微载体培养技术的研究与进展

微载体培养技术

微载体培养技术 (microcarrier culture technique) 一、微载体培养应用此技术于1967年被用于动物细胞大规模培养。经过三十余年的发展，该技术目前已渐日趋完善和成熟，并广泛应用于生产疫苗、基因工程产品等。微载体培养是目前公认的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术，其兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，放大容易。目前微载体培养广泛用于培养各种类型细胞，生产疫苗、蛋白质产品，如293细胞、成肌细胞、Vero细胞、CHO细胞。 使用较多的反应器有两种：贝朗公司的BIOSTAT?B反应器，使用双桨叶无气泡通气搅拌系统；NBS公司的CelliGen、CelliGen PlusTM和Bioflo3000反应器，使用Cell-lift双筛网搅拌系统。两种系统都能实现培养细胞和收获产物的有效分离。 二、微载体是指直径在60-250μm，能适用于贴壁细胞生长的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。自Van Wezel用DEAE-Sephadex A 50 研制的第一种微载体问世以来，国际市场上出售的微载体商品的类型已经达十几种以上，包括液体微载体、大孔明胶微载体、聚苯乙烯微载体、PHEMA微载体、甲壳质微载体、聚氨酯泡沫微载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体等。常用商品化微载体有三种：Cytodex1、2、3，Cytopore和Cytoline。 ●微载体的大小：增大单位体积内表面积（S/F）对细胞的生长非常有利。使微载体直径尽可能小，最好控制在100-200μm之间。 ●微载体的密度：一般为1.03-1.05g/cm2，随着细胞的贴附及生长，密度可逐渐增大。 ●微载体的表面电荷：据研究，控制细胞贴壁的基本因素是电荷密度而不是电荷性质。若电荷密度太低，细胞贴附不充分，但电荷密度过大，反而会产生“毒性”效应。 三、微载体培养原理与操作 1.原理：其原理是将对细胞无害的颗粒-微载体加入到培养容器的培养液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。 贴壁依赖性细胞在微载体表面上的增殖，要经历黏附贴壁、生长和扩展成单层三个阶段。细胞只有贴附在固体基质表面才能增殖，故细胞在微载体表面的贴附是进一步铺展和生长的关键。黏附主要是靠静电引力和范德华力。细胞能否在微载体表面黏附，主要取决于细胞与微载体的接触概率和相融性。 2. 搅拌转速：由于动物细胞无细胞壁，对剪切力敏感，因而无法靠提高搅拌转速来增加接触概率。通常的操作方式是：在贴壁期采用低搅拌转速，时搅时停；数小时后，待细胞附着于微载体表面时，维持设定的低转速，进入培养阶段。微载体培养的搅拌非常慢，最大速度75r/min。 3.细胞与微载体的相融性，是与微载体表面理化性质有关。一般细胞在进入生理PH值时，表面带负电荷。若微载体带正电荷，则利用静电引力可加快细胞贴壁速度。若微载体带负电

刺激响应性药物传递载体的研究进展

刺激响应性药物传递载体的研究进展 智能、可控、高效的刺激响应性药物传递载体是当今药物传递系统的研究及临床实验的热点。本文以”基于体内微环境”与”利用环境外加刺激激发”为主线，综述了几类重要的刺激响应性的药物传递载体材料。介绍了体内微环境信号如pH、温度、氧化还原电势、葡萄糖及酶响应性载体，环境外加刺激如电信号、光信号及超声信号响应性等体系及多响应性载体在药物传递系统中的应用。总结了药物传递系统的发展方向及亟待解决的问题，从科学研究及临床治疗角度介绍了药物传递系统的发展方向。 标签：药物传递；刺激响应；体内环境；外加刺激 药物传递系统（Drug Delivery System DDS）是现今科学领域的重点攻关项目，在各类生物医用材料研究中，大多数与药物（或者基因）传递相关。目前，药物传递系统研究的主要任务是：①控制药物在体内的持续作用时间及作用等级。②将药物靶向引导到人体中特定的区域或细胞。③克服某种不可避免的组织（如肺、皮肤和小肠等）对药物的阻碍作用。 为了实现这些目标，医学科学家设计了一系列的药物释放载体并取得了一定的效果。若想取得更加理想的效果，智能型药物传递载体显示出了更大的潜力。本文主要分别从”基于体内微环境的响应性载体”和”基于外加刺激信号的响应性载体”来综述目前刺激响应载体的研究进展。 1基于体内微环境的响应性载体 1.1 pH响应性载体人体的消化道有着明显的pH值变化，胃部的pH在2～3而在小肠出pH值升至8左右。基于此变化，简单的以聚丙烯酸PAA类水凝胶为载体包载胰岛素，由于在胃部pH较低，PAA的羧基不发生电离，整个水凝胶紧紧包裹着胰岛素，保护其不被胃液消化。一旦水凝胶来到小肠，pH升高致使PAA的羧基开始电离，整个体系溶胀，便可以通过简单的设计将胰岛素特异性的释放在小肠环境中。目前，大多数针对肿瘤治疗的pH响应性载体是基于肿瘤外部酸性微环境及内部溶酶体酸性微环境的，其中以”质子海绵效应”类载体为代表（可以在酸性下吸收氢离子，使得细胞浆大量渗透进入溶酶体中，最终使溶酶体破裂将药物释放入细胞浆中的一种机理。）发展出了一系列高效的药物及基因载体。 1.2温度响应性载体对于局部温度较高的区域如炎症与肿瘤组织附近，研究人员设计了一种存在低临界共溶温度（LCST）的聚N-异丙基丙酰胺（PNIPAm）类材料。通过调控其分子链的链段结构，使其在人体较高温度下产生亲水-疏水转变。利用材料的亲水-疏水转变，可以成功的控制载体聚集起效的位置，从而定点的释放出药物。利用温度响应性材料与光热试剂的有机整合体为治疗基体，利用外加辐射作为辅助治疗方法，将可以定点定量的对病灶进行清除。

