小鼠表皮细胞的原代培养_细胞生物学

综合设计性实验报告

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实验六细胞培养

——小鼠表皮细胞的原代培养

摘要目的探讨体外分离和培养小鼠表皮细胞的方法。方法采用脱臼法处死新生小鼠，结合

酶消化法和组织块法对新生小鼠表皮细胞进行了体外分离、培养。（用眼科剪把新生小鼠表皮细胞组织剪成小于1mm3大小的植块，然后用胰蛋白酶消化5~10min，最后将组织块接种于培养瓶中进行体外培养。）结果新生小鼠表皮细胞克隆2~3d后开始形成［1］，细胞呈梭形，体外培养一个星期后仍能够保持良好的生长状态。结论采用该方法能够实现对小鼠表皮细胞的体外原代培养，并且细胞贴壁生长的速度比单纯采用酶消化法和组织块法大大提高。

关键词原代培养小鼠表皮细胞酶消化法组织块法

1前言

目的：初步了解动物细胞原代培养的基本方法、原理和基本操作过程，初步掌握无菌操作方法。意义：细胞培养技术目前已经广泛地被应用于生物学的各个领域。如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、病毒学等领域，已发展成为一种重要的生物技术。为此有必要使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的技术的基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，并对原代培养有一个基本概念。［2］方法：结合酶消化法和组织块法通过无菌操作培养新生小鼠细胞。结果：运用这种方法成功并比较快速地培养出原代表皮细胞。结论：这种方法为广泛开展表皮细胞原代培养奠定了基础。

2实验原理

原代细胞培养是指直接从动物体获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体取出所需的组织（或器官），用组织块培养法，在人工培养下，使其不断地生长及繁殖。

3实验用品

3.1器材

每小组：

解剖剪、镊1套；眼科剪7把、眼科镊6把；吸管（如有条件，吸管最好由可消毒移液器及其Tip取代）：直、弯头各7支，2 ml刻度吸管5支；吸管胶头：小18个、大6个；细胞培养瓶（或细胞培养皿）：小组人数+1个；青霉素瓶及瓶塞：小组人数+2个（其中一个用于分装胰酶液）；血细胞计数板1块, 盖玻片; 2～5ml注射器及注射针头1套；培养皿(用于解剖取材)：大、小各1套。烧杯：5～10ml 2个、100 ml 1个。分类彻底清洗、干燥、包装、消毒灭菌后备用（用于取材接种及培养）。

每大组共用：

用于分装培养用液：盐水瓶250 ml1个、100 ml2个（或100、50各1个），配套100 （或50ml）盐水瓶塞2个，1 ml刻度吸管2支，吸管胶头（小）2个，青霉素瓶及瓶塞1个/小组。

用于无菌操作：不锈钢杯子1个（作废液缸）；解剖镊1把，广口瓶大、小各1个（装消毒棉球），医用棉花、纱布，酒精灯1台、打火机1个。

用于装载及包装物品：有盖白瓷盘2个、消毒盒3个、牛皮纸、棉绳。小培养皿(装

盖玻片)1个。

用于超净工作台放置需多次使用的吸管：试管12支；试管架1个。

记号笔1支等。

3.2试剂

3.2.1清洗用液：5%稀盐酸、1%稀盐酸、2%NaOH、洗洁精、单蒸水、三蒸水、清洗液（用浓硫酸和重铬酸钾配制、全班共用）等。

3.2.2消毒剂（用前配制）：甲醛、高锰酸钾、新洁尔灭、75%酒精、碘酒、过氧乙酸等。

3.2.3 培养用液：

3.2.3.1 细胞培养用液（每大组100mL，用100mL盐水瓶装）：经过滤过的F10 （RPMI1640）培养基占80~90%、经过滤除菌的小牛血清占10~20%,加入经过滤除菌、终浓度各为100国际单位的抗菌素。

3.2.3.2细胞消化液（每小组1青霉素瓶，约5mL）：经过滤除菌的0.25%胰蛋白酶

或EDTA—胰蛋白酶液。

3.2.3.3平衡盐溶液：不含钙、镁离子的Hank液：每组约50mL，用50（或100）mL 盐水瓶装。

3.3 材料：新生小白鼠

4实验方法

4.1技术路线清洗玻璃仪器,胶塞→制备消毒棉球→包装分装培养液用液用品→

消毒分装培养用液用品→分装培养用液→包装原代培养接种用品→实验时的准备工作如小组所示→打开腹腔，切取小鼠皮肤组织块→洗去血污→剔除多余成份→剪成小于1mm3大小的组织块→胰蛋白酶消化组织块→接种组织块→贴壁→培养→观察和记录

