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FACSCantoII中文培训手册

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FACSCantoII中文培训手册

BD FACSCanto II TM 中文培训手册

目 录录

FACSCa FACSCanto nto (II)培训所需设备培训所需设备//试剂试剂 (3)

FACSCanto(II)开机程序开机程序 (4)

FACSCanto(II)关机程序关机程序 (6)

BD FACSCanto 临床软件进行仪器日常质控临床软件进行仪器日常质控((QC QC))........................ 7 HLA HLA--B27校准校准 (99)

FACSCanto Clinical 六色免洗淋巴细胞亚群检测六色免洗淋巴细胞亚群检测 (10)

FACSCanto Clinical 软件的获取分析的具体操作软件的获取分析的具体操作 (11)

FACSCanto Clinical 软件进行HLA-B27分析分析 (14)

Diva 软件进行HLA-B27手动获取和分析手动获取和分析 (18)

Calibrite 四色小球模拟细胞

演示四色实验演示四色实验样本获取和分析样本获取和分析样本获取和分析 (20)

Diva 软件进行单色&双色获取和分析双色获取和分析 (23)

Cytometer Setup and Tracking (CS&T )操作流程操作流程 (24)

FACSCanto (II)流式细胞仪HTS 操作规程 (31)

FACSCanto(II)日常保养和维护日常保养和维护 (33)

FACSCa FACSCanto nto (II)培训所需设备培训所需设备//试剂

1. 普通低速离心机(实验要求为300g,相当于1000~1500rpm,可调转速调时间,能离心

12x75mm 的5ml 试管);

2. 固定或可调节的加样器及相应加样头若干: 20ul,50ul, 100ul, 200ul, 250ul,450ul,

1ml;

3. 旋涡混匀器;

4. 烧杯,量筒或移液管,三个清洁的玻璃或塑料带盖试剂瓶(50-100ml),一个棕色瓶,漏

斗,滤纸;

5. 300目过滤尼龙网;

6. 可放置12x75mm 的5ml 试管的试管架2-3个;

7. PBS 溶液和蒸馏水:0.22μm 滤膜过滤;

8. NaClO:分析纯,有效氯浓度10%;

9. 每天需要一管2ml 的抗凝的人血样本 (最好是EDTA-K 3抗凝);

10.多聚甲醛。

附1:

PBS 配制方法:800ml 蒸馏水中溶解NaCl 8.0g ;KCl 0.2g ;Na 2HPO 4 1.44g ;KH 2PO 4 0.24g ;

调节pH 到7.2~7.4(用HCl 或NaOH 调节,各地蒸馏水的酸碱度不同),加蒸馏水定容至1L ,0.22μm 滤膜过滤后,室温保存。

附2:

多聚甲醛配制方法:贮存液用PBS 配制4%多聚甲醛溶液,待完全溶解后(溶解时需要不断搅拌,加热的温度小于50℃,可加入1N 的NaOH 溶液加速溶解)

,调整PH 值在7.2~7.4,并用0.22μm 的滤膜过滤后置于2-8°C 保存。使用时,用PBS 稀释为2%浓度的应用液。应用液2-8°C 存放,可使用一周。

FACSCanto(II)开机程序

1、打开稳压器电源,打开位于仪器左侧的总电源,将同时开启仪器、液流车以及激光电源。

2、启动计算机,在出现的登陆对话框中,输入用户名和密码,点击“OK”。。

观察桌面右下角系统时间旁的网络图标中有一个显示仪器与电脑已连接。

3、运行软件,双击桌面上的快捷方式。

BD FACSCanto临床软件BD FACSDiva软件

4、在BD FACSDiva软件出现的登陆对话框中,无需输入用户名和密码,直接点击“OK”;

在BD FACSCanto临床软件出现的登陆对话框中,输入密码“BDIS”,点击“OK”进入软件。

5、在“仪器框”中确认软件已经和仪器相连接;

如果有必要,选择Cytometer>Connect;

