基因工程复习要点
基因工程复习要点
1】★基因工程(gene engineering):就是对不同生物的遗传物质，在体外进行剪切、组合和拼接，使遗传物质重新组合，然后通过载体转入微生物、植物和动物细胞内，进行无性繁殖，并使所需要的基因在细胞中表达，产生出人类所需要的产物或组建成新的生物类型。
2】★广义的概念：基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建, 即重组DNA技术。下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。
3】★基因工程四大要素：供体基因、载体、工具酶、受体细胞
4】★理论上的三大发现：证明了生物的遗传物质是DNA （基因工程的先导）、DNA的双螺旋结构和半保留复制机理、遗传信息的传递方式（中心法则）
5】★技术上的三大发现：限制性内切酶的发现（标志着DNA重组时代的开始）、DNA连接酶的发现、载体的使用
6】基因诊断：利用重组DNA技术作为工具，直接从DNA水平监测人类遗传性疾病的基因缺陷，因而比传统的诊断手段更加可靠。
7】基因探针技术：利用DNA碱基互补的原理，用已知的带有标记的DNA通过核酸杂交的方法检测未知的基因。
8】基因治疗（gene therapy）：将外源正常基因导入靶细胞，取代突变基因，补充缺失基因或关闭异常基因，达到从根本上治疗疾病的目的。
9】基因克隆的工具酶（instrumental enzyme of gene cloning）：应用于基因克隆中的各种酶的总称。
10】核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核苷酸链发生水解断裂的蛋白酶叫做核酸酶。专门水解断裂RNA分子的叫做核糖核酸酶（RNase），从核酸分子的末端开始，一个核苷酸一个核苷酸地消化降解多核苷酸链，叫做核酸外切酶（exonuclease），从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫做核酸内切酶（endonuclease）
11】限制性核酸内切酶(restriction enzyme) ：一类能从DNA分子中间水解磷酸二酯键,从而切断双链DNA的核酸水解酶。(寄主控制与修饰现象P13)
12】I型酶：要求有特定的识别序列，但切点在序列以外的不远处
★II型酶：蛋白质结构最简单，最常用。能识别专一的核苷酸序列，不兼有甲基化酶的活性，细胞内另有独立的甲基化酶，切点严格，而且就在识别序列之中。II 型限制性核酸内切酶的基本特性：在DNA分子双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子产生链的断裂。2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的。断裂的结果形成的DNA片段，也往往具有互补的单链延伸末端、识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列、大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧、识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构。（EcoRI等产生的5′粘性末端、PstI等产生的3′粘性末端、PvuII等产生的平头末端）
III型酶：有专一的识别序列，距离是严格的。
IV型酶：只切割碱基已被甲基化、羟甲基化或葡糖-羟甲基化的DNA序列。
13】限制性核酸内切酶的命名
属名种名株名
Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株
EcoRⅠ大肠杆菌 RY13之酶Ⅰ、HindⅢ嗜血流感杆菌Rd之酶Ⅲ、
AluⅠ藤黄节杆菌之酶Ⅰ、HaeⅢ埃及嗜血菌之酶Ⅲ
★命名法：属名（大写，斜体）、种名（小写，斜体）、株名（正体）eg:Hin d III=H in d
14】同裂酶(isochizomer):也叫同切点酶，异源同工酶，这类酶识别相同的序列，但是切割点不一定在同一点上。
15】同尾酶(isocaudamer)：是一类来源不同中，识别序列也不同，但对DNA切割所产生的粘性末端相同的一类酶。
16】杂种位点一般不能被原来的任何一种同尾酶所识别。
17】限制片段末端的连接作用有两种类型：①分子间的连接：不同的DNA片段通过互补的粘性末端之间的碱基配对而彼此连接起来②分子内的连接：由同一片段的2个互补末端之间的碱基配对而形成的环形分子。
18】1 U 核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应 1 小时，完全水解 1 μg 标准DNA所需的酶量
19】影响核酸内切限制酶活性的因素：①DNA的纯度（加大酶的用量，1 mg DNA 用 10U 酶、加大反应总体积、延长反应时间）②DNA样品的甲基化程度③酶切消化反应温度，大多数酶标准反应温度都是37℃。④DNA的分子结构⑤核酸内切限制酶的缓冲液，核酸内切酶的标准缓冲液的组份包括：氯化镁、氯化纳或氯化钾、Tris-HCl（三羟甲基氨基甲烷盐酸），?-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白（BSA）等。BSA的作用酶保护剂，在反应中保证酶具有最佳的活性。
20】星号活性（Star activity）：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的星号活性现象
21】DNA连接酶：依据反应时所需能量辅助因子的不同分为两类：一类是依赖ATP的DNA连接酶；一类是依赖NDA+的DNA连接酶。依据其来源可分为三类：T4噬菌体DNA连接酶、大肠杆菌DNA 连接酶和热稳定DNA连接酶
22】用于共价连接DNA限制片段的连接酶有两种不同的来源：由Ecoli染色体编码的DNA连接酶（用NAD+作能源辅助因子）、由Ecoli T4噬菌体DNA编码的T4DNA连接酶（ATP作能源辅助因子）
23】1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 ℃反应 1 小时，完全连接 1 μgλ DNA （Hind III片段）所需的酶量
24】★黏性末端：是指DNA分子在限制性内切核酸酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸形成的末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新连接起来。
25】平末端：限制性内切核酸酶在识别序列的对称轴上切割形成的片段末端。
26】平末端DNA片段的连接操作提高平末端连接效率的方法包括：加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）；加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会；加入10% PEG8000，促进大分子之间的有效作用；加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200 mM
27】克隆位点（MCS）：含有多种单一限制性内切酶的识别位点。
TA载体：线性，两端各带有一个不配对的脱氧胸腺嘧啶。
Cos位点：即黏性末端位点。
28】平末端DNA片段连接法：直接连接（效率低）、同聚物加尾法（末端核苷酸转移酶）、衔接物连接法（形成黏性末端，linker:衔接物）、接头分子连接法（使用T4 PNP多核苷酸激酶、碱性磷酸酶,adapter:接头）
主要有同聚物加尾法、衔接物连接法及接头连接法
同聚加尾法：DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸。bp表示一个碱基对
衔接物（linker）：指用化学方法合成的一段由10～12个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。
DNA接头：是一类人工合成的一头具某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸
短片段。
29】DNA聚合酶DNA-polⅠ：功能：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。
30】★λ噬菌体分为三个区：左臂、右臂、中间区
31】★自主复制序列需要：端粒；复制起始位点；着丝粒；合适的选择标记
32】Ti质粒可分为T-DNA、Vir、Con、Ori四个功能区。
33】Klenow片段的用途：a 补齐DNA 3′隐缩未端、b 标记DNA片段未端、c cDNA合成第二链、d DNA测序（Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶）
34】切口平移（缺口转移）（nick translation）当外切酶活性从缺口的5′端移去一个5′核苷酸之后，聚合作用就会在缺口的3′端补上一个新的核苷酸。5′端的核苷酸不断地被移去，3′端的核苷酸又按序地增补，于是缺口便沿着DNA分子合成的方向移动。
35】T4-DNA聚合酶基本特征：5′→3′的DNA聚合酶活性和3′→5′的核酸外切酶活性;在无dNTP时，可以从任何3‘-OH端外切，在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止；在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位。
36】T4-DNA聚合酶的基本用途：切平由核酸内切酶产生的3′粘性末端,DNA片段的同位素末端标记
37】依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）反转录酶的基本特性：以RNA为模板聚合cDNA链;双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链
38】作用于单链的外切核酸酶：核酸外切酶VII（ExoVII）大肠杆菌的核酸外切酶VII不需要Mg2+。大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ包括两个亚基组成单位，它们分别为xseA和xseB基因的编码产物。它能够从5′-末端或3′-末端降解DNA分子，产生出寡核苷酸短片段。
39】作用于单链的外切核酸酶：核酸外切酶Ⅲ由大肠杆菌xthA基因编码的单体蛋白质。主要活性:按3′→ 5′的方向催化双链DNA自3′-OH末端释放5′-单核苷酸
40】λ核酸外切酶（λexo）:最初是从感染了λ噬菌体的大肠杆菌细胞中纯化出来的。这种酶催化双链DNA分子自5′-P末端进行逐步的加工和水解，释放出5′单核苷酸，但它不能降解5′-OH末端。用途：将双链DNA转变成单链的DNA，供双脱氧法进行DNA序列分析使用；从双链DNA 中移去5′突出末端，以便用末端转移酶进行加尾。
41】单链核酸内切酶：S1核酸酶需要低水平的Zn2+离子，最适pH值4.0～4.3。主要功能：催化RNA和单链DNA分子降解成为5′单核苷酸；作用于双链核酸分子的单链区，并从此处切断核酸分子。
