 2.融合蛋白：指蛋白质的N末端由原核DNA序列编码，C端由真核DNA的完整序列编码，这样的蛋白由一条短的原核多肽和真核蛋白质结合在一起，故称为融合蛋白。 3.悬浮细胞：生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长。 4.二倍体细胞系：原代细胞经过传代筛选克隆，从多种细胞成分的组织中，挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。 5.转化细胞系：通过某个转化过程形成的，常由于染色体断裂变成异倍体，失去正常细胞特点，而获得无限增殖能力。 6.基因文库：将特定生物个体的全部DNA片段连接入载体DNA分子上，并导入受体细菌或细胞中，经扩增产生的包含该生物全部基因组序列的克隆群体。 7.基因组文库：是包含有某物种全部基因随机片段的重组DNA克隆的集合体。 8. cDNA文库：是指通过克隆的方法保存在宿主中的一群混合分子，这些分子中的插入片段的总和可代表某种生物的全 9.mRNA序列9..补料分批培养：将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间后，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方式。10.连续培养：将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至一定浓度后，开动进料和出料的蠕动泵，以控制一定稀释率进行不间断的培养。 11.分批培养：将溶氧控制和流加补料措施结合起来，使糖的流加速率不超过氧化容量。 12.透析培养：利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离，通过去除培养液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响。 13.星号（*）活性：如果改变反应条件就会影响限制酶的专一性和切割效率 14.强启动子：是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的特定序列15.转录终止子：在一个基因或是一个操纵子的3’末端提供转录终止信号的一段特定DNA序列15.逆转录法：先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成cDNA，后进行cDNA的克隆表达。 16. RT-PCR：是指以mRNA在反转录酶作用下合成的cDNA第一链为模板的PCR。 17.同裂酶:能识别相同序列，切割位点可以相同也可以不同，来源不同的酶。 18.同尾酶:识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。 19.穿梭质粒载体：人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。 20.可溶性受体：一般指细胞膜受体的胞外与配基结合的膜外区，由于多种原因自胞膜脱落但仍保留和配基结合能力的受体。 21.反义技术：是采用反义核酸分子抑制、封闭或破坏靶基因的技术。 22.反义核酸：是根据碱基互补原理结合并调节靶基因活性的核酸分子。 23.细胞因子概念：在机体内由多种细胞分泌的，在体内含量极低但具有多种生物学活性的小分子蛋白多肽或糖蛋白 24..基因诊断：是一种新的临床诊断方法，是通过基因检测寻找内源基因异常变化，以及发现与鉴定病原性外源基因的存在，从而达到对有关疾病特异、敏感和快速的诊断。 25.基因治疗：是指对缺陷基因进行原位修复或以正常基因替代缺陷基因(或)。26..in vivo法：通过载体将目的基因直接转入靶细胞、组织，使其在体内表达 27.受体介导的基因转移：是利用能与细胞表面特异性受体结合的相应的配体或抗体，以多价阳离子辅助物为连桥，与DNA形成一种特殊的蛋白- 核酸复合物 28.靶向逆转录病毒载体：逆转录病毒的宿主性决定于病毒外壳糖蛋白env，所以，通过改变或修饰env蛋白可以实现逆转录病毒载体的靶向转移。 29.细胞因子：在机体内由多种细胞分泌的，在体内含量极低但具有多种生物学活性的小分子蛋白多肽或糖蛋白。 名词解释： 1.Gene Engineering基因工程：在体外把核酸分子（DNA的分离、合成）插入载体分子，构成遗传物质的新组合（重组DNA），引入原先没有这类分子的受体细胞内，稳定地复制表达繁殖，培育符合人们需要的新品种（品系），生产人类急需的药品、食品、工业品等。 2.HGP人类基因组计划：是一项规模宏大，跨国跨学科的科学探索工程。其宗旨在于测定组成人类染色体（指单倍体）中所包含的30亿个碱基对组成的核苷酸序列，从而绘制人类基因组图谱，并且辨识其载有的基因及其序列，达到破译人类遗传信息的最终目的。 