4.2 实验步骤

1 玻璃仪器的初步清洗、开始培育小白鼠（第一批雌鼠与雄鼠混养、观察记录阴道口的情况等）

2 继续培养乳鼠（第二批雌鼠与雄鼠混养、观察记录阴道口的情况等），玻璃仪器的清洗（清洗液浸泡）、胶制品的清洗。

3 继续培养乳鼠（常规饲养工作）、完成清洗工作（包括各类物品）、制备消毒用棉球、包装分装培养用液用品。

4 继续培养乳鼠（常规饲养工作、留意小鼠的出生）、消毒分装培养用液用品、分装

培养用液、包装原代培养接种用品。

5 消毒原代培养接种用品

6 细胞原代培养［3］

(1)洗手操作者用洗涤剂刷洗双手→自来水冲净→新洁尔灭浸泡→进入无菌室

(2)准备工作：

［1］操作者于超净台用酒精棉球消毒双手，待酒精稍干后点燃酒精灯，然后用酒精棉球消毒工作面。

［2］去掉Hank液、细胞培养液、酶液的包装纸。

［3］打开试管、吸管胶头包装，将试管插（尽量斜插）入试管架

［4］取出需用的吸管（直、弯吸管各一支，刻度吸管一支）套上胶头，试管一支，插入相应的试管中。

［5］打开培养皿以及解剖工具手持端的包装

(7)处死小鼠(脱臼法) →消毒（放入含75%酒精的烧杯中浸泡数秒）。将以处死消毒的

小鼠转移至超净工作台的培养皿盖，背部朝上。培养皿倒扣于包装纸上待用。

(8)解剖取皮肤：用酒精棉球擦拭背部，在腰部后缘用解剖镊提起皮肤，用解剖剪呈T

形剪开皮肤，再用眼科剪切取皮肤组织块，置于无菌培养皿中。

(9)用Hank液洗涤皮肤组织2次，吸去Hank。

(10)剪碎组织块：换另一套眼科剪将组织块剪成小于1mm3的组织块（大小尽量一致）。

用Hank液洗涤，弃Hank液。

(11)酶消化：将胰蛋白酶液加入装有组织块的青霉素瓶中，盖紧盖子，置超净工作台

中消化5—10min，知道组织块变松软、粘稠状，颜色略变白色为止。

(12)将培养液直接加入盛有胰蛋白酶和皮肤组织块的青霉素瓶中，利用其中的牛血清

终止酶消化的作用，弃去酶液和培养液的混合液。加入培养液重复此操作2—3次。

(13)取一培养瓶，在培养瓶的上面做好标志（在瓶侧注明班、组别、、材料名称等信

息）

(14) 用培养液湿润的吸管小心吸取组织块,轻轻吹出到培养瓶的培养瓶面,按照一定

的间隔和形式用弯吸管将植块排列好

(15) 翻转培养瓶（培养面在上方），加入4ml的培养液。

(16) 将培养皿加盖封口,送入37度恒温箱,静置（加入的培养液不浸泡植块，不从瓶

口流出）

(17) 4小时后，待组织块充分贴壁后，翻转培养瓶使植块浸于培养液中且不漂浮；(18)

观察至于37度培养的细胞，需逐日进行观察，主要观察：

［1］培养物是否被污染，如培养液变为黄色且混浊，表示该瓶被污染。

［2］细胞生长与培养液颜色的变化，如培养液变为紫红色，一般细胞生长不好。

可能是瓶塞未盖紧或营养液pH过高。

［3］培养液若变为桔红色，一般表示细胞生长良好。

经过1～2天培养后，若细胞生长情况较差或培养液变红了，则可换一次营养液。换液时也要注意无菌操作（若经过1～2天培养后,若细胞生长情况较差或培养液变红,则需换液。

a 无菌室的准备工作如小组方案中所示

b 从37摄氏度培养箱中取出培养瓶，于超净工作台吸去全部旧培养液

c 用平衡盐溶液轻缓漂洗培养物1～2次,弃平衡盐溶液

d 加入与换液前相同的量的培养液

e 放回原来的培养箱继续培养

若经2～3天后，细胞营养液变黄，此时表示细胞已生长。每日观察结果用文字记录，换液也需记录，在整个培养过程的不同阶段（最少在前、中、后阶段）置倒置显微镜下观察细胞生长情况并拍照记录。

5实验结果

5.1.图片展示

图一:第二天小白鼠的皮肤组织的生长情况

生长情况（第一次换液后一天）

5.2.结果分析

形态学观察结果分离的表皮细胞，在培养3h后即能够充分贴壁生长。

（1）表皮细胞在生长的早期（24～48h）已有比较多的细胞进行了贴壁生长，细胞多数呈梭形，并且细胞状态较好（如图一所示）。这时，培养液变为橙黄色，

证明细胞已生长。

6 结果分析与讨论

本实验结合酶消化法和组织块法成功地培养出小鼠表皮细胞，并且相对单一采用酶消化法或者组织块法细胞贴壁生长的速度要大大提高了。原因是因为皮片经胰蛋白酶消化后，表皮很容易从真皮上分离下来。此时基底细胞联接较松散，把组织块放置于培养瓶中培养时，基底细胞即可轻易地游离到培养液中，然后在培养瓶底部进行贴壁生长。［4］而单纯的组织块培养没有经过酶消化，单个的细胞不易从组织块上脱落，因此细胞游离出来贴壁生长的速度比较慢。因此，通过该实验证明，经过酶消化进行的组织块培养的这种方法是一种改良后的细胞培养的方法，此方法培养的细胞不仅细

胞贴壁生长速度快，而且细胞生长的状态也很好。因此本实验成功地探讨出了一种细胞培养的方法，为以后的细胞培养提供了一种更加简便、更为可靠的方法，为广泛开展表皮细胞培养提供了基础。

7 参考文献

[1]王丽娟,耀兰等.小鼠表皮干细胞的分离与培养.生物技术通讯,Vol.22 No.3 May,2011.

[2]汉民.细胞生物学实验.第二版. :高等教育，1997.

[3]薜庆善.体外培养原理与技术［M］. :科学.2001.

[4]王亮.新生小鼠表皮细胞的培养.日用化学工业，第1期， 2001年2月.

原代细胞培养：原代肝细胞

【嘉美生物】肝是生物转化和蛋白质合成的主要器官，也是药物毒性作用发挥的主要场所。因此许多的体外测试都选用肝细胞来研究药物间的相互作用和其他一些生化过程。 嘉美生物用于培养原代细胞的组织采集于各大医院（包括协和医院、301医院、北三医院等），采集根据美国IRB 和HIPAA批准的方案进行。这些原代细胞均来自新鲜组织，并采用公司专利的技术来优化目的细胞生长条件，降低杂细胞（如脂肪细胞、纤维细胞等）的污染。分离的细胞经过短暂培养、传代，然后迅速冻存。这些保持分化状态的细胞可以用于评估体外药物模型系统和调节特定基因的遗传功能。 嘉美生物原代肝细胞产品均经过严格的QA/QC检测，可以直接用于药物优化和筛选、基因克隆、表达图谱分析以及各种分子生物学和药物学实验的研究。 凭借着先进的技术设备和资深的专业经验，嘉美生物能为您提供高品质的原代细胞产品和特殊的定制服务： 1、各种新鲜原代肝细胞 嘉美生物除提供多种人、小鼠、大鼠、猴等新鲜肝细胞产品外，嘉美生物还可以为您提供特定动物、特定组织、特定年龄的新鲜肝细胞定制服务。 2、各种原代细胞提取物 嘉美生物除提供的人、小鼠、大鼠、猴等四大类的肝微粒体、肝S9、CYP450酶和其他亚细胞提取物外，嘉美生物还可以为您提供专业的原代细胞提取物定制服务。 嘉美生物可以同时提供高质量的原代细胞产品和专业的个性化定制服务，为您的研究提供最新鲜优质的实验材料，提供其他原代细胞相关专业服务（原代肝细胞靶药分析服务、原代细胞靶药优化服务和原代细胞药物筛选等）。嘉美生物能完美整合各类原代细胞类服务，是原代细胞分离，原代细胞提供，原代细胞实验课题服务中的佼佼者。