慢病毒载体及其应用的研究进展_毛颖佳

中国图书分类号Q782R392.11文献标识码A文章编号1004-5503（2009）02-0196-05【综述】 慢病毒载体及其应用的研究进展 毛颖佳综述郑源强石艳春审校 【摘要】与其他载体相比，慢病毒载体具有携带基因片段容量大、转染效率高、可感染分裂细胞及非分裂细胞、目的基因可在宿主细胞中长时间稳定表达以及安全性好等诸多优点，现已成为转移目的基因的理想载体。本文主要就慢病毒载体及其在基因治疗、生物医药与科学研究等领域的研究进展作一综述。 【关键词】慢病毒载体；基因治疗 Progress in Study on Lentiviral Vectors and Their Application MAO Ying-jia,ZHENG Yuan-qiang,SHI Yan-chun（Research Center of Molecular Biology,Inner Mongolia Medi－cal College,Huhehot010059,China） 【Abstract】Nowadays lentiviral vectors（LVs）is the only desire ideal genetic vector system which affords both efficient and sta－ble gene delivery.In contrast to other vectors,LVs can persist in dividing and non-dividing cells.Their virtues also include large ca－pacity of interested gene fragment and satisfied safety.The development of LVs and their application in gene therapy,biological prod－ucts and scientific research are reviewed in this paper. 【Key words】Lentiviral vector;Gene therapy 慢病毒（Lentivirus）属逆转录病毒科（Retrovidae），为RNA病毒。慢病毒载体（Lentiviral vector／len-tivector，LV）来源于包括人类免疫缺陷病毒、猫免疫缺陷病毒、猴免疫缺陷病毒、马传染性贫血病毒在内的许多物种，由于与其他载体相比有诸多优势，现已成为理想的基因转移载体，广泛应用于基因治疗、疫苗生产以及科学研究等领域。 1.慢病毒载体的发展 1.1病毒载体概述：载体是供插入目的基因并将其导入宿主细胞内表达或复制的运载工具。目前所用的载体按来源，可分为病毒载体和非病毒载体。与非病毒载体相比，病毒载体具有转染效率高、可在体内稳定表达等优点。目前，最常用的病毒载体是经过人工改建、携带有正常人类DNA的病毒。它充分利用了病毒高度进化所具有的靶细胞定向感染性、宿主细胞寄生性以及高转导效率的特点，因而成为基因治疗研究和临床应用的主要工具。但目前常用的病毒载体如逆转录病毒载体，由于可因随机整合引起插入突变、病毒颗粒可经免疫反应而迅速降解、经其携带进入宿主基因组的外源基因容易发生基因沉默等原因，限制了其应用；而腺相关病毒由于感染效率低，目的基因瞬时表达以及单链基因组在整合之前需要形成双链DNA而限制了其应用。因此，很多学者把目光投向了以Ⅰ型人类免疫缺陷病毒（HIV-1）为代表的慢病毒载体的研究［1］。 1.2慢病毒载体：慢病毒属逆转录病毒科，为二倍体RNA病毒。早期的慢病毒载体主要来源于HIV-1［2］，之后出现了以猫免疫缺陷病毒（Feline imm-unodeficiency virus，FIV）为代表的非灵长类慢病毒载体系统［3］。随着生物技术的发展，慢病毒载体系统得到了极大的发展，相继发现了各种有蹄类动物的慢病毒，包括马传染性贫血病毒（Equine infectious anemiavirus，EIAV）［4］、山羊类关节炎-脑炎病毒（Caprine arthritis-encephalitis virus，CAEV）［5］、牛免疫缺陷病毒（Bovineimmunodeficiency virus，BIV）［6］和绵羊髓鞘脱落病毒（Visna virus）［7］等。非灵长类慢病毒载体在人类基因治疗中的相关生物安全性问题尚需进一步研究和证实，例如亲代病毒能否在人体完成复制或引起人类疾病。而随着人们对HIV-1更加深入的了解，现已有20多种抗逆转录病毒药物可以用于抑制HIV-1来源的具复制活性的逆转录病毒（Re-plication competent retrovirus，RCR）［8］。因此，目前最令人关注的是以HIV-1为基础构建的慢病毒载体。 慢病毒载体是以慢病毒基因组为基础，除去其复制所需的基因，以治疗性基因和选择性标记物构建而成，转移基因片段容量大，无毒性且不易诱发宿主免疫反应，安全性较好，不仅能感染分裂细胞，且能 基金项目：教育部"春晖计划"（Z2007-1-01004）；内蒙古医学院重大项目（NY2006ZD005）. 作者单位：内蒙古医学院分子生物学研究中心（呼和浩特010059）. 通讯作者：石艳春，E-mail：ycshi5388@https://www.wendangku.net/doc/cf9723150.html,