6、在“仪器框”中查看液面水平,过低液面和已满废液显示红色。

7、 选择Cytometer>Fluidics Startup 开启液路,出现显示进程的对话框。液路启动完毕

(complete )后,点击“OK ”。

在液路启动的过程中,不要放上样品管,否则清洗液和废液会返流入样品管。液

路启动程序会移去管道中关机液,用鞘液代替。

8、 激光预热,完成后,会在“仪器框”的底部显示“system ready ”(系统准备完毕)。

9、 打开流动室的门,检查流动室有没有气泡。

排除流动室中的气泡,选择Cytometer > Cleaning Modes > De-gas Flow Cell ,出现显示进程的对话框。

鞘液 废液 关机液 清洗液

点击“OK”,检查流动池,若还有气泡,可重复上述操作。

10、仪器可以开始工作。

FACSCanto(II)关机程序

1、在browser中指定任意一管tube,样本管中盛有0.5%-1%次氯酸钠,高速跑样5min。

2、换DI水,高速跑样至少5min,然后取下样本管

3、选择Cytometer>Fluidics Shutdown;

运行“关闭液路”程序将所有管路中的鞘液排出,并用清洗液和关机液清洗这些管道。

此操作将避免液体管道由于盐的结晶而堵塞。

4、出现系统可以关闭的提示后,点击“OK”;

5、退出软件,关闭计算机;

6、关闭仪器总电源;

7、关闭稳压电源。

QC)

(QC

临床软件进行仪器日常质控(

BD FACSCanto临床软件进行仪器日常质控

无论在BD F ACSCa nto临床软件或者是在BD F ACSD iv a软件中运行样本,都需要使用BD F ACSCa nto临床软件来运行自动化设置和Q C。

利用BD F ACS 7色设置微球,对检测器电压进行调节,把设置微球调整在预定的靶值位置,对检测灵敏度值进行测量,并且对荧光补偿值进行计算并保存荧光补偿的资料。使用BD F ACSCa nto临床软件中的Levey-Jennin g s功能,按时间追踪并监测流式细胞仪性能,留下参数的变化和趋势。

1.准备BD F ACS 7色设置微球:取一只BD F ACS 7色设置微球样本管,加稀释液至刻度线(约1ml),充分混匀。

2.按每日开机程序打开流式细胞仪主机和电脑,打开F ACS Ca nto临床软件并登陆,启动液路。

3.选择“C yto m ete r(流式细胞仪)”→“S et up(设置)→S t a nd ar d S et up(标准设置)。4.在“S et up Lot Info rma tion(设置批号信息)”对话框中点击“N ew Lot I D(新批号)”。

5.输入相应微球批号及失效期,并点击“OK”。

6.按照BD F ACS 7色校准微球标签上所显示的信息输入或检查Lot I D(批号)、t arg ets(靶值)及s p ect ral ove rlap f a cto r s(光谱叠加因子),输入完毕后点击“N e x t”。

7.仪器显示Sa ve S et up B e a d Lot Info (保存校准微球批号信息)对话框,点击“Yes”

8.选择“R u n set up in M a n ual m ode(手动执行校准)”,点击“N e x t”。

9.仪器显示如下提示框,充分摇匀微球样本管,将废液吸引臂推到最左边,上样,点击“OK”。

10.校准过程自动进行,待软件出现如下提示框时,取下样本管。

11.如校准成功,仪器显示“S et up C o mpl eted Su ccessf ull y(成功完成校准)”。软件将报告以PD F格式按如下路径及文件名自动保存(C:\Pr o gram Fi l es\ BD F ACSCa nto S oftw ar e\ S et up Re p o r ts\ S et up Re p o r t_yyyyMMdd_hh mm.p df)。点击“Finish(完成)”,校准结束。

运行HLA HLA--B27校准校准

1.试剂准备试剂准备::

取H L A-B27试剂盒中的H L A-B27 c al ib ra tion be a ds 试剂,混匀,加两滴到装有1ml 鞘液的试管中,混匀,待测。

2.FACSCanto 临床软件上机检测HLA HLA--B27的具体步骤的具体步骤

在运行H L A-B27校准前仪器必须成功通过BD F ACS 7色微球的校准且不超过24小时。 1. 打开F ACS Ca nto 临床软件,在C yto m ete r 菜单下选择S et up,在S et up 右侧出现的下

拉菜单中选择H L A-B27 S et up,出现如下H L A-B27校准对话框。

2. 在右侧框中输入正确的H L A-B27 Lot I D 值、Su ffi x 值和B e a ds Lot I D 值、Su ffi x 值。

这些参数分别决定了FL 1 P M T 的标准和decision mar ke r 的位置。对于结果至关重要,不可弄错。点击S t ar t ,出现如下对话框,手动上样后点击OK。

