PCR引物设计之精华
ＰＣＲ的问题，无疑是绝大多数学生物的人都关心的问题。今天我们把相关内容整理出来，与大家共同讨论，希望对大家能有所帮助。同时欢迎您来到ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｏｎ．ｎｅｔ做进一步的讨论。
一、引物设计
所谓“工欲善其事，必先利其器”，这年头手工设计引物的人似乎不多，还是用软件方便些，防止你一不小心看走眼，丢一个碱基，同时计算起来也方便。设计软件有很多，既可以在线设计（如Primer3 https://www.wendangku.net/doc/d71330831.html,/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi），也可以用Primer5、Oligo6.65等等。到哪找？别着急，咱论坛里有，用起来有什么问题也可以到论坛里问问：
Primer5：https://www.wendangku.net/doc/d71330831.html,/dispbbs.asp?boardID=25&ID=38536
Oligo6.67：https://www.wendangku.net/doc/d71330831.html,/dispbbs.asp?boardID=25&ID=40898
有了软件就该讲讲怎么设计了：
1. 引物设计的原则
细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同时扩增其他的非目的序列。下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点：
1. 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。
2. 选择GC含量为40％到60％或GC含量与模板GC含量接近的引物。
3. 设计5'端和中间区为G或C的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。
4. 避免引物对3'末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。
在用软件设计时大家常常会疑惑,究竟?G不能低于多少?这里有个数据: ?G为0~-2时,PCR产率可达100%, ?G=-6时,为40%.
5. 避免3'末端富含GC。设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。
6. 避免3'末端的错误配对。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。3’最好以G 或C结尾，防止A T的松散结合引起错配。
7. 避免存在可能会产生内部二级结构如发夹结构的序列，这会破坏引物退火稳定性。
8. 引物的一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。两引物的Tm值相差不应大于5℃。计算Tm有几种公式。第一个公式(Wallace规则):Tm = 4℃（g + C） +2℃（a + T）,这来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于15-20个碱基的引物,也适用于手工设计时的简单计算。第二个公式(Baldino算法)适用于计算14-70个核苷酸在≤0.4mol\L的阳离子溶液中的Tm,也可用于扩增产物的Tm计算. Tm=81.5+16.6*lg[K+]+0.41(%[G+C])-(675/n)。以上两种算法都是基于碱基组成而不是碱基排列而计算的，事实上相同碱基组成的引物Tm可能差异不小：GGGAA和GAGAG的Tm是不一样的，所以确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序如Primer5等均使用近邻分析法。
９． 当在引物
点，在引物发出后才发现错误的事情本人就干过，在论坛上也能看到这样的粗心人。这样的错误会给将来的克隆造成麻烦。ｂ）如果打算ＰＣＲ后直接酶切，不要忘了在酶切位点的外侧再加上保护碱基，不同的酶对于保护碱基的要求是不同的，关于这一点，论坛里讨论过好几次了，到ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｏｎ．ｎｅｔ／Ｌｉｓｔ．ａｓｐ？ＢｏａｒｄＩＤ＝９５，用“保护碱基”为关键词搜索一下吧。如果不设计保护碱基，则多半要用ＴＡ克隆的方式连接到质粒上，这时要注意Ｔａｑ酶的选择，这一点在后面再聊。
若想在目的序列上附加上并不存在的序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5'端而不影响特异性。当计算引物Tm值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。
10. 有时候，对于引物设计仅了解有限的序列信息。比如，如果仅知道氨基酸序列，可以设计兼并引物。兼并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。为了增加特异性，可以参考密码子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少兼并性。次黄嘌呤可以同所有的碱基配对，降低引物的退火温度。特别要注意的是：不要在引物的3'端使用兼并碱基，因为3'端最后3个碱基的退火足以在错误位点起始PCR。使用较高的引物浓度（1μM到3μM），因为许多兼并混合物中的引物不是特异性针对目的模板。
说了半天了,想起来还得提醒大家一句:千万别搞错了引物的位置！这句话似乎多余,可是事实上,在论坛中不时能看到一些朋友一不小心就犯错!