3.Gene Therapy 基因治疗：是指将外源正常基因导入靶细胞，取代突变基因，补充缺失基因或关闭异常基因，达到从根本上治疗疾病的目的。 .基因诊断：是利用重组DNA 技术作为工具，直接从DNA水平监测人类遗传性疾病的基因缺陷。 Vector载体：是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增或表达的工具。 plasmid质粒：是生物细胞内固有的、能独立于宿主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。shuttle vector穿梭载体：是指含有两个亲缘关系不同的复制子，能在两种不同的生物中复制的。 质粒不相容性;同种的或亲缘关系相近的两种质粒不能同时稳定地保持在一个细胞内的现象，称为质粒不相容性. multiple cloning sites，MCS多克隆位点：DNA载体序列上人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点。能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。 α-互补：LacZ’基因的互补：lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶基因的突变体之间实现互补。 粘性末端：指DNA分子的两端具有彼此互补的一段突出的单链部分, 这一小段单链部分和同一分子的另一端或其它分子末端的单链部分如果互补的话，则能通过互补碱基之间的配对, 形成双链。并在DNA连接酶的作用下, 使同一DNA分子的两端连接成环状,或使两个分子连成一大的线状分子。 cos位点：当λDNA进入细菌细胞后，便迅速通过黏性末端配对形成双链环状的DNA分子，这种黏性末端结合形成双链的区域称为cos位点。 Cosmid考斯质粒：由于λ-DNA包装蛋白只识别粘性末端的一小段顺序cos区。将这段DNA与质粒连在一起,构建的重组质粒,可装载DNA(32~45.5kb)。 pBR322：是一个人工构建的重要质粒，有万能质粒之称。它是由pSF2124、pMB1及pSC101三个亲本质粒经复杂的重组过程构建而成的。 phagemid or phasmid噬菌粒：是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体。 人造染色体载体：利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体称之为。 BAC细菌人工染色体：是指一种以F质粒为基础建构而成的细菌染色体克隆载体，常用来克隆150kb左右大小的DNA片段，最多可保存300kb个碱基对。 YAC酵母人工染色体:是一种能够克隆长达400Kb的DNA片段的载体，含有酵母细胞中必需的端粒、着丝点和复制起始序列。 19.工具酶;基因工程中分子水平的操作，是依赖于一些重要的酶（如限制性核酸内切酶，连接酶等）作为工具对DNA进行切割和拼接，我们把这些有关的酶统称为基因工程进行切割和拼接，我们把这些有关的酶统称为基因工程工具酶。 20.R-M System限制与修饰系统：限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断，细菌自身的DNA 碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。 21.同裂酶：又称异源同序酶或异源同工酶，是指识别位点与切割位点均相同的不同来源的酶识别相同序列. 22.同尾酶：是指识别位点不同，但切出的ＤＮＡ片段具有相同的末端序列的一类酶，同尾酶的切割产物互为粘性末端，并能互补连接，但连接后二个酶的识别序列均被破坏。 23.star activity星活性:在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星 一、名词解释： 1、基因：是遗传的物质基础，是DNA（脱氧核糖核酸）分子上具有遗传信息的特定核 苷酸序列的总称，是具有遗传效应的DNA分子片段。 2、基因组：该指单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部DNA分子 3、操纵子:原核生物的几个功能相关的结构基因往往排列在一起，转录生成一个mRNA， 然后分别翻译成几种不同的蛋白质。这些蛋白可能是催化某一代谢过程的酶，或共同完成某种功能。这些结构基因与其上游的启动子，操纵基因共同构成转录单位，称操纵子。 4、启动子:是RNA聚合酶结合位点周围的一组转录控制组件，包括至少一个转录起始点。 在真核基因中增强子和启动子常交错覆盖或连续。有时，将结构密切联系而无法区分的启动子、增强子样结构统称启动子。 5、增强子:是一种能够提高转录效率的顺式调控元件，增强子通常占100～200bp长度， 也和启动子一样由若干组件构成，基本核心组件常为8～12bp，可以单拷贝或多拷贝串连形式存在。 