3. 仪器开始自动校准FI TC电压,完成后仪器会在窗口底部出现一行提示:S et up co mpl eted

s u ccessf ull y 。软件将报告以PD F格式按如下路径及文件名自动保存(C :\Pr o gram Fi l es\ BD F ACSCa nto S oftw ar e\ S et up Re p o r ts\ H L AB27_yyyyMMdd_hh mm.p df )。 4. 点击Sa ve ,保存校准结果即仪器设置条件。软件将H L A-B27校准结果自动保存在

C :\Pr o gram Fi l es\C o mm on Fi l es\B

D \S et up Res ul ts\H L A-B27.o p t . 5. 点击Finish ,校准结束。

检测

FACSCanto Clinical六色免洗淋巴细胞亚群

色免洗淋巴细胞亚群检测

【主要试剂】:

(1) 抗体:CD3/CD8/CD45 /CD4;CD3/CD16+56/CD45 /CD19四色荧光抗体。

(2)FACS Lysing Solution(溶血素)(10×,使用前用蒸馏水稀释成1×)。【实验步骤】:

1、在流式管中加入50ul充分混匀的抗凝全血。

2、加入20ul CD3/CD8/CD45/CD4/CD16+56/CD19,涡旋混匀,室温避光放置15-

20min。

3、取出加入450ul 1×FACS 溶血素,充分混匀,避光放置15min。

4、24小时内上机用FACSCanto Clinical软件获取2500个淋巴细胞进行检测,上机前

应充分混匀。;

注意事项】】:

【注意事项

1.样本使用EDTA抗凝全血,室温放置,24小时内处理,处理前充分混匀。

2.染色和溶血步骤应在室温避光进行,并充分混匀过程中,尽量防止血样的飞溅,以

免血样留在管壁上。

FACSCanto Clinical软件的获取分析的具体操作

(1)、执行FACSCanto开机程序,在桌面上点击进入FACSCantoClinical软件。

(2)、在出现的“Logging In”窗口中输入用户名及密码,然后点击“Login”。 (3)、软件进入“Worklist(工作表)”窗口。

(4)、在“Name”栏中输入患者姓名(可选),在“ID”栏中输入患者ID号(必填),在“Case Number”中输入病例号(可选),点击“Panel”栏,在下拉菜单中选择实验组合如:6color;

Lot ID””,在弹出(5)、如需输入试剂批号,可点击菜单栏“Tools”,在下拉菜单中选择“Lot ID

的对话框中点击“Multitest”标签,在窗口中输入试剂批号,输入完毕后点击“OK”。 (6)、在窗口最上方的“View”的下拉菜单中,选择“Detectors

Detectors””、“Overlap

Spectral Overlap””、

Staus””,出现相应的四个窗口。

Threshold””、“Staus

“Threshold

(7)、然后将第一管样本充分混匀,上样,确认wo r k l ist最左边指示箭头指向待测样本,点击“”,弹出对话框询问是否需要保存wo r k l ist,点击“Yes”保存;软件出现“Lo a d Tu be”提示框时点击。

(8)、软件显示获取图标,并且出现细胞。如果显示细胞位置不合适,可点击“”,然后再点击“”,即可调整SSC电压和阈值,调完毕后可点击“”进行数据获取。

(9)、获取完成后,在出现提示后取下样本管。

(10)、此时显示实验室报告,并倒计时10秒,可点击“Pau se”进入分析报告窗口,双击任何一张图可以进行手动设门,设门完毕点击OK,分析结果自动更改,调整完毕后点击“C ontin u e”。

Exit””,退出FACSCanto (11)、继续其他实验,或点击菜单栏“Fi l e”在下拉菜单中选择“Exit

Clinical软件。

注意::

注意

BDFACSCantoFCSFiles\\YYYYMMDD”;实验室报告(L a b 1.F CS格式数据文件保存于“C:C:\\BDFACSCantoFCSFiles

LabReportFiles\\YYYYMMDD””