专题八作业：基因治疗中病毒载体的研究进展

专题八作业：基因治疗中病毒载体的研究进展？ 基因治疗自1990年成功应用于重症联合免疫缺陷综合征(SCID-X1)患者的治疗，已走过了十几个年头，给人类一些疑难杂症如肿瘤的治愈带来了曙光。但其发展却屡遭挫折，比如近来发现经基因治疗的SCID-X1患者之一出现了类白血病反应，可能是基因随机整合染色体所致，使得人们不得不以怀疑的目光审视它的成长。而基因载体是阻碍其发展的主要因素，主要表现为安全性、靶向性、转染效率不高及表达时问短等问题。病毒载体是目前临床基因治疗中应用最多的载体，各种病毒载体有自身的利弊，除了对它们的选择外，病毒载体只有通过自身的不断改造完善，才能更好的服务于基因治疗，进而真正造福于人类。 1 逆转录病毒(retrovirus vectors，RVJ载体 逆转录病毒载体基因转移系统包括两部分：一部分是用外源基因替换病毒结构基因的逆转录病毒载体；另一部分是包装细胞的基因组DNA中整合了逆转录病毒结构基因。1990年世界上首例临床基因治疗采用的就是逆转录病毒载体n]。到目前为止，RV载体是基因治疗临床试验使用最多的载体，较常用的是基于moloney鼠白血病病毒(MMLV)改造而来的各种Rv载体。RV载体具有基因表达持久而稳定、转染效率较高等优点，但只能感染分裂期细胞，载体容量<8kb，与宿主细胞基因组的随机整合可引起基因突变及产生可复制的野生型病毒等危险，故需要进一步的改造完善。将水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)整合于逆转录病毒包膜中能加速各种宿主细胞对其进行膜融合和内吞，具有广泛的宿主范围和更高的转染效率，可高效的转染静止细胞，并能抵抗血清补体灭活的作用。诸多的优点使该载体在造血系统疾病和肿瘤的基因治疗方面有潜在的应用前景。为了提高逆转录病毒感染靶细胞的特异性，降低其潜在的危险性，可以在原来的病毒Env蛋白上接上一段具有特异靶向的多肽，目前应用较多的是单链可变区抗体(acFV)；还可通过插入组织特异启动子实现靶向表达。第三代包装细胞系aF-crip和m 使载体与包装细胞问至少需要发生4次同源重组才可能产生有复制能力的逆转录病毒，提高了RV载体的安全性。 2 腺病毒(adenovirus，AV)载体 腺病毒载体自1993年首次被应用于临床试验以来，迄今为止大约有40％基因治疗临床试验方案采用腺病毒为载体，仅次于RV载体_3 J。至今AV载体已经发展了4代，第2、3代腺病毒去除EI、E2和E4编码序列，与第一代相比，有更低的免疫原性和更大的载体容量。第四代腺病毒仅含有反向末端重复序列

脂质体药物载体的研究进展

脂质体药物载体的研究进展 摘要 当两性分子如磷脂和鞘脂分散于水相时，分子的疏水尾部倾向于聚集在一起，避开水相，而亲水头部暴露在水相，形成具有双分子层结构的封闭囊泡，称为脂质体。脂质体的直径为25-1000nm不等，因为其与细胞膜有良好的融合性，所以可以利用脂质体将药物送入细胞内。脂质体作为药物载体已有很长时间，本文首先描述了脂质体作为药物载体研究的最新进展，如免疫脂质体、长循环脂质体、长循环免疫脂质体；然后本文对脂质体作为药物载体的靶向作用进行了介绍，有抗体介导靶向，叶酸介导靶向，转铁蛋白介导靶向等；最后总结了各种有药物控释作用的脂质体，主要有pH敏感型，温度敏感型，光敏感型和磁敏感型。 关键词：脂质体，靶向，控释，免疫，长循环。