42】Bal31核酸酶既具有单链特异的核酸内切酶活性，同时也具有双链特异的核酸外切酶活性主要用途包括：诱发DNA发生缺失突变；定位测定DNA片段中限制位点的分布；研究超盘旋DNA 分子的二级结构，并改变因诱变剂处理所出现的双链DNA的螺旋结构
43】核酸修饰酶：TdT：末端脱氧核苷酸转移酶，简称末端转移酶。一般从小牛胸腺中提取的一种碱性蛋白。在它的催化下，将脱氧核苷酸添加到DNA分子的3’-OH末端，伴随无机磷酸的释放。
44】★碱性磷酸酶有两种来源：一是来源于大肠杆菌，叫做细菌碱性磷酸酶（BAP）;二是来源于小牛肠，叫做小牛肠碱性磷酸酶（CIP）
45】T4多核苷酸激酶(T4-PNP )基本特性：在DNA、RNA、dNR、NR的5′-OH上加磷
46】载体(Vector):在基因工程中，通常是把外源DNA片断利用运载工具送入生物细胞。携带外源基因进入受体细胞的这种工具叫做载体(载体的本质是DNA)。
常用的主要载体有：质粒(Plasmid)（主要指人工构建的质粒），噬菌体载体，柯斯质粒 (cosmid)、单链DNA噬菌体M13、动物病毒、人工染色体 (artificial chromosome)
47】卸甲载体：将Ti质粒上的T-DNA的致瘤基因全部去掉，仅保留其两边界及与T-DNA转移所必需的25个碱基序列，构成的载体称为卸甲载体。
48】载体的功能：运送外源基因高效转入受体细胞；为外源基因提供复制能力或整合能力；为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。
49】载体必须满足的条件：具有对受主细胞的可转移性，能在宿主细胞内自主复制，具有多克隆位点，具有合适的选择性标记。
50】载体按功能分为：克隆载体（cloning vector）：对目的基因克隆，建立DNA文库和cDNA 文库，其上有复制子即可。表达载体（expression vector）：使目的基因在宿主细胞中表达，既有复制子，又有强启动子。穿梭载体（shuttle vector）：可以在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。
51】质粒Plasmid：是一种独立于染色体外的小分子环状DNA，一般大小约106~108D，可自身复制和表达。
52】基因克隆载体的质粒DNA分子，必定包括：复制基因、选择性记、克隆位点。
53】质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制
54】质粒DNA的构型：两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构，称为共价闭合环形DNA（cccDNA），通常呈现超螺旋的SC构型；有一条DNA链出现有一至数个缺口，称为开环DNA（ocDNA），此即OC构型；线性分子DNA（IDNA），称为L构型
55】质粒的基本性质：1、质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制。根据拷贝数，质粒可分为两大复制类型：严紧型质粒（stringent plasmid）在宿主细胞中拷贝数少的质粒，1－数个拷贝，松弛型质粒（relaxed plasmid）在宿主细胞中拷贝数多的质粒，10个拷贝以上。多拷贝质粒的复制不受宿主菌蛋白合成的影响的影响2、质粒的不相容性：两个质粒在同一宿主中不能共存的现象。3、质粒DNA的转移：G－细菌质粒可分为两类：接合型质粒能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用）如F、Col、R质粒等。非接合型质粒不能在天然条件下独立地发生接合作用
56】F质粒：大肠杆菌的某些品系的雄性或供体是被一个致育因子或性因子决定的F因子，具有这种因子的能育品系记为F＋，相当于雄性。不含这种致育因子F的品系记为F－，相当于雌性。R质粒：也称抗药性因子。R质粒编码一种或数种抗菌素抗性基因，此种抗性通常能转移到缺乏该质粒的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。
Col质粒：此类质粒编码有控制大肠杆菌素合成的基因，即所谓产生大肠杆菌素因子。大肠杆菌素是一种毒性蛋白，它可以使不带Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死。
柯斯质粒（cosmid）是一类由人工构建的含有λ DNA的 cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体
应用柯斯质粒载体，在大肠杆菌细胞中克隆大片段的真核基因组DNA技术，叫做“柯斯克隆”（cosmid cloning）
57】按其用途可将标记基因分为：选择标记基因——用于鉴别目标 DNA （载体）的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来。筛选标记基因——可用于将特殊表型的重组子挑选出来，筛选标记主要用来区别重组质粒与非重组质粒。
58】★在基因的编码区中，若某个密码子发生突变后变成终止密码子，则称这样的突变为赭石突变（突变为 UAA），或琥珀突变（突变为 UAG），或乳白突变（突变为 UGA）。
supF 基因编码细菌的抑制性 tRNA ，可在 UAG 密码子上编译酪氨酸。如果在某一宿主中含具琥珀突变的 tetr 基因和 ampr 基因，只有当宿主含有 supF 基因时才会对 Amp 和 Tet 具有抗性。
59】天然质粒：一般是指那些没有经过以基因克隆为目标的体外修饰改造的质粒。
60】重组质粒当一个外源 DNA 片段插入到一个质粒载体上时，可通过该标记来筛选插入了外源
片段的质粒，即重组质粒。
61】乳糖操纵子（lac operon）大肠杆菌的乳糖 lac 操纵子中的 lacZ 基因编码β-半乳糖苷酶（β-galactosidase），如果 lacZ 基因发生突变，则不能合成有活性的β-半乳糖苷酶。
★底物X-gal被β-半乳糖苷酶分解后可产生蓝色产物，可使菌落或噬菌斑呈蓝色。即产物表达
呈蓝色，未表达呈无色。
【lacZ△M15 基因是缺失了编码β-半乳糖苷酶中第 11-41 个氨基酸的 lacZ 基因，无酶学活性。 lacZ′：只编码 N-端 140 个氨基酸的 lacZ 基因，其产物也没有酶学活性。当这两个无酶学活性的产物混合在一起时，可恢复β-半乳糖苷酶的活性，实现基因内互补。
在 lacZ′编码区上游插入一小段 DNA 片段（如 51 个碱基对的多克隆位点），不影响β-半乳糖苷酶的功能内互补。若在该 DNA 小片段中再插入一个片段，将几乎不可避免地导致产生无α-互补能力的β-半乳糖苷酶片段。底物 X-gal 还可充作生色剂，被β-半乳糖苷酶分解后可产生兰色产物，可使菌落或噬菌斑呈兰色。（此处为重点要理解记忆！)】
62】插入失活：外源DNA的插入而导致基因失活的现象，称为插入失活(insertional inactivation)。
63】★质粒DNA的分离纯化：氯化铯密度梯度离心法碱溶法沸水浴法
64】RNA干扰：双链RNA对基因表达的阻断作用。
根据dsRNA来源的不同，RNAi可分为转基因RNAi和病毒介导的基因沉默（VIGS）两种方法，使用不同的载体。
65】基因沉默：是利用植物体天然存在的免疫机制，将目的基因片段构建到病毒载体中并用病
毒侵染寄主植物，目的基因片段作为病毒的一部分同病毒一起复制并扩散到整株植物，植物体的防御机制被病毒激活后，在识别病毒和目的基因的同时，将內源的目的基因mRNA降解，从而达到基因沉默的目的。
66】VIGS技术最早的载体是以烟草花叶病毒（TMV）或马铃薯病毒X（PVX）为基础，但是，应用最成功的是烟草脆裂病病毒（TRV）
67】★RNAi表达框架（SECs）：由启动子、siRNA正义链模板、间隔区、siRNA反义链模板和终止子构成。
动物细胞一般采用polIII启动子
68】质粒载体必须具备的基本条件：具有复制起点、具有抗菌素抗生基因、具若干限制酶单一识别位点、具有较小的分子量和较高的拷贝数
69】重要的大肠杆菌质粒载体：1、pBR322质粒载体组成部分：氨苄青霉素抗性基因（ampr）、四环素抗性基因（tetr）、质粒pMB1的DNA复制起点（ori）优点:具有较小的分子量；具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号；具有较高的拷贝数；
2、pUC质粒载体是在pBR322质粒载体的基础上，组入了一个在其5′-端带有一段多克隆位点的lacZ′基因，而发展成为具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。特点：来自pBR322质粒的复制起点（ori）；氨苄青霉素抗性基因（ampr），但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的核酸内切限制酶的单识别位点；大肠杆菌β-半乳糖酶基因（lacZ）的启动子及其编码α-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ′基因；位于lacZ′基因中的靠近5′-端的一段多克隆位点（MCS）区段，但它并不破坏该基因的功能。
3、T载体：一个线性含3`-T突出端的载体用于直接高效地连接PCR产物。
70】克隆方法（Original TA Cloning Kit）即利用Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，在每条PCR扩增产物的3`端自动添加一个3`-A突出端。
71】病毒（virus）是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞（转导）,然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转
化。作为载体的原因：高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞；自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增黏性质粒载体：含有λ噬菌体DNA的某些位点并被包装而获得的载体
72】M13：小分子的丝状单链噬菌体
73】The phage cos ends： cos位点（cohesive-end site，粘性末端位点）在λ噬菌体线性双链 DNA分子的两端，各有一条由12个核苷酸组成的彼此完全互补的5′单链突出序列，即通常所说的粘性末端。
74】★λ噬菌体将基因组分为三个区：左臂、右臂、中间区
溶原状态：λ噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。
75】λ噬菌体载体构建时插入选择性标记基因：lacZ 基因、cⅠ基因失活（cⅠ是λ噬菌体的抑制基因，高频溶源化（hfl）的 E.coli 中，cⅠ的表达使λ噬菌体进入溶源状态）、Spi 筛选76】λ噬菌体载体分为两类：插入型载体（insertion vectors）只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点。替换型载体又叫做取代型载体（substitution vector一类在λ噬菌体基础上改建的、在其中央部分有一个可以被外源插入的DNA分子所取代的DNA片段的克隆载体。
