酶学论文
α-淀粉酶在食品工业的应用进展综述 摘要: α-淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物中，能水解淀粉产生糊精、麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。目前，α-淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发酵以及纺织等许多行业。本文对α-淀粉酶来源、分类、作用机理及其应用进行了相关综述。
关键词: α-淀粉酶；分类；作用机理；应用
Abstract: α-amylases are universally distributed throughout the animal, plant and microbial kingdoms.They can hydrolyse starch molecules to give diverse products including dextrins and progressively smaller polymers composed of glucose units. α-amylases are one of the most popular and important form of industrial amylases.These enzymes are applied in baking industry, the processing of starch, fermentation, brewing industry, textile and paper industries. In this paper, the α-amylase source, classification, mechanism of action and the application of α-amylase are reviewed.
Key words: α-amylase; Classification; mechanism; application
1 α-淀粉酶的定义
根据淀粉酶对淀粉的水解方式不同，可将其分为α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和异淀粉酶等（图1）[1]。其中，α-淀粉酶（α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖苷酶)多是胞外酶，其作用于淀粉时可从分子内部随机地切开淀粉链的α-1，4糖苷键，而生成糊精、寡糖、麦芽糖、葡萄糖等产物，产物的末端残基碳原子构型为α-构型，故称α-淀粉酶。α-淀粉酶是一种内切酶，其相对分子量约50000Da 左右，它水解直链淀粉的最终产物是麦芽糖与葡萄糖，而其水解支链淀粉的最终产物是麦芽糖、葡萄糖和异麦芽糖。α-淀粉酶是一种非常重要的工业用酶，广泛应用于食品、纺织、造纸、洗涤、医药等工业[2-4]。
2 α-淀粉酶的来源
图1根据淀粉酶的作用淀粉的方式分类[1]
α-淀粉酶广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物中，它可以由微生物发酵制备，也可以从动植物中提取；主要存在发芽谷物的糊粉细胞中及人的唾液和胰脏中，也存在于蟑螂涎腺、芽胞杆菌、枯草杆菌、黑曲霉和米曲霉中，从微生物到高等动、植物均可分离到，是一种重要的淀粉水解酶，也是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。
微生物来源的淀粉酶具有来源丰富、性能多样和易于工业化生产的特点，可满足多种工业应用需求，在工业上的应用也最为广泛[1,5]，主要可由米曲霉、嗜酸性普鲁士蓝杆菌、淀粉液化杆菌、地衣芽孢杆菌和枯草杆菌分别经发酵、精制、干燥而得。其中在现代工业的淀粉质处理过程中，微生物淀粉酶的水解方法已经彻底取代传统的化学水解方法[2]。虽然有多种微生物可以产生α-淀粉酶，包括丝状真菌、酵母、细菌和放线菌等。但是，目前能够满足工业应用需求的α-淀粉酶主要来源于细菌和丝状真菌[1]，其中由真菌产生的α-淀粉酶称为真菌α-淀粉酶。
3 α-淀粉酶的分类
3.1根据α-淀粉酶来源不同分类
α-淀粉酶的来源非常广泛，包括动物、植物和微生物，其中微生物来源的淀粉酶具有来源丰富、性能多样和易于工业化生产的特点，可满足多种工业应用需求，在工业上的应用也最为广泛[1,5]。根据来源不同，α-淀粉酶有真菌α-淀粉酶、谷物α-淀粉酶、细菌α-淀粉酶，其性质各异。谷物α-淀粉酶及细菌α-淀粉酶，热稳定性较强，尤其是细菌α-淀粉酶，其钝化温度高达95℃，当面包进入焙烤阶段后，仍对淀粉具有水解作用，虽对提高面包质量，改善表皮色泽，增大面包体积，延缓面包老化起很大作用，但若添加过量，易使面包心发粘，故应谨慎添加使用。椐资料介绍，近年来已鉴定了一些耐热性相对较低的细菌α-淀粉酶，并已被用作有效的抗老化剂。真菌α-淀粉酶热稳定性较差，65℃以下就已失活，即使添加量过多，也不会造成面包心发粘的质量问题，故面包生产厂商普遍喜欢使用真菌α-淀粉酶。
3.2 根据的不同分类
根据α-淀粉酶的酶学性质可将其分为中温α-淀粉酶、耐高温α-淀粉酶、耐酸性α-淀粉酶、耐酸耐高温α-淀粉酶等。
3.2.1 中温α-淀粉酶
中温α-淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的总称，其系统名称为α-1，4葡聚糖-4-葡聚糖水解酶( α-1，4-g1uca-4-g1uca-nohydroLase) ，是一种内切淀粉酶[6]。中温α-淀粉酶主要用于淀粉糖生产、味精生产、啤酒和酒精生产中辅料的加工、织物退浆、以及其它酿造、有机酸和医药行业[7,8]。在面粉中添加中温α-淀粉酶不仅可以增加发酵率，降低生面团粘度，改进产品的体积和质地，改良面面制品的口感、外皮颜色和质量，使产品体积更大，颜色更好，颗粒更柔软，还可以延长面制品的保鲜时间[9-11]。
3.2.2 耐酸性α-淀粉酶
目前，工业上广泛使用的α-淀粉酶的最适在pH=5.8-6.2，在低pH情况下易丧失活力[12,13]。在我国淀粉质原料深加工过程中，大多要经过液化和糖化两个阶段，其中所使用的酶分别为α-淀粉酶和糖化酶。两种酶的最适作用pH分别约为pH=6.5和pH=4.5[12,14]，在两个阶段衔接中需要加入一些化学试剂进行酸度调节，这样不仅耗费大量的酸、碱，而且最后还要对产品进行离子交换脱盐，进一步纯化，使得工艺流程变得复杂，生产成本大大提高。耐酸性α-淀粉酶是在酸性条件下能水解淀粉的酶类，可以在低pH条件下液化淀粉，能在酸性条件下保持高活性，简化液化、糖化过程，降低淀粉深加工的生产成本。
3.2.3 耐高温α-淀粉酶
近几年来，α-淀粉酶广泛地应用于淀粉加工、酒精、味精、啤酒、有机酸和饲料行业，由于这些行业的特殊性，常需要在高温条件下进行，因此要求α-淀粉酶具有高度的耐热性。耐高温a-淀粉酶具有良好的液化作用，可以任意切断水解淀粉中的α-1，4葡萄糖苷键，使糊化的淀粉液粘度迅速下降，
产生长短不一的短链糊精和少量的低聚糖；且作用力强，反应速度快，为糖化提供了更多的糊精非还原性末端。耐高温α-淀粉酶具有良好的耐热性能，其最适作用温度为90℃，最适作用温度范围为90-95℃，最适使用温度范围可达到95-105℃，在蒸汽喷射工艺中，使用温度可高达105-110℃[15]。耐高温α-淀粉酶热稳定性好，对钙离子的需要量少，还可以利用温度变化提高在固态发酵体系中α-淀粉酶的生产量[16]。
3.2.4 耐酸耐高温α-淀粉酶