看了上面的图吧,如果要扩增目的序列为”ATG…………………………TGA”的片段，则引物分别为“ATG…………”和“TCA…………”仔细琢磨一下，特别是5’端再接上酶切位点可别搞错了！合成错了一条可就是50块钱，到时候挨老板批的时候别怪我没提醒你哦：）设计好了引物就要让公司合成，这时候别忘了谈价格：）现在竞争很厉害，价格已经挺便宜了，注意两个参数：一个是OD值，如果公司说1OD能比2OD优惠，那通常1OD足够了。第二是纯度，是HPLC的还是OPC的，事先要说好，建议看看这里（唉，不是我给他们做广告，只是他们的说明书写得真不错）：https://www.wendangku.net/doc/d71330831.html,/product/cs/c_3.htm#1引物设计方面还有很多话题可说，比如如何利用引物搭桥将两个片段通过PCR而不是酶连接起来、如果要设计引物表达蛋白时注意“N端规则”……这些有趣的话题可以见论坛内相关讨论，这将是我们推出“原核表达”专辑时的内容。
二、 PCR成分
引用《分子克隆3》提供的PCR标准反应条件：
模板 1pg-1μｇ
引物1μmol/L
DNA聚合酶1－5单位
Mg2＋ 1.5mmol/L
dNTPs 200μmol/L
KCl 50 mmol/L
1.模板
模板可是PCR的关键，模板的质量是PCR成功的先决条件，巧妇难为无米之炊嘛！怎
样得到模板，这可是一个大问题，仅仅一个提取基因组DNA就有很多的名堂，这会是我们后面专辑的内容，这里不多说啦，有问题来论坛讨论吧。P不出东西的时候不妨先考虑：模板有没有问题？（DNA样品中发现有多种污染物会抑制PCR。一些在标准基因组DNA制备中使用的试剂，如SDS，在浓度低至0.01％时就会抑制扩增反应。）
所需的最佳模板量取决于基因组的大小。你的目的片段在基因组中占多少？至少要保证模板中含有一个单拷贝吧！100ng到1μg的人类基因组DNA，相当于3×104到3×105个分子。所以对于单拷贝基因,这需要0.1μg的人基因组DNA,10ng的酵母DNA,1ng的大肠杆菌DNA.扩增多拷贝序列时,用量更少.灵敏的PCR可从一个细胞,一根头发,一个孢子或一个精子提取的DNA中分析目的序列.模板量过多则可能增加非特异性产物.DNA中的杂质也会影响PCR 的效率。
2. 引物
引物以干粉形式运输。最好用TE重溶引物，使其最终浓度为100μM。TE比去离子水好，因为水的pH经常偏酸，会引起寡核苷的水解。当然，如果担心TE对于PCR的影响，不妨用ddH2O。
引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。以大于10μM浓度溶于TE的引物在-20℃可以稳定保存6个月，但在室温（15℃到30℃）仅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室温（15℃到30℃）最多可以保存2个月。
注意：溶解之前先离心一下，防止一开盖就飞了。
引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在0.1到0.5μM。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。通常跟着引物来的说明书会告诉你，关于寡核苷酸的计算可以看看这里：https://www.wendangku.net/doc/d71330831.html,/product/fl/i_1.htm
3. 聚合酶的选择
这可是有讲究，咱论坛里有个专题讨论这个问题。主要考虑两个方面：用途——对保真度的要求高不高？成本——高保真的酶总是会贵一些的。综合考虑一下找个平衡点吧，当然啦，该花钱的时候可不能省。Taq DNA聚合酶被看做是低保真度的聚合酶，因为其缺少3'到5'外切核酸酶（校正）活性。使用带有3'到5'外切核酸酶活性的热稳定聚合酶可以提高保真度。但是这些聚合酶的产量比Taq DNA聚合酶低。在很多公司的手册中有对各种酶特性的描述，大家不妨比较一下。提醒一点：高保真酶除了我所知的Merck的Easy-A以外，都不会在3’端加A尾巴（因为其3’-5’外切酶活性），所以做TA克隆的时候需要一点小诀窍——扩增完了再加普通Taq去加个A。另外还有个方法：将Taq DNA聚合酶同带有3'到5'外切核酸酶活性第二种聚合酶混合在一起可以获得比单独Taq DNA聚合酶高的保真度，并可以得到高产量及扩增长模板。
4. Mg2＋浓度
镁离子影响PCR的多个方面，如DNA聚合酶的活性，这会影响产量；再如引物退火，
这会影响特异性。dNTP和模板同镁离子结合，降低了酶活性所需要的游离镁离子的量。最佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同，但是包含200μM dNTP的典型PCR起始浓度是1.5mM（注意：对实时定量PCR，使用3到5mM带有荧光探针的镁离子溶液）。在多数情况下，较高的游离镁离子浓度可以增加产量，但也会增加非特异性扩增，降低忠实性（当然，也有相反的报道）。为了确定最佳浓度, 可以用０．１－５ｍｍｏｌ／Ｌ的递增浓度的Ｍｇ２＋ 进行预备实验，选出最适的Ｍｇ２＋浓度。在ＰＣＲ反应混合物中， 应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团， 例如磷酸基团或ＥＤＴＡ等可能影响Ｍｇ２＋ 离子浓度的物质，以保证最适Ｍｇ２＋ 浓度。
5. dNTPs
高浓度的dNTPs会对扩增反应起抑制作用。将每种dNTP的浓度从200μM降低到25-50μM 可以使扩增产物获得满意的产率。