原位移植法建立肝脏H22肝癌细胞移植瘤小鼠模型

World Journal of Cancer Research 世界肿瘤研究, 2015, 5, 15-20 Published Online January 2015 in Hans. https://www.wendangku.net/doc/cf8589537.html,/journal/wjcr https://www.wendangku.net/doc/cf8589537.html,/10.12677/wjcr.2015.51003 Orthotropic Transplantation to Establish H22 Hepatocellular Carcinoma Model in Mice Chen Han1,2, Hengxiao Wang1,2*, Zhaoxia Wang3 1Department of Immunity, Institute of Basic Medicine, Shandong Academy of Medical Sciences, Ji’nan 2School of Medicine and Life Sciences, University of Jinan-Shandong Academy of Medical Sciences, Ji’nan 3Department of Pathology, Institute of Basic Medicine, Shandong Academy of Medical Sciences, Ji’nan Email: *wanghengxiao@https://www.wendangku.net/doc/cf8589537.html, Received: Nov. 24th, 2014; revised: Dec. 22nd, 2014; accepted: Dec. 30th, 2014 Copyright ? 2015 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). https://www.wendangku.net/doc/cf8589537.html,/licenses/by/4.0/ Abstract Objective: To establish a liver orthotropic transplantation tumor model with H22 cells, for the further development of the related experimental study. Methods: A certain number of H22 cells were directly injected in the left lobe of the liver in C57BL/6 mice, establishing a transplanted tu-mor model of hepatocellular carcinoma in situ. Results: After 7 days of surgery, the liver surface appeared irregular size nodules, nodules increased with the prolongation of time increases, the late abdominal organs appeared invasion, adhesion, ascites was increased. Histopathological ex-amination of liver tumor tissues and adjacent tissues of cancer showed that liver orthotropic transplantation tumor formation rate was 100%, no spontaneous regression. Conclusions: Ortho-tropic injection of H22 cell established orthotropic transplantation tumor formation in the liver, and the tumor formation time was relatively short, tumor formation processes associated with organ metastasis and ascites. This model was reasonable to simulate the pathological and physio-logical body of liver cancer in human, and could satisfy the requirement of research on liver can-cer. Keywords Hepatocellular Carcinoma, Orthotropic Transplantation, Experimental Animal Models 原位移植法建立肝脏H22肝癌细胞 移植瘤小鼠模型 韩琛1,2，王恒孝1,2*，王朝霞3 *通讯作者。

细胞生物学实验三 小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数(山东大学)

实验三小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数 13生物基地 201300140059 刘洋 2015-04-06 同组者：吕赞洪俊蔡正琦 一、实验目的 1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体方法，并对小鼠脾细胞进行原代培养。 2.掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用。 3.学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法。 4.学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数。 二、实验原理 1.细胞培养 细胞培养指的是在无菌条件下，把动植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 细胞培养的意义:具有其他生物技术无可比拟的优点；培养条件易改变和控制，便于单因子分析；便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察；在生物学的各个领域(如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等)已被广泛应用。 细胞培养的局限性：在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有一定距离；观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况；细胞培养得到的产物少。 培养细胞的条件有水的质量、无菌环境，最适温度、渗透压、气体条件、最适PH、营养条件和培养基质等。 2.细胞死活鉴定 细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。 活细胞和死亡细胞在生理机能和性质上主要存以下差异： ①细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作 用，只允许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。基于此，发展出了以台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化乙啶等为染料鉴别细胞生死状态的方法，上述染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。此外，应用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生死状态。活细胞的原生质具有选择透过性，死细胞因其原生质的选择透过性已遭破坏，故与高渗透压溶液接触

细胞生物学笔记-第三章细胞生物学研究方法

第三章细胞生物学研究方法 如何学习细胞生物学？ ?抽象思维与动态观点 ?结构与功能统一的观点 ?同一性(unity)和多样性(diversity)的问题 ?细胞生物学的主要内容： 结构与功能（动态特征）； 细胞的生命活动； ?实验科学与实验技术——细胞真知源于实验室 ——What we know//How we know. 第三章细胞生物学研究方法 细胞形态结构的观察方法 细胞组分的分析方法 细胞培养、细胞工程与显微操作技术 第一节细胞形态结构的观察方法 光学显微镜技术（light microscopy）

电子显微镜技术(Electro microscopy) 扫描探针显微镜（Scanning Probe Microscope） 扫描遂道显微镜(scanning tunneling microscope ) 第二节细胞组分的分析方法 离心分离技术 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法 特异蛋白抗原的定位与定性 细胞内特异核酸的定位与定性 放射自显影技术 定量细胞化学分析技术 第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术 细胞的培养 细胞工程 一、光学显微镜技术（light microscopy) 普通复式光学显微镜技术 荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy）

激光共焦扫描显微镜技术（Laser Confocal Microscopy） 相差显微镜（phase-contrast microscope） 微分干涉显微镜 （differential interference contrast microscope, DIC） 录像增差显微镜技术（video-enhance microscopy） 二、电子显微镜技术 电子显微镜的基本知识 电镜与光镜的比较 电镜与光镜光路图比较 电子显微镜的基本构造 主要电镜制样技术 负染色技术 冰冻蚀刻技术 超薄切片技术 电镜三维重构技术 扫描电镜（Scanning electron microscope，SEM） SPM(Scanning probe microscope) 三、扫描遂道显微镜 Scanning Probe Microscope,SPM (80年代发展起来的检测样品微观结构的仪器) 包括：STM、AFM、磁力显微镜、摩擦力显微镜等 原理：扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产生彼此间相互作用力，如 量子力学中的隧道效应（隧道电流）、原子间作用力、磁力、摩擦力等， 并在计算机显示出来，从而反映出样品表面形貌信息、电