6、基因表达：是指细胞在生命过程中，把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻 译，转变成具有生物活性的蛋白质分子。 二、名词解释 1、基因工程：是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行剪接重组，然后转入另一种生物体（供体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。 2、载体：能载带微量物质共同参与某种化学或物理过程的常量物质，在基因工程重组 DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。三种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。 3、转化：指将质粒或其他外源DNA导入处于感受态的宿主菌，并使其获得新的表型的过程。 4、感染：利用噬菌体将外源DNA导入宿主细胞的方法。 5、转导：由噬菌体将一个细胞的基因传递给另一细胞的过程。它是细菌之间传 递遗传物质的方式之一。其具体含义是指一个细胞的DNA或RNA通过病毒载体的 感染转移到另一个细胞中。 6、转染：指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。常用的方法有电穿孔法，磷酸钙共沉淀法，脂质体融合法等。 各种题型 确定题目 重要题目 候补题目 不确定答案的题目 试卷与题库重复题目 名词解释 同裂酶（同切点酶）：有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶序列，这类酶称为同裂酶。 同尾酶：与同裂酶对应的一类限制性内切酶,它们来源各异，识别的靶序列也各不相同,但切割后都能产生相同的黏性末端,特称为同尾酶。测序酶：是经修饰过的T7噬菌体DNA聚合酶，是采用缺失的方法，从外切核酸酶结构域中除去28个氨基酸，这样使得T7DNA聚合酶完全失去了3~-5~外切酶活性，只有5~-3~聚合酶活性，而且聚合能力很强，测序时常用此酶。与klenow相比优点是：是双脱氧链终止法对长片段进行测序的理想用酶。 限制性核酸内切酶：是一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基系列的核酸水解酶。 限制-修饰系统中的限制和修饰作用：限制-修饰系统中的限制作用是指一定类型的细菌可以通过限制性酶的作用，破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制；而生物细胞(如宿主)自身的DNA分子合成后，通过修饰酶的作用，在碱基中特定的位置上发生了甲基化而得到了修饰，可免遭自身限制性酶的破坏，这就是限制-修饰系统中的修饰作用。 5. 限制性片段长度多态性（RFLP）：当DNA序列的差异发生在限制性内切酶的识别位点时，或当DNA片段的插入、缺失或重复导致基因组DNA经限制性内切酶酶解后，其片段长度的改变可以经过凝胶电泳区分，出现的这种DNA多态性称为限制性片段长度多态性。 6. 星号活性：限制性内切核酸酶识别和切割特异性位点是在特定的条件下测定的。当条件改变时，许多酶的识别位点会改变，导致识别与切割序列的非特异性，这种现象称为星号活性。（“非最适的”反应条件例如高浓度的核酸内切限制酶、高浓度的甘油、低离子强度、用Mn2+取代Mg2+以及高pH值等。)克服星号活性的方法：维持反应体系适当的离子强度、较低的温度或酶浓度，尽可能缩短反应时间或DNA 样品的重新处理等。 7. 载体(vector): 在基因操作中携带外源基因进入受体细胞的工具。 克隆载体：主要用于扩增或保存DNA片段，是最简单的载体。主要有：质粒载体、噬菌体载体、黏粒载体、人工染色体（YAC和BAC）。YAC（酵母人工染色体）：是利用酿酒酵母的染色体的复制元件构建的载体，其工作环境也是在酿酒酵母中。 BAC（细菌人工染色体）：是基于大肠杆菌（E.coli）的F质粒构建的高通量低拷贝的质粒载体。 表达载体是可携带外源基因进入宿主细胞进行复制并进行转录、翻译的载体。 病毒表达载体：是以病毒基因组序列为基础，插入必要的表达元件所构建成的真核基因转移工具。 T-载体：Taq酶的末端转移酶活性可在PCR产物的3’端加上一个不依赖于模板的A，根据这一特性，为方便进行PCR产物的直接克隆而开发出T-载体。 Ti质粒（tumor inducing plasmid）：是在根癌农杆菌中发现的可决定冠瘿病（即可诱发寄主植物产生冠瘿瘤）的质粒。大小在200kb左右。 12. 粘粒载体：由人工构建的、大小一般在5~7kb左右、含有λDNA的cos序列和质粒复制子的一类特殊的质粒载体。 17.一元载体：含目的DNA的中间表达载体与改造后的受体（Ti质粒）通过同源重组所产生的一种复合型载体。 