77】转染（transfection）用λ重组体DNA分子直接感染大肠杆菌，使之侵入寄主细胞内。这种由寄主细胞捕获裸露的噬菌体DNA的过程叫做转染。转染效率：每微克λDNA转染产生的噬菌斑数目
78】末端酶（terminase）或Ter体系：λ噬菌体具有的一种位点特异的切割体系（site-specific cutting system）。发生作用的条件：λDNA分子具有两个cos位点，两个cos位点之间的距离38～54kb
79】Ti 质粒几乎所有的双子叶植物尤其是豆科类植物的根部常常会形成根瘤，这是由于植物根部被一种革兰氏阴性土壤杆菌农杆根瘤菌（Agrobacterium.tumefaciens）感染所致，其致瘤特性是由该菌细胞内的野生型质粒 Ti介导的.可分为T-DNA、Vir、Con、Ori四个功能区。Ti质粒的表达载体：一元载体是含目的基因的中间表达载体与改造后的受体通过同源重组所产生的一种复合性载体。双元载体是指由两个分别含有T-DNA和Vir区的相容性突变 Ti质粒构成的系统。80】常用的人造染色体载体：★酵母人工染色体载体YAC在酵母中复制的必需元件包括：自主复制序列、着丝粒、两个端粒。细菌人工染色体BAC
81】核酸的提取与纯化：
82】基因组DNA的提取的方法：1、浓盐法：利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分
离、2、有机溶剂抽提法：有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用、3、密度梯度离心法：利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物、4、CTAB 法、5、酚抽提法、6、SDS 法（SDS 可使蛋白质变性并降解蛋白质，也可降低DNA 酶活性）
83】碱裂解法提取质粒DNA 原理：环状的双链质粒DNA 在强碱作用下变性成单链DNA ，两条闭合环状的质粒DNA 在中性条件可复性成DNA 双链。
步骤 ：悬浮菌体——破膜、蛋白质和DNA 变性——中和——离心除去沉淀——纯化DNA ——沉淀DNA （乙醇）
84】DNA 提取常见问题：1、DNA 样品不纯，抑制后续酶解和PCR 反应 原因：DNA 中含有蛋白、多糖、多酚类杂质；DNA 在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应；DNA 中残留有金属离子
2、DNA 降解的 原因：材料不新鲜或反复冻融、未很好抑制内源核酸酶的活性、提取过程操作过于剧烈，DNA 被机械打断、外源核酸酶污染、反复冻融。
3、DNA 提取量少 原因实验材料不佳或量少、破壁或裂解不充分、沉淀不完全、洗涤时DNA 丢失
85】RNA 的提取与纯化：异硫氰酸胍/苯酚法 原理：细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；释放出来的DNA 和RNA 由于在特定pH 下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离；有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA 。离心分离法
86】影响RNA 提取的因素：材料、样品破碎及裂解、纯化、
87】核酸的纯度与浓度鉴定：紫外分光光度法（只用于测定浓度大于0.25ug/ml 的核酸溶液）、荧光光度法 88】断核酸样品的纯度：DNA 纯品: OD260/OD280 = 1.8
RNA 纯品: OD260/OD280 = 2.0
纯DNA 比值1.8，＜ 1.8 Pr 、苯酚污染
纯RNA 比值2.0， < 2.0 DNA 、 Pr 、苯酚污染
DNA 或RNA 的定量，OD260=1.0相当于50μg/ml 双链DNA 、40μg/ml 单链DNA （或RNA ）、20μg/ml 寡核苷酸
89】核酸的保存①DNA 的储存1、短期贮存：4℃或-20℃存放于TE （tris 和EDTA ）缓冲液中。2、长期贮存：TE 缓冲液中-70℃保存数年；②RNA 的储存：RNA 溶于0.3mol/L 的NaAc 溶液或三蒸水中，-70℃保存。
90】核酸电泳分成两类：聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳
91】DNA 电泳影响主要因素：DNA 分子特性和电泳条件（DNA 分子越大在胶中的摩擦阻力就越大，泳动也越慢；DNA 分子构型； 对于同种DNA 分子胶浓度越高，电泳速率越慢；电场强度偏高时电泳分离的线性范围会变窄（5V/cm ）；溴化乙锭 （ EB ））
92】DNA 电泳上样缓冲液 （loading buffer ）：10mmol/l 的EDTA 螯合Mg 2＋，防止电泳过程中DNA 被降解、一定浓度的甘油或蔗糖、溴酚蓝指示剂
93】★DNA 完整性的测定：以EB 为示踪剂的核酸凝胶电泳的结果可判定核酸制品的完整性，若降解，电泳图呈拖尾状
94】★RNA 完整性的测定：完整或降解很少的RNA 电泳图谱中，三条带荧光强度积分应呈特定的比值，沉降系数大的核酸区带，电泳迁移率低，荧光强度积分高；反之，分子量小，迁移率高，荧光强度积分低。
95】分子杂交(molecular hybridization)：利用带有标记（放射性同位素(32P 或125I)、生物素或荧光酶等）探针（DNA 、RNA 或蛋白质）进行相同或不同种类分子间相互特异识别而发生结20
4050)/(260或或稀释倍数核酸浓度??=A ml g μ
合的过程.Southern 杂交(Southern blotting )、Northern 杂交(Northern blotting )、Western 印迹法(Western blotting)、噬菌斑杂交。
96】探针（probe ）：一小段用放射性同位素、生物素或荧光染料进行标记的已知序列的核酸片段，即为探针（probe ）。
97】★通常用α-
P 32进行标记，因为P 32-γβ、会被切除。
98】寡核苷酸探针（oligonucleotid probe ）：是人工合成且被适当标记的由短链核苷酸组成的大分子（即一段比较短的DNA 或RNA ），能与被检测长链DNA 或RNA 进行分子杂交，且杂交后可由该分了上的标记显示目的长链DNA 或RNA 分子的存在。常用的标记物为放射性同位素标记： 32P 、 33P 、 35S ，非放射ABC 性标记：生物素、地高辛
99】探针的标记方法：末端标记法、切口平移法、引物延伸法、体外转录法
100】★杂交探针的标记：①ABC 荧光标记；②ABC 显色酶标记（加入生物素：蓝色；加入过氧化氢酶：棕褐色）；③地高辛系统标记（地高辛甾醇半抗原：digoxigenin DIG ）.(①②为非放射性检测)
101】原位杂交(in situ hybridization)：将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。
102】菌落或噬菌斑杂交:将生长在培养基平板上的菌落或噬菌斑按照其原来的位置不变地转移到滤膜上，并在原位发生溶菌、DNA 变性和杂交作用。
103】聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)利用单链寡核苷酸引物对特异DNA 片段进行体外扩增的一种方法。
104】基本过程包括：变性、退火、延伸。
105】反应最终的DNA 扩增量Y ：Y ＝(1＋X)n 代表DNA 片段扩增后的拷贝数，X ：表示平均每次的扩增效率n ：代表循环次数
106】平台效应：随着PCR 产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进 入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台效应
107】PCR 反应的基本成分：引物、酶(热稳定性DNA 聚合酶)、dNTP 、模板和二价阳离子（Mg2+）、一价阳离子（K+）、缓冲液
108】高保真酶：特点3′→5′核酸外切酶活性，降低碱基错配率。
用途：表达基因的克隆、基因的定点突变、细胞内基因点突变分析（SNP ）
109】引物是PCR 特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA 互补的程度 110】Ⅰ设计引物的原则：1、引物长度： 15-30bp ，常用为20mer 左右
引物的有效长度不能大于 38 个碱基；2、引物扩增跨度：以500bp 为宜；3、引物碱基：G+C 含量以40-60%为宜；4、避免两条引物间互补， 特别是 3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带；5、引物 3′端的碱基要求严格配对；6、引物中有或能加上合适的酶切位点；7、引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性8、引物量：每条引物的浓度0.1 ~ 1umol 或10 ~ 100 pmol ，以最低引物量产生所需要的结果为好9、引物的解链温度：两个引物之间的 Tm 值差异最好在 2-5℃
111】设计引物的操作流程：序列下载——同源性比较——引物设计筛选
112】DNA 序列的测定：双脱氧法测序 化学法测序
113】DNA 的体外重组：将目的基因与载体连接，这种重新组合的DNA 称为重组DNA 。
114】PCR 产物的连接：1.在引物的5’端设计酶切位点（3’端15～20bp 与模板互补； 5’端内切酶识别序列＋保护碱基）2. 与T 载体直接连接
115】耐热的DNA聚合酶:（1）Taq DNA聚合酶（保真度低于pfu，但扩增效率较高）、（2）Tth DNA 聚合酶、（3）Vent DNA聚合酶、（4）?Pfu DNA聚合酶（保真度最高，碱基错配率最低）、（5）Pwo DNA聚合酶
116】荧光扩增曲线可以分成三个阶段:荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。117】实时定量PCR技术:是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对模板中特定基因进行定量分析的方法。
118】实时荧光定量PCR计算步骤:临界点选择、临界点循环数、标准曲线绘制
119】DNA序列分析:Maxam–Gilbert化学降解法、Sanger双脱氧链终止法
120】★根据大肠杆菌对密码子的利用率（密码子的偏好性）来选择核苷酸最少的序列。
121】★3'端好扩增，因为有一个poly尾
122】★Gateway 噬菌体位点特异性重组系统；高效的实现DNA序列在多种载体系统的转移。包括BP和LR反应。
123】★attB和attP位点可发生重组反应，产生attL位点和attR位点