原代小鼠肝细胞制备

细胞培养室肝细胞原代培养标准操作规程 实验试剂 培养基：William’s E Medium(GiBCO 12551-032), 谷氨酰胺(GiBco 21051-024-100g)292mg/L，双抗（GiBco 15140-122 penicillin +10,000Units/mL, streptomycin +10,000μg /mL）5mL/500mL, 胰岛素(GiBCO 12585-014 4 mg/mL)8μg/mL, 地塞米松（中国药品生物制品检定所）5mg/L。 D-Hanks’液（CaCl2 0.55g/L, NaCl 8.0g/L, KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06g/L, Na2HPO4?7H2O 0.06g/L, NaHCO3 0.35g/L, 三蒸水溶解，NaHCO3调pH 7.2-7.4, 4℃保存） 0.05%胶原酶Ⅳ溶液(（Sigma C5138-1G） D-Hanks’液溶解, 0.22μm微孔滤膜过滤除菌, -20℃ 保存）) PBS预灌流溶液（NaCl 8.0g/L, KCl 0.2g/L, KH2PO40.2g/L, Na2HPO4?7H2O 1.56g/L, EDTA 0.1mM, 三蒸水溶解, NaHCO3调pH 7.2-7.4, 0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存） 鼠尾胶原（GiBCO A10483-01 20mL/ 瓶）（0.05 mg/ mL）用0.02M 的醋酸稀释,临用现配） 0.02M 的醋酸：115μL的醋酸(大于99%)用水稀释至100mL 0.05 mg/ mL-200μL鼠尾胶原（5 mg/ mL）用0.02M的醋酸稀释至20 mL Overlay(0.25 mg/ mL的Matrigel（BD 356237）(用William’s E Medium稀释，视具体批号而定稀释倍数，临用现配） Hanks’液（CaCl2 0.14g/L, NaCl 8.0g/L, KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06g/L, MgCl2?6H2O 0.10g/L, MgSO4.7H2O 0.10g/L, Na2HPO4?7H2O 0.09g/L, NaHCO3 0.35g/L, D-葡萄糖 1.0 g/L，三蒸水溶解，NaHCO3调pH 7.2附近，4℃保存） 实验仪器 CO2 恒温培养箱（日本SANYO 公司）； Sigma高速离心机； IX-51 型荧光倒置显微镜（日本尼康公司）； DHL-A电脑恒流泵（上海青浦沪西仪器厂）； 液相-质谱联用分析系统（LC/MS/MS）由美国Thermo系列四元泵、在线脱气机、自动进样器、以及Thermo Finnigan LTQ线性离子阱质谱检测器，系统工作软件为XcaLibur（美国）； Sigma5310离心机； ZHWY-103B多振幅轨道式恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）。 实验方法 实验准备

原代肝细胞培养

原代肝细胞培养 原代肝细胞培养 1．实验材料 灌流液：NaCl、KCl、NaH2PO4.2H2O、Na2HPO4.H2O、NaHCO3、HEPES、EDTA、Glucose （国药或阿拉丁）。 消化液：Collagenase IV（Yeasen，翊圣生物，产品货号：40510ES60，100 mg ，279￥）、CaCl2。 Percoll：Percoll（GE Healthcare，17-0891-02）我买的是分装的100ml，450￥的17-0891-01-1。麻醉剂：10%水合氯醛。 实验器材：200目细胞筛、20ml 注射器、头皮针、手术剪3把、手术镊3把（实验前灭菌），细胞培养皿2个，离心机，实验前备冰盒及水浴锅，鼠板及大头针（实验前酒精及紫外消毒）。 2. 实验前准备 1) 灌流液 Perfusion Solution NaCl KCl NaH2PO4.2H2O Na2HPO4.H2O NaHCO3 HEPES EDTA Glucose 离子）。用前37℃温育。 每只老鼠消耗15ml灌流液。 2）消化液 100× CaCl2：560mg CaCl2，加入10 ml PBS/ ddH2O，分装-20℃保存。10× CollagenaseIV：100 mgCollagenaseIV粉末溶于20 mlDMEM（无血清），0.22 uM滤膜过滤除菌，每管1.5ml分装。 消化液：13.5 mlDMEM（无血清）加入150 μl100× CaCl2（终浓度5 mM），再加入1.5 ml10× CollagenaseIV（终浓度0.5 mg/ml），于37℃温育。 每只老鼠消耗15ml消化液。 3）40%Percoll g/L 8.0 0.4 0.078 0.151 0.35 2.380 0.19 0.9 调节pH 7.2-7.4，配好后过滤除菌。（不能高压灭菌，其中含葡萄糖及HCO3- 16.2 ml 100%percoll原液，加入1.8 ml10×PBS，再加入27ml 1×PBS，得45 ml。（等渗溶液） 每只老鼠消耗5-6 ml40%Percoll。

肝癌小鼠造模实验方法

肝癌小鼠造模实验方法 (1)肿瘤细胞悬液的制备小鼠肿瘤细胞用小鼠腹腔培养，然后抽取腹水，是 取得大量肿瘤细胞最便捷的方法。具体操作如下：将肿瘤细胞株复苏后，接种于babl/c （昆明小鼠）腹腔，培养8-10天后，接种小鼠的腹腔内长出含肿瘤细胞的腹水，选择腹水饱满的小鼠，在超净台内于无菌条件下消毒小鼠腹部，用注射器抽取淡腹水为瘤源，放入无菌容器内，加入无菌生理盐水稀释瘤液，小心摇匀，并置冰水上保存。若用多只动物做瘤源时，则应混合腹水。(腹水应为淡黄色浓稠液体，若为深黄色或红色则应弃去不用。) (2)肿瘤细胞计数取少量腹水，放置于干试管内，用生理盐水稀释100倍，用 枪头吸取少许腹水，滴于载玻片上，推片，镜下观察细胞形态：细胞为圆形，胞浆均匀，透明，折光性好，分布均匀。并于镜下进行细胞分类计数，其中肿瘤细胞数应≥95％。 (3)肿瘤细胞接种腹水用无菌生理盐水调整细胞浓度为1*107mL ，在小鼠右侧腋下(右侧腋窝 皮下？)常规接种H22瘤液0．2mL ／只(含2*106个瘤细胞)（5*106）？。全程严格无菌操作， 40min 内完成。 (4)分组与给药昆明小鼠用上法造模，造模后再将腹水瘤小鼠按体重分层，随 机分为阳性对照组(CTX)、青蒿素各剂量组(150mg ／kg 、300mg ／kg)、青蒿琥酯P0组(60mg ／kg)、青蒿琥酯ip 组(60mg ／kg)、青蒿醇提物和青蒿水提物各剂量组 (1000mg ／kg 、4000mg ／kg)和模型对照组(Model)，每组各lO 只小鼠。造模24h 后，阳性对照组(CTX)20mg ／kg 和青蒿琥酯ip 组(60mg ／kg)，腹腔注射0．2mL ／只，每天1次，连续lOd ：其它组灌胃给药，灌服溶液0．4mL ／只，每天1次，连续lOd 。模型对照组仅予等量CMC-Na 溶液，连续lOd 。平均每只小鼠每天给等量鼠料，每周换垫料2次，每日换新鲜水1次。记录各小鼠死亡的时间。 其他问题： 检测药物对肿瘤的抑制作用，给药时间怎么确定？ 1、 造模后第二天给药 2、 肿瘤长出一定体积后在给药