1 脂质体给药的最新进展 过去30多年脂质体作为药物载体引起了人们的极大关注1。最近，脂质体作为药物载体又有了新的发展。脂质体作为药物载体存在的严重缺点是脂质体很容易被淋巴和网状内皮系统从血液中清除，致使能达到病灶的药物很少。针对这个缺点，科学家们研发了几种新的脂质体。 1．1 免疫脂质体 在偶联剂的作用下，将天然或修饰的抗体分子偶联到含有适当功能基因的脂质体上，可形成免疫脂质体。免疫脂质体携带药物具有靶向性强、毒副作用小、半衰期长、运载量大等优点2。免疫脂质体的发展经历了三个阶段，如图1。第一代免疫脂质体，是指连有单克隆抗体的脂质体。通过单克隆抗体与靶细胞的特异结合，将脂质体包载的药物导向靶组织，赋予脂质体主动靶向性，但由于巨噬细胞的吞噬会很快被血液清除。第二代免疫脂质体，此技术包括PEG含有的长循环脂质体，但PEG长链对单抗的屏蔽使抗体与靶细胞的结合能力降低。第三代免疫脂质体，为了增加长效脂质体的靶向性，将抗体或其它配体连接于长效脂质体表面上的聚合物（如PEG)链的末端上，从而避免了PEG链对靶位识别的干扰，得到一种新型脂质体。免疫脂质体具有制备工艺简便，无毒、无免疫原性及可被生物膜利用的特点，它携带、保护及释放药物的能力高于Mab（单克隆抗体），是现阶段抗体靶向治疗的研究热点。 图1 三代免疫脂质体 根据靶向特异性细胞和器官的原理可将免疫脂质体分为抗体介导和受体介导两类3。抗体介导的免疫脂质体是利用抗原-抗体特异性结合反应，将单抗与脂质体偶联。Audrey Roth4等研究了抗体介导的免疫脂质体anti-CD166 scFv（H3）在前列腺癌细胞的药物输送，用anti-CD166 scFv包覆topotecan, vinorelbine和doxorubicin三种抗癌药物作用于三种前列腺癌细胞Du-145, PC3, LNCaP。结果显示脂质体包覆的药物的细胞毒性远大于未包覆的药物，如图2。受体介导的脂质体是利用受体与配体结合的专一性，针对体内某些组织和器官中存在的特殊受体能选择性识别配体，将脂质体与配体共价结合3。张小文5等人研究了整合素受体

微载体培养动物细胞技术的研究与进展

微载体培养动物细胞技术的研究与进展 摘要： 微载体是将对细胞无害的颗粒-微载体加入到培养容器的培养液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。微载体具有比表面积大等优点，在微载体培养技术中具有决定性作用。而微载体细胞培养技术是一种微载体与生物反应器结合的技术,现已广泛应用于组织工程领域"组织工程生物反应器系统能使细胞体外培养条件接近体内环境。报告就近年来制备微载体的生物材料和方法探究技术以及其在培养动物细胞的研究进展做一综述，为微载体培养技术和组织工程的研究提供理论基础。 关键词：微载体、载体类型、细胞培养、综述文献 引言： 荷兰学者van Wezel 于1967年首先创立了。微载体培养动物细胞技术。在微球表面培养细胞可以在较短时间内得到大量的细胞，且细胞传代只需要添加新的微载体，基本上可避免细胞在胰酶消化过程中受到的损伤，因此微载体培养细胞技术是非常方便和有意义的。20世纪80年代，微载体出现了商品化。Famarcia 公司利用中性葡聚糖凝胶表面偶联正电荷基团开发出Cytodex 1、Cytodex 2和Cytodex 3系列商品，但这些微载体由于通过特殊处理都不具有降解性或降解性较差，且价格昂贵。而理想的微载体则应具有良的生物相容性、降解可吸收性。因此，优质微载体生物材料的开发仍是当前研究热点。本文综合分析近年来国内外微载体制备材料和方法的研究进展，为细胞微载体培养技术和组织工程的研究提供理论基础。 1 资料和方法： 1.1 资料来源 由第一作者在CNKI进行检索。网址：https://www.wendangku.net/doc/cf9723150.html,/。英文资料的检索时间范围为2007/2012；中文资料的检索时间范围为2007/2012。英文检索词为“microcarrier，biomaterials cellculture, tissue engineering”；中文检索词为“微载体，生物材料，细胞培养，组织工程”。 1.2 入选标准