目前广泛应用的α-淀粉酶大部分都存在着热稳定性较差和pH 范围较窄等方面的缺陷，致使工业生产成本的增加。不同的应用领域由于工艺条件的特殊性，要求α-淀粉酶必须具备耐酸耐高温的特性才能在工业应用中更高效更节省的行使其催化作用。在淀粉产品的加工过程中常常包括两个过程：液化和糖化，除了作用温度不同外，在液化和糖化两个过程中所需的两种酶α-淀粉酶和糖化酶的作用pH 也有显著差异。如果能够开发出热稳定性好、活性强、pH 适用范围广的α-淀粉酶，不但可以省去淀粉糊化到液化的冷却过程，减少了大量的能源消耗，还增加液化速度，而且还避免了从液化到糖化工艺的pH 调节，降低酸碱消耗和生产成本。现阶段研究最多的是将耐酸耐高温α-淀粉酶基因克隆到其他菌种中，国外已成功将地衣芽孢杆菌[17]中耐酸耐高温α-淀粉酶基因提取，并在枯草芽孢杆菌中表达，重组菌产的α-淀粉酶有良好的耐酸耐热性，广泛应用于食品与酿造工业。
4 α-淀粉酶的作用机理
α-淀粉酶水解淀粉的机制研究表明[18,19]，α-淀粉酶在切割α-1，4-D 糖苷键时，使糖链末端的C 原子的构型发生α构型变化。水解过程主要分为3步：第一步由质子供体Glu261使得糖苷键上的O 2原子质子化，并由催化氨基酸残基 Asp231向糖环上的C1发起攻击并使底物还原糖末端断裂。第二步由激活的水分子水解位于糖链C1和D231之间的共价键。第三步起始质子化状态的再生(图2）。在活性位点上的氨基酸残基Asp328没有直接参与催化反应，目前对于它在催化反应中所起的作用还不是很清楚。
α--淀粉酶作用于淀粉时，将α-1，4 糖苷键裂开，而产物的构型保持不变。
淀粉酶水解直链淀粉的过程，一般可以分为两个阶段：第一阶段，淀粉酵将直链淀粉迅速随机水解成小分子糊精、麦芽糖和麦芽三糖。第二阶段的水解速度相对较慢，这是因为淀粉酶不能水解麦芽
糖，并且对麦芽三糖的水解也很困难，因而主要是将第一步生成的糊精水解成葡萄糖、麦芽糖和低聚糖，这就造成即使是在极高的酶浓度条件下，也仅仅只有少量的葡萄糖产生的现象。
淀粉酶水解支链淀粉时，其水解特性有所不同。当淀粉酶遇到，葡萄糖苷键时，不能进行水解，但能越过此键继续作用，因此其水解产物中除了有麦芽糖、葡萄糖和低聚糖外，还残留有一系列的极限糊精。由于，葡萄糖苷键的存在，淀粉酶水解支链淀粉比水解直链淀粉要慢得多。
5 α-淀粉酶在食品工业的应用
图2 糖苷水解酶的催化机制[18]
α-淀粉酶广泛存在于动物、植物、微生物中，是工业生产中应用最为重要，最为古老，最为广泛的酶制剂之一，主要应用于食品加工、酒精酿造、制药、纺织退浆、造纸、洗涤液、饲料及石油开采等多种领域，而在食品行业主要应用于淀粉深加工、焙烤工业、啤酒酿造等等[7]。
5.1 α-淀粉酶在面包焙烤中作为保鲜剂
酶应用在焙烤工业中生产各种高品质的产品已经有几百年的历史，最近几十年，麦芽α-淀粉酶和微生物α-淀粉酶被广泛用于焙烤工业，这些酶用于面包工业，使这些产品体积更大、颜色更好、颗粒更柔软。真菌α-淀粉酶可水解面粉中的受损淀粉生成小分子糊精，通过酵母的进一步发酵产生醇类物质和二氧化碳，从而使面包体积增大。在此过程中产生的还原糖在面包烘焙过程中可参与美拉德反应，有助于改善面包的外表色泽。因此，真菌α-淀粉酶的添加，不仅可以加快生面团的发酵速率、改善面包的结构和体积，同时其产生的糖类物质对面包的口感、色泽及品质等也都具有明显的促进作用。
5.2 α-淀粉酶在淀粉生产中的应用
α-淀粉酶用于淀粉工业，可用来生产变性淀粉，淀粉糖等。由于α-淀粉酶在适宜条件下对淀粉具有较强的水解能力，控制反应的条件，可以控制淀粉的水解率，从而将淀粉水解成多孔状的多孔淀粉。多孔淀粉可以作为微胶囊芯材和吸附剂，作为香精香料、风味物质、色素、药剂及保健食品中功能成分的吸附载体，成本低，可自然降解，现已广泛应用于食品、医药、化工、农业、保健品等领域。淀粉在高温条件下发生糊化，因此生产多孔淀粉多采用中温α-淀粉酶，另外，将α-淀粉酶和其它淀粉酶如糖化酶、普鲁兰酶等协同使用会提高反应效率和淀粉成孔效果，因此现在多孔淀粉的研制多采用α-淀粉酶和其它酶协同反应[20]。
5.3 α-淀粉酶在生产糖浆中应用
α-淀粉酶的主要市场是淀粉水解的产物，如葡萄糖和果糖。淀粉被转化为高果糖玉米糖浆。由于他们的高甜度，被用于饮料工业中软饮料的甜味剂。真菌α-淀粉可以水解淀粉内部的α-1，4-糖苷键，生成高麦芽糖和低葡萄糖含量的糖浆。α-淀粉酶在淀粉液化上的应用工艺已经相当成熟，而且有很多相关报道。目前，欧美各国大多采用真菌α-淀粉酶作为糖化剂生产高麦芽糖浆，得到的麦芽糖浆其组成中麦芽糖占40%-60%，麦芽三糖约10%-20%，其他为葡萄糖、低聚糖和糊精等[21]。工业生产中往往与β-淀粉酶和脱枝酶配合使用，用以生产超高麦芽糖浆，其麦芽糖含量超过70%，甚至更高[21]。在淀粉糖行业，真菌α-淀粉已逐渐替代β-淀粉酶而成为以淀粉为原料生产麦芽糖浆的关键酶[1,2]。
5.4 α-淀粉酶酿酒中的应用
啤洒是最早用酶的酿造产品之一，在啤洒酿造中添加α-淀粉酶使其较快液化以取代一部分麦芽，使辅料增加，成本降低，特别在麦芽糖化力低，辅助原料使用比例较大的场合，使用α-淀粉酶和β-淀粉酶协同麦芽糖化，可以弥补麦芽酶系不足，增加可发酵糖的含量，提高出汁率，产生的麦汁色泽鲜亮，过滤速度加快，提高了浸出物的得率，同时又缩短了整体的生产周期。啤酒酿造中糊化时添加α-淀粉酶，在20世纪70年代主要用BF7658α-淀粉酶；80 年代末，我国无锡酶制剂厂首先生产出耐高温α-淀粉酶，可使副原料比例从原来的30%增加到40%以上，实现了无麦芽糊化，节粮、节能显著，使啤酒行业的综合经济效益得到进一步提高[22]。
此外，真菌α-淀粉酶在啤酒酿制行业（提高麦芽汁的可发酵性）[22]、黄酒酿制行业（改善酒质，提高出酒率）[24]和生料酒精行业有利用对糖化醪中淀粉进行低温液化（50-60℃）[22]以及低聚异麦芽糖生产[24]等行业均有不同程度的应用。
6 总结与展望
α-淀粉酶作为一种重要的工业用酶，已经广泛应用于食品及其他工业中，且已经取得了很好的使用效果。大量的微生物可以用于高效生产淀粉酶，但是酶的大规模商业化生产仍然局限于几种特定的真菌和细菌中。食品和淀粉工业仍然是α-淀粉酶的主要市场，α-淀粉酶在这些领域的需求仍然是最大
的。不同α-淀粉酶应用于食品中，由于酶学性质的不同使得其作用有所差异。因此，在以后的研究中，可以通过化学方法或生物方法对α-淀粉酶进行改性，扩展其使用的范围，提高使用效率。随着科技的不断发展、科学研究的不断深入，α-淀粉酶将会得到更加广泛的应用。
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酶学性质研究
1.6 酶学性质研究 （1）pH 的影响：分别测定粗酶液在pH3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0下的酶活力，确定其最适反应pH 值；将粗酶液用上述pH 缓冲液稀释后，45℃水浴保温4小时后，测定其剩余酶活力。 （2）温度的影响：分别在40~95℃下测定酶活力，确定其最适反应温度；将酶液在40～90℃范围内的不同温度下保温60 min 后，测定其剩余酶活力。 （3）金属离子的影响：在酶液中分别添加各种金属离子，使其浓度为4 mmol ／L ，然后测定酶活力。 2.5 纤维素酶粗酶液酶学性质 2.5.1酶反应的最适pH 值和酶的pH 稳定性 粗酶液在不同pH 值下测得的酶活及在不同pH 值下处理4小时后测得的相对酶活示于图11。结果表明，CMCase 在pH 3.5～4.5有较高的酶活力，最适反应pH 值为4.0；β-Gluase 在pH 4.5～5.5酶活力较高，最适反应pH 值为5.0，同样方法测得FPA 最适反应pH 为5.0。可见，该菌株所产的各组分纤维素酶是酸性酶。 图11表明，该菌产CMCase 在pH3.0～6.0的范围内，β-Gluase 在pH3.5～5.5的范围内，酶活力均可保持在80％以上，说明该菌株所产酸性纤维素酶可在较宽的pH 值范围内保持其酶活力的稳定性。2.5.2 酶反应的最适温度和酶的热稳定性 在不同温度下直接进行酶促反应测得的酶活及在不同温度下热处理60 min 后于最适反应温度和最适pH 下测得的相对酶活(以4℃保存的酶液活力为100%)示于图12。结果表明，CMCase 、β-Gluase 及FPA 最适反应温度均为65℃。 c e l l u l a s e a c t i v i t y ( U .m l -1) pH r e l a t i v e y a c t i v i t y （%） c e l l u l a s e a c t i v i t y ( U .m l -1) temperature ( o C ) r e l a t i v e y a c t i v i t y （%） 图11 pH 值对酶活力及酶稳定性的影响 Fig.10 Effects of pH value on Cellulase activity and stability 图12 温度对酶活力及酶稳定性的影响 Fig.11 Effects of temperature on activity and stability of cellulase
