文档库

最新最全的文档下载
当前位置:文档库 > 原核表达步骤

原核表达步骤

1.引物的设计及合成

2.基因的克隆: PCR反应

PCR产物的回收和纯化

PCR产物的酶切

3.质粒pET-32a的扩增、提取及酶切

接种含有pET-32a空质粒的DH5α的菌株至LB (含有Amp l00ug/mL)中,37℃培养过夜。取5mL菌液,按质粒提取试剂盒说明书提取质粒,酶切提取出的质粒,-20℃保存。4.重组原核表达质粒的构建:

4.1重组质粒的连接

4.2感受态细胞的制备和转化:参照《分子克隆实验指南》的方法进行BL21感受态细胞的制备[16]。在平板上挑取新鲜的BL21菌落,接种到5mLLB培养基中,37℃振荡培养2~5h,OD600达到0.35~0.5之间,取l~2mL菌液于无菌离心管中,冰上放置至0℃,4℃、5000 rpm离心5min,弃上清,用200uL CaCl2(0.1M)重悬,冰上放置30min,4℃、5000 rpm离心5min,弃上清,0.1M CaC12100uL重悬,4℃放置备用。

4.3重组质粒转化感受态细胞:将10uL重组原核表达质粒加入到100uL的BL21感受态细胞中,轻轻混匀,冰上放置30min,将离心管放入42℃水浴中热休克90s,立即将离心管冰浴5~10min,每管加入800uL的LB培养基,然后放入37℃摇床中100rpm培养45min,取出离心管5000rpm离心5min,弃去600uL上清,将沉淀的细菌混匀并涂布氨卞抗性的LB平板,涂布后正置30min后倒置于37℃培养箱中,培养12~16h。

4.4 重组质粒的鉴定

4.4.1 PCR鉴定:挑取抗性LB平板上长出的BL21重组菌,并接种LB培养基中(含Amp100ug/mL),37℃、200rpm摇振培养3~5h,PCR鉴定。

4.4.2 酶切鉴定:应用限制性内切酶对提取的质粒进行双酶切鉴定,通过双酶切鉴定目的基因有无插入及大小是否正确。酶切结束后进行1%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统下观察并拍照记录。

4.4.3重组质粒基因序列测定:挑选PCR检测条带亮,酶切鉴定正确的菌株测序。将阳性菌株培养物涂布含有Amp的LB抗性平板,37℃过夜培养至单菌落出现,挑取单菌落接种于含有Amp的LB液体培养基中,37℃,200rpm过夜振荡培养后取适量样品测序。

5 基因在BL21中的诱导表达和检测

将过夜培养的菌液按1:100的比例接种于5 mL含有Amp的LB液体培养基中,37℃200rpm震荡培养3~4h,至OD600达到0.8时,加入IPTG至终浓度1mM/mL于37℃诱导6h,取100μL样品离心,进行SDS-PAGE电泳,以确定重组蛋白是否表达。

6 原核表达Ptx3蛋白的可溶性检测

取50uL的重组菌加入到5mL的LB培养液中,按照以上的方法进行诱导表达,12,000rpm离心1min,弃上清,用1×PBS重悬沉淀,4℃,8000rpm离心10min,重复三遍,收集菌体并置冰浴中进行超声破碎,工作时间4s,间隔时间8s,工作次数99次,重复一遍,待菌液清亮时,4℃,10,000rpm离心20min,分别收集上清和沉淀,取20uL的上清和沉淀悬浮液,分别加入5uL的5×SDS loading buffer,煮沸10min,进行SDS-PAGE电泳分析,确定表达产物是可溶性的(存在上清中)还是以包涵体形式存在(沉淀中)。

7原核表达蛋白的纯化

7.1 原核表达蛋白包涵体的制备

取2 mL的重组菌加入到200mL的LB培养液中,按照以上的方法进行诱导表达和获得目的蛋白包涵体,加入10mL的包涵体蛋白Binding Buffer重悬沉淀,并置于37℃水浴中使其充分溶解,4℃,10,000rpm离心15min,并将上清通过0.45um滤膜过滤除去杂质。7.2 原核表达蛋白的Ni-NTA亲和层析

蛋白的纯化方法:

清洗:用5倍柱床体积的ddH2O(5mL)清洗亲和层析柱;

平衡:用5mL 包涵体Bing Buffer 平衡亲和层析柱;