18.双元载体：是指由两个分别含有T-DNA和vir区的相容性突变Ti质粒构成的系统。 16. 卸甲载体：将Ti质粒上的T-DNA的致瘤基因全部去掉，仅保留其两边界及与T-DNA转移所必需的25bp序列而构建成的载体。 8.质粒的相容性：是指两种质粒是否可以共存于同一个细胞，如果能够共存则叫相容又叫亲和。 质粒的不相容性：两个质粒在同一宿主中不能共存的现象，出现这种现象的原因主要是它们常常共用同一复制系统。 9. 转移性：质粒具转移性是指在自然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合的作用转移到新宿主内。不含tra基因的质粒则不具备转移性。 T-DNA ：能导入宿主细胞并插入其DNA中发挥作用的Ti质粒部分DNA片段。 T-DNA区：即转移DNA，能转移并整合在植物细胞核基因组上的、决定植物形成冠瘿瘤的一段DNA。LTS和RTS对于T-DNA的转移和整合是不可缺少的。 α-互补：指lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，由 1024个氨基酸组成）阴性的突变体之间实现互补。 11. cos序列（cohesive endsite）：λDNA分子两端各有12碱基(5′-GGGCGGCGACCT-3′)的单链互补粘性末端，当λ噬菌体进入细菌细胞后，其DNA可迅速按碱基互补配对结合形成双链环状DNA分子。 COS位点：当λDNA进入细菌细胞后，便迅速粘性末端配对形成双链环状DNA分子，这种粘性末端结合形成的双链区域叫做COS位点. 13. 端粒重复序列（telomeric repeat，TEL）：定位于染色体末端一段序列，用于保护线状的DNA不被胞内的核酸酶降解，以形成稳定的结构。 14. 自主复制序列：一段特殊的序列，含有酵母菌中DNA进行双向复制所必须的信号。 22. 多克隆位点：含有紧密排列的多个限制性内切酶识别位点的一段DNA片段。 23、分子杂交：是指在分子克隆中的一类核酸和蛋白质分析方法，用于检测混合样品中特定核酸分子或蛋白质分子是否存在及其分子量大小。 24、菌落原位杂交：是将菌落或噬菌斑转到固相膜上，原位裂解细胞后使核酸固定在膜上，然后与探针杂交。用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织细胞间期染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段。 26、真核细胞原位杂交：是一项组织化学与分子杂交相结合的技术，使探针与固定在载玻片上的细胞组织切片内的变性染色体杂交。 27、荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）：对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记，后用原位杂交方法与靶染色体或DNA 上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相偶联的单克隆抗体（单个细胞增殖形成的细胞群所产生的抗体）来确定该DNA序列在染色体上的位置。 28、凝胶阻滞试验：（gel retardation assay）：又叫DNA迁移率变动试验（electrophoretic mobility shift assay，EMSA），是用于体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。 26. 盒式诱变：就是用一段人工合成具有突变序列的DNA片段，取代野生型基因中的相应序列。这就好象用各种不同的盒式磁带插入收 基因工程：按照预先设计好的蓝图，利用现代分子生物学技术，特别是酶学技术，对遗传物质DNA直接进行体外重组操作与改造，将一种生物（供体）的基因转移到另外一种生物（受体）中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。 遗传工程：广义：指以改变生物有机体性状为目标，采用类似工程技术手段而进行的对遗传物质的操作，以改良品质或创造新品种。包括细胞工程、染色体工程、细胞器工程和基因工程等不同的技术层次。狭义：基因工程。 限制性核酸内切酶：是可以识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，简称限制酶 回文结构：每条单链以任一方向阅读时都与另一条链以相同方向阅读时的序列是一致的，例如5'GGTACC3' 3'CCATGG5'. 同裂酶(isoschizomer)或异源同工酶:不同来源的限制酶可切割同一靶序列（BamH I 和Bst I具有相同的识别序列G↓GATGC） 同尾酶(isocaudiners)：来源不同、识别序列不同，但产生相同粘性末端的酶。两个同尾酶形成的黏性末端连接之后，一般情况下连接处不能够再被其任何一种同尾酶识别。 