BD FACSCanto Software\\LabReportFiles

Re p o r t)保存于“C:C:\\Files

Program Files\\Software

路径中可以日后进行重新分析。

2.中国人群淋巴细胞亚群正常参考值(采用此K it检测,各实验室最好建立自己的参考值)

CD3(总T淋巴细胞) 50-84%

CD3+CD4+(T h细胞) 27-51% CD3+CD8+(T c/T s细胞) 15-44% CD3-CD16+CD56+(NK细胞) 7-40% CD3-CD19+(B细胞) 5-18%

CD4/CD8(T h/T s) 0.71-2.78

FACSCanto Clinical 软件进行HLA-B27分析样本的制备::

1 、样本的制备

试剂::

1)试剂

①HLA-B27试剂盒——包括抗体试剂A,10X溶血素试剂B,微球试剂C;

②抗凝全血;

③流式细胞实验常规试剂和仪器。

制备流程::

2)制备流程

①在试管上对应于每一个样本作好识别标志(每个样本一个试管);

②加30ul 抗体到试管中;

③用微量移液器小心地将50ul充分混匀的抗凝血加到进样管的底部,确保WBC

的浓度在3.5×103-9.4×103WBC/ul之间,低速混匀3秒钟,室温避光静置15

-20分钟;

注意:小心避免血样加到试管壁上,以免血与试剂不能充分接触,静置时避

免样本直接光照。

④将10×溶血素用蒸馏水稀释成1×,每管中加入2ml室温的1×溶血素,立

即低速混匀,避光室温静置10分钟,不要超过12分;

注意:溶血时间不应太长,以免破坏白细胞。

⑤随后室温300g离心5分钟;

⑥弃去上清液,留大约50ul液体于试管中以免损伤细胞团;

⑦低速混匀,重悬细胞,每管中加入2ml含0.1%叠氮纳的PBS清洗细胞,低速

混匀,室温300g离心5分钟;

⑧吸去上清液,留大约50ul液体于试管中以免损伤细胞团;

⑨低速混匀,重悬细胞,每管中加入含1%-2%多聚甲醛的PBS来固定细胞,

低速混匀,固定30分钟;

⑩将已处理好的样本管盖好,避光保存于2-8℃以待上机检测。最好在染色后24小时以内分析样本,上样前充分混匀悬液以防细胞聚集。

2、HLA-B27自动软件上机检测的具体步骤

1)执行F ACSCa nto开机程序,进入FACSCanto Clinical软件。

2) 在出现的“Logging In”窗口中输入用户名及密码,然后点击“Login”。

3) 软件进入“Worklist(工作表)”窗口。

4) 在“Name”栏中输入患者姓名(可选),在“ID”栏中输入患者ID号(必填),在“Case Number”中输入病例号(可选),点击“Panel”栏,在下拉菜单中选择实验HLA--B27;

组合HLA

5)点击“”,出现如下提示框:

如需保存工作表,点击“Yes”;不需要保存工作表,点击“N o”。

6)然后在出现时“Load Tubes”对话框时,充分混匀样本管,上样,点击“OK”,软件开始获取数据;

7)软件以中速(60u L/m in)获取数据,软件默认获取2000个淋巴细胞或250秒钟后自动停止。

8)获取完毕,软件显示实验室报告(Lab Report)。

如需进行手动设门,可以在进行倒计时过程中点击“Pause”,然后点击“Re-gate”进行手动设门。

9)设门完毕,点击“”继续获取下一个样本数据,重复(6)-(8)步骤,直

到所有样本获取完毕。

10) 点击菜单栏“Fi l e ”在下拉菜单中选择“Exit Exit””,退出FACSCanto Clinical 软件。

注意注意::F CS 格式数据文件保存于“C:C:\\BDFACSCantoFCSFiles BDFACSCantoFCSFiles\\YYYYMMDD ”;实验室报告(L a b Re p o r t )保存于“C:C:\\Files Program Files\\BD FACSCanto Software Software\\LabReportFiles LabReportFiles\\ YYYYMMDD ””路径中可以日后进行重新分析。

用Diva软件进行HLA-B27手动获取和分析

同自动软件))

:(同自动软件

样本制备:(

一、样本制备

同自动软件

软件手动获取及分析::