124】★溶源途径的重组蛋白是由λ噬菌体整合酶以及大肠杆菌整合宿主因子蛋白组成，这两种酶的混合物称之为BP克隆酶混合物，而裂解途径的重组蛋白是由λ噬菌体整合酶、切除酶以及大肠杆菌整合宿主因子蛋白组成，这三种酶的混合物称之为LR克隆酶混合物。
125】★重组体导入受体细胞的方法：转化（transformation）（大肠杆菌捕获质粒DNA的过程）、转导（借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程）和转染（transfection）（受体菌直接捕获噬菌体DNA的过程)
126】转化：热激法（制备感受态细胞）和电转化法（不需要制备特殊的感受态细胞）
127】共转化:一个受体细胞可同时接纳多个质粒分子。
128】CaCl2法制备感受态细胞转化DNA的原理：1、将处于对数生长期的细菌置于0℃的CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，处于感受态；
2、将感受态细胞与DNA混合，Ca2+与DNA结合形成抗DNase的羟基-磷酸钙复合物，粘附于细胞表面；
3、经42℃短时间热激处理，细胞吸收DNA复合物；
129】4、在培养基中生长数小时之后，球形细胞复原并增殖。
130】感受态细胞：处于能吸收外源DNA分子的生理状态的细胞
131】重组DNA导入真核细胞：（1）导入酵母细胞：原生质体转化（共转化：将两个以上的基因同时导入感受态细胞的方法）、碱金属离子介导的完整细胞转化、P132】农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法：将目的基因插入到载体的T-DNA区，形成重组DNA、将重组DNA转入含有Vir致病基因的农杆菌、通过农杆菌侵染植物外植体、将含有外源目的基因的T-DNA整合到植物细胞基因组中，获得转基因植株
（2）导入植物细胞：载体介导的转化（农杆菌介导）、DNA直接导入（基因抢法、电击法等）、种质系统法（花粉管通道法等）
（三）导入动物细胞：磷酸钙沉淀法、脂质体介导法、显微注射法、
DEAE(二乙氨乙基)-葡聚糖葡聚糖转染法
133】转化率（cfu / μgDNA）：每微克重组DNA转化后，接纳DNA分子的受体细胞的个数，即阳性克隆数。
转化率＝产生菌落的总数 / DNA的加入量
例1：取1μl（0.1 ng/μl）完整的质粒转化100μl的感受态细胞。向转化反应液中加入900μl培养液，让细菌恢复一小段时间，取100μl铺板。培养过夜，产生1000个菌落，转化率为多少？
转化率＝1000 / 0.01 ng DNA = 108 cfu /μg
例2：某一DNA重组实验的重组率为20%，转化率为107 cfu / mg 天然载体，经酶切和连接处理后的重组载体转化率比天然载体约低100倍，欲获得104个重组克隆，需要投入多少重组载体DNA进行重组实验？
104 ＝ 107 cfu / mg ×10-2 × a × 20% 重组载体 a = 0.5 mg
134】转化率的影响因素:1）载体DNA类型、大小；重组DNA浓度、纯度
2）受体细胞、3）转化方法：同一转化方法技术参数影响转化率
135】重组子的筛选与鉴定：一、载体表型选择法：抗药性标记及其插入失活选择法（pBR322质粒上有两个抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。）β-半乳糖苷酶显色反应选择法
（X-gal β-半乳糖苷酶半乳糖 + 5-溴-4-氯靛蓝（深蓝色））
二、根据插入基因的表型选择：利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。弥补缺陷、增加新性状
三、DNA电泳检测法直接电泳检测法、酶切电泳筛选法
四、PCR检测法：鉴定阳性克隆最为简单的方法
五、核酸杂交检测法:菌落原位杂交、Southern印记法（从宿主细胞中提取DNA，用探针杂交）、Northern印记杂交（从宿主细胞中提取RNA，用探针杂交）和Western印记杂交技术
六、免疫化学检测法（对表达产物的检测）：放射性抗体检测
七、DNA序列分析：DNA测序是最为准确的重组子鉴定方法
136】报告基因（reporter gene)：基因载体上引入的一些可证明载体已经进入宿主细胞，并可将含有目的基因的宿主细胞从其他细胞中识别区分甚至挑选出来的具有特殊标志意义的基因。★报告基因：gus A、gfp
137】组成型表达:管家基因
138】组成型启动子:一般来自于看家基因，可连续不断地启动基因的表达。
核糖体结合位点（RBS）在启动子下游。在原核生物中，又称为SD序列。
139】SD序列是翻译起始密码子上游5~13个核苷酸处的一段富含嘌呤5'-UAAGGAGGU-3'的全部或其中的一部分序列，在翻译起始阶段与核糖体小亚基16S rRNA的3'端相互作用，以确定正位起始密码子。
140】基因工程操作的一般步骤：（1）获得目的基因；（2）目的基因与载体的酶切与连接；（3）将目的基因导入受体细胞；（4）转化受体细胞的大量繁殖；（5）目的基因的检测和表达。
大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征：优势:全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架；基因克隆表达系统成熟完善；繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定；被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物。劣势:缺乏对真核生物蛋白质的复性功能；缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统；内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白；细胞周质内含有种类繁多的内毒素外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理：启动子、终止子、核糖体结合位点、密码子、质粒拷贝数
启动子的构建：TTGACA：-35区，RNA聚合酶的辨认位点，σ亚基结合位点。TATACA：-10区，Pribnow盒，RNA聚合酶的稳定结合位点。β'亚基的结合位点。
核糖体结合位点（RBS）：又称SD序列，是翻译起始密码子（AUG）上游5~13个核苷酸处的一段富含嘌呤5’ UAAGGAGG 3’的全部或其中的一部分序列，在翻译起始阶段与核糖体小亚基16SrRNA 的3’端相互作用，以正确定位起始密码子。
基因工程实验技术介绍
一、大肠杆菌质粒DNA的提取 质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法：碱裂解法。此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。方法如下： 1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养 基。 2、37℃振荡培养过夜。 3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3 min，弃上清液。 4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-H Cl pH8.0)充分混合。 5、加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH，1％ SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。 6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，p H4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。 7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另 一新Ep管 8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置1 0min。 9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。 10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有 液体。 11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中 二、质粒DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定 琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，应选用电泳纯的，琼脂糖此级产品筛除了抑制物和核酸酶，而且用溴化乙锭染色后荧光背景最小。 (1)琼脂糖凝胶电泳装置
由于琼脂糖凝胶电泳既要求不高，而适应性又强，在过去15年里已成功地设计了形形色色及大大小小的电泳槽。对这些装置的选择主要是依据个人的喜恶。使用最普遍的装置是Walt er Schaffner发明的水平板凝胶。 水平板凝胶通常在一块可安放于电泳槽平台的玻璃板或塑料盘上灌制。在有些装置中，则可将凝胶直接铺在平台上。凝胶恰好浸在缓冲液液面下进行电泳。凝胶的电阻几乎与缓冲液的电阻相同，所以有相当一部分的电流将通过凝胶的全长。 （2）琼脂糖凝胶的制备 琼脂糖凝胶的制备是将琼脂糖在所需缓冲液中熔化成清澈、透明的溶液。然后将熔化液倒入胶模中，令其固化。凝固后，琼脂糖形成一种固体基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。通贯凝胶的电场接通后，在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移。 （3）琼脂糖凝胶的染色 电泳完毕，将琼脂糖凝胶转移入含EB的染液中，染色10分钟，取出紫外灯下观察。 三、质粒DNA热激法转化大肠杆菌 感受态的细胞可以摄入外部溶液中的DNA，而常态的细胞却不能，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。 1、取1%大肠杆菌E.coli接种于含2ml LB培 养基的试管中，37℃振荡培养过夜 2、取0.1ml过夜培养物转种于含10ml LB培 养基的三角瓶中，37℃振荡培养3h至OD600=0. 3 3、然后把培养物倒入1.5ml离心管中，冰浴1 0min。 4、在4℃下以4000rpm离心5min，去上清液 5、把菌体悬浮于15m1冰冷的0.1M CaCl2溶液 中，置冰上30min 6、然后再在4℃下以4000rpm离心10min，去 上清液
基因工程原理练习题及答案
