高效液相色谱柱的选择

高效液相色谱柱的选择

一、硅胶基质填料

1、正相色谱

正相色谱用的固定相通常为硅胶（Silica）以及其他具有极性官能团，如胺基团（NH2，APS）和氰基团（CN，CPS）的键合相填料。

由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他极性基团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如正已烷（Hexane），氯仿（Chloroform），二氯

甲烷（Methylene Chloride）等。2、反向色谱

反向色谱用的填料常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱官能团的键合相。反向色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲醇、乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最先被冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。

常用的反向填料有：C18（ODS）、C8（MOS）、C4（Butyl）、C6H5（Phenyl）等。二、聚合物填料

聚合物填料多为聚苯乙烯—二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂等，其重要优点是在PH值为1—14均可使用。相对于硅胶基质的C18填料，这类填料具有更强的疏水性；大孔的聚合物对蛋白质等样品的分离非常有效。现有的聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料，色谱柱柱效较低。三、其它无机填料

其它HPLC的无机填料色谱柱也已经商品化由于其特殊的性质，一般仅限于特殊的用途。如，石墨化碳黑正逐渐成为反向色谱柱填料。这种填料的分离不同于硅胶基质烷基键合相，石墨化碳的表面即是保留的基础，不再需其它的表面改性。该柱填料一般比烷基键合相硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强。石墨化碳可用于分离某些几何异构体，由于在HPLC流动相中不会被溶解，这类柱可在任何PH与温度下使用。氧化铝也可以用于HPLC。氧化铝微粒刚性强，可制成稳定的色谱柱柱床，其优点是可以在PH高达12的流动相中使用。但由于氧化铝与碱性化合物的作用也很强，应用范围受到一定限制，所以未能广泛应用。新型色谱氧化锆基质填料也可用于HPLC。商品化的只有聚合物涂层的多孔氧化锆微球色谱柱，应用PH1-14，温度可达100℃。由于氧化锆填料是最近几年才开始研究，加之面临的实验难度，其重要用途与优势尚在进行之中。

七、保留值与分离度重现性不好原因分析

问题

原因

表现

不同色谱柱间差异使用期间柱变化

填料、键合相不同柱床破坏键合相丢失硅胶基质溶解

强保留组分堆积堵塞

保留因子(k), 分离因子(a）柱效(N）

保留因子(k), 分离因子(a）柱效(N)

保留因子(k), 柱效(N)柱外效应

系统差异、进样量大、进样阀与色谱柱之间、色谱柱与检测器之间的管路太长、检测器流通池体积大、接头死体积大等。柱效(N)

分离效果变差

流动相组分改变流速改变温度改变保留因子(k)，柱效变化很小保留因子(k), 分离因子(a)保留因子(k), 柱效变化很小柱平衡慢重新平衡时间不够保留因子(k), 柱效变化很小柱超载

样品量太大

保留因子(k), 柱效(N)

四、造成色谱峰（ 不对称）拖尾的原因

1．色谱柱本身填装问题,筛板堵塞或填料塌陷；2．柱头有污染；3．样品超载；

4．样品溶剂不合适；5．柱外效应；

6．化学或二次保留（硅羟基）效应；7．缓冲容量不足或不合适；8．重金属污染。

五、如何解决峰形拖尾的问题

A. 与化学有关的拖尾问题

1．流动相中，加入30mM的三乙胺（用于碱性化合物）或

醋酸胺（用于酸性化合物）， 未知化合物加醋酸三乙胺；

2．如仍然拖尾，将三乙胺换为二甲基辛胺（或醋酸二甲基辛胺）；

3.降低进样量至<1μg。

B. 与色谱柱有关的拖尾问题

1.如柱头处有强保留的样品组分积聚，反相柱可用20倍柱体积的96%的二氯甲烷与4%甲醇，加1%氢氧化铵混合液冲洗；正向柱可用甲醇冲洗；

2.使用保护柱。

C. 与HPLC系统有关的峰拖尾和峰加宽1.进样体积过大，（通常≤25μL）；

2.进样阀与色谱柱及检测器之间的管路体积过大（最佳连接管应<20cm，内径为0.007”）；

3.检测器流通池的体积过大。

六、如何贮存色谱柱

1.防止缓冲溶液和水溶液流动相产生微生物,做到流动相用多少配多少, 或在水流动相中加200ppm的叠氮钠以抑制细菌生长（一定当心其毒性和潜在的爆炸性）；或在流动相中加20%的有机改性剂，也可抑制微生物生长， 有机改性剂还有助于流动相脱气。

2.尽可能将色谱柱贮存于100%有机溶剂（乙晴最好）中，避免在缓冲溶液中保存。

3.使用缓冲溶液后的色谱柱，应用15～20倍柱体积的不含缓冲剂的同种水-有机溶剂流动相冲洗色谱柱，后换成100%有机溶剂贮存。

4.避免用纯水冲洗键合致密的C18柱。

5.将色谱柱的两端用堵头拧好，以免柱床填料干裂。

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