6. KCl
标准浓度为50 mmol/L, 对于较短片段可将其提高到70-100 mmol/L.
三、 PCR反应参数
1. 变性：在第一轮循环前,在94℃下变性5-10min非常重要,它可使模板DNA完全解链,然后加入Taq DNA聚合酶(hot start),这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。变性不完全,往往使PCR失败,因为未变性完全的DNA双链会很快复性,减少DNA产量.一般变性温度与时间为94℃ 1min。在变性温度下,双链DNA解链只需几秒钟即可完全,所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。对于富含GC的序列,可适当提高变性温度.但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。
2. 退火：这是PCR的一个关键参数。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的Tm低5℃, 当产物中包含有影响实验的非可异性扩增带时, 以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃。或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。退火温度越高, 所得产物的特异性越高。有些反应甚至可将退火与延伸两步合并,只用两种温度(例如用60℃和94℃)完成整个扩增循环, 既省时间又提高了特异性。退火一般仅需数秒钟即可完成,反应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度。
3. 延伸：延伸反应通常为72℃,接近于Taq DNA聚合酶的最适反应温度75℃.实际上,引物延伸在退火时即已开始,因为Taq DNA聚合酶的作用温度范围可从20℃-85℃.延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度.在一般反应体系中,Taq DNA聚合酶每分钟约可合成1kb长的DNA。延伸时间过长会导致产物非特异性增加.但对很低浓度的目的序列, 则可适当增加延伸反应的时间。一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(10-30min)的延伸反应,以获得尽可能完整的产物, 这对以后进行克隆或测序反应尤为重要（关于最后72℃10min 原理的讨论见论坛相关帖子https://www.wendangku.net/doc/d71330831.html,/dispbbs.asp?boardID=95&ID=47101）
4. 循环次数：当其它参数确定之后, 循环次数主要取决于DNA浓度。一般而言25-30轮循环已经足够。循环次数过多,会使PCR产物中非特异性产物大量增加。通常经25-30轮循环扩增后, 反应中Taq DNA聚合酶已经不足, 如果此时产物量仍不够, 需要进一步扩增, 可将扩增的DNA样品稀释103-105倍作为模板, 重新加入各种反应底物进行扩增, 这样经60轮循环后, 扩增水平可达109-1010 。
扩增产物的量还与扩增效率有关,扩增产物的量可用下列公式表示:C＝C0 (1+P)n。其中：C为扩增产物量,C0为起始DNA量, P为增效率, n为循环次数。
在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应，减少非特
异性产物。
四、提高PCR扩增特异性
1.递减PCR（TouchDown PCR）
递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严紧的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1℃到2℃（当然，也可以每几个循环降1－2℃），直到退火温度低于Tm 5℃。特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如AFLP? DNA指纹分析。
2.热启动
热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。尽管Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度在72℃，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如定点突变、表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR尤为有效。并且，热启动在很大程度上防止引物二聚的发生。
限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液，并将其置于预热的PCR仪。这种方法简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。
热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度。包括延缓加入Taq DNA聚合酶在内的大部分手工热启动方法十分烦琐，尤其是对高通量应用。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分，入镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。象手动热启动方法一样，蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。