肝损伤主要表现为肝脏酶学改变
肝损伤主要表现为肝脏酶学改变、胆红素代谢异常、物质合成功能障碍以及生物降解功能下降，但不同疾病所引起的生化异常和结构改变在性质和程度上各具特征。此外，胆道疾病亦可引起肝功能异常。 肝脏生化检查是临床常用的实验室检测项目，主要包括ALT、AST、总蛋白、白蛋白（Alb）、球蛋白、TBil和DBil 等指标。近年来肝脏生化检查又新增了一些项目，如铁蛋白、前白蛋白（prealbumin，PA）、透明质酸（HA）等。各检测指标具有不同的临床意义，可以将其分为四类：肝细胞损伤标志物、胆红素代谢标志物、肝脏合成功能标志物以及肝纤维化相关血清指标。通过对这些检查指标的分析可以判断疾病的性质以及严重程度，为疾病诊断和治疗提供依据。 肝细胞损伤标志物 氨基转移酶 ALT和AST是临床应用最广泛的反映肝细胞损伤的生化指标。ALT主要分布于肝细胞胞浆，AST主要分布于肝细胞线粒体，少数分布于胞浆。当致病因素导致肝细胞变性、细胞膜通透性增加时，从细胞内释放的主要是ALT；而当肝细
胞严重损伤、坏死时，线粒体内的AST便释放出来，导致血清AST显著升高。轻型肝炎发生时，AST/ALT比值下降，重型肝炎、肝硬化和肝癌发生时，AST/ALT比值上升。因此，测定血清AST、ALT水平及AST/ALT比值有利于肝功能异常 的诊断和鉴别。 生理状态下，血清中ALT和AST活性较低，通常低于40U/L。在致病因子的作用下，肝细胞变性和坏死都会导致细胞内ALT和AST释放入血引起血清转氨酶活性升高。各种致病因素所致肝病会引起ALT和AST不同程度升高，因此，对于ALT 和AST活性的分析可用于疾病诊断和鉴别以及评估病情严重程度。各种肝脏疾病都能引起转氨酶轻至中度升高，因此，中等程度以下（<300U/L）的转氨酶升高无特异性。若ALT 急剧升高（>1000U/L），提示存在大量肝细胞坏死，其最常见的疾病有急性病毒性肝炎、毒物或药物性肝损伤、急性缺血性肝病等。此外，重症自身免疫性肝炎和肝豆状核变性也能导致转氨酶急剧升高，但同时伴有自身免疫性抗体升高或铜代谢异常。 如果致病因素持续存在，肝细胞长期遭受损伤将会引起 转氨酶长期升高，常见疾病有慢性病毒性肝炎（乙型肝炎和丙型肝炎）、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝以及药物性肝损
实验 酶学性质研究
实验四酶学性质研究 一、实验目的 1、了解pH、温度、金属离子对酶的活性的影响机理； 2、掌握如何选择酶催化反应的最适pH、温度和获得最适pH条件的确定、以及Km常数的测定。 二、实验原理 酶促反应速度受介质pH的影响，一种酶在几种pH介质中测其活力，可看到在某一pH时酶促效率最高，这个pH称为该酶的最适pH。pH影响酶分子的活性部位的解离，另外，也影响底物的解离状态，从而影响酶活性中心的结合与底物或催化。其次，有关基团解离状态的改变影响酶的空间构象，甚至会使酶变性。酶的最适pH不是酶的特征性常数，如缓冲液的种类与浓度，底物浓度等均可改变酶作用的最适pH。 在一定温度范围内，酶促反应速率随温度的升高而加快；但当温度高到一定限度时，酶促反应速率不仅不再加快反而随着温度的升高而下降，最终，酶因高温变性失去活性，失去了催化能力。在一定条件下，每一种酶在某一温度时活力最大，这个温度称为这种酶的最适温度 在进行酶学研究时一般都要制作一条pH与酶活性的关系曲线，即保持其他条件恒定，在不同pH条件下测定酶促反应速度，以pH值为横坐标，反应速度为纵坐标作图。由此曲线，不仅可以了解反应速度随pH值变化的情况，而且可以求得酶的最适pH。最适温度的实验方法和pH类似。 酶促动力学研究酶促反应的速度及影响速度的各种因素，而米氏常数K m值等于酶促反应速度为最大速度一般时所对应的底物浓度，其值大小与酶的浓度无关，是酶促反应的特征常数。不同酶的K m值不同，同一种酶与不同的底物反应
时，其Km值也不同，Km值反映了酶和底物亲和力的强弱程度，Km值越大，表明酶和底物的亲和力越弱；Km值越小，表明酶与底物的亲和力越强。 酶的活力就是酶所催活的反应速度，通常用单位时间内底物的减少或产物的增加来表示。酶反应过程中产物的生成和时间的关系可以用进程曲线来说明，曲线的斜率就是酶反应过程中的反应速度。从进程曲线来看，在一定时间内反应速度维持恒定，但随着时间的延长，反应速度逐渐降低，这是由多种因素造成的。所以，为了准确表示酶的反应速度必须采用初速度，即保持恒定时的速度。同样，不同酶浓度下的反应进程曲线也可以说明这个问题。V=Vmax[S]/Km+[S]，Vmax 指该酶促反应的最大速度，[S]为底物浓度，Km是米氏常数，V是在某一底物浓度时相应的反应速度。双倒数作图（将米氏方程两边取倒数，可转化为下列形式：1／V=Km／Vmax.1／[S]+1／Vmax，可知，1/V对1/[S]的作图得一直线，其斜率是Km/V，在纵轴上的截距为1/Vmax，横轴上的截距为-1/Km。此作图除用来求Km和Vmax值外，在研究酶的抑制作用方面还有重要价值 三、实验器材与试剂 1、试剂：磷酸二氢钠、柠檬酸、ABTS、酸性靛蓝。 2、器材：可见分光光度计、恒温水浴锅、试管、酸度计 四、操作步骤 1、配置缓冲溶液 按下表配置缓冲溶液，其溶液pH值以酸度计测定值为准。
实验四多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质
实验四多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质 This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020
实验四、马铃薯块茎多酚氧化酶（PPO）活性测定及酶学性质一、实验目的 1掌握分光光度法测定多酚氧化酶活性的一般原理及操作技术方法。 2了解酶的活性与植物组织褐变以及生理活动之间的关系。 二、实验原理 马铃薯不耐储藏，在加工过程中去皮切分后非常容易发生酶促褐变，使外观品质和营养价值大为降低，制约着马铃薯的开发利用。酶促褐变是马铃薯加工产业必须解决的难题。其中多酚氧化酶是导致马铃薯等果蔬发生酶促褐变的重要酶类。多酚氧化酶活性大小直接影响酶促褐变程度。 多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)又称酪氨酸酶、儿茶酚酶、酚酶等．是自然界中分布极广的一种含铜氧化酶．普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中。植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成醌，使组织形成褐变．以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。研究多酚氧化酶的特性对食品的加工与保藏工艺有非常重要的意义。因此，检测食品中多酚氧化酶具有重要意义。 多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在一定的温度、pH条件下，有氧存在时，能使催化邻苯二酚氧化生成有色物质，单位时间内有色物质在410nm处的吸光度与酶活性强弱成正相关，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值的变化确定PPO的酶活大小。 多酚氧化酶 邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2O 2——————→邻醌＋H 2 O