细胞培养基本操作技能

细胞培养基本操作技能 无菌操作基本技术 1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。 2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70 % ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。 3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。 4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。 5. 定期检测下列项目： 5.1. CO2 钢瓶之CO2 压力 5.2. CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。 5.3. 无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300 小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。 6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。 实验用品 1. 种类︰ 1.1. 细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器与pasteur pipet 外，其它均为塑料无菌制品。 1.2. TC 级培养盘表面均有coating 高分子物质以让细胞吸附，培养容器种类有Tflask, plates, dishes, roller bottle 等，依实验需要使用。 1.3. plastic sterile pipet: 1 ml, 2 ml,5 ml, 10 ml, 25 ml 1.4. 塑料离心管: 15 ml, 50 ml，均有2 种不同材质，其中polypropylene (PP) 为不透 明材质，polystyrene (PS) 为透明材质，可依实验需要而选择适合材质之离心管。 1.5. glass pastuer pipet: 9 inch，用以抽掉废弃培养液等。 1.6. 玻璃血清瓶(Pyrex or Duran glassware)：100 ml, 250 ml,500 ml,1000 ml 2. 清洗︰ 2.1. 新购玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡数小时，洗净后才开始使用。 2.2. 用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗干净，勿加清洁剂清洗。 3. 灭菌︰ 3.1. 实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌121 oC, 15 lb, 20 分钟，置于

囊泡作为药物载体的研究进展

囊泡作为药物载体的研究进展 赵 静，王仲妮* （山东师范大学化学化工与材料科学学院，山东 济南 250014） 摘 要： 囊泡有较强的增溶能力，其双层膜具有较好的牢固性和稳定性，作为药物载体给药途径较广，载药稳定性、药物增溶量以及药物生物利用度较高。本文介绍了囊泡作为药物载体的研究现状，包括囊泡形成，膜结构选择和应用，以及囊泡在口服给药、局部给药和体内给药的应用。关键词：囊泡；表面活性剂；药物载体 中图分类号：R944.5 文献标识码：A 文章编号：1672-979X(2010)03-0129-04 收稿日期：2009-12-24 基金项目：山东省自然科学基金（Y2006B29），贵州省教育厅自然科学研究项目[黔教科（2007）016号]作者介绍：赵静（1985-），女，硕士研究生，从事胶体与界面化学研究 * 通讯作者：王仲妮，女，硕士生导师 E-mail: zhongniw@https://www.wendangku.net/doc/cf9723150.html, Progress on V esicle as Drug Carrier ZHAO Jing, W ANG Zhong-ni (College of Chemistry, Chemical Engineering and Materials Science, Shandong Normal University, Jinan 250014， China ) [4] Gould F A. Mitigation of surfactant erythrocyte toxicity by egg phosphatidylcholine[J]. J Pharm Pharmacol , 2008, 52: 1203-1209. [5] Buggins T R, Dickinson P A , Taylor G. The effects of pharmaceutical excipients on drug disposition[J]. Adv Drug Deliv Rev , 2007, 59(15): 1482-1503. [6] Filardo G, Blasi M D, Galia A, et al . Peracetylated β-cyclodextrin as solubilizer of arylphosphines in supercritical carbon dioxide[J]. J Supercrit Fluid , 2006, 36(3): 173-181. [7] Górnicki A. The hemolysis kinetics of psoriatic red blood cells[J]. Blood Cell Mol Dis , 2008, 41(2): 154-157. [8] Pierigè F, Sera fi ni S, Rossi L, et al . Cell-based drug delivery[J]. Adv Drug Deliv Rev , 2008, 60: 286-295. [9] Savi ? S, Weber C, Savi ? M M, et al . Natural surfactant-based topical vehicles for two model drugs: Influence of different lipophilic excipients on in vitro/in vivo skin performance[J]. Int J Pharm , 2009, 381(2): 220-230. [10] Bandyopadhyay P, Neeta N S. Evidence for vesicle formation from 1:1 nonionic surfactant span 60 and fatty alcohol mixtures in aqueous ethanol: Potential delivery vehicle composition[J]. Colloid Surf B: Biointerface , 2007, 58(2): 305-308. [11] Ohnishi M, Sagitani H. The effect of nonionic surfactant structure on hemolysis[J]. J Am Oil Chem Soc , 1993, 70(7): 679-684.[12] Prete P S C, Gomes K, Malheiros S V P. Solubilization of human erythrocyte membranes by non-ionic surfactants of the polyoxyethylene alkyl ethers series[J]. Biophys Chem , 2002, 97: 45-54. [13] Galembeck E, Meirelles N C. Effects of polyoxyethylene chain length on erythrocyte hemolysis induced by poly[oxyethylene (n ) nonylphenol] non-ionic surfactants[J]. Chem-Biol Interact , 1998, 113: 91-103. [14] 孙岩, 陈怡，等. 烷基糖苷与生物膜的相互作用及其溶血活性 [J]. 表面活性剂工业,1998, 2: 3-6. [15] Sanchez L, Vinardell M P. Potential irritation of lysine derivative surfactants by hemolysis and HaCaT cell viability[J]. Toxicol Lett , 2006, 161: 53-60. [16] Vives M A, Vinardell M P. Erythrocyte hemolysis and shape changes induced by new lysine-derivate surfactants[J]. Chem-Biol Interact , 1999, 118: 1-18. [17] Vinardell M P. Characteristics of interaction between amphiphiles and membranes[J]. Trends Comp Biochem Physiol , 1996, 2: 73-82. [18] Groot R D, Rabone K L, et al . Mesoscopic simulation of cell membrane damage, morphology change and rupture by nonionic surfactants[J]. Biophys J , 2001, 81: 725-736. [19] Shalel S, Streichman S, Marmur A. The mechanism of hemolysis by surfactants:effect of solution composition[J]. J Colloid Inter Sci , 2002, 252: 66-76. [20] Lichtenberg D, Opatowski E, Koslov M, et al . Phase boundaries in mixtures of membrane-forming amphiphiles and micelle-forming amphiphiles[J]. BBA-Biomembranes , 2000, 1508: 1-19.[21] Sánchez L, Martínez V, Infante M R, et al . Hemolysis and antihemolysis induced by amino acid-based surfactants[J]. Toxicol Lett , 2007, 169(2): 177-184.