上样:将包涵体溶解滤过液用注射器缓慢注入亲和层析柱,收集流出液;

清洗:用10倍柱床积体积的包涵体Bing Buffer冲洗柱子;

洗脱:用10mL包涵体Elution Buffer洗脱目的蛋白,每1mL用一个EP管收集,并对收集

液进行SDS-PAGE电泳,以分析蛋白的纯度和浓度。

清洗:先用5倍柱床体积的ddH2O清洗柱子,再用3个柱床体积的20%乙醇流洗,并置于4℃保存备用。

注意:所有过柱的液体均需通过0.45um滤膜过滤除去杂质,速度控制在3秒1滴。洗脱时前10滴可弃去,之后的部分每1ml收集一管。

7.3 包涵体纯化蛋白的复性:采用透析法去除纯化蛋白中的脲

8.原核表达蛋白多克隆抗血清的制备

选用40日龄1~1.2 kg的新西兰大白兔进行Ptx3蛋白免疫(由江苏省农业科学院种兔场提供),耳缘静脉采集4mL血液制备免疫前血清,作为ELISA阴性对照使用;用pH 7.2 l0mM/L 的PBS将处理好的蛋白稀释至1mg/mL,取500uL稀释好的蛋白加入等体积的弗氏完全佐剂进行充分乳化。碘酊消毒注射部位,在背部皮下进行多点注射,每点100uL;2周后加等体积弗氏不完全佐剂以同等剂量加强免疫,1周后同第二次方法进行第三次免疫,耳缘静脉采集少量血液用间接ELISA法检测Ptx3蛋白抗体效价,当效价达1:10,000以上后,心脏采血制备兔抗原核表达Ptx3蛋白多克隆血清,并将动物处死。

9. ELISA检测原核表达蛋白抗血清效价

9.1原核表达蛋白最佳包被浓度的确定

采用方阵滴定的方法来确定。

包被:用包被液将原核表达的蛋白分别稀释至1ug/mL、0.5 ug/mL、0.25 ug/mL、0.1 ug/mL,每个浓度100uL/孔,包被6个孔,37℃湿盒内包被2h,之后用PBST洗涤3次,每次5min;

封闭:每孔加200uL的5%脱脂奶,37℃湿盒内封闭2h,之后用PBST洗涤3次,每次

5min;

加一抗:加入兔抗蛋白多克隆血清,稀释度从1:50、1:100、1:200到1:1000和兔阴性血清,100uL/孔,每个蛋白包被浓度做三个重复,37℃湿盒内封闭2h,之后用PBST洗涤3次,每次5min;

加二抗:加入1:2000稀释的酶标SPA蛋白,100uL/孔,37℃湿盒内封闭2h,之后用PBST洗涤3次,每次5min;

显色:加100uL的TMB显色液,避光显色5min,并用2M/mL的H2SO4终止显色,15min 后用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)。

结果判定:选择阴性孔的OD值小于0.1,且P/N值最大的抗原稀释度作为原核表达的蛋白的包被浓度。

9.2 ELISA检测原核表达蛋白抗血清效价

根据上一步的实验结果,用包被缓冲液将原核表达蛋白稀释至合适的浓度,在酶标板的每个孔中加入100uL(空白对照孔加入100uL不含抗原的包被液),4℃过夜,次日,用PBST 洗涤酶标板3次,每次5min;

封闭:按200uL/孔加入5%脱脂奶封闭缓冲液,37℃湿盒中孵育2h,PBST洗涤3次,每次5min;

加一抗:将待检的兔抗多克隆血清用PBS进行倍比稀释,按顺序加入酶标板,每孔加入100uL,置37℃湿盒中孵育2h,同时设立空白对照(用缓冲液包被)和阴性对照。PBST洗涤3次,每次5min;

加二抗:在各反应孔中,加入1:2000稀释的酶标SPA100uL,37℃湿盒中孵育2h后,PBST洗涤3次,每次5min;

显色:在各反应孔中加入TMB底物显色液100uL,避光显色5min,并用2M/mL的

H2SO4终止显色,15min后用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)。

结果判定:采用酶标仪测定,检测波长为450nrn,读取各孔OD值,阴性对照孔OD值记为N,阳性对照孔OD值记为P,若P/N〉2.1,则判定此待测样品孔为阳性;相反,如

P/N<2.1,则判定此待测样品孔为阴性。