基因工程原理练习题及其答案 一、填空题 1．基因工程是_________年代发展起来的遗传学的一个分支学科。 2．基因工程的两个基本特点是：(1)____________，(2)___________。 3．基因克隆中三个基本要点是：___________；_________和__________。 4．通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小的片段，可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点相互位置的___________。 5．限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的，第一个大写字母取自_______，第二、三两个字母取自_________，第四个字母则用___________表示。 6．部分酶切可采取的措施有：(1)____________(2)___________ (3)___________等。 7．第一个分离的限制性内切核酸酶是___________；而第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是_____________。8．限制性内切核酸酶BsuRI和HaeⅢ的来源不同，但识别的序列都是_________，它们属于_____________。 9．DNA聚合酶I的Klenow大片段是用_____________切割DNA聚合酶I得到的分子量为76kDa的大片段，具有两种酶活性：(1)____________；(2)________________的活性。 10．为了防止DNA的自身环化，可用_____________去双链DNA__________________。 11．EDTA是____________离子螯合剂。 12．测序酶是修饰了的T7 DNA聚合酶，它只有_____________酶的活性，而没有_______酶的活性。 13．切口移位(nick translation)法标记DNA的基本原理在于利用_________的_______和______的作用。 14．欲将某一具有突出单链末端的双链DNA分子转变成平末端的双链形式，通常可采用_________或_______________。15．反转录酶除了催化DNA的合成外，还具有____________的作用，可以将DNA- RNA杂种双链中的___________水解掉。 16．基因工程中有3种主要类型的载体：_______________、_____________、______________。 17．就克隆一个基因(DNA片段)来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部分：_______________、_____________、______________。另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子量。 18．一个带有质粒的细菌在有EB的培养液中培养一段时间后，一部分细胞中已测 不出质粒，这种现象叫。 19．pBR322是一种改造型的质粒，它的复制子来源于，它的四环素抗性基因来自于，它的氨苄青霉素抗性基因来自于。 20．Y AC的最大容载能力是，BAC载体的最大容载能力是。 21．pSCl01是一种复制的质粒。 22．pUCl8质粒是目前使用较为广泛的载体。pUC系列的载体是通过 和两种质粒改造而来。它的复制子来自，Amp 抗性基因则是来自。 23．噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：一是；二是。 24．野生型的M13不适合用作基因工程载体，主要原因是 和。 25．黏粒(cosmid)是质粒—噬菌体杂合载体，它的复制子来自、COS位点序列来自，最大的克隆片段达到kb。 26．野生型的λ噬菌体DNA不宜作为基因工程载体，原因是：(1) (2) (3) 。 27．噬菌粒是由质粒和噬菌体DNA共同构成的，其中来自质粒的主要结构是，而来自噬菌体的主要结构是。 28．λ噬菌体载体由于受到包装的限制，插入外源DNA片段后，总的长度应在噬菌体基 因组的的范围内。 29．在分离DNA时要使用金属离子螯合剂，如EDTA和柠檬酸钠等，其目的是 。 30．用乙醇沉淀DNA时，通常要在DNA溶液中加人单价的阳离子，如NaCl和NaAc， 其目的是。 31．引物在基因工程中至少有4个方面的用途：(1) (2) (3) (4) 。 32．Clark发现用Taq DNA聚合酶得到的PCR反应产物不是平末端，而是有一个突出 碱基末端的双链DNA分子。根据这一发现设计了克隆PCR产物的。 33．在cDNA的合成中要用到S1核酸酶，其作用是切除在 。 34．乙醇沉淀DNA的原理是。 35．假定克隆一个编码某种蛋白质的基因，必须考虑其表达的三个基本条件：
最新基因工程笔记总结
第二章Enzymes 第四节DNA连接酶Ligase 一、DNA连接酶的发现 二. 连接条件 必须是两条双链DNA。 DNA3’端有游离的-OH，5’端有一个磷酸基团（P）。需要能量。 三、连接反应的机理 1、A TP（NAD+)提供激活的AMP。 2、A TP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi。 3、AMP 与连接酶的赖氨酸-氨基相连。 4、AMP 随后从连接酶的赖氨酸-氨基转移到DNA 一条链的5’端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物。 5、3’-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP。 Ligase：只连“Nick切口”，不连“Gap缺口” 四. 两种DNA连接酶 1. E. Coli DNA ligase 来源：E.coli 适用：粘性末端（PEG与高浓度一价阳离子存在可连平末端） 2. T4 ligase 来源：T4 phage 适用：粘性末端及平末端 T4 vs. E.coli T4 DNA ligase制备容易，价格便宜，能进行各种类型连接反应，应用更广泛！ 五.Ligase的反应温度 最佳温度： 界于酶作用速率和末端结合速率之间，一般认为是4-15℃比较合适。 六. DNA分子连接的四种形式 1. 粘性末端； 2. 平末端； 3. 平末端加尾； 4. 平末端加衔接物(linker)或接头(adaptor) (1)Digestion and Ligation 1．粘性末端连接 Problem: (自我环化作用) 解决方法：a、双酶切（两种内切酶）b、去磷酸 2.平末端连接 粘性末端连接效率高于平末端约100倍！ 解决方法：化平末端为粘性末端 3. 平末端连接---同聚物加尾法（1）末端脱氧核苷酸转移酶 功能：5’至3’单链聚合 作用特点：单链；无模版 作用机理： a: 用5’-特异的核酸外切酶处理DNA分子，以便移去少数几个末端核苷酸, 获得3’-OH的单链延伸末端。 b: 加入dA TP/dTTP和末端脱氧核苷酸转移酶组成的反应混合物中，DNA分子的3-OH末端将会出现单纯由poly(dA)和poly(dT)组成的DNA单链延伸。 c: 获得poly(dA)和poly(dT)尾巴，就会彼此连接起来。缺点： 当poly(dA)，Poly(dT)不严格等长时,重组DNA分子会有缺口。 需要用DNA聚合酶I填补，然后用DNA连接酶连接最后的缺口。 4. 平末端连接 ---衔接物连接法与接头连接法 (1) 平末端的衔接物连接法 衔接物的5’末端和待克隆的DNA片段的5’-末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化。通过T4 DNA连接酶的作用使两者连接起来。用适当的限制酶消化具衔接物的DNA分子和克隆载体分子。 (2) 平末端的接头连接法 将具有某种限制性酶(BamHI)粘性末端的典型DNA 接头分子与平末端的DNA片段连接后，后者变成具有粘性末端的DNA分子。 七.热稳定的DNA连接酶——来自嗜热高温放线菌 热稳定的DNA连接酶的应用： 寡核苷酸连接测定法（oligonucleotide ligation assay, OLA） 连接酶链式反应（ligation chain reaction, LCR） 寡核苷酸连接测定法的作用 检测突变 寡核苷酸连接测定法的作用：检测突变。 1. 寡核苷酸连接测定法 （1）原理: 两条寡聚核苷酸探针分子，同一种与之互补变性的靶DNA之间的杂交作用,这两条寡聚核苷酸探针分子在靶DNA分子上的位置是彼此相邻的。 当他们同靶DNA链是完全碱基配对时，便可以被连接酶连接起来。 结合点或靠近结合点处存在和靶DNA错配的碱基两个探针之间不能形成磷酸二脂键。 精品文档
基因工程实验报告
基因工程实验报告 、
小麦GAPDH截短体的重组与表达 摘要：本实验通过基因工程（genetic engineering）手段对小麦总RNA进行提取、PCR扩增及与质粒载体的重组构建的操作，并将重组质粒以氯化钙法导入大肠杆菌感受态细胞，诱导目的基因表达，并在蛋白水平进行Western检测。通过本对实验的实践，我们对基因工程技术将会有一个比较全面的认识和了解。 关键字：小麦基因；载体；感受态 前言 基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术。为在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。 （一）实验过程
1.实验部分流程：
2．小麦总RNA提取（Trizol法） 2.1 材料 小麦幼苗 2.2 试剂配制及器具处理 ① 0.1％的DEPC H2O（DEPC：焦碳酸二乙酯） ②器具处理：试剂瓶、量筒、研钵、大小枪头和1.5ml和0.2ml 的EP管等用纱布包裹，在 0.1％的DEPC H2O中浸泡过夜（37℃），高压灭菌，80℃烘干备用。剪刀、镊子和药匙等160℃烘烤6h以上。 ③无RNA酶灭菌水（DEPC H2O）：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃×2h）装蒸馏水，然后加入 0.1%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。 ④Trizol ⑤ 75%乙醇：用新打开的无水乙醇和DEPC处理过的水配制75%乙醇（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。 ⑥氯仿(最好用新的)。 ⑦异丙醇(最好用新的)。 2.3 操作步骤： ①先在研钵中加入液氮，再将小麦叶片剪成小段在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取50～100mg组织粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中（注意研磨粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%），充分混合均匀。 ②室温放置5min，然后加入200μL的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡15秒钟。 ③ 12000rpm离心10min，取上层水相于一新的EP管中（千万不要将中间的沉淀层和下层液混入，否则重新离心分离），加入500μL异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置10min，12000rpm 离心10min。 ④小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4℃下12000rpm离心5min。 ⑤重复步骤④。 ⑥弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥5～10min（注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度）。用30μL DEPC处理过的水将RNA溶解，必要时可55℃～60℃水浴10min。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。 3. RT-PCR扩增目的基因cDNA 3.1 试剂 ① RNA模板 ②Olig（dT）18 ③反转录缓冲液 ④dNTP ⑤ M-MULV反转录酶 ⑥ RNA抑制剂（RNasin） ⑦Premix EX Taq DNA聚合酶 ⑧ PCR特异引物 3.2操作步骤： 3.2.1 RNA的反转录 采用Thermo Scientific（Fermentas）RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Total RNA 6μL（需加入RNA约1μg） OligodT primer 1μL H2O（nuclease-free）5μL 12μL 65℃ 5min，补加下列试剂： 5× Reaction buffer 4μL RibolockRNase Inhibitor 1μL 10mM dNTP Mix 2μL RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase 1μL 20μL 42℃ 60min 70℃，5min，﹣20℃保存
《基因工程原理》期末复习思考题教案资料
《医用基因工程》复习思考题 第一章基因和基因组及基因工程的概念 一、名词概念 ①移动基因(插入序列；转位子)；②断裂基因；③RNA剪辑； ④内含子(间隔序列)与表达子；⑤重叠基因；⑥重复序列；⑦假基因；⑧启动子与终止子；⑨起始位点、终止位点。 二、讨论题 1.什么叫基因?何谓基因的新概念?基因的主要功能是什么? 2.一种基因一种酶的提法妥否？ 3.基因密码子三联体间是否存在着逗号？ 4.基因表达的产物中，氨基酸序列相同时，基因密码子是否一定相同？为什么？ 5.何谓转位子和转位作用?转位的后果如何? 6.基因中最小的突变单位和重组单位是什么？ 7.基因工程应包括哪些内容？何谓基因工程的四大里程碑和三大技术发明? 8.真核细胞基因组中常有内含子存在，能否在原核细胞获得表达？能，为什么？不能，为什么？ 第二章基因工程中常用的工具酶 1.什么是限制性核酸内切酶？ 2.什么是R/M现象？如何解释？ 3.II型核酸内切酶的基本特点有哪些？ 4.影响II型核酸内切酶活性的因素有哪些？如何克服和避免这
些不利因素？ 5.DNA连接酶有哪两类？有何不同？ 6.甲基化酶有哪两类？有何应用价值？ 7.什么叫同尾酶、同裂酶？在基因工程中有何应用价值？ 8.平末端连接的方法有哪些？(图示) 9.Klenow酶的特性和用途有哪些？举例说明。 10.反转录酶的特性有哪些？有何应用价值？ 11.列举碱性磷酸酶BAP/CAP的应用之一。 12.列举末端核苷酸序列转移酶的应用之一。 13.质粒单酶切点的基因连接如何降低本底和防止自我环化和提高连接效率？ 14.基因片段与载体的平末端连接的方法有哪些？ 15.用寡核苷酸和衔接物DNA的短片段连接时为使基因内部的切点保护，常用何种办法解决？ 第三章基因克隆载体 1.基因工程常用的载体有哪5种？其共同特性如何？ 2.什么是质粒？质粒分哪几种？有哪两种复制类型，质粒的分子生物学特性有哪些？ 3.质粒存在的三种形式是什么？ 4.分离质粒的基本步骤有哪些？ 5.分离纯化质粒的方法有哪几种？简述CsCl密度梯度(浮密度)分离法、碱变性法的原理，如何选择合适的分离方法？ 6.作为理想质粒载体的基本条件有哪些？ 7.什么叫插入失活，举例说明之。 8.构建pBR322质粒载体的亲本质粒有哪些？ 9.什么叫插入型和替换型噬菌体载体?插入型和替换型入噬菌体
生物选修3专题1 基因工程知识点复习学案
专题1 基因工程 基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过________________________，赋予生物以 _____________________，创造出______________________________________。基因工程是在____________上进行设计和施工的，又叫做__________________。 1. （1 （2 （3 2. (1)两种DNA ②区别：E· (2)与DNA 酸二酯键。 3. （1 （2 _____________________的双链___________DNA （3）其它载体： _________________________________ (二)基因工程的基本操作程序 第一步：__________________________ 1.目的基因是指： ______________________________________________________ 。 2.目的基因可采取_______________-获得，也可以用_____________________。人工合成目的基因的常用方 法有________________和_________________。 3.PCR技术扩增目的基因 （1）原理：_____________________ 将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是________________，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是 _______________。此方法的受体细胞多是 ____________。将目的基因导入微生物细胞：★原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少， 最常用的原核细胞是 ____________，其转化方法是：先用 ________处理细
植物基因工程实验技术
植物基因工程实验技术
编者: 赵 燕
主审: 张学文
湖南农业大学植物科学实验教学中心
2007 年 4 月
前
言
基因工程是现代生物技术的核心, 也是现代分子生物学研究的重 要手段. 掌握基因工程技术对于生物技术专业及其它生物学相关专业 学生都很重要. 基因工程本身是由一系列分子生物学操作技术组成的系统性技 术体系,本实验指导侧重于 DNA 重组操作,将基因工程操作的常用 和核心技术组织起来, 以为我校生物技术本科生及有关专业研究生基 因工程实验提供简单而明确的指导. 为适应基因工程的飞速发展,一些生物技术公司匠心独运,开发 出专门的试剂盒,使一些复杂的实验操作简单化了.这对于实验者来 说自然是好事,但也使实验者动手胜于用脑.对于实验人员来说,一 定应知其然并知其所以然, 才会在实验中运用自己的知识予以创新性 的发展.期望本实验指导不成为实验中的教条.
编
者
2007 年 4 月
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目
实验一 实验二 实验三 实验四 实验五 实验六 实验七 实验八 实验九 实验十 附录:
录
大肠杆菌的对照培养,单菌落的分离及菌种保存 ...............3 强碱法小量制备质粒 DNA.....................................................5 琼脂糖凝胶电泳......................................................................7 植物总 DNA 的提取,纯化和检测 ........................................9 DNA 的 PCR 扩增................................................................. 11 植物总 RNA 的分离 .............................................................15 RT-PCR..................................................................................17 体外重组分子的构建,筛选及检测.....................................21 植物表达载体的构建,筛选及检测.....................................22 植物遗传转化技术 ................................................................23 实验中常用的仪器与器皿 .....................................................24
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基因工程实验(答案)
——凯1.简述本学期从基因组DNA提取到重组质粒鉴定的实验流程？（实验题目的总结） 答：①基因组DNA的提取；②PCR扩增目的基因；③凝胶电泳分离纯化PCR扩增的DNA片段以及DNA的体外连接；④重组质粒的转化及转化子的筛选；⑤重组质粒的抽提；⑥重组质粒的酶切鉴定。 2.如何正确使用微量移液器？（自己写的） 答：①选取合适量程的移液器；②根据取液量设定量程；③安装（吸液）枪头；④按至第一档，将枪头垂直伸入液面下适当位置吸液；⑤按至第二档将液体打入容器；⑥弃掉枪头；⑦将量程调至最大，放回原处。 3.在琼脂糖凝胶电泳点样时，DNA通常和什么试剂混匀，其主要成分和作用是什么？ 答：loading Buffer。主要成分为溴酚蓝，二甲苯青和甘油。 溴酚蓝和二甲苯青起指示作用；甘油加大样品密度，从而沉降于点样孔中，以免浮出。 4.简述制作1%的琼脂糖凝胶电泳的操作步骤。（题目有歧义） 答：①取0.5g琼脂粉置于锥形瓶，量取50ml 1×TBE溶液于瓶中，微波炉加热至琼脂溶解； ②将移胶板放入胶室中，选取合适梳子垂直安插在移胶板上方，待琼脂降温至55℃下后，缓慢导入该胶室里；③量取合适量1×TBE溶液导入洗净的电泳槽，并正确插好电泳线；④等凝胶凝固后，将梳子垂直拔出；⑤点样；⑥轻放移胶板至电泳槽的合适位置；⑦打开电泳仪的开关，调好参数，开始电泳；⑧一定时间后，停止电泳，取出凝胶板，然后经BE染色放入成像系统显色、观察。 5.琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？（实验书P75） 答：①样品DNA的大小和构象；②琼脂糖浓度；③电泳电场；④温度；⑤缓冲液；⑥嵌入染料的存在与否； 6.在使用苯酚进行DNA抽提时应注意什么？（实验书P31） 答：注意不要吸取中间的变性蛋白质层。 7.在基因组DNA提取过程中常用酚、氯仿、异戊醇试剂，它们各有什么作用？ 答：酚——是蛋白质变性，抑制DNA酶的降解作用；氯仿——除去脂类，同时加速有机相与水相的分层；异戊醇——降低表面张力，从而减少气泡的产生。 8.提取DNA实验中，通常可选用哪些试剂沉淀DNA？ 答：冷的无水乙醇，冷的异丙醇，终浓度为0.1～0.25mol/L 的NaCl 9.简述在DNA提取实验中个试剂的作用（SDS，EDTA，酚/氯仿/异戊醇、无水乙醇，70%乙醇）。 答：SDS——破坏细胞膜，解聚核蛋白；EDTA——整合金属离子，抑制DNase活性；酚/氯仿/异戊醇——见第7题；无水乙醇——沉淀DNA；70%乙醇——洗涤DNA沉淀。 10.简述PCR扩增技术的原理及各种试剂的作用（Mg2+，dNTP，引物，DNA，缓冲液，Taq