三、试验材料、试剂及试验用品 1．材料：马铃薯块茎。 2．仪器：分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵；试管；移液管；容量瓶 3．试剂：L 磷酸缓冲液（pH=）；L邻苯二酚；L磷酸氢二钠；L磷酸二氢钠；10mmol/L 柠檬酸；10mmol/L抗坏血酸；10mmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA）；10mmol/L亚硫酸钠 四、实验方法： 1.多酚氧化酶的提取 取马铃薯块茎样品，加入预冷的磷酸缓冲液（）3ml，研磨匀浆，转移到离心管中，再用7mL磷酸缓冲液冲洗研钵，合并提取液，在４℃下离心（8000r/min）5min，取上清液为多酚氧化酶提取液，并量取粗酶液体积。 2.多酚氧化酶活性测定 采用比色法测定。将ｍl邻苯二酚加入2ｍl磷酸缓冲液（ｐＨ）中，加入ｍl酶提取液，立即于波长410nm下测定吸光值，2min后再计吸光值，以不加酶提取液的反应液做对照(注意空白为： ml缓冲液和 mL邻苯二酚溶液)。以每分钟吸光度变化为1个多酚氧化酶活性单位。 表1 多酚氧化酶活性测定
果蔬过氧化物酶酶学特性进展
食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY 食品开发· 62 ·2012年 第37卷 第10期过氧化物酶(peroxidase，POD，EC1.11.1.7)收稿日期：2012-03-30 *通讯作者 基金项目：国家自然科学基金项目(31071625)。 作者简介：丁薪源(1989—)，女，吉林德惠人，硕士研究生，研究方向为食品质量与安全。 是广泛存在于各种动物、植物和微生物体内的一丁薪源，曹建康* (中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083) 摘要：综述了过氧化物酶在植物抗性方面的作用及研究意义，并对抗性相关酶POD 的分离纯化、同工酶谱、酶结构及分布等酶学特性进行了综述。分析得到，果蔬中过氧化物酶的最适pH 范围大部分集中在5.0~7.0之间，最适温度集中在30~60 ℃，对于大部分果蔬的过氧化物酶，Fe 2+、Fe 3+、Ca 2+、Mg 2+等金属离子有不同程度的激活作用，表面活性剂PEG 、SDS 和DETA 的激活作用不明显，甲醇、乙醇、丙酮、抗坏血酸、柠檬酸、L-半胱氨酸也有不同程度的抑制作用。研究表明，大多数植物的过氧化物酶分子量在30~60 ku 范围内，不同品种、不同发育期、不同器官之间的同工酶种类有所差异。同时，对过氧化物酶的发展前景进行了展望。关键词：植物抗性；过氧化物酶；酶学特性；同工酶；果蔬 中图分类号：TS 201.2+5 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2012)10-0062-05 Characteristics of peroxidase from fruit and vegetable research progress DING Xin-yuan, CAO Jian-kang * (College of Food Science & Nutritional Engineering, Chinese Agricultural University,Beijing 100083) Abstract: This paper described the peroxidase’s role in plant resistance and research significance, and summarized the characteristic of peroxidase, such as purification, isozymes, structure and distribution of POD. The result showed that, the optimum pH of the peroxidase in many fruits and vegetables concentrated in 5.0~7.0, the optimum temperature concentrated in 30~60 ℃. For many fruits and vegetables, peroxidase activities were stimulated in different degrees by some metal ions like Fe 2+, Fe 3+, Ca 2+, Mg 2+, and almost weren’t stimulated by surfactant like PEG, SDS, DETA. Methanol, ethanol, acetone, ascorbic acid, citric acid, L-cysteine have different degrees of inhibition to the peroxidase. Molecular weights of most of the PODs vary from 30 ku to 60 ku, and isoenzyme types are different between the different varieties, different developmental stages and different organs. This paper gave an overview of peroxidase development prospects.Key words : plant resistance; peroxidase; enzymatic characteristics; isozymes; fruits and vegetables 果蔬过氧化物酶酶学特性研究进展
《食品酶学》复习总结
食品酶学复习总结 1、酶的特性及其对食品科学的重要性。 酶的特性：酶的催化效率高；具有高度的专一性。 对食品科学的重要性主要体现在： 1）内源酶对食品质量包括：颜色、质地、风味、营养质量的影响 2）外源酶制剂在食品工业中的应用，可以高效地提高食品品质和产量 3）酶在食品分析中的应用，可以快速、专一、高灵敏度和高精确度检测进行分析 2、酶、胞外酶、胞内酶、同工酶、酶活力单位、比活力、酶原概念。 酶是一类具有专一性生物催化功能的生物大分子。根据酶分子化学组成可分为蛋白类酶和核酸类酶。 酶在生活细胞中产生，但有些酶被分泌到细胞外发挥作用。如人和动物消化管中以及某些细菌所分泌的水解淀粉，脂肪和蛋白质的酶，这类酶称胞外酶。其他大部分酶在细胞内起催化作用，称为胞内酶。 同工酶是指在生物体内或组织中催化相同反应而具有不同分子形式（包括不同的氨基酸序列、空间结构等）的酶. 酶活力单位：酶活力高低用酶活力单位表示，国际酶学委员会规定：在特定条件下（最适pH，25℃，最适底物浓度，最适缓冲液离子强度），1min内能转化1umol底物或催化1umol产物形成所需要的酶量为一个国际单位（IU）。 比活力：每毫克酶蛋白所具有的酶活力单位数。 酶原：某些酶在细胞内合成或初分泌时没有活性，这些没有活性的酶的前体称为酶原。 3、酶的发酵生产对培养基的要求？ 