胶原微球作为药物载体的研究进展_石婧圆

胶原微球作为药物载体的研究进展 石婧圆　陈燕忠　吕竹芬 【摘要】　近年来,微粒给药系统的发展为大分子药物靶向及缓控释给药提供更多的方法,但对药物载体的要求也越来越高。胶原因其良好的生物相容性、生物可降解性及极低的免疫原性成为药物载体材料研究的新热点。本文对胶原作为药物载体的研究进展进行了综述,包括胶原微球、胶原包衣微球及胶原复合材料微球的研究。 【关键词】　胶原微球;药物载体 C o l l a g e nMi c r o p a r t i c l e s i n D r u gD e l i v e r y S H I J i n g -y u a n ,C H E NY a n -z h o n g ,L VZ h u -f e n .I n s t i t u t e o f P h a r -m a c e u t i c a l S c i e n c e s ,G u a n g d o n gC o l l e g e o f P h a r m a c y ,G u a n g z h o u 510006,C h i n a 【A b s t r a c t 】　T a r g e t i n g d e l i v e r ya n dc o n t r o l l e dr e l e a s e d e v i c e s f o r m a c r o m o l e c u l a r d r u g s d e l i v e r y m a k e a b i g c h a l l e n g e t o m i c r o p a r t i c l e d r u g d e l i v e r y s y s t e m ,e s p e c i a l l y t h e d r u g c a r r i e r s .C o l l a g e n i s a n i n t e r e s t i n g n a t u -r a l m a t e r i a l f o r t h e p r e p a r a t i o n o f m i c r o p a r t i c l e s .T h e a t t r a c t i v e n e s s o f c o l l a g e nr e s t s o n i t s h i g h b i o c o m p a t i b i l i t y a n d l o wi m m u n o g e n i c i t y .T h i s a r t i c l e h i g h l i g h t s c o l l a g e n m i c r o p a r t i c l e s 'p r e s e n t s t a t u s a s a c a r r i e r i nd r u g d e -l i v e r y ,i n c l u d i n g :c o l l a g e n -c o a t e d m i c r o s p h e r e s ,t h e p r e p a r a t i o n o f c o l l a g e nm i c r o p a r t i c l e s a n d c o l l a g e n c o m p o s -i t e s . 【K e yw o r d s 】　C o l l a g e nm i c r o p a r t i c l e s ;D r u g c a r r i e r 作者单位:510006广东药学院药物研究所 现今,大分子药物为治疗癌症、心血管疾病提供了新的治疗途径。大分子药物包括核酸、蛋白质、细胞及细胞因子等。其主要治疗原理是将大分子药物传送至特定靶标,作用于某种异常蛋白质或者某段异常基因,改变其病理显性症状以达到治疗疾病的效果。然而,大分子活性药物因较难穿过各种生物膜,不易靶向给药从而导致效能较低,并且具有全身性副作用及排异反应[1]。