3. 促进PCR的添加剂
退火温度，引物设计和镁离子浓度的优化足以对大多数模板进行高特异性的扩增，但是，某些模板，包括高GC含量的模板，需要其他的措施。影响DNA熔解温度的添加剂提供了提高产物特异性和产量的另外一种方法。为获得最好的结果需要模板的完全变性。另外，二级结构会阻止引物结合和酶的延伸。PCR添加剂，包括甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱以及PCRx E nhancer Solution可以增强扩增。它们可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。PCRx Solution还有其他优点。在同Platinum Taq DNA聚合酶和Platinum Pfx DNA聚合酶一起使用时，仅需很少的镁离子优化。这样，将Platinum技术同添加剂结合，增强了特异性，同时减少了第三种方法-镁离子优化的依赖。为获得最佳结果，应优化添加剂的浓度，尤其是会抑制Taq DNA聚合酶的DMSO，甲酰胺和甘油。
4.巢式PCR
使用巢式引物进行连续多轮扩增可以提高特异性和灵敏度。第一轮是15到20个循环的标准扩增。将一小部分起始扩增产物稀释100到1000倍加入到第二轮扩增中进行15到20个循环。或者，也可以通过凝胶纯化将起始扩增产物进行大小选择。在第二轮扩增中使用一套巢式引物，其可以同第一套引物内侧的靶序列结合。巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同两套引物都互补的靶序列很少。而使用同样的引物对进行总数相同的
循环（30到40）会扩增非特异性靶位点。巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5' RACE）的特异性。
五、 PCR产物测序
对于PCR产物的测序有两个方式:
1.DNA直接测序: 指直接分析不经分离的PCR扩增产物,如果各个位点上碱基序列都是
一致的,则所得信号是确定的,否则,在那些有相异碱基的位点出现模糊信号, 如果模板在多数情况下被正确扩增,则少数的突变将被掩盖,这是结果显示的是模板的序列.但是,当扩增的前几轮即出现错误扩增并被后续的循环积累,这时就不再反映模板的状况.
2.PCR产物经克隆后测序: 这是对单克隆测序,其结果是反映单一扩增产物的序列,结果
是确定的.
六、 PCR污染与对策
PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生.
1、污染原因
(一)标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染.
(二)PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.
(三)PCR扩增产物污染.这是PCR反应中最主要最常见的污染问题.因为PCR产物拷贝量大(一般为1013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可造成假阳就可形成假阳性.
还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题.
(四)实验室中克隆质粒的污染:在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常见.因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力.其污染可能性也很大.
2、污染的监测
一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染.
对照试验
1.阳性对照:在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR 反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志.阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高(100个拷贝以下).但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大.因而当某一PCR试剂经自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照.
2.阴性对照:每次PCR实验务必做阴性对照.它包括①标本对照:被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照.②试剂对照:在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂是否污染.
3.重复性试验
4.选择不同区域的引物进行PCR扩增
3、防止污染的方法
(一)合理分隔实验室:将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开. 最好能划分①标本处理区;②PCR反应液制备区;③PCR循环扩增区;④PCR产物鉴定区. 其实验用品及吸样枪应专用.实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA.