二、Diva软件手动获取及分析

(1).在“浏览框”建文件夹(H L A-B27)和实验组(H L A-B27),样本(日期),采

集管(H L A-B27),并重命名。

(2). 将“浏览框”的采集箭头选中采集管,点击“C yto m ete r”的参数param ete r

页面,删除不必要的荧光参数,仅保留FI TC和PE,散射光和FI TC荧光参数均选

择线性,PE参数选择对数,F SC选择H高度信号,其余参数均选择A面积信号。

在G l ob al W o r ksheet上做图,选择点图或直方图工具,总共画三个图,两个散点

图,一个直方图。

1)散点图F SC-H/SSC-A,选择点图工具,在空白处画出一个新的散点图: X Param ete r横轴参数:F SC-H,

Y Param ete r纵轴参数:SSC-A;

2)散点图F SC-H/CD3-PE,选择点图工具,在空白处画出一个新的散点图: X Param ete r横轴参数:F SC-H,

Y Param ete r纵轴参数: PE-A,

在图中画门P1圈上PE阳性的细胞;

3)直方图H L A-B27-FI TC/C o u nt,选择直方图工具,在空白处画出一个新的直方图:

X Param ete r横轴参数:FI TC-A;

右键单击该图,选择“S how P o pula tion-P1”, 单击右键,选择“S how P o pula tion

H ie rar chy”;

选择间隔门工具,在直方图中画P2,圈定所有细胞;

右键单击这个直方图,选择“Cr e a t S t a tics V iew”对直方图进行统计,右键

单击统计图,选择“E dit S t a tistics V iew”,统计框中选择Tu be Nam e、Me a n

和Medi a n;

4)设计试剂参数,在Exp e r i m ent菜单中选择Exp e r i m ent L a yo u t,在L a b l e标签中输入各管样本对应的参数:FI TC—H L A-B27,PE—CD3。

上机

三三、上机

(1)标准微球样本:

取1ml鞘液加入1滴标准微球上机,调整F SC、SSC电压使微球在F SC/SSC 图中显示在合适的位置,在F SC/PE图中设门圈定微球,在FI TC荧光通道中收集

微球荧光信号,根据说明书上在微球的平均荧光强度数值,乘以1024换算成在

F ACSCa ntoII上的荧光强度数值(说明书上的荧光道数为256,F ACSCa ntoII的FI TC

取线性坐标为262144,故在F ACSCa ntoII上荧光强度为说明书的1024倍),例如微球的荧光强度被调至说明书上微球的平均荧光强度数值的位置:140,相对应位置为143360左右。通过调节电压,使微球荧光强度稳定于此位置。

(2)H L A—B27样本:

在测定标准微球并调节好FI TC电压后,不可再改变FI TC的设置。通过

F SC/CD3PE 设门圈定CD3阳性细胞(T淋巴细胞),检测其B27的平均荧光强度,将其Medi a n值和试剂后缀的大小比较,从而判定样本为阳性还是阴性。例如试剂后缀为142,相应乘以1024倍后为145408,标本荧光强度均值小于145408为阴性,反之为阳性。

如果在临界值附近的弱阳性,须以其他方法确认,再提示阳性报告。

Calibrite 四色小球模拟细胞 演示四色演示四色实验实验实验样本获取和分析样本获取和分析

㈠ 试验准备: 1、 主要试剂:

a:BD Cal ib r ite 3 be a ds b :BD Cal bib r ite APC be a ds 2、 样本制备:

① 取5支流式上样管,分别标记为u n la b l e 、FI TC、PE、P e rCP、APC。

② 5支管中分别加入一滴混匀的u n la b l e 小球,除u n la b l e 管外,另外4支荧光标记

的管中分别加入相应的混匀小球。 ③ 每管中加入1ml 鞘液进行稀释

㈡ 流式上机检测:

1、 在“Br owse r 浏览框”建文件夹(4C)和实验文件夹(4C),样本(日期)

2、将“浏览框”的采集箭头选中采集管,点击“仪器框”的参数param ete r 页面,删除不

必要的荧光参数,仅保留FI TC、PE、P e rCP、APC,散射光参数选择线性,荧光参数选择对数。

3、建立自动补偿对照:选择e xp e r i m ent→co mp ens a tion cont r o l →c r e a te co mp ens a tion

cont r o l,在新跳出的窗口中点击OK。

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