BamH I 识别序列： G↓GATCC Bgl II 识别序列： A↓GATCT 黏性末端 (cohesive terminus/sticky ends)：DNA末端一条链突出的几个核苷酸能与另一个具有突出单链的DNA末端通过互补配对粘合，这样的DNA末端，称为黏性末端。 平末端（blunt ends）： DNA片段的末端是平齐的。 星活性（star activity）：指限制性内切酶在非标准条件下，对与识别序列相似的其它序列也进行切割反应，导致出现非特异性的DNA片段的现象。易产生星活性的内切酶用*标记。如：EcoR I* 底物位点优势效应:酶对同一个DNA底物上的不同酶切位点的切割速率不同。连杆/衔接物（linker）：化学合成的8～12个核苷酸组成的寡核苷酸片段。以中线为轴两边对称，其上有一种或几种限制性核酸内切酶的识别序列，酶切后可产生一定的粘性末端，便于与具有相同粘性末端的另一DNA片段连接。 衔接头/接头（adaptor）：化学合成的寡核苷酸，含有一种以上的限制性核酸内 在DNA复制时，合成方向与复制叉移动的方向一致并连续合成的链为前导链；合成方向与复制叉移动的方向相反，形成许多不连续的片段，最后再连成一条完整的DNA链为滞后链。 转录(transcription) ：生物体以DNA为模板合成RNA的过程。 DNA分子上转录出RNA的区段，称为结构基因。 转录单元（transcription unit）：一段从启动子开始至终止子结束的DNA序列。 启动子：指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。 转录起点：与新生RNA链第一个核甘酸相对应DNA链上的碱基。 增强子：指能使与它连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列。 转录终止子：是在一个基因编码区下游的可被RNA聚合酶识别和停止合成RNA的一段DNA 顺序。 单顺反子mRNA：只编码一个蛋白质的mRNA。 多顺反子mRNA：编码多个蛋白的mRNA。 操纵子：多顺反子mRNA是一组相邻或相互重叠基因的转录产物，这样一组基因可被称为一个操纵子。一个操纵子（元）通常含有一个启动序列和数个编码基因 基因：产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核苷酸序列。 RNA的编辑：是指转录后的RNA在编码区发生碱基的突变、加入或丢失等现象。 SD序列：mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列。在mRNA分子的起始码上游8-13个核苷酸处的顺序 翻译：指将mRNA链上的核甘酸从一个特定的起始位点开始，按每三个核甘酸代表一个氨基酸的原则，依次合成一条多肽链的过程。 三联子密码：mRNA链上每三个核甘酸翻译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸，这三个核甘酸就称为密码子或三联子密码(triplet coden) 。 简并：由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象 同义密码子：对应于同一氨基酸的密码子 组成性表达：指不大受环境变动而变化的一类基因表达。 名词解释 基因工程：用人工方法, 在体外对DNA分子进行切割、连接，组成重组DNA分子，再导入生物体内,并使其在异种生物内复制、表达,从而使受体生物获得新的遗传性状,这一全过程称为基因工程。（PPT） 限制酶：限制酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。（P 21页） DNA连接酶：DNA连接酶是一种能够将两段DNA拼接起来的酶称为DNA连接酶。 （或DNA连接酶是一种能够催化双链DNA片段紧靠在一起的3`羟基末端与5`磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接起来的酶）（P 27页） DNA聚合酶：DNA聚合酶是能够催化DNA复制和修复DNA分子损伤的一类酶。（P 30页）DNA修饰酶：DNA修饰酶是一类通过添加或删除化学基团来修饰DNA分子的酶，主要有末端脱氧核苷酸转移酶（简称末端转移酶）、碱性磷酸酶、T4噬菌体多核苷酸激酶等。（P 22页与网上整理结合） 质粒：质粒是一些存在于微生物细胞染色体外的小型闭合环状双链DNA分子，是能够进行独立复制并保持恒定遗传的复制子。（P 42页） 穿梭质粒：穿梭质粒载体是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可在两种不同的寄主细胞中存活和复制，并可以携带着外源DNA在不同物种的细胞之间往返穿梭的质粒载体。