小鼠脾细胞培养实验

山东大学实验报告2011年3月30日 姓名张行润系年级 2009级生科4班学号同组者张少华 科目细胞生物学实验题目小鼠脾细胞培养实验仪器编号105 一、实验目的 了解原代细胞培养的基本方法及操作过程。学习细胞计数、营养液的配制等，初步掌握无菌操作方法。 二、实验原理 (一)细胞原代培养 原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分解成单个游离细胞，在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。 细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。 (二)细胞死活鉴定 死活细胞的鉴定方法有很多种，常用的有染色法和仪器分析法。染色法是常用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作。不同的死活细胞鉴定方法有各自不同具体的反应机理，但无论采用何种办法，都是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异。 染色法分化学染色法和荧光染色法，根据染色机理的不同，染料或使死细胞着色，或使活细胞着色。死活细胞在生理机能和性质上的差异主要包括： 死活细胞细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性的通过；而细胞死亡之后，细胞膜受损，通透性增加。常用的以台盼蓝鉴别细胞死活的方法就是利用了这一性质。台盼蓝，又称锥蓝，是一种阴离子型染料，不能透过完整的细胞膜。所以经台盼蓝染色后只能使死细胞着色，而活细胞不被着色。甲基蓝有类似的染色机理。植物细胞的质壁分离也可鉴定死活。 死活细胞在代谢上的差异：是采用美蓝染料鉴定酵母细胞死活的依据。美蓝是一种无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。由于活细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化性变为无色的还原型，因此美蓝染色后活的酵母细胞无色；而死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们的无还原能力或还原能力极弱，使美蓝处于氧化态，从而被染成蓝色或淡蓝色。 除此之外，还有一些细胞器的专有染料。如液泡系的专有染料中性红。中性红是一种低毒性染料，可以使活细胞液泡着红色，而细胞质和细胞核不被着色；死细胞的液泡不被着色或浅染，染料弥散于整个细胞中，细胞核和细胞质被染成红色。有时侯为了增加染色效果可以将两种染料结合使用，如甲基蓝-中性红混合染色法。 三、实验器材

4细胞生物学研究方法答案

第二章细胞生物学研究方法一、名词解释1、resolution：分辨力是指显微镜或人眼在25cm的明视距离处，能清楚地分辨被检物体细微结构最小距离的能力。能够区分的两点间的距离越小，表示分辨力越高。2、显微结构：通过光学显微镜所观察到的样品的各种结构，如细胞的大小、外部形态以及细胞核、线粒体、高尔基复合体、中心体等内部构成都属于显微结构。3、超微结构：也称亚显微结构。指在电子显微镜下所观察到的细胞结构，如细胞核、线粒体、高尔基复合体、中心体、核糖体、微管、微丝等细胞器的微细结构。4、细胞培养：指活细胞在体外的培养技术，即在无菌条件下，从机体中取出组织或细胞、模拟机体内正常生理状态下生存的基本条件，让它在培养皿中继续生存、生长和繁殖的方法。5、原代培养：指从机体组织中取材后接种到培养基中所进行的细胞培养，即直接取材于机体的细胞培养。所形成的细胞称原代细胞，它是在体外培养任何一种体细胞所必须经历的阶段和传代培养的基础。6、传代培养：指当原代培养的细胞在培养瓶中生长、增殖到一定密度后，一分为二或以其他比例分装或转移到2个以上的培养瓶中所进行的再培养。7、细胞融合：又称为细胞杂交，指细胞彼此接触时，2个或2个以上的细胞合并成为一个细胞的现象。8、cell line ：原代培养首次传代成功后，则称之为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系；已获无限繁殖能力，能持续生存的细胞系，则称为连

续细胞系或无限细胞系。二、选择题【A1型题】1、A；2、B； 3、B； 4、A； 5、C； 6、D； 7、A； 8、D； 9、C；10、D；11、C；12、A；13、A；14、B；15、C；16、A；17、E；18、A；19、C；20、D；21、C；22、E；23、A；24、D；25、B；26、E 【A2型题】1、E；2、D；3、C；4、D；5、A；6、B；7、C；8、D；9、D；10、A 【X型题】1、ACE；2、CDE；3、AE；4、CE； 5、ABCD； 6、ABC； 7、ABCED； 8、ACD； 9、ABCD 三、填空题1、普通显微镜相差显微镜暗视野显微镜荧光显微镜 2、照明系统光学放大系统机械装置系统 3、电子照明系统电磁透镜成像系统真空系统记录系统电源系统 4、物镜和照明系统的位置颠倒5、扫描电子显微镜透射电子显微镜6、0.1μm 0.1mm 3nm 7、差速离心法密度梯度离心法8、0.2μm R=0.61λ／N.A. N.A.=n·sinα／2 9、细胞化学法荧光细胞化学和免疫荧光镜检术放射自显影技术细胞显微分光光度测定技术流式细胞计量术细胞组分的分级分离法10、冰冻蚀刻11、原代培养传代培养 12、单层生长形态变成多态性具有接触抑制现象13、体外环境不能与体内的条件完全等同四、判断题1、√；2、×；3、√；4、×；5、√；6、×；7、√；8、√；9、√；10、×；11、√；12、×；13、×；14、× 五、简答题1、光学显微镜上调节光线强弱的装置有反光镜、聚光镜和光阑。（1）反光镜：反光镜是安装在镜台下面、镜柱前方的—面可转动的圆镜。用来调节光线，能将来自不同

