简述cDNA文库构建的方法
简述cDNA文库构建的方法
1．1 mRNA纯化
构建一个cDNA文库的第一步是分离在某一给定的组织或细胞类型表达的mRNA。mRNA仅占细胞总RNA的1%～5%，因而需要另外的纯化技术来富集mRNA。从细胞总RNA中分离mRNA是根据实际上所有真核细胞mRNA 3’端有一长的伸展的腺嘌呤核苷，这个序列被称为poly(A)尾巴，是mRNA分子特有的而其他主要RNA 没有，poly(A)尾通常有足够的长度因而能与人工合成的互补的寡脱氧胸苷酸（oligo(dT)）杂交。正是这种特性使得mRNA从RNA分子的混合物中分离出来。
方法有三种：
·寡脱氧胸苷酸亲和层析：即分离mRNA的标准方法，将一个寡脱氧胸苷酸（12~18碱基）连接到纤维素的亲和层析柱法，总RNA混合物上样后，mRNA与寡脱氧胸苷酸退火。非poly(A)RNA不结合并很容易从柱子洗去。用低盐缓冲液洗柱，己结合的mRNA很快洗脱出来。
·溶液杂交：本方案也用寡脱氧胸苷酸－纤维素，但不用层析柱，而是将基质直接加到总RNA溶液中。退火和洗涤步骤通过离心含有RNA沉淀的基质在溶液中完成。
·生物素标记寡脱氧胸苷酸和链霉亲和素包被磁性球珠：本方案中，一个生物素标记的寡脱氧胸苷酸酸引物在溶液中与总RNA退火，然后加入以链霉亲和素包被的磁性球珠，用磁分离器从大量溶液中分离球珠－mRNA复全体。移去磁分离器，加入洗脱缓冲液，并重复磁性分离步骤。在无盐的状态下，寡脱氧胸苷酸引物从mRNA上解离。
1.2cDNA的合成与克隆
1.2.1 cDNA第一条链的合成
所有合成cDNA第一条链的方法都要用依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）来催化反应，有两个关键的因素，一个是mRNA模板，另一个反转录酶。
目前商业化的反转录酶主要有两种：一种是禽源反转录酶(reverse transcriptase)，另一种是鼠源反转录酶。两种酶都无3’－5’外切酶活性，但禽源反转录酶有很强的RNAase H酶活性，鼠源的具有相对较弱的RNAaseH酶活性。RNAase H酶活性在反应中起负作用，可降解mRNA分子末端的poly(A)序列和cDNA-RNA杂交分子中的RNA。因此一般反转录过程都是采用鼠源反转录酶。GIBCO-BRL公司出品一种鼠源反转录酶，称为SUPERSCRIPT反转录酶，缺少C-末端180个氨基酸，完全去除了其RNAase H酶活性，保持完整的DNA聚合酶活性。
1.2.2 cDNA第二条链的合成
合成cDNA第二条链的传统方法是“自身引导法”，即将第一条链合成过种中形成的cDNA/RNA杂交分子变性，降解RNA，则单链cDNA分子的3’末端自身环化，形成发卡结构。以此为引物，在DNA聚合酶作用下合成第二条链。所得到的产物是双链cDNA，在其相当于mRNA5’端的地方有一发卡闭环结构。然后用单链特异性的SI核酸酶消化该环，得到可供克隆的双链cDNA分子。由于SI酶的消化反应难以控制，不可避免地导致对应于mRNA5’的序列出现缺失和重排，并造成克隆效率偏低，故该法基本上己被一些改进的方法所代替。主要的改进之处是在合成第一条链的反应体系中加入4mmol/L的焦磷酸钠，以抑制发卡结构的形成，这样便避免了使用SI核酸酶。然后再用其他方法合成第二条链的引物。
1.2.3 cDNA的克隆
dscDNA（双链cDNA）合成后，将此DNA与载体（质粒或噬菌体）组成重组分子，然后转化到受体菌中进行扩增。cDNA文库可用质粒载体或噬菌体载体构建。质粒文
库具有易于操作的优点，但质粒文库适于筛选10000到50000个重组子。噬菌体文库更适合于筛选较大数量（>100000）的重组子。载体的选择还必须考虑一种mRNA在细胞内的含量，即mRNA的丰度。如果要筛选的目的cDNA的mRNA是低丰度mRNA，要用噬菌体载体构建文库；如果是高丰度mRNA，则可用质粒载体。
1.2.4 重组子的筛选与鉴定
基因克隆的最后一道程序是从转化细菌菌落中筛选含有阳性重组子的菌落并鉴定重组子的正确性，通过细菌培养以及重组子的扩增，从而获得所需基因片段的大量拷贝，进一步研究该基因的结构，功能或表达该基因的产物。
重组子转化宿主细胞后，载体上的一些筛选标志基因的表达失活，会导致细菌的某些表型改变，通过琼脂平板中添加一些相应筛选物质，可以直接筛选鉴别含重组子的菌落。例如将cDNA克隆到多数载体是通过插入到载体分子上的β－半乳糖苷酶基因（lacZ）内完成的。在简便的噬菌斑测试中，插入的DNA破坏了lacZ基因的编码序列从而导致载体的表现型从蓝色（亲本）变成无色（重组子）。以这种方式可以很容易地确定出现在文库中的重组子。