（P 56页）： 噬菌粒：噬菌粒是一类由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型载体系列。（P 77页）粘粒载体：粘粒又称柯斯质粒，是一类由人工构建的含有λDNA粘性末端cos序列和质粒复制子的杂种质粒载体。（P 70页） M13噬菌体载体： M13噬菌体是一种含有6.4kb环状单链DNA分子的大肠杆菌丝状噬菌体。（73页及PPT） 克隆载体：克隆载体是指具有在细胞内进行自我复制能力的DNA分子，是外源基因的运载体， 一、名词解释 1、分子生物学 2、基因工程 3、DNA的变性与复性 4、细胞学说 5、遗传密码的简并性 6、DNA半保留复制、半不连续复制 7、SD序列 8、开放阅读框（ORF） 9、多顺反子 10、蓝白斑筛选 11、中心法则 12、限制修饰系统 13、断裂基因 14、单链结合蛋白 15、核酶 16、密码子家族 17、TA克隆 18、PCR 19、SNP 20、操纵子学说 21、DNA重组技术 22、减色效应-增色效应 23、可变剪接 24、反转录 25、同尾酶 26、加帽反应 27、蓝白斑筛选 28、表观基因组学 29、DNA的溶解温度 30、DNA的大C值 31、重叠基因 32、引物酶 33、逆转录 34、限制性内切酶 35、载体的选择标记 36、DNA甲基化 37、端粒 38、端粒酶 39、前导链 40、启动子 41、反式作用因子 42、同义密码子 43、多克隆位点（MCS） 44、基因组计划 45、C值悖论 46、顺式作用元件 47、胸腺嘧啶二聚体 48、寄主的限制修饰现象 49、拓扑异构酶 50、DNA的溶解 51、拓扑异构体 52、间隔基因 53、假基因 54、同源异型蛋白 55、翻译 56、多重PCR 57、抗终止作用 58、SD序列 59、空载tRNA 60、cDNA RACE 61、分子杂交 62、cDNA文库 63、载体 64、RT-PCR 65、反义RNA 66、延伸tRNA 67、起始tRNA 68、探针 69、反式剪接 70、增强子 71、动物基因工程 72、基因组 73、限制性内切酶 74、单顺反子 75、密码子 76、转录 77、RNA干扰 78、中心法则 79、回环模型 80、TATA box 81、前导链 82、目的基因 83、RFLP 84、RACE 二、判断 1、大肠杆菌DNA生物合成中，DNA聚合酶I主要起聚合作用。( ) 2、DNA半保留复制时，后随链的总体延伸方向与先导链的延伸方向相反。( ) 3、原核生物DNA的合成是单点起始，真核生物为多点起始。（） 4、以一条亲代DNA(3’→ 5’)为模板时，子代链合成方向5’→ 3’，以另一条亲代DNA链 5’→ 3’为模板时，子代链合成方向3’→ 5’。（） 5、RNA的生物合成不需要引物。（） 6、大肠杆菌RNA聚合酶全酶由4个亚基（α2ββ’）组成。( ) 7、大肠杆菌在多种碳源同时存在的条件下，优先利用乳糖。 ( ) 8、在DNA生物合成中，半保留复制与半不连续复制指相同概念。（） 9、逆转录同转录类似，二者均不需要引物。（） 10、真核生物染色体核心组蛋白的乙酰化、组蛋白H1的磷酸化，都会使基因得以失活。（） 11、在原核细胞中，起始密码子AUG可以在mRNA上的任何位置，但一个mRNA上只有一个起 始位点。( ) 12、蛋白质生物合成过程中，tRNA在阅读密码时起重要作用，他们的反密码子用来识别mRNA上的密码子。( ) 13、表观遗传效应是不可遗传的。( ) 14、cAMP与CAP结合、CAP介导正性调节发生在有葡萄糖及cAMP较高时。( ) 15、DNA甲基化永久关闭了某些基因的活性，这些基因在去甲基化后，仍不能表达。 （） 16、RNA聚合酶催化的反应无需引物，也无校对功能。( ) 17、基因是存在于所有生命体中的最小遗传单位 18、人类基因组中大部分DNA不编码蛋白质 19、蛋白质生物合成过程中，tRNA在阅读密码时起重要作用，他们的反密码子用来识别 mRNA上的密码子。 ( ) 高一（生物）基因工程及其应用(第1课时)学案 编制人初审人审核人编制时间 5月20日 班级姓名第小组 【学习目标】: 1.简述基因工程的基本原理； 2.说出基因工程的基本工具 3 简述基因工程的基本操作步骤 【问题导学】: 学点1.基因工程的概念：阅读课本P102第2段回答下面的问题: 1. 基因工程又叫技术或技术。通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的提取出来，加以，然后放到另一种生物的细胞里，地改造生物的。 2.精读概念，想一想基因工程为什么又叫基因拼接技术”？ 学点2. 基因工程的工具: : ﹙1﹚基因的“剪刀”：学习课本P102第3段回答下面的问题 ①基因的“剪刀”是指：（简称__________） 一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并在的切点上切割DNA分子。 ②EcoRⅠ限制酶识别的特定序列是什么?在哪个部位将序列切开? ③什么是黏性末端？不同的酶切出的黏性末端是否相同?这体现了酶的哪种特性? 【试一试：】试写出下列序列受EcoRⅠ限制酶作用后的粘性末端 CTTCAT GAATTC CCTAA GAAGTA CTTAAG GGATT （2）、基因的“针线”：阅读课本P103第1段回答下面的问题 ①基因的“针线”是指_______ 它可以“缝合”和交替 连接而构成的DNA骨架上的缺口。 ②DNA连接酶作用的部位是氢键吗？ 【试一试：】请在右图中标出DNA连接酶连接的部位。 （3）、基因的“运载体”：阅读课本P103第2段回答下面的问题 ①基因工程中，目前常用的运载体有________、________和______________等。 质粒存在于中，是拟核或细胞核外能够的分子。 ②运载体的作用是什么？质粒的本质是什么？ 学点3. 基因工程的操作步骤：阅读课本P103第3段思考下面的问题 ①什么是目的基因? ②提取目的基因时需要对目标DNA切割几次才能获得目的基因？ ③目的基因与运载体结合时需要对质粒切割几次？ ④切取目的基因和运载体时是否需要使用相同的限制酶？为什么？ ⑤基因工程操作的一般步骤为：__________________、目的基因与___________结合、将目的基因导入_________________、目的基因的________和________。 【小试牛刀】：重组DNA分子的模拟操作(以小组为单位,合作完成) 基因工程复习试题 （名词解释和问答仅供参考） 名词解释： 1、基因工程（genetic engineering）：就是在分子水平上，提取（或合成）不同生物的遗传物质（基因），在体外切割，再和一定的载体拼接重组，然后把重组的DNA 分子引入细胞或生物体内，使这种外源DNA（基因）在受体细胞中进行复制与表达，按人们的需要繁殖扩增基因或生产不同的产物或定向地创造生物的新性状，并能稳定地遗传给下代。 2、载体(vector)：基因工程中，携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。 3、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）：定义：是一类能识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。主要从原核生物中分离纯化出来。 4、1）同裂酶（isoschizomers）：来源不同，识别位点和切割位点均相同的限制性内切酶。即同裂酶产生同样的切割，形成同样的末端。同裂酶对识别序列的甲基化状态有不同的限制性反应。2）同尾酶（isocaudamer）：来源不同，识别序列也不相同，但切出的DNA片段具有相同的末端序列。3）同位酶：识别序列相同，但切割位点不同。 5、酶活性单位：1个酶活性单位就是指1min能转化1mmol底物的酶量。 6、DNA连接酶：能催化双链DNA片段靠在一起的3′羟基末端和5′端磷酸基团末端之间形成的磷酸二酯键，使两末端连接的一种核酸酶。 7、DNA聚合酶：作用是指在引物和模板的存在下，把脱氧核糖核苷酸（dNTP）连续地加到引物链的3’–OH 末端，催化核苷酸的聚合作用。 8、DNA连接酶能够封闭双螺旋DNA骨架上的缺口，但不能封闭裂口。缺口（nick）：即在双链DNA的某一条链上两个相邻核苷酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的单链断裂； 9、常用连接酶：E.coli DNA 连接酶、T4 DNA 连接酶（常用）。既能进行粘性末端的连接，又能进行平末端的连接，但E.coli DNA 连接酶进行平末端连接的效率低。 10、DNA连接酶的连接条件：必须是两条双链DNA、一条链的3‘末端有游离的羟基（-OH），而另一条链的5’端具有一个磷酸基团（-P）、需要能量（ATP或NAD+）。 11、T4多核苷酸激酶：是一种磷酸化酶，可将ATP的磷酸基团转移到DNA或RNA的5‘末端。1）5‘加磷酸基团。对于缺乏5‘磷酸的DNA或合成接头进行磷酸化。2）末端标记。 12、末端转移酶TDT 来源：小牛胸腺活性：不依赖模板的DNA 聚合酶，能催化dNTP 掺入DNA 3′-OH 末端。当反应液中只有一种脱氧核苷酸时，可形成仅有一种核苷酸组成的3′尾巴，称之为同聚物加尾。功能：1）主要用于给外源DNA片段及载体分子加上互补的同聚物尾巴，便于连接。2）末端标记 13、碱性磷酸酶：细菌碱性磷酸酶（bacterial alkaline phosphatase，简称BAP）、小牛肠碱性磷酸酶（calf intestinal alkaline phosphatase，简称CIP）特性：催化除去DNA或RNA 5′端的磷酸基团。功能：1）DNA分子片段5′末端的去磷酸化，防止自身连接。2）可作为5′-末端标记的DNA片段。 