培养基的营养成分是微生物发酵产酶的原料，主要是 (1)碳源: 尽量选用具有诱导作用的碳源，不用或少用有分解代谢物阻遏作用的碳源。 (2)氮源: 动物细胞要求有机氮，植物细胞主要要求无机氮。多数情况下将有机氮源和无机氮源配合使用才能取得较好 的效果. (3)无机盐:需要有磷酸盐及硫、钾、钠、钙、镁等元素存在 (4)生长因子: 包括某些氨基酸、维生素、嘌呤或嘧啶 (5)产酶促进剂: 显著提高酶的产率。 酶的发酵生产根据细胞培养方式不同对培养基的要求不同，例如：发酵温度、pH、溶氧量等的要求以及培养基固液态，应根据实际生产要求设计不同的培养基。 4、分离纯化酶有哪些常用方法，根据什么？举一例说明 （1）沉淀分离：通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。 （2）离心分离：借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。 （3）过滤和膜分离：借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。 （4）层析技术，亦称色谱技术：利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，从而达到分离。 （5）电泳分离：利用酶所带电荷不同，带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动从而达到分离。（6）萃取分离：利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技术。 举例略 5、分析酶反应速度随反应时间延长而降低的原因？ 引起酶促反应速度随反应时间延长而降低的原因很多，如底物浓度的降低、产物浓度增加从而加速了逆反应的进行、产物对酶的抑制或激活作用以及随着反应时间的延长引起酶本身部分分子失活等等。 6、酶的动力学研究包括哪些内容？以L-B图式表示竞争性抑制、非竞争性抑制及反竞争性抑制的区别。 酶的动力学研究酶促反应速度以及诸多因素 （底物浓度、抑制剂、温度、pH和激活剂等） 对反应速度的影响，从而找到最有利的反应条 件从而提高酶催化反应的效率以及了解酶在代 谢过程中的作用和某些活性物质的作用机制。
酶学性质研究
Breeding of D (–)-Lactic Acid High Producing Strain by Low-energy Ion Implantation and Preliminary Analysis of Related Metabolism Ting-Ting Xu &Zhong-Zhong Bai &Li-Juan Wang &Bing-Fang He Received:21January 2008/Accepted:5May 2008/Published online:24June 2008#Humana Press 2008 Abstract The low-energy nitrogen ion beam implantation technique was used in the breeding of mutant D (–)-lactic-acid-producing strains.The wild strain Sporolactobacillus sp.DX12was mutated by an N +ion beam with energy of 10keV and doses ranging from 0.4×1015to 6.60×1015ions/cm https://www.wendangku.net/doc/d01186725.html,bined with an efficient screening method,an efficient mutant Y2-8was selected after two times N +ion beam implantation.By using the mutant Y2-8,121.6g/l of D -lactic acid was produced with the molar yields of 162.1%to the glucose.The yield of D -lactic acid by strain Y2-8was 198.8%higher than the wild strain.Determination of anaerobic metabolism by Biolog MT2was used to analyze the activities of the concerned enzymes in the lactic acid metabolic pathway.The results showed that the activities of the key enzymes responded on the substrates such as 6-phosphofructokinase,pyruvate kinase,and D -lactate dehydrogenase were considerably higher in the mutants than the wild strain.These might be affected by ion beam implantation. Keywords Nitrogen ion beam implantation .D (–)-Lactic-acid-producing strain .Mutation .Breeding .Metabolic influence Introduction For centuries,lactic acid has traditionally been used in the food,textile,chemical,and pharmaceutical industries.In recent years,poly-L -lactic acid (PLLA)has attracted much interest as a renewable alternative to conventional petroleum-based plastics.Its properties make it useful for many applications such as biodegradable packaging and agricultural mulch film [1].However,thermal stability of PLA is not sufficiently high to some Appl Biochem Biotechnol (2010)160:314–321DOI 10.1007/s12010-008-8274-4 T.-T.Xu :Z.-Z.Bai :L.-J.Wang :B.-F.He (*) College of Life Science and Pharmaceutical Engineering,Nanjing University of Technology,Xinmofan Road 5,Nanjing,210009Jiangsu,China e-mail:bingfanghe@https://www.wendangku.net/doc/d01186725.html,
碱性蛋白酶的分离纯化及其酶学特性的研究