原代肝细胞

原代肝细胞分离培养与方法 肝细胞的分离和培养是体外组合性生物人工肝研究的基础，但单纯机械分离法对肝细胞损伤较大，分离后的肝细胞体外培养的难度亦较大，方法复杂，成本较高 体外培养肝细胞的关键是如何分离得到形态完整、体外代谢活性高的肝细胞. 1 非酶分离细胞法 1．1 直接分离法：麻醉或处死动物后，取出肝脏，剪成小块，通过机械方法(挤压、剪碎、震荡、吹打)得到单个细胞，多与 EDTA螯合法、灌注法相结合，即先用 EDTA溶液进行充分的灌流，再剪成组织小块，然后用各种机械的方法分离得到肝细胞。该方法操作简单、流程短，不需要复杂仪器和昂贵的胶原酶。但实验操作对细胞的损伤大，尤其是造成细胞表面蛋白不可逆的机械性损伤，导致细胞的获得率和存活率较低。 1．2 组织块培养法：用麻醉剂 (乙醚、戊巴比妥纳等 )将动物麻醉或直接断头处死，取出肝脏，用缓冲液充分洗涤后，剥离肝被膜，将其剪成 1 mm。的组织小块，充分洗涤后，以 0．5 cm的间隔接种于培养器皿中(25 m L的培养瓶中可接种 3O块 )，先加入少量的培养基，静置培养 12～ 24 h后再加入足量的培养基。该操作过程短，污染少，损伤小，细胞成活率很高而成本低。但纯度不高，且形成典型上皮细胞层所需时间较长，在细胞爬出后还需剔除组织块，易造成二次污染。可能是因为成年动物的结缔组织比新生动物的结缔组织致密，肝细胞难以迁出，故此法多用于 1～ 6 d的新生动物或动物胚胎。 2．离体肝脏酶消化分离法 2．1 胰蛋白酶、胶原酶消化法：麻醉或处死动物后，取出肝脏，用缓冲液充分洗涤后，剥离肝被膜，将其剪成 1 mm。的组织小块，充分洗涤后，在 37℃下用胰酶或 (和)胶原酶消化，待消化物成蓬松的絮状物后加入培养基终止消化，吹打均匀后经 200目不锈钢网筛过滤后，离心、重悬即可获得肝细胞。胶原酶只消化细胞间质而对肝细胞机械性损伤较小，也能较完整地保存膜蛋白¨7]，分离效果好。肝细胞产率高、损伤小，且保持特异性功能的时间长。但胶原酶价格比较昂贵，成本高。胰蛋白酶既消化细胞问质又消化细胞本身，操作简单，价格便宜，但胰酶消化的条件极难把握而使该法未被广泛应用 L8．9_。 2．2 胰蛋白酶、胶原酶消化的组织块法：处死小鼠，无菌分离肝脏，置 D-Hanks液中，冲洗肝脏至灰白色，将肝脏剪成 1 mm。的组织块，在 37℃下用胰酶或(和)胶原酶消化后，加人培养基终止消化，自然沉降后，取下层组织块，再用培养基洗涤数次即可将肝组织块贴壁于培养瓶中，每个培养瓶放组织块 30~35块，加少许培养基。该法分离效果、纯度较单纯的组织块法好，且细胞从组织块爬出时间相对短。但消化酶的用量和时间不易控制：消化过度，形成的絮状组织块不能分离；消化不充分，酶没有发挥其作用[10~12]。 2．3 在体肝脏酶灌注法 2．3．1 Seglen灌注法：即经典的二步胶原酶灌注法。两步灌注即经门静脉以无钙缓冲液和胶原酶恒流、恒温灌注，这是目前国际上公认的方法。首先用不含 Ca 的离子螯合剂(EDTA等)移走肝组织中的 Ca ，从而打破固定细胞的细胞桥粒样结构；再用胶原酶进行蛋白分解

shRNA抑制CLIC1基因表达对小鼠肝癌细胞株Hca-F生物学行为的影响

shRNA抑制CLIC1基因表达对小鼠肝癌细胞株Hca-F生物学行为的影响

大连医科大学 博士学位论文 shRNA抑制CLIC1基因表达对小鼠肝癌细胞株Hca-F生物学行为 的景程 姓名：李荣宽 申请学位级别：博士 专业：病理与病理生理学 指导教师：唐建武 201006

shRNA抑制CLIC 1基因表达对小鼠肝癌 细胞株Hca．F生物学行为的影响 博士研究生：李荣宽指导教师： 唐建武教授专业 名称：病理学与病理生理学 摘要 背景：转移潜能是恶性肿瘤最重要的生物学特征之一，也是肿瘤患者死亡率高、预后差的主要原因。对于上皮来源的恶性肿瘤，淋巴道转 移是其早期转移的主要方式，但确切机制目前仍不清楚。原发性肝癌 (primary carcinoma of the liver)是最常见恶性肿瘤之一，包括肝细胞癌 (hepatocellular carcinoma，HCC)、肝内胆管上皮癌(intrahepatic cholangiocarcinoma，IHCC)、肝细胞及胆管上皮细胞混合癌三种细胞类 型，其中90％以上为肝细胞癌。全世界每年新发约62．6万例HCC患者， 其中的半数以上病例发生在我国。同时，它也是恶性程度最高、致死率 最高的肿瘤之一，位居全球恶性肿瘤死因第三位、我国恶性肿瘤死因第 二位。即便是经过根治性切除手术治疗，5年的复发转移率仍高达60％， 因此，揭示肝癌转移的分子机制及其关键调控环节，进而采取相应的干 预措施，将有助于减少、甚至避免病人术后发生复发转移，从而达到降 低死亡率的目的。 Hca．F和Hca．P是将小鼠肝癌细胞株H22在61 5小鼠体内反复接种和筛选后得到的一对来源于同一亲本细胞、但是淋巴道转移潜能显著 不同的小鼠肝癌腹水型细胞株。其中Hca．F具有高淋巴道转移潜能，接 种到6l 5小鼠体内后其淋巴结转移率超过70％，Hca．P是低转移潜能 的细胞株，其淋巴结转移率低于30％。通过对比研究二者的差异，可以 为我们揭示小鼠肝癌的淋巴道转移机制提供有益的参考。本课题组在前 期工作中已经应用不同的方法，对Hca．F和Hca．P这一对具有高低不通 淋巴道转移潜能的细胞株进行了一系列系统的研究。首先，利用抑制性 消减杂交技术(suppression substractive hybridization，SSH)及基因 芯片 (Genechip)高通量筛选(high throughput screen，HTS)技术得出了Hca．F 细胞和Hca．P细胞之间一系列差异表达基因，继而采用定量蛋白质组学技术建立了高低淋巴道 转移潜能小鼠肝癌细胞的荧光差异蛋白表达图

小鼠脾脏细胞原代培养

小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数 陈素君 200900140007 实验目的：了解原代培养的基本方法及操作过程。学习细胞消化、细胞计数、营养液的配制 及酸碱度的调节。初步掌握无菌操作方法。学会分辨死活细胞，掌握细胞计数。 实验原理：细胞培养是用无菌的方法将动物体内的组织（或器官）取出，模拟动物体内的生理条件，在体内进行培养，使其不断生长、繁殖，人们借以观察细胞生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。 细胞培养的突出优点，一是便于研究各种理化因素对细胞生长发育和分化等的影响，二是细胞培养便于人们对细胞内部结构（如细胞骨架等）、细胞生长及发育过程的观察。因而是探索和显示细胞生命活动规律的一种简便易行的实验技术，但是不可忽略它脱离了生物机体的一些变化。细胞培养分为原代培养和传代培养。原代培养是指直接从动物体内获得的细胞组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分散成单个游离的细胞，在人工培养的条件下，使其不断地生长及繁殖。 要细胞能在体外长期生长，必须满足基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。 台盘蓝氧化与还原型颜色不同，活细胞由于新陈代谢产生较强还原力，染色后呈无色，死细胞染色后呈蓝色。细胞计数以显微镜计数法进行，即将少量待测样品悬浊液置于特定的具有确定容积的载玻片上（计菌器），于显微镜下直接观察计数。 细胞浓度（个/ml）=4个中等方格内的细胞总数÷4×10000×稀释倍数。 实验用品： 一、器材 解剖剪、解剖镊、眼科剪、眼科镊、培养皿、纱布块、吸管、橡皮头、烧杯、移液枪、注射器、针头、Eppendorf管。上述器具彻底清洗、消毒、烤干、包装好 倒置相差显微镜、酒精灯、酒精棉球、试管架、解剖板 二、试剂 PBS缓冲溶液、培养液、台盘蓝 三、小白鼠 实验方法： 1. 细胞的原代培养 1.1断头法处死小鼠，将血放掉洗净，在酒精中浸泡3min消毒。 1.2在超净工作台无菌操作，将小鼠背朝下放在解剖板上，用镊子提起腹部皮肤，剪开。沿 开口向两侧斜着剪开，翻起皮肤露出腹腔，即可看到白色的胃。提起胃，找到后面条状的脾，用弯头镊子取出脾，将周围的脂肪组织去除。PBS缓冲液清洗1-2次待用。 1.3在无菌培养皿内加入PBS缓冲液30滴，用L型针头吸取PBS0.2mL注入小鼠脾脏，用针 头在脾脏上戳几个小孔，顺脾脏轻轻刮，从小孔挤出分散的细胞。 1.4将培养皿倾斜，使大块组织充分沉淀，吸取分散的细胞悬液2mL，1000r/min离心5min。