(二)吸样枪:吸样枪污染是一个值得注意的问题.由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染.
(三)预混和分装PCR试剂:所有的PCR试剂都应小量分装，如有可能，PCR反应液应预先配制好，然后小量分装，-20℃保存.以减少重复加样次数，避免污染机会.另外，PCR试剂，PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱.
(四)防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用.
(五)设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准病原体核酸为宜，并注意交叉污染的可能性，每次反应都应有一管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照.
(六)减少PCR循环次数，只要PCR产物达到检测水平就适可而止.
(七)选择质量好的Eppendorf管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部.开管动作要轻，以防管内液体溅出.
4、PCR污染解决对策（这是从另一篇文章总结而来，与前面的部分略有重复，大家随便看看吧）
PCR检测微量感染因子时，一定要注意产物残留污染的问题。
一．污染的预防
进行PCR操作时，操作人员应该严格遵守一些操作规程，最大程度地降低可能出现的PCR污染或杜绝污染的出现。
（一）划分操作区：目前，普通PCR尚不能做到单人单管，实现完全闭管操作，但无论是否能够达到单人单管，均要求实验操作在三个不同的区域内进行，PCR的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行：
1. 标本处理区，包括扩增摸板的制备；
2. PCR扩增区，包括反应液的配制和PCR扩增；
3. 产物分析区，凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆的制备。
各工作区要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。如：标本制备→PCR 扩增?产物分析?产物处理。
切记：产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。
（二）分装试剂：PCR扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分装。所有的加样器和吸头需固定放于其中，不能用来吸取扩增后的DNA和其他来源的DNA：
1． PCR用水应为高压的双蒸水；
2．引物和dNTP用高压的双蒸水在无PCR扩增产物区配制；
3．引物和dNTP应分装储存，分装时应标明时间，以备发生污染时查找原因。(三) 实验操作注意事项尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因，样品间的交叉污染也是原因之一。因此，不仅要在进行扩增反应是谨慎认真，在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意：
1. 戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套；
2. 使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染；
3. 避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面；
4. 操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度；
5. 最后加入反应模板，加入后盖紧反应管；
6. 操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性；
7. 尽可能用可替换或可高压处理的加样器，由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染，最好使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种特殊的加样器，至少PCR 操作过程中加样器应该专用，不能交叉使用，尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个区；
8. 重复实验，验证结果，慎下结论。
二．追踪污染源
如果不慎发生污染情况，应从下面几条出发，逐一分析，排除污染。