碱性蛋白酶的分离纯化及其酶学特性的研究碱性蛋白酶(alkaline protease)是一类最适pH为碱性的蛋白酶,是一种非常重要的水解酶类,在医药、饲料、食品等领域中都有广泛应用。本论文以Cellulomonas bogoriensis sp.nov为出发菌株,对其产酶条件、碱性蛋白酶的分离纯化及酶学性质等方面进行了研究,并得到以下结论:利用单因素法和响应面Box-Behnken组合设计方法对菌株产碱性蛋白酶的发酵条件进行了优化,得出菌株最佳产酶条件为:培养温度30℃,培养基初始pH 10.5,装液量75/250 mL,1.5%(w/v)蔗糖为碳源、1.5%(w/v)的牛肉膏酵母浸粉(1:1)为混合氮源、NaCl 含量为2.67%(w/v),培养时间120 h。 经硫酸铵分级沉淀和CM Sepharose Fast Flow柱层析纯化得到一个相对分子质量约为18.3 kDa的碱性蛋白酶,纯化倍数为10.83,回收率为25.79%。酶的最适反应温度70℃,最适pH为11.0。 在4-60℃、pH3.0-12.0范围内酶活力稳定;1 mM的Mg2+、Fe2+会增加蛋白酶活力;而1 mM的Ba2+、Mn2+、Ca2+对蛋白酶活力几乎没有影响,但在10mM时会明显抑制蛋白酶的活力。EDTA浓度为10m M时,碱性蛋白酶的酶活力仍能达到77%。 抑制剂PMSF,TPCK对酶有强烈的抑制作用,表明该酶属于丝氨酸蛋白酶家族中的胰凝乳蛋白酶。酶对甲醇、乙醇、甘油等有机溶剂具有较强的耐受能 力,Triton X-100强烈抑制酶活力。 该蛋白酶最佳作用底物为酪蛋白,可以水解血红蛋白和牛血清白蛋白,不能水解明胶和胶原蛋白,米氏常数Km为19.2μg/mL,Vmax为2000μg/min。该蛋白酶与市售的洗涤剂均有良好的相容性,具有良好的脱毛效果、处理血污的能力和
(完整版)酶学与酶工程总结
?Lecture 1 酶学与酶工程 ?酶的概念:酶（enzyme）是一类由活细胞产生的，具有催化活性和高度专一性的特殊蛋白质，是一类生物催化剂。 ? ?酶的分类(6类)、组成、结构特点？和作用机制？ 组成：单体酶、寡聚酶、多酶复合体 Note:一个酶蛋白可有多种催化活性，相当于多个酶(关注原核和真核生物的差别) 除水解酶和连接酶外，其他酶在反应时都需要特定的辅酶。 金属在酶催化中的作用：稳定酶构象、参与酶的催化作用（如激活底物）、电子传递体 ?酶作为催化剂的显著特点: 强大的催化能力：加快反应速度可高达1017倍; 没有副反应; 高度的专一性：各种酶都有专一性，但专一程度的严格性上有所差别; 可调节性; ?同工酶的概念:同一种属中由不同基因或（复）等位基因编码的多肽链所组成的单体、纯聚体或杂交体，其理化及生物学性质不同而能催化相同反应的酶称同工酶。 同一基因生成的不同mRNA所翻译出来的酶蛋白也列入同工酶的范畴。 酶蛋白合成后经不同类型的共价修饰（如糖基化等）而造成的多种酶分子形式，严格来说不属于同工酶而称为synzyme，但也有人称其为次生性同工酶（secondary isozyme）。 不同种属中催化相同反应的酶称为xenozyme，也不属于同工酶。
?酶的活性中心 指必需基团在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构的区域，能与底物特异结合并将底物转化为产物 必需基团(essential group):酶分子中氨基酸残基侧链的化学基团中，一些与酶活性密切相关的基团。 活性中心内的必需基团:结合基团（与底物相结合）和催化基团（催化底物转变成产物） 活性中心外的必需基团：维持酶活性中心应有的空间构象所必需； 构成酶活性中心的常见基团：His的咪唑基、Ser的－OH、Cys的－SH、Glu的γ-COOH。 ?酶的作用机制 ?酶活力的调节 ?酶的应用 食品加工方面：生物技术在食品工业中应用的代表就是酶的应用，目前已经有几十种酶成功用于食品工业。如葡萄糖、饴糖、果葡糖浆的生产、蛋白质制品加工、果蔬加工、食品保鲜以及改善食品品质与风味等。 常用的酶制剂主要有：淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、葡萄糖异构酶、果胶酶、脂肪酶、纤维素酶葡萄糖氧化酶等。 酶在轻工业方面的应用：用酶进行原料处理（发酵原料、淀粉原料、纤维素原料、含戊聚糖的植物原料的处理、纺织原料、造纸原料的制浆、生丝的脱胶处理、羊毛的除垢），用酶生产各种产品（L-氨基酸、核苷酸、酱油或豆酱、制革），用酶增强产品的使用效果（加酶洗涤剂；加酶牙膏、牙粉和嗽口水） 酶在医学中的应用：主要的医药用酶、用酶进行疾病的诊断、用酶治疗各种疾病、用酶制造各种药物 ?酶与食品质量安全 酶制剂作为食品添加剂进入食品的潜在危害 酶催化有毒物质的产生 酶作用导致食品中营养组分的损失 潜在的产毒素性 潜在的致病性 对策：安全菌株，体外基因毒理学测试，酶制剂的安全评价，酶制剂来源安全性的评估标准 ?Lecture 2 基因工程的酶学基础 ?核酶（Ribozyme)：概念：具有生物催化功能的RNA。 看课件 ?基因工程的酶学基础 ?基因克隆表达的过程 基因克隆常用的酶，有什么应用，注意事项（补充后两者）
诊断酶学
52 诊断酶学 一、概述 （一）酶的组成、结构与功能 1.酶的本质和特征 ⑴酶的化学本质：绝大部分的酶是蛋白质，有些酶是核酸和酶蛋白组成的复合体，极少数酶是核酸。 ⑵酶除了具有蛋白质的理化性质、一般催化剂的共同性质外，还具有极高的催化效率、高度的特异性（specificity）及催化作用的可调节性等特点。 ⑶由酶所催化的反应称为酶促反应。 ⑷核酶（ribozyme）：具有催化作用的核糖核酸。 （二）酶的催化作用机制 1.酶活性中心是酶分子执行催化功能部位 酶分子中能和底物特异结合并将底物转化为产物的区域称为酶的活性中心（active center），酶活性中心是由空间上彼此靠近的化学基团组成的具有特定空间结构的区域。 2.酶反应的诱导契合学说（induced fit hypothesis） 在酶促反应中，酶与底物结合时，底物首先和酶分子上的活性中心相结合，形成酶-底物中间复合物（ES）。在构象上相互诱导，致使活性中心与底物完全紧密结合，这一过程称为诱导契合学说。（三）酶的分类与编号 1. 根据酶所催化反应类型可将酶分为六大类，即： 氧化还原酶类（oxidoreductases） 转移酶类（transferases） 水解酶类（hydrolases） 裂解酶类（或裂合酶类）（lyases） 异构酶类（isomerases） 合成酶类〔synthetases或连接酶类(ligases）〕 2. 国际酶学委员会将每种酶用4个数字加以系统编号。数字前冠以EC，数字之间用黑点隔开。第一个数字表示酶的类别，第二个表示
亚类，第三个表示亚-亚类，第四个表示酶的编号序数。 (四)同工酶的概念与特征 同工酶是指催化相同化学反应，但酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。 同工酶存在于同一种属或同一个体的不同组织或同一细胞的不同亚细胞结构中，使不同的组织、器官和不同的亚细胞结构具有不同的代谢特征，这为同工酶用来诊断不同器官的疾病提供了理论依据。 (五)工具酶参与的指示反应 通常把酶学分析中作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性浓度的酶称为工具酶。常用工具酶多为氧化还原酶类。 在临床生化检验中，许多项目的测定均有工具酶参与，最常用的有两类分光光度法： 一类是利用较高特异性的氧化酶产生过氧化氢（H2O2），再加氧化发色剂比色； 另一类是利用氧化-还原酶反应使其连接到NAD(P)-NAD(P)H的正/逆反应后，直接通过分光光度法或其他方法测定NAD(P)H的变化量。 附：酶循环法 酶循环法（enzymatic cycling methods）采用两类工具酶进行循环催化反应，使被测物放大扩增，从而使检测灵敏度提高。目前临床上已应用于总胆汁酸、HCY的测定。 （六）代谢物浓度的酶法测定技术 1.终点法 在代谢物酶促反应中，随着时间的延续，待测物浓度逐渐减少而产物逐渐增多，一定时间后反应趋于平衡，测定反应达到平衡后待测物（底物）或产物变化的总量，即终点法（又称平衡法）。 (1)直接法：如果待测物与产物在理化性质上有可直接进行检测的差异，如吸收光谱不同，则可直接测定待测物或产物本身信号的改变来进行定量分析.