细胞生物学小鼠细胞培养实验报告

广州大学 综合设计性实验报告 学院生命科学学院 课程细胞生物学实验 实验项目细胞培养 实验题目小鼠肝细胞的原代培养 专业生物技术 年级、班别生技142 姓名徐嘉宽 学号 1414300030 任课教师陈鲲

细胞培养 ——小鼠细胞的原代培养 摘要目的探讨体外分离和培养小鼠肾、脑、心肌细胞的方法。方法采用脱臼法处死新生小鼠，结合酶消化法和组织块法对新生小鼠肾、脑、心肌细胞进行了体外分离、培养。（用眼科剪把新生小鼠心肌细胞组织剪成小于1mm3大小的植块，然后用胰蛋白酶消化5~10min，最后将心肌组织块接种于培养瓶中进行体外培养。脑和肾直接进行组织块培养。）结果比较成功地进行了原代肾、脑、心肌细胞培养，并进行了形态学观察。结论采用该方法能够实现对小鼠心肌、肾、脑细胞的体外原代培养，较好观察到心肌、脑、肾细胞的形态。 关键词原代培养小鼠细胞组织块法酶消化法 1前言 初步了解动物细胞原代培养的基本方法、原理和基本操作过程，初步掌握无菌操作方法。学习植块培养法、营养液的配置及酸碱度的调节。细胞培养是当前细胞生物学乃至整个生命科学研究与生物工程中最基本的实验技术。当前，细胞培养技术广泛应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，已发展成为一种重要的生物技术。了解动物细胞培养的技术的基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，并对原代培养有一个基本概念。结合酶消化法和组织块法通过无菌操作培养新生小鼠细胞。 2实验原理 原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），用植块培养法或酶解法，在人工培养下，使其不断地生长及繁殖。 细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要是细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。 3实验用品 3.1器材 解剖剪、镊1套；眼科剪7把、眼科镊6把；吸管直、弯头各7支，2 ml刻度吸管5支；吸管胶头：小18个、大6个；细胞培养瓶5个；青霉素瓶及瓶塞：6个（其中一个用于分装胰酶液）；培养皿(用于解剖取材)：大、小各1套。烧杯：5～10ml 2个、100 ml 1个。用于无菌操作：解剖镊1把，广口瓶大、小各1个（装消毒棉球），医用棉花、纱布，有盖白瓷盘1个、消毒盒3个、牛皮纸、棉绳。小培养皿(装盖玻片)1个。

小鼠原代肝细胞培养

一种改良的小鼠原代肝细胞培养方法 1材料与方法 1.1动物 2～4周龄BALB/C小鼠，雌雄不限（湖北省防疫站动物房提供）。 1.2试剂 D-hank's液； 消化液Ⅰ：含1 g/L胰蛋白酶、10 g/L聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyroli done, PVP)及0.3 g/L EDTA(武汉中健公司提供)； 消化液Ⅱ：含2 g/L胶原酶Ⅳ（上海华美生物工程公司提供）及10 g/L PVP； 基础培养液为DMEM，另含青霉素100u/ml、链霉素100 μg/ml、50 mmol/L HEPES、30 g/L谷氨酰胺（武汉中健公司提供）； 小牛血清（BS，GIBCO公司提供）； 培养基内其他因子：胰岛素5 μg/ml 、转铁蛋白5 μg/ml (上海华美生物工程公司产品)、促甲状腺素释放因子10－6 mol/L（Sigma公司产品）、促肝细胞生长因子20 μg/ml、氢化可的松10－6 mol/L（广东阳江制药厂产品）。 1.3鼠肝组织块培养 1）断头处死动物，置于75%酒精浸泡2-3分钟，无菌分离肝组织后均在冰浴下操作。2）肝组织用4℃D-hank's液（PBS）或不含BS的培养液洗净血污，剥除包膜及纤维成分； 3）将肝组织切为约1mm3小块，再用上述液体尽量洗去残留血污，最后一次清洗后800r/min离心4 min，弃上清， 4）加入消化液Ⅰ（5-6倍体积），37℃孵育12 min，再用培养液洗3次以清除胰酶。5）将消化好的肝组织块贴于25cm2培养瓶中，加少许含100 ml/L BS培养液置37℃、5% CO2条件下2～3h后再补充6 ml含100 m l/L BS培养液。待细胞长出生长晕后改为50 ml/L BS培养液。 1.4鼠肝细胞单层培养 动物和肝组织处理同上，加入消化液Ⅱ，置4℃过夜消化，去除消化液加含100 ml/L BS培养液，用滴管轻轻吹打成细胞悬液，经200目尼龙筛网过滤后用培养液洗2次，4 ℃50 g离心4 min，收集肝细胞，台盼蓝活细胞计数>80%,按5×105/ml密度接种，于37℃、5% CO2条件下培养，待细胞贴壁生长后改为50ml/L BS培养液。 或者： 1）断头处死动物，置于75%酒精浸泡2-3分钟，无菌分离肝组织后均在冰浴下操作。2）肝组织用4℃D-hank's液（PBS）或不含BS的培养液洗净血污，剥除包膜及纤维成分； 3）将肝组织切为约1mm3小块，再用上述液体尽量洗去残留血污，最后一次清洗后800r/min离心4 min，弃上清， 4）加入消化液Ⅰ（5-6倍体积），37℃孵育20 min，每隔5min振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离； 5）加入3-5mL含血清培养液以终止胰酶消化作用； 6）用100目筛网过滤，除去未消化的大组织块； 7）再次离心5min，弃上清； 8）加入无血清培养液5mL，冲散细胞，再离心一次，弃上清； 9）加入含血清培养液1-2mL（视细胞数量），血球计数板计数； 10）将细胞调整到5*105/mL左右，转移至6孔培养板中，37℃、5% CO2条件下培养。