基因工程复习题答案
基因工程原理复习题思考题 基因工程绪论 1、基因工程的定义与特征。 定义：在体外把核酸分子（DNA的分离、合成）插入载体分子，构成遗传物质的新组合（重组DNA），引入原先没有这类分子的受体细胞内，稳定地复制表达繁殖，培育符合人们需要的新品种（品系），生产人类急需的药品、食品、工业品等。 特征：1、具跨越天然物种屏障的能力。 2、强调了确定的DNA片段在新寄主细胞中的扩增。 2、试述基因工程的主要研究内容。 1）、目的基因的分离 2）、DNA的体外重组（载体、受体系统等） 3）、重组DNA分子转移到受体细胞及其筛选 4）、基因在受体细胞内的扩增、表达、检测及其分析。 3、基因工程在食品工业上有何应用发展？ 主要是通过基因重组，使各种转基因生物提高生产谷氨酸、调味剂、酒类和油类等有机物的产率；或者改良这些有机物组成成分，提高利用价值。 4、转基因是一把双刃剑，请客观谈谈对转基因及转基因食品安全性的认识。 转基因技术所带来的好处是显而易见的，在人类历史进步和发展中起到了积极作用。 首先，通过该项技术可以提供人们所需要的特性，改良培育新品种； 第二，延长食品保存时间或增加营养成分； 第三，将抗虫防菌基因转入到作物中，使作物本身产生抵抗病虫害侵袭的能力，减少了农药的使用量，有利于环境保护； 第四，转基因技术及基因食物在医学方面得到广泛研究和应用。 人们对转基因技术的主要担忧在于环境方面。外源基因的导入可能会造就某种强势生物，产生新物种或超级杂草、损害非目标生物、破坏原有生物种群的动态平衡和生物多样性，也即转基因生物存在潜在的环境安全问题。 转基因作物的大面积种植已有数年，食用转基因食品的人群至少有10亿之多，但至今仍未有转基因食品对生命造成危害的实例；更何况目前每一种基因工程食品在上市前，都要经过国家法律认可，食品卫生部门和环境部门的严格检测。只有测试合格了，才能投放市场。因此公众完全可以安全地消费、大胆地食用转基因食品。 第一章 DNA的分子特性与利用 1、原核生物和真核生物的基因表达调控有何差别？ 1）原核基因表达调控的三个水平：转录水平调控、翻译水平调控、蛋白质加工水平的调控原核基因表达调控主要是在转录水平上的调控。 2）真核生物基因表达的特点： ● 1．基因组DNA存在的形式与原核生物不同； ● 2．真核生物中转录和翻译分开进行； ● 3．基因表达具有细胞特异性或组织特异性； ● 4．真核基因表达的调控在多个水平上进行：DNA水平的调控、转录水平调控、转 录后水平调控、翻译水平调控、蛋白质加工水平的调控； 2、什么是基因？根据基因的产物，基因可分为哪三类？ 基因是具有生物学功能的、在染色体上占据一定位置的一段核苷酸序列，是分子遗传的功能
基因工程技术 笔记整理
基因工程技术：按照人们的愿望，进行严密的设计，通过体外DNA重组和转移等技术，有目的地改造生物种性，使现有物种在较短的时间内趋于完善，创造出新的生物类型。 质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、共价闭合环状DNA分子cccDNA，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中，它具有自主的复制和转录系统。质粒在细胞内的复制一般有二种：紧密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，通常每个细胞内只含有一个或几个质粒分子；后者在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝。 质粒的不相容性：利用共同复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共存。 从细胞中分离质粒DNA 的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。 溶菌酶：破坏菌体细胞壁；SDS和Triton X-100：使细胞膜裂解。 染色体DNA通常用于构建基因组文库和Southern杂交等。 基因组DNA的提取 植物基因组DNA提取：提取缓冲液（Tris.Cl—保持pH,EDTA,NaCl,SDS），氯仿/戊醇/乙醇溶液—沉淀和抽提DNA，异丙醇—沉淀DNA（提染色体），TE（Tris.Cl,EDTA）--溶解DNA，RNase—保存液，降解RNA，NaAC—加盐，70%乙醇—漂洗。 细菌基因组DNA提取：SDS，蛋白酶K，氯仿：异戊醇（24：1）-- 沉淀DNA，苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）-- 抽提，70%乙醇—漂洗，TE,NaCl—调节离子强度，RNase A，CTAB/NaCl 溶液—CTAB--一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，异丙醇/无水乙醇—沉淀上清液。 总RNA制备 mRNA的分子结构容易受到RNA酶的攻击反应而降解，加上RNA 酶极为稳定而且广泛存在，因此，在提取过程中应严格防止RNA 酶的污染并设法抑制其活性，这是实验成败的关键。仪器—玻璃器皿：200℃烘2h，塑料器皿：DEPC水液处理—所有器皿最后硅烷化处理。 RNA酶抑制剂：DEPC--强烈但不彻底，与氨水溶液混合会产生致癌物；异硫氰酸胍--最有效，使RNA酶失活；其他--RNA酶蛋白抑制剂（RNasin）SDS, 尿素等。 细胞内总RNA制备方法：异硫氰酸胍热苯酚法、酚/SDS法、Trizol法。（均先将组织在液氮中研磨成粉末） 异硫氰酸胍热苯酚法：异硫氰酸胍(GIT)与β－巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性，GIT与十二烷基肌氨酸钠(Sarcosyl)作用使蛋白质变性。 酚/SDS法：用酚和SDS破碎细胞和去除蛋白质，用LiCl选择沉淀RNA以去除DNA 和其它不纯物。 Trizol法：Trizol试剂（含酚、异硫氰酸胍和溶解剂等）。 mRNA提取 制备mRNA原理：分离的总RNA 可利用mRNA3’端含有poly(A)的特点，用oligo(dT)纤维素柱分离，当RNA流经oligo(dT)纤维素柱时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素上，然后逐渐降低盐浓度洗脱，在低盐溶液或蒸馏水中，mRNA被洗下。然后经过两次oligo（dT）纤维素柱，可得到较纯的mRNA。纯化的mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。（上样buffer和洗脱buffer）。溶液中无盐时要沉淀RNA，必须加盐NaAC。 琼脂糖凝胶电泳 DNA凝胶电泳：琼脂糖-- 分离DNA片段大小范围广；聚丙烯酰胺-- 小片段，分辨力高。
基因工程实验考试试题(答案)
1.简述本学期从基因组DNA提取到重组质粒鉴定的实验流程？ 答：①基因组DNA的提取；②PCR扩增目的基因；③凝胶电泳分离纯化PCR扩增的DNA片段以及DNA的体外连接；④重组质粒的转化及转化子的筛选；⑤重组质粒的抽提；⑥重组质粒的酶切鉴定。 2.如何正确使用微量移液器？ 答：①选取合适量程的移液器；②根据取液量设定量程；③安装（吸液）枪头；④按至第一档，将枪头垂直伸入液面下适当位置吸液；⑤按至第二档将液体打入容器；⑥弃掉枪头；⑦将量程调至最大，放回原处。 3.在琼脂糖凝胶电泳点样时，DNA通常和什么试剂混匀，其主要成分和作用是什么？ 答：loading Buffer。主要成分为溴酚蓝，二甲苯青和甘油。 溴酚蓝和二甲苯青起指示作用；甘油加大样品密度，从而沉降于点样孔中，以免浮出。 4.简述制作1%的琼脂糖凝胶电泳的操作步骤。 答：①取0.5g琼脂糖置于锥形瓶，量取50ml 1×TBE溶液于瓶中，微波炉加热至琼脂糖溶解；②将移胶板放入胶室中，选取合适梳子垂直安插在移胶板上方，待琼脂降温至55℃下后，缓慢导入该胶室里；③量取合适量1×TBE溶液导入洗净的电泳槽，并正确插好电泳线； ④等凝胶凝固后，将梳子垂直拔出；⑤点样；⑥轻放移胶板至电泳槽的合适位置；⑦打开电泳仪的开关，调好参数，开始电泳；⑧一定时间后，停止电泳，取出凝胶板，然后经BE染色放入成像系统显色、观察。 5.琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？（实验书P75） 答：①样品DNA的大小和构象；②琼脂糖浓度；③电泳电场；④温度；⑤缓冲液；⑥嵌入染料的存在与否； 6.在使用苯酚进行DNA抽提时应注意什么？（实验书P31） 答：注意不要吸取中间的变性蛋白质层。 7.在基因组DNA提取过程中常用酚、氯仿、异戊醇试剂，它们各有什么作用？ 答：酚——是蛋白质变性，抑制DNA酶的降解作用；氯仿——除去脂类，同时加速有机相与水相的分层；异戊醇——降低表面张力，从而减少气泡的产生。 8.提取DNA实验中，通常可选用哪些试剂沉淀DNA？ 答：冷的无水乙醇、冷的异丙醇、终浓度为0.1～0.25mol/L 的NaCl 9.简述在DNA提取实验中个试剂的作用（SDS，EDTA，酚/氯仿/异戊醇、无水乙醇，70%乙醇）。 答：SDS——破坏细胞膜，解聚核蛋白；EDTA——整合金属离子，抑制DNase活性；酚/氯仿/异戊醇——见第7题；无水乙醇——沉淀DNA；70%乙醇——洗涤DNA沉淀。 10.简述PCR扩增技术的原理及各种试剂的作用（Mg2+，dNTP，引物，DNA，缓冲液，Taq DNA聚合酶）。 答:(1)利用半保留复制的原理，以待扩增的DNA为模板，通过一系列酶在体外引物介导下，
基因工程试题及答案