酶学总结-xyj
陈清西酶学考试试题选集 一、名词解释（二十六选五，每个两分） 1)全酶: 由酶蛋白和辅助因子结合形成的复合物称为全酶。 2)辅助因子：属于结合蛋白质的酶是由蛋白质部分和非蛋白质部分组成的，非蛋白质部分称为酶的辅助因子。 3)辅基：与酶蛋白结合紧密，不能通过透析或超滤方法将其除去的辅助因子。Eg：羧肽酶A（Zn2+） 4)辅酶：与酶蛋白结合疏松，用透析或超滤方法可将其与酶蛋白分开的辅助因子。Eg：羧化酶（TPP） 5)底物载体substrate carriers：某些非蛋白质化合物，其不是酶的一个组成部分，但却是酶催化作用所必需的，在 催化反应中起了携带电子、质子和功能基团的作用，因此这类物质通常被称为底物载体或辅底物。Eg:NAD+。 6)酶蛋白：属于结合蛋白质的酶是由蛋白质部分和非蛋白质部分组成的，纯蛋白质部分称为酶蛋白。 7)酶的专一性：酶对底物的选择性称为酶的专一性。一般可分为，绝对特异性，相对特异性和立体异构特异性。 8)反应专一性：一类酶只能催化一类反应。 9)底物专一性：一类酶只能作用于一类底物。 10)初速度:在反应初始的一段时间内，产物生成量与酶反应时间成正比，这时的速度为初速度。（一般也以底物浓 度变化在起始浓度的5%以下的速度作为初速度的近似值。） 11)酶活力单位：在最适条件下，每分钟催化1μmmol底物转化为产物所需的酶量为一个酶活性单位，亦称国际 单位。 12)酶活力及比活力：酶活力是指酶催化一定化学反应的能力，亦即酶活性。（其大小可以用在一定条件下所催化 的某一化学反应的速度来表示。）比活力：每毫克蛋白所含的酶活力单位，用U/mg表示。 13)酶的克分子活力 14)酶催化反应的动力学模型及动力学方程：a.也称为动力学机理，是描述酶怎样与其底物和产物结合而形成中间 物的方程式。b.依据动力学模型，推导出的能够表示反应速度与底物浓度的方程式。 15)Haldane关系式： 16)酶的失活作用与抑制作用：a. 凡可使酶蛋白变性而引起酶活力丧失的作用称为酶的失活作用。b. 由于酶的必 需基团化学性质的改变，但酶未变性，而引起酶活力的降低或丧失称为酶的抑制作用。 17)可逆抑制与不可逆抑制：a.抑制剂与酶分子以非共价键结合而引起酶活力降低或丧失，但这种抑制可用物理方 法除去抑制剂后被解除，使酶分子重新获得活性。b.抑制剂与酶分子上的某些必须基团一共价键的方式结合，引起了酶活力的丧失，这种抑制不能通过物理方法除去抑制剂而恢复。 18)Ks型与Kcat型抑制剂：a.此类抑制剂是根据底物的化学结构设计的，具有底物类似的结构，可以和相应的酶结 合，同时还带有一个活泼的化学基团，能与酶分子中的必需基团反应，进行化学修饰，从而抑制酶活性。 b. 此类抑制剂是根据酶催化过程设计的，它不但具有天然底物类似的结构，且本身也是酶的底物，能与酶结合 发生类似于底物的变化，但抑制剂还有一个潜伏的基团，当酶对它进行催化反应时，该潜伏基团被暴露或活化，并作用于酶活性中心的必需基团或酶的辅基，使酶不可逆失活。这类抑制剂的专一性极高，有人将之称为自杀性底物。 19)酶的稳定状态中间物和过渡状态复合物 20)序列机理与乒乓机理 21)Random Bi Ter mechanism 22)Bi Uni Uni ping pong mechanism 23)酶原与酶原的激活：a.无活性的酶的前身物质称为酶原。b.酶原受某种因素作用后，转变成具有活性的酶的过 程叫酶原的激活。 24)酶的活性中心与酶活性必需基团：a.酶分子中的必需基团在空间结构中彼此靠近，形成一个能与底物特异性结 合并催化底物转化为产物的特定空间区域。这一区域称为酶的活性中心。b.与酶活性密切相关的基团称为必需基团。 25)酶作用的“诱导契合”与“底物形变”： 26)酶作用的“邻近效应”与“定向效应”：
实验四多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质
实验四、马铃薯块茎多酚氧化酶（PPO）活性测定及酶学性质 一、实验目的 1掌握分光光度法测定多酚氧化酶活性的一般原理及操作技术方法。 2了解酶的活性与植物组织褐变以及生理活动之间的关系。 二、实验原理 马铃薯不耐储藏，在加工过程中去皮切分后非常容易发生酶促褐变，使外观品质和营养价值大为降低，制约着马铃薯的开发利用。酶促褐变是马铃薯加工产业必须解决的难题。其中多酚氧化酶是导致马铃薯等果蔬发生酶促褐变的重要酶类。多酚氧化酶活性大小直接影响酶促褐变程度。 多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)又称酪氨酸酶、儿茶酚酶、酚酶等．是自然界中分布极广的一种含铜氧化酶．普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中。植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成醌，使组织形成褐变．以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。研究多酚氧化酶的特性对食品的加工与保藏工艺有非常重要的意义。因此，检测食品中多酚氧化酶具有重要意义。 多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在一定的温度、pH条件下，有氧存在时，能使催化邻苯二酚氧化生成有色物质，单位时间内有色物质在410nm处的吸光度与酶活性强弱成正相关，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值的变化确定PPO的酶活大小。 多酚氧化酶 邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2O 2——————→邻醌＋H 2 O