细胞生物学复习全资料1

细胞生物学复习资料 第一章绪论 1.什么叫细胞生物学 细胞生物学是研究细胞基本生命活动规律的科学，它是在不同层次（显微、亚显微与分子水平）上以研究细胞结构与功能、细胞增殖、分化、衰老与凋亡、细胞信号传递、真核细胞基因表达与调控、细胞起源与进化等为主要容。核心问题是将遗传与发育在细胞水平上结合起来。 第二章细胞基本知识概要 一、名词解释 1.古核细胞：也称古细菌，是一类很特殊的细菌，多生活在极端的生态环境中。具有原核生物的某些特征，如无核膜及膜系统；也有真核生物的特征。 2.含子：是基因不编码蛋白质的核苷酸序列，不出现在成熟的RNA分子中，在转录后通过加工被切除。大多数真核生物的基因都有含子。在古细菌中也有含子。 3.外显子：指真核细胞的基因在表达过程中能编码蛋白质的核苷酸序列。 二、简答 1.真核细胞的三大基本结构体系 （1）以脂质及蛋白质成分为基础的生物膜结构系统； （2）以核酸（DNA或RNA）与蛋白质为主要成分的遗传信息表达系统 （3）由特异蛋白分子装配构成的细胞骨架系统。 2.细胞的基本共性 （1）所有的细胞都有相似的化学组成 （2）所有的细胞表面均有由磷脂双分子层与镶嵌蛋白质构成的生物膜，即细胞膜。 （3）所有的细胞都含有两种核酸：即DNA与RNA作为遗传信息复制与转录的载体。 （4）作为蛋白质合成的机器─核糖体，毫无例外地存在于一切细胞。 （5）所有细胞的增殖都以一分为二的方式进行分裂。 3.病毒与细胞在起源与进化中的关系并说出证明 病毒是非细胞形态的生命体，它的主要生命活动必须要在细胞实现。病毒与细胞在起源上的关系，目前存在3种主要观点： 生物大分子→病毒→细胞 病毒 生物大分子→ 细胞 生物大分子→细胞→病毒（最有说服力） 认为病毒是细胞的演化产物的观点，其主要依据和论点如下: （1）由于病毒的彻底寄生性，必须在细胞复制和增殖，因此有细胞才能有病毒 （2）有些病毒（eg腺病毒）的核酸和哺乳动物细胞DNA某些片段的碱基序列十分相似。病毒癌基因起源于细胞癌基因 （3）病毒可以看做DNA与蛋白质或RNA与蛋白质的复合大分子，与细胞核蛋白分子有相似之处

小鼠腹水型肝癌淋巴道转移实验

小鼠腹水型肝癌淋巴道转移实验 [摘要] 目的:1.通过可移植性小鼠腹水型肝癌淋巴道转移实验，从感性上认识肿瘤侵袭与淋巴道转移的生物学特性，了解肿瘤动物实验模型建立的过程及意义。2.进一步了解动物尸体解剖、组织取材、染色的过程。3.强化科研思维的培养及实验技能的训练。 方法:将高转移力小鼠腹水型肝癌细胞(HCa - F)经 615 小鼠右腋中线皮下接种，定期观察右腋皮下肿瘤的生长和同侧腋窝淋巴结及腹股沟淋巴结肿大情况，并于接种后 21 天处死全部小鼠，取皮下瘤体及双侧腋窝淋巴结，腹股沟淋巴结称重并测量大小，同时观察肿瘤的形态特点，生长方式，肺、肝、肾等脏器，并将瘤体、淋巴结及脏器做切片处理以作染色和镜下观察。 结果:21 天观察，实验使用 10 只小鼠，最终存活 8只，其中形成肿块 7 只（3只形成的肿块较大），成瘤率 70%，淋巴结转移率 70%。肉眼观察，较大肿瘤 2*1.5*1.3cm，灰白色，质地较硬，从中间切开，发现肿块大部分坏死，中心部分出现腔，腔内有肿瘤坏死物质。镜下观察，坏死组织粉染，轮廓尚存。残存肿瘤组织细胞存在异型性：瘤细胞大小和形态不一致，细胞核体积增大并呈现多形性，核浆比增大。核的大小、形状和染色不一。核分裂象增多，核浆比失调，胞浆减少。结论:高转移力小鼠腹水型肝癌细胞通过淋巴道转移，无器官转移，且具有高转移力。 [关键词]HCa-F（高转移力小鼠腹水型肝癌细胞); 615小鼠; 高淋巴道转移[前言]研究背景:原发性肝癌的发生率地区差异大，在亚非国家较常

见，我国的发病率较高，属于常见的肿瘤之一。近年来，我国对肝癌的防治研究取得了明显的成绩，一些直径在1cm一下的小肝癌已被发现并及时治疗取得满意的疗效[1]。随着临床治疗经验的积累，逐渐意识到即使是小肝癌根治性切除，转移复发仍然是一个十分严峻的问题，术后 5 年复发率可高达 50% 。 存在的问题:本次试验采用的方法是将瘤细胞移植于615小鼠右腋中线皮下，观察肿瘤生长及转移状态[2]。所以移植瘤没有展现自发性肿瘤从正常组织转变成肿瘤、随后出现转移的全过程,没有了解疾病完整的自然史。 实验的意义:为了探究肝癌的实质性问题，即肿瘤本身的生物学特性，尤其是其转移的生物学特性，本次试验对肝癌转移的生物学行为进行实验性研究。即将肿瘤细胞直接接种到小鼠的皮下组织然后观察肿瘤细胞在小鼠体内的生长及转移情况。它基本上模拟了从肿瘤生长到转移瘤形成的一系列步骤，又涉及宿主的反应性，因此结果可靠，近似于临床病人的实际情况，对提高恶性肿瘤患者的生存率和预后有重要的意义[3]。 [正文] 一、材料 1、细胞系：高转移力小鼠腹水型肝癌细胞，由大连医科大学病理教研室建株并保存。 2、实验动物：近交系615小鼠，雌雄兼用，6-8周龄，体重18-22g，由大连医科大学实验动物中心提供。