另外,细胞植入性治疗需要细胞能够在体内进行再生,需要载药体系给细胞提供合适的再生环境。微粒给药系统因其独特的优势而成为了载送大分子药物的理想选择。其对大分子药物的负载能力良好,可用于载送D N A 、小片段R N A 、蛋白质、细胞和细胞因子等。微粒系统给药方便,可全身给药,也可直接注射至靶区;能改变药物的带电性及亲疏水性质,以帮助药物透过细胞膜[2]。采用微球载送细胞,制备出的细胞微球稳定性良好,不但对细胞有保护作用,并能充当细胞增殖、迁移的支持性基质[3],仅通过增加微球的量即可避免胰蛋白酶消化效应,促进细胞进一步增殖[4],为细胞体内再生提供了良好环境。 然而,达到上述效果的关键在于成球载体材料的选择。良好的大分子药物载体需要有很高的生物相容性,生物可降解性及较低的免疫原性,并且能克服所载药物的缺点,满足给药需求。现有的微球载体主要有三大类:天然、半合成以及合成高分子载体材料。天然高分子材料来源于生物体,人体本身存在同类物质,免疫系统往往将其当作自身物质对待,因此较后两种载体具有更高的生物相容性和更低的免疫原性。胶原(c o l l a g e n ),作为生物体内存在最为广泛的蛋白质,因其特殊的三螺旋纤维式结构而具有更高的稳定性,从而引起了医药领域科研人员浓厚的兴趣。早在20世纪80年代,胶原已用于制备生物可吸收手术缝合线,之后出现了胶原制备的生物可吸收止血海绵,眼用及创伤用缓释药膜,人工皮肤及组织再生用支架等,近期则越来越多的被应用于载药微球的制备。研究结果表明[5,9],胶原具有优良的生物可吸收性,生物相容性和极低的免疫原性,可作为多种药物 的良载体,包括亲脂或亲水性药物,核酸、蛋白质及细胞等, 并且具有非常好的生物粘附性。这些性质使胶原有可能成为用途最为广泛的药物载体之一。1　胶原微球 单独使用胶原作为成球材料的研究文献多集中于近几年。胶原多由牛跟腱、动物皮等材料中提取而得。早期的研究发现,胶原微球可用于搭载脂溶性药物,球体只能被特异性酶降解,热稳定性良好,其粒径范围依赖于变性程度,即在制备过程中变性程度越高,则获得粒径越小。并发现当脂溶性药物的载药率高于9%时,胶原微球失去亲水性[10]。具有亲脂性的胶原微球则表现出较强的皮肤穿透性,能够帮助药物透过皮肤[11]。 骨骼中有机物有70%～80%为胶原,胶原纤维组成骨骼生成前框架,帮助骨细胞依附生长。因此胶原被广泛运用于制备骨再生支架。近期研究发现,制备成胶原微球可以搭载软骨细胞迁移,并于氨基葡聚糖富集区域沉积[12]。人类间充质干细胞(h M S C s )能于胶原微球内部网络中增殖、迁移,胶原微球为h M S C s 提供仿生环境,帮助其功能再造,进一步生成软骨细胞[10]。 基于胶原为关节腔液中主要蛋白质,E l r o n -G r o s s 等[13] 研制了一种新型胶原-脂质交联微球,此复合胶原体在模拟关节液中稳定,并表现出高度载药率(85%)和对靶细胞的高度亲和力,并达到缓释效果(半衰期11d )。此剂型可关节腔注射给药,能够避免胃肠道反应。体内试验结果表明此新剂型作为有效临床常规诊断用药具有进一步研究价值。胶原微球常用的制备方法为:将胶原及药物溶液溶于两相中制备成乳浊液,然后使其重构或将其冻干,最后加入固化剂使其定型。然而,胶原为一种线性蛋白,由几十种氨基酸组成,官能团众多,性质复杂。为了使胶原微球能具有更好的性能,近年来对其制备方法的研究也屡见不鲜。C h a n g 等[7]使用一种纯水相反应装置制备透明质酸(H A )/胶原微球。其装置为在水中放置一个中空平行圆形电极,在两端加入特定电压,使微球体在纯水相中构建,先后加入F e C l 3溶液及1- 乙基-3-(3-二甲基氨丙基)亚胺(E D C ),· 229·中国现代药物应用2010年3月第4卷第5期　C h i nJ M o dD r u g A p p l ,M a r 2010,V o l .4,N o .5 DOI :10.14164/j .cn ki .cn11-5581/r .2010.05.231