三、试验材料、试剂及试验用品 1．材料：马铃薯块茎。 2．仪器：分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵；试管；移液管；容量瓶 3．试剂：L 磷酸缓冲液（pH=）；L邻苯二酚；L磷酸氢二钠；L磷酸二氢钠；10mmol/L柠檬酸；10mmol/L抗坏血酸；10mmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA）；10mmol/L亚硫酸钠 四、实验方法： 1.多酚氧化酶的提取 取马铃薯块茎样品，加入预冷的磷酸缓冲液（）3ml，研磨匀浆，转移到离心管中，再用7mL磷酸缓冲液冲洗研钵，合并提取液，在４℃下离心（8000r/min）5min，取上清液为多酚氧化酶提取液，并量取粗酶液体积。 2.多酚氧化酶活性测定 采用比色法测定。将ｍl邻苯二酚加入2ｍl磷酸缓冲液（ｐＨ）中，加入ｍl酶提取液，立即于波长410nm下测定吸光值，2min后再计吸光值，以不加酶提取液的反应液做对照(注意空白为： ml缓冲液和 mL邻苯二酚溶液)。以每分钟吸光度变化为1个多酚氧化酶活性单位。 表1 多酚氧化酶活性测定
酶学分析方法及酶活性测定复习与练习
酶学分析方法及酶活性测定复习与练习 一、有关酶的基本理论知识 1、酶浓度与酶促反应速度的关系是？ 2、底物浓度与酶促反应速度的定量关系式是？ 3、影响酶促反应速度的因素主要有哪些？ 4、Km及Vm代表的含义及它们在临床酶活性测定中应用及意义。 二、酶活性测定的基本知识 1、酶活性的概念及酶活性单位如何表示表示 2、目前酶活性单位有-------、----------、-------------三种表示方式。？ 3、解释酶活性国际单位、催量（Katal）的概念，并比较两者的关系？ 4、酶活性单位的计算：几类计算公式要求理解并熟练应用。 1）通用公式 2）惯用单位的计算公式（测定产物生成类的计算公式；测定底物消耗类的计算公式）3）**连续监测法根据摩尔吸光系数进行酶活性浓度的计算； **连续监测法因素F值（全自动化生化仪多用K表示）的计算和应用？ 三、酶活性的测定方法 1、酶活性测定的基本原则是什么？ 2、酶反应时间进程曲线有————、—————、————三个时期 酶活性测定是在————期测定，此时期反应速度不受------------的影响也称------期3、根据反应时间，酶活性测定分为两类方法是---------和--------------两种 从概念、结果计算、优缺点叙述并比较两类方法？其中连续监测法 4、按检测对象的酶活性测定方法分为----------和------------法；其直接法的方法类型有哪些？ 5、何谓酶偶联反应？写出酶偶联反应的基本模式？什么是待测酶、辅助酶、指示酶？ 6、何谓工具酶？酶作为工具应用于临床生化检验可进行酶活性测定或进行代谢物浓度（底物）的测定时一般有哪两大指示系统？何谓-Trinder反应？Trinder反应的主要缺点或影响因素有哪些？ 7、何谓同工酶？同工酶分析的常用原理有哪些？检测同工酶有何临床意义？并举例说明？ 8、酶活性测定条件及影响因素有哪些？ 9、从几个酶类测定（如AMY、ALT、LD、ALP|等）的实验操作中，讨论酶活性测定应注意的问题？ 10、试述影响血清酶的生理变异有哪些？ 11、酶活性测定，标本的采集、处理、贮存及样品试剂比有何要求？ 四、体液酶测定： 1、常用于临床协助诊断的血浆酶有哪些？用于协助诊断心肌损伤、肝脏疾病、胰腺疾病、骨骼骨骼肌、前列腺疾病等的常用的血清酶有哪些？常用的临床诊断酶谱有哪些？ 2、将各血清酶活性测定的方法学原理进行分析归纳，请总结出有哪几大反应基础。 3、书写出AMS、ALP两种（化学比色法、（连续监测法）方法及ALT、AST、GGT、LDH、CK酶测定（连续监测法）反应原理、主要试剂成分和作用？影响结果准确性因素有哪些？评价LD-L反应和 LD-P反应试剂盒的优缺点？ 4、血清ALT、AST、ALP、GGT、AMS、CK、LD等酶测定的临床意义？
酶学
1.4.4 第四章酶 第四章酶 学习目标 知识目标 （1）阐述酶的概念和酶的组成。 （2）概括酶的结构与功能及影响酶促反应速度的因素。 （3）描述酶与医学的关系。 能力目标 （1）会运用影响酶促反应速度的因素来解释一些医疗现象。 （2）能举例说明酶在疾病诊断和治疗上的应用。 生物体体内的物质代谢是生命活动的基本特征之一，也是一切生命活动的基础。物质代谢所包含的各种化学反应几乎都是在生物催化剂（biocatalyst）的催化作用下完成的。迄今为止，已发现有两类生物催化剂：①酶（enzyme，E）是具有高效催化作用的蛋白质，是机体内催化各种代谢反应的最主要催化剂；②核酶（ribozyme）是具有高效、特异催化作用的核酸，是近年来发现的一类新的生物催化剂，主要参与RNA的剪接。任何生命活动都离不开酶的催化作用。在酶的催化下，体内的物质代谢有条不紊地进行，酶的异常可导致体内代谢紊乱，从而引起疾病。 酶是由活细胞合成的具有催化作用的生物大分子。酶的化学本质是蛋白质，具有蛋白质的所有属性。酶所催化的化学反应称为酶促反应（enzymatic reaction）。在酶促反应中被
酶催化的物质称为底物（substrate，S），反应的生成物称为产物（product，P）。酶所具有的催化能力称为酶活性，酶丧失催化能力称为酶失活。 知识链接 酶的发现 1773年，意大利科学家斯帕兰扎尼（L．Spallanzani）设计了一个巧妙的实验：将肉块放入小巧的金属笼中，然后让鹰连同肉块和金属笼一起吞下去。过一段时间他将小笼取出，发现肉块消失了。于是，他推断胃液中一定含有消化肉块的物质。但到底是什么，他还不清楚。 1836年，德国科学家施旺（T．Schwann）从胃液中提取出了消化蛋白质的物质，解开了胃的消化之谜。 1926年，美国科学家萨姆纳（J．B．Sumner）从刀豆种子中提取出了脲酶的结晶，并通过化学实验证实脲酶是一种蛋白质。 20世纪30年代，科学家们相继提取出多种酶的蛋白质结晶，并指出酶是一类具有生物催化作用的蛋白质。 20世纪80年代，美国科学家切赫（T．R．Cech）和奥特曼（S．Altman）发现少数RNA也具有生物催化作用。 1.4.4.1 第一节酶的分子结构与功能 第一节酶的分子结构与功能 一、酶的化学组成