（一）设立阴阳性对照：有利于监测反应体系各成分的污染情况。选择阳性对照时，应选择扩增弱，且重复性好的样品，因强阳性对照可产生大量不必要的扩增序列，反而可能成为潜在的污染源。如果以含靶序列的重组质粒为对照，100个拷贝之内的靶序列就足以产生阳性扩增。阴性对照的选择亦要慎重，因为PCR敏感性极高，可以从其它方法（Sourthern 印迹或点杂交等）检测阴性的标本中检测出极微量的靶分子。此外，每次扩增均应包括PCR体系中各试剂的时机对照，即包括PCR反应所需的全部成分，而不加模板DNA，这对监测试剂中PCR产物残留污染是非常有益的。如果扩增结果中试剂对照为阳性结果，就是某一种或数种试剂被污染了。此时，要全部更换一批新的试剂进行扩增，扩增时设立不同的反应管，每一管含有一种被检测试剂，在检出污染试剂后，应马上处理。
（二）环境污染：在排除试剂污染的可能性外，更换试剂后，若不久又发现试剂被污染了，如果预防措施比较严密，则考虑可能为环境污染。
环境污染中常见的污染源主要有：
1. 模板提取时真空抽干装置；
2. 凝胶电泳加样器；
3. 电泳装置；
4. 紫外分析仪；
5. 切胶用刀或手术刀片；
6. 离心机；
7. 冰箱门把手，冷冻架，门把手或实验台面等；
此时可用擦拭实验来查找可疑污染源。1）用无菌水浸泡过的灭菌棉签擦拭可疑污染源；2）0.1ml去离子水浸泡；3）取5ml做PCR实验；4）电泳检测结果。
8. 气溶胶。如果经过上述追踪实验，仍不能查找到确切污染源，则污染可能是由空气
中PCR产物的气溶胶造成的，此时就应该更换实验场所，若条件不允许，则重新设计新的引物（与原引物无相关性）。
三．污染处理
（一）环境污染
1. 稀酸处理法：对可疑器具用1mol/L盐酸擦拭或浸泡，使残余DNA脱嘌呤；
2. 紫外照射（UV）法：紫外波长（nm）一般选择254/300nm，照射30min即可。需要注意的是，选择UV作为消除残留PCR产物污染时，要考虑PCR产物的长度与产物序列中碱基的分布，UV照射仅对500bp以上长片段有效，对短片段效果不大。UV照射时，PCR 产物中嘧啶碱基会形成二聚体，这些二聚体可使延伸终止，但并不是DNA链中所有嘧啶均能形成二聚体，且UV照射还可使二聚体断裂。形成二聚体的程度取决于UV波长，嘧啶二聚体的类型及与二聚体位点相邻核苷酸的序列。在受照射的长DNA链上，形成二聚体缺陷的数量少于0.065/碱基，其他非二聚体的光照损伤（如环丁烷型嘧啶复合体，胸腺嘧啶乙二醇，DNA链间与链内的交联和DNA断裂等）均可终止Taq DNA聚合酶的延伸。这些位点的数量与二聚体位点相当。如果这些位点（0.13/碱基）在DNA分子上随机分布，一个500bp 片段的DNA分子链上将有32处损伤位点，那么，105个这样的分子中每个分子中会至少有一处损伤。相反，如果100bp的片段，每条链上仅有6处损伤，105个拷贝分子中将有许多分子没有任何损伤。这就是UV照射有一定的片段长度限制的原因。
（二）反应液污染
可采用下列方法之一处理：
1. DNase I法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5U DNase I，室温反应30 min后加热灭活，然后加入模板和Taq聚合酶进行正常PCR扩增。该方法的优点是不需要知道污染DNA的序列；
2. 内切酶法：选择识别4个碱基的内切酶（如Msp I和Taq I等），可同时选择几种，以克服用一种酶只能识别特定序列的缺陷，室温作用1h 后加热灭活进行PCR；
3. 紫外照射法：未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液进行紫外照射，注意事项与方法同上述UV照射法；
4. g射线辐射法：1.5kGy的辐射可完全破坏0.1ng基因组DNA，2.0 kGy可破坏104拷贝的质粒分子，4.0 kGy仍不影响PCR，但高于此限度会使PCR扩增效率下降。引物可受照射而不影响PCR，g射线是通过水的离子化产生自由基来破坏DNA的。
（三）尿嘧啶糖苷酶（UNG）法
由于UV照射的去污染作用对500bp以下的片段效果不好，而临床用于检测的PCR扩增片段通常为300bp左右，因此UNG的预防作用日益受到重视和肯定。
1. 原理：在PCR产物或引物中用dU 代替dT。这种dU化的PCR产物与UNG一起孵育，因UDG可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG对不含dU的模板无任何影响。UNG可从单或双链DNA中消除尿嘧啶，而对RNA中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。
2. dUTP法：用dUTP代替dTTP，使产物中掺入大量dU。在再次进行PCR扩增前，用UNG处理PCR混合液即可消除PCR产物的残留污染。由于UNG在PCR循环中的变性一步便可被灭活，因此不会影响含dU的新的PCR产物。
3. dU引物法：合成引物时以dU 代dT，这样PCR产物中仅5ˊ端带dU。UNG处理后，引物失去了结合位点而不能扩增。对长片段（1-2kb以上）的扩增用dUTP法效率较用dTTP 低，而用dU法就可克服这一缺点。dU引物最好将dU设计在3ˊ端或近ˊ端。该法仅能用于引物以外试剂的处理。
4. 优点：可以去除任何来源的污染；UNG处理可以和PCR扩增在同一个反应管内进
行；由于扩增产物中有大量dU存在，可彻底消除污染源。