《基因工程》 一、选择题（每小题1.5分，共15分） 1．基因工程的创始人是( )。 A A. Kornberg B W. Gilbert C P. Berg D S. Cohen 2．关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有( )不太恰当。 A 由作用于同一DNA序列的两种酶构成 B 这一系统中的核酸酶都是Ⅱ类限制性内切核酸酶 C 这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对DNA进行修饰 D 不同的宿主系统具有不同的限制-修饰系统 3．在DNA的3’-5’链上，基因的起始密码子是( ) A ATG（或GTG） B AGT C TAG D TGA 4．II限制性内切核酸酶可以特异性地识别( )。 A 双链DNA的特定碱基对 B 双链DNA的特定碱基序列 C 特定的三联密码 D 以上都正确 5．末端转移酶是合成酶类，具有( )活性。 A 3’5’DNA聚合酶 B 5’3’DNA聚合酶 C 5’3’DNA内切酶 D 5’3’DNA外切酶 6．下面关于松弛型质粒(relaxed plasmid)性质的描述中，( )是不正确的。 A 质粒的复制只受本身的遗传结构的控制，因而有较多的拷贝数。 B 可以在氯霉素作用下进行扩增。 C 通常带有抗药性标记。 D 同严紧型质粒融合后，杂合质粒优先使用松弛型质粒的复制子。 7．关于cDNA的最正确的说法是( )。 A 同mRNA互补的单链DNA B 同mRNA互补的双链DNA C 以mRNA为模板合成的双链DNA D 以上都正确 8．关于T4 DNA Ligase，下列说法中哪一项不正确? ( ) A 是最常用的DNA连接酶。 B 不但能连接粘性末端，还能连接齐平末端。 C 不但能连接粘性末端。 D 最适温度37 ℃。 9．下列关于建立cDNA文库的叙述中，( )是错误的? A 从特定组织或细胞中提取DNA或RNA B 用反转录酶合成mRNA的对应单链DNA C 以新合成的单链DNA为模板合成双链DNA D 新合成的双链DNA克隆到载体上，并导入受体细胞 10．用下列方法进行重组体的筛选，只有( )说明外源基因进行了表达。 A Southem blot B Northem blot C Western印迹 D 原位菌落杂交
基因工程复习笔记
第一章 一、电泳 电泳(eletrophorosis) :带电荷的分子在电场中以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动.移动速度称为电泳迁移率。 影响因素：1 电泳迁移率同电场的强度和分子本身所带的净电荷数目成正比。 2. 电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比。 3当电场强度一定,电泳介质相同,电荷相同的分子在电场中迁移的速度主要取决于分子本身的大小和形状(构型)。 4分子形状相似的分子的迁移速度主要与分子量相关: 分子量越大，移动越慢。 指示剂：溴酚蓝（Bb）：常用指示剂。分子量670，分子筛效应小，近似于自由电泳，呈蓝紫色。二甲苯青(Xc)：分子量554.6，呈蓝色，迁移速度比Bb慢。 染料：溴化乙锭（EB） 1、聚丙烯酰胺凝胶电泳优点：比琼脂糖凝胶的分辨率高的多；回收DNA样品纯度高，无色透明，韧性好，银染的凝胶干燥后可长期保存；能装载的DNA量大，达每孔10μgDNA。 2 、SDS-PAGE 原理：SDS是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上相同密度负电荷。SDS与蛋白质结合使蛋白质构象改变，成为形状近似雪茄状的长椭圆棒，SDS-蛋白质复合物短轴相同，而长轴与蛋白质的分子量成正比。
蛋白质-SDS复合物电泳的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒的长度，即蛋白质分子量有关。 二、PCR技术 定义：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术，以DNA为模板，在引物、dNTPs、Taq酶的作用下，经变性－退货－延伸反复循环，使某个基因在体外特异性地扩增。 PCR法的原理也是利用人工合成带突变位点的诱变引物，通过PCR 扩增而获得定点突变的基因或DNA片段。 影响因素：（1）Taq DNA聚合酶（具有5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，但没有3’→5’外切酶活性因此不能修复错误的碱基配对）。 （2）引物（primer）一般引物设计为长15—30bp；位置与待扩增的模板DNA区段的两3’端序列互补（5‘端相同）的短DNA；引物的碱基组成：尽可能提高G+C含量，避免连续相同碱基排列或内部回文序列，避免形成引物二聚体。 （3）引物的Tm值：实际复性温度选择低于Tm值5 oC。 （4）dNTPs 含量适中 （5）Mg 2+ 的浓度 （6)对照实验 三、PCR技术的扩展：反向PCR：不对称PCR：差异显示PCR。反向PCR 原理：扩增两个引物外侧的未知序列，使引物的外侧序列“转变” 成内侧序列。扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA，
基因工程试验指导
《基因工程》实验指导 湖南师范大学生命科学学院 遗传与发育生物学系 2009年5月
基因工程课程综合实验---转基因斑马鱼的构建 一、实验目的 本课程的教学目的是让学生对基因工程技术所涉及的主要环节的基本原理、完整流程和基本技术进行系统地学习和掌握，培养学生具有通过这些原理进行基因工程实验和研究方面的设计能力。在基因工程理论课程的讲授和实践课程的实际操作过程中对学生进行基因操作与社会伦理方面的训练和教育，重在素质和能力的培养。 二、实验原理 转基因动物（transgenic animal）是指动物所有细胞基因组中整合有外源基因的一类动物，具有将外源基因遗传给子代的能力，整入动物基因的外源基因被称为转基因（transgene）。转基因动物技术是常规分子生物学技术的延伸和拓展，是基因工程技术的核心内容之一，它不仅为人们研究生命科学提供了一个更有效的工具，转基因技术是生物学领域最新重大进展之一，已能渗透到生物学、医学、畜牧学等学科的广泛领域。转基因动物已成为探讨基因调控机理、致癌基因作用和免疫系统反应的有力工具。同时人类遗传病的转基因动物模型的建立，为遗传病的基因治疗打下坚实的理论和实验基础。转基因技术涉及外源基因的获取、重组载体的构建与检测鉴定、受体系统的准备、显微注射基因导入、供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物的饲养等方面的内容。 三、材料
限制性内切酶：Eco R I、Sal I、Age I、Not I、Bam H I；T4 DNA聚合酶；LA DNA聚合酶混合物均为大连TaKaRa公司产品； 3. 2菌株及细胞系 DH5α感受态细胞：由本实验室自行制备并存于-20℃； 3. 3 质粒与表达载体系统 3. 3.1 pEGFP-N1载体 pEGFP- N1载体是一种把异源性的蛋白质融合至EGFP的N端的哺乳动物表达载体，为Clontech公司的产品。含有人类巨细胞病毒（CMV）启 图1 含有绿色荧光蛋白基因的卡那霉素抗性的pEGFP-N1质粒 动子，SV40 Poly A尾，pUC复制起始点（原核）和SV40复制起始点（真核），20个多克隆位点，具有筛选标志卡那霉素（原核）和新霉素（真核）的抗性基因，见图1。异源性蛋白与EGFP阅读框一致地克隆入pEGFP-N1，形成的表达重组体在CMV启动子启动下，表达EGFP和目标蛋白的融合蛋白。该融合蛋白保持了EGFP的荧光特性，可对融合蛋白进行活细胞内
最新-第二学期基因工程原理课程考试试卷(A)参考答案
学习-----好资料 2008─2009学年 第 2学期 《基因工程原理》课程考试试卷(A 卷)参考答案 专业: 生物技术 年级:2006 考试方式:闭卷 学分:4 考试时间:120分钟 一、名词解释(每小题2.5分，共15分) 1、 基因工程：是指在分子水平上进行的遗传操作，指将一种或多种生物提（供体）的基因 或基因组提取出来，或者人工合成基因，按照人们的愿望，进行严密的设计，经过体外加工重组，转移到另一种生物体（受体）的细胞内，使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术。 2、 星活性：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH 值等，会使一些核酸内切酶 的识别和切割序列发生低特异性，即Star activity 现象。 3、 插入型载体：只具有一个可供外源DNA 插入的克隆位点。 4、 反转录PCR ：在逆转录酶的作用下、以mRNA 为模板合成互补的cDNA ，再以cDNA 为 模板进行PCR 反应。 5、 感受态：受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂法）的处理后，细 胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA 的载体分子通过的感受态细胞。 6、 考斯质粒：考斯质粒是一类人工构建的含有l-DNA cos 序列和质粒复制子的特殊类型的载 体 二、填空题(每小题1分，共10分) 1、用酚—氯仿抽提DNA 时，通常要在氯仿或酚—氯仿中加少许异戊醇，这是因为异戊醇可以 防止气泡 ；分离DNA 时要使用金属离子螯合剂，如EDTA 和柠檬酸钠等，其目的是 抑制了DNase 。 2、按照质粒拷贝数的多少，质粒可以分为 严谨型质粒 。和 松弛型质粒 。 3、λ 噬菌体在感染大肠杆菌以后，可以进入 Lytic growth 也可以进入 Lysogenic state 。如果其基因组 DNA 通过专一性重组整合到宿主染色体中，则其进入 融源状态 。；它也可以选择进入 融菌状态 ，大量复制并组装子代噬菌体颗粒。 4、ddNTP 与普通的 dNTP 的不同之处在于 ddNTP 2’和3’双脱氧 ，它们可以在 DNA 聚合酶的作用下，通过其 5’ 掺入到正在增长的 DNA 链中，导致链延伸反应终止。 5、Klenow DNA 聚合酶是 DNA 聚合酶Ⅰ 经蛋白酶裂解而从全酶中除去 5’—3’外切酶 活性的多肽大片断，而其他活性保持不变。 三、选择题(每小题1.5分，共15分) 1、限制性内切核酸酶可以特异性地识别（ C ）。 A 、特定的三联密码； B 、双链 DNA 的特定碱基对； C 、双链 DNA 的特定碱基序列； D 、单链 DNA 的特定碱基序列。 2、在切口平移方法标记 DNA 探针时只能使用（ B ）。 A 、Klenow 酶； B 、DNA 聚合酶 Ⅰ； C 、DNA 聚合酶 Ⅱ； D 、DNA 聚合酶 Ⅲ。 3、在下列进行 DNA 部分酶切的条件中，控制哪一项最好（ C ）。 A 、反应体积； B 、酶反应温度； C 、反应时间； D 、酶量。 4、PCR 扩增有时会出现弥散的条带，以下原因阐述不正确的是（ B ）。 A 、退火温度过低； B 、退火温度过高； C 、dNTP 浓度过高； D 、循环次数过多。 5、以下不属于 PCR 的应用的为（ D ）。 A 、随机扩增多态性 DNA （RAPD ）； B 、扩增片段长度多态性（AFLP ）； C 、RACE ； D 、S1 酶作图。 6、pUC18 与 pUC19 的区别在于（ B ）。 A 、二者的选择标记不同； B 、二者的多克隆位点方向相反； C 、pUC18 无 lacZ 基因； D 、pUC19 无 lacZ 基因。 7、有关 DNA 序列自动化测定的不正确叙述是（ D ）。 A 、用荧光代替了同位素标记； B 、激光扫描分析代替人工读序 基； C 、本原理与手工测序相同； D 、不再需要引物。