MDCK细胞培养基本技术方法 -2011本

MDCK细胞培养 一、目的MDCK细胞培养是分离流感病毒及相关研究实验的基本技术。 二、适用范围适用于疾控中心所有技术人员。 三、程序 （一）生物安全要求实验室生物安全级别：BSL-1所有操作必须在BSL-1实验室的生物安全柜里进行。 （二）材料 1.生长成片的MDCK细胞 2.无菌的T25细胞培养瓶 3.D-MEM培养液（含有L-谷氨酰胺） 4.青、链霉素母液（10000U/mL青霉素G；10000μg/mL硫酸链霉素），分装后保存于-20℃ 5.HEPES缓冲液，1M母液 6.胎牛血清 7.EDTA-胰酶（0.05%胰酶，0.53mMEDTA-4Na），分装后保存于-20℃8.7.5%牛血清白蛋白组分V9.1mL、10mL无菌移液管10.70％～75％的酒精注意事项：经常检查试剂使用的有效期。 （三）实验步骤这里以T75细胞瓶的单层细胞培养为例，叙述MDCK细胞的培养程序。如果细胞瓶的规格有变，MDCK细胞悬液的量必须做相应的调整。 1.D-MEM培养液的准备 500mLD-MEM液中加入：青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100μg/mL链霉素），HEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）。7.5%牛血清白蛋白组分Ⅴ12.5mL 2.细胞生长液的准备 胎牛血清10mL加到90mL的上述（1）的液体中，使胎牛血清的终浓度为10%。 3.首先将细胞培养瓶中的培养液弃去，加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶。 4.温和地摇动细胞瓶1min，使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。然后用移液管吸去EDTA胰酶。

5.重新加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶重复上述步骤。 6.加入1mLEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37℃孵育细胞瓶直至细胞从塑料细胞瓶的表面分离（约5～10min）。必要时可以摇动或吹打来分离细胞。然后加入1mL胎牛血清灭活残余的胰酶。 7.加9mL已经配置好的含有L-谷氨酸的D-MEM培养液，轻轻用移动移液管来吹散细胞团。 8.取10mL混合物加到90mL细胞生长液（细胞悬液的浓度大约为每毫升含105细胞） 9.每个T25细胞培养瓶加入6mL（6×105/mL）细胞悬液，剩余的细胞悬液可以加到T75细胞瓶用于细胞传代。通常6mL细胞悬液2～3日可生长成片（80％～90％）的单层细胞。 10.于37℃，5%CO2培养箱里培养细胞，每天观察细胞状态，以供进一步实验用。

微乳液作为药物载体研究进展

微乳液作为药物载体研究进展 吕锋锋刘少杰刘杰李干佐郑利强* (胶体与界面化学教育部重点实验室(山东大学) 济南 250100) 摘要总结了微乳液型药物载体在药物缓释和控释方面的研究背景、现状及方法；介绍了微乳液型药物载体的组分选择原则；讨论了影响微乳液型药物载体中药物释放的因素以及斯潘，吐温系列的表面活性剂在药物载体的研究中的重要性。 关键词微乳液药物载体药物缓释研究进展 Research Progress of Microemulsion-based Drug Delivery Systems Lü Fengfeng, Liu Shaojie, Liu Jie, Li Ganzuo, Zheng Liqiang* (Key Laboratory of Colloid and Interface Chemistry (Shandong University), Jinan 250100) Abstract The systems of microemulsions are currently of interest to the pharmaceutical scientist because of their considerable potential to act as drug delivery vehicles by incorporating a wide range of drugs. The microemulsion-based drug delivery systems are often used to control or delay the release of the entrapped drugs. This paper gives an overview of the formation, phase behaviour and characterization of microemulsions. The factors that influence the release of the incorporated drugs and the importance of the nonionic surfactants, such as Span and Tween are also discussed. Key words Microemulsion, Drug Delivery 药物要制成一定的剂型才能用于疾病的预防和治疗。药物的剂型主要有口服型、注射型和外用型。为了提高药物疗效、降低药物毒副作用，人们一方面致力于开发新药，另一方面就是转换药物剂型。目前，国内外药物制剂的研究方向可以概括为以下两方面，即(1)毒性小、副作用小、剂量小(三小)；(2)高效、速效、长效(三效)。 然而，开发新药耗资巨大，需历时数年且命中率极低。如20世纪90年代初，筛选化合物的命中率为万分之一，而2000年降为十万分之一。因此，转换或开发新的药物剂型就成为人们研究的热点。 药物载体就是人们转换药物剂型的一种有效方式。药物载体是指能改变药物进入体内的方式和在体内的分布，控制药物的释放速率，并将药物输送到靶向器官的物质[1]。载体可防止药物在体内的局部浓度过高，刺激或损伤某些器官，过早降解、失活、排泄以及发生人体免疫反应，从而达到缓释、控释、靶向的目的。为了寻找合适的药物载体，人们已经对各种体系进行了较为详尽的研究。载体种类繁多，主要有：白蛋白、红细胞、某些酶蛋白、脂质体以及表面 吕锋锋女，24岁，硕士生，现从事表面活性剂物理化学的研究。*联系人，E-mail: lqzheng@https://www.wendangku.net/doc/cf9723150.html, 国家自然科学基金(20243005)、贵州省长基金黔科教办(2001)6号资助项目