14、分子杂交技术：分子杂交是用于检测混合样品中特定的核酸分子和蛋白质分子是否存在，以及其相对分子质量的大小的一种方法。杂交技术：是利用DNA分子的变性、复性以及碱基互补配对的高度精确性，对某一特异性DNA序列进行探查的技术。 15、Southern杂交(预杂交、杂交、洗膜) 分子杂交：预杂交：将结合了DNA 分子的滤膜先与特定的预杂液进行预杂交，也就是将滤膜的空白处用鱼精DNA 或牛奶蛋白封闭起 《医用基因工程》复习思考题 第一章基因和基因组及基因工程的概念 一、名词概念 ①移动基因(插入序列；转位子)；②断裂基因；③RNA剪辑； ④内含子(间隔序列)与表达子；⑤重叠基因；⑥重复序列；⑦假基因；⑧启动子与终止子；⑨起始位点、终止位点。 二、讨论题 1.什么叫基因?何谓基因的新概念?基因的主要功能是什么? 2.一种基因一种酶的提法妥否？ 3.基因密码子三联体间是否存在着逗号？ 4.基因表达的产物中，氨基酸序列相同时，基因密码子是否一定相同？为什么？ 5.何谓转位子和转位作用?转位的后果如何? 6.基因中最小的突变单位和重组单位是什么？ 7.基因工程应包括哪些内容？何谓基因工程的四大里程碑和三大技术发明? 8.真核细胞基因组中常有内含子存在，能否在原核细胞获得表达？能，为什么？不能，为什么？ 第二章基因工程中常用的工具酶 1.什么是限制性核酸内切酶？ 2.什么是R/M现象？如何解释？ 3.II型核酸内切酶的基本特点有哪些？ 4.影响II型核酸内切酶活性的因素有哪些？如何克服和避免这 些不利因素？ 5.DNA连接酶有哪两类？有何不同？ 6.甲基化酶有哪两类？有何应用价值？ 7.什么叫同尾酶、同裂酶？在基因工程中有何应用价值？ 8.平末端连接的方法有哪些？(图示) 9.Klenow酶的特性和用途有哪些？举例说明。 10.反转录酶的特性有哪些？有何应用价值？ 11.列举碱性磷酸酶BAP/CAP的应用之一。 12.列举末端核苷酸序列转移酶的应用之一。 13.质粒单酶切点的基因连接如何降低本底和防止自我环化和提高连接效率？ 14.基因片段与载体的平末端连接的方法有哪些？ 15.用寡核苷酸和衔接物DNA的短片段连接时为使基因内部的切点保护，常用何种办法解决？ 第三章基因克隆载体 1.基因工程常用的载体有哪5种？其共同特性如何？ 2.什么是质粒？质粒分哪几种？有哪两种复制类型，质粒的分子生物学特性有哪些？ 3.质粒存在的三种形式是什么？ 4.分离质粒的基本步骤有哪些？ 5.分离纯化质粒的方法有哪几种？简述CsCl密度梯度(浮密度)分离法、碱变性法的原理，如何选择合适的分离方法？ 6.作为理想质粒载体的基本条件有哪些？ 7.什么叫插入失活，举例说明之。 8.构建pBR322质粒载体的亲本质粒有哪些？ 9.什么叫插入型和替换型噬菌体载体?插入型和替换型入噬菌体 项目1 一、名词解释 基因、操纵子、外显子、内含子、启动子、增强子、终止子、SD序列、半保留复制、复制、转录、翻译、遗传密码 二、问答题 1.简述核酸的定义、分类、组成、结构。 2.核酸有哪些重要的理化性质？这些性质在基因操作中有什么作用？ 3.比较病毒基因组、原核生物基因组、真核生物基因组的特点。 4.简述DNA复制、RNA转录以及蛋白质翻译的过程及其参与的酶和蛋白因子的作用。 5.以大肠杆菌乳糖操纵子为例说明原核生物基因表达调控的特点。 项目2 一、名词解释 基因工程、基因操作技术、基因克隆、基因文库 二、问答题 1.基因操作的基本步骤是怎样的？每一步骤各需要哪些物质参与？ 2.目的基因克隆的方法有哪些？ 项目3 一、名词解释 质粒、电泳 二、问答题 1.简述提取核酸的基本步骤。 2.简述提取质粒DNA的经典方法的步骤及原理。 3.简述提取基因组DNA的经典方法的步骤及原理。 4.结合实验比较经典碱裂解法与试剂盒法提取质粒DNA的差异。 5.结合实训简述试剂盒法所加试剂的作用？ 6.简述测定核酸浓度和纯度的方法原理及步骤。 7．简述琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理、操作步骤、影响因素 8.结合DNA琼脂糖凝胶电泳实训简述所用试剂的作用。 9.简述SDS-PAGE电泳分离蛋白质的原理及操作步骤 项目4 一、名词解释 PCR、变性、变性温度、退火、退火温度、延伸、延伸温度、载体、质粒载体、λ噬菌体载体、病毒载体、克隆载体、表达载体、多克隆位点（MCS）限制性内切酶、回文结构 二、问答题 1.简述PCR反应的基本原理 2.简述PCR反应体系的组成和体系中各成分的作用 3.简述PCR的标准反应过程设定那些参数？其中那个参数最为重要，需要在实际工作中优化。 4.简述PCR引物设计的原则。 5. 简述载体的概念、种类。 6.简述作为载体应具备的条件。 7.简述表达载体应该具备的条件 8.简述 噬菌体载体的特点及其类型基因工程名词解释总
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