5. 需注意的是掺入dUTP的DNA不应对产物的任何操作有影响，在进行PCR产物克隆时，应该转化UNG-（UNG缺陷）大肠杆菌受体菌，否则转化产物会被受体菌UNG消化掉。
（四）固相捕获法
用于去除标本中污染的核酸和杂质，原理如下：1）用一生物素标记的单链RNA探针与待扩核酸杂交，杂交区域是非扩增区；2）用包被链霉亲和素的固相载体来捕获带有生物素探针的杂交核酸，通过漂洗可去除污染的扩增产物和杂质；3）洗脱靶分子后用特异引物扩增非RNA探针杂交区域。第2）步的漂洗后可用PCR检测以确定标本是否被扩增产物或重组质粒污染。
（五）RS-PCR法（RNA-specific PCR）
也称为链特异性PCR，主要指用于RNA模板的特异性PCR法，该法可明显降低假阳性而不影响PCR的敏感性。其关键在于设计引物，逆转录引物的3ˊ端（A区）有2 0个核苷酸左右为模板的特异性互不序列，5ˊ端2 0个核苷酸（C区）为附加修饰碱基。与mRNA 逆转录后，经超速离心使 cDNA与多余引物分开，再用和第二引物（C）以第一链cDNA 为模板合成第二链cDNA，以后的PCR循环中用逆转录引物的B区和引物C进行扩增加尾cDNA，而污染的DNA或质粒DNA才不会被扩增。
（六）抗污染引物法
该对引物扩增时通过病毒DNA克隆如入质粒的位点。这一区域只存在完整的原病毒中，在重组质粒中，这一区域分成两个区域与克隆位点被。如果重组质粒污染了标本，也不能扩增出任何条带，即使出现了扩增带，其大小也与预期的不同。只有原病毒DNA才能被引物扩增，因此只要出现预期大小的扩增带就可以证明标本是阳性的，该法试用于环状靶分子系列。
附录: 各种碱基符号
在设计简并引物或测序时你可能会碰到这样的符号来表示碱基,到时候不要不知道哦J
B =
C or G or T
D = A or G or T
H = A or C or T
K = G or T
M = A or C
N = A or C or G or T
R = A or G
S = C or G
V = A or C or G
W = A or T
Y = C or T
后记：该专题只是涉及了PCR最基本的问题，作为PCR系列的第一辑，随后，我们将继续探讨更加深入的内容，如RT-PCR、AP-PCR、定量PCR、PCR产物的克隆……等等，欢迎大家提出宝贵意见，我们将在论坛上与大家讨论。（本专题的编写参考了《invitrogen PCR ／RT-PCR指南》、《分子克隆3》、《PCR聚合酶链式反应》等书及论坛战友提供的相关资料）
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引物设计步骤与要点
引物设计step by step 1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。 2、用Primer Premier5搜索引物 ①打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer，进入引物窗口。 ②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。在Search Parameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300～500bp. ③点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。 ④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。此窗口中需要着重查看的包括：Tm 应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo来完成，Oligo自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5. ⑤在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏，选择File-Print-Current pair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档，里面有该引物的详细信息。 3、用Oligo验证评估引物 ①在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open，定位到目的cDNA序列（在primer中，该序列已经被保存为Seq文件），会跳出来两个窗口，分别为Internal Stability（Delta G）窗口和Tm窗口。在Tm窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置（Primer5已经给出）即可，而引物长度可以通过点击Change－Current oligo length来改变。定位后，点击Tm窗口的Upper按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击Lower按钮，确定下游引物。引物确定后，即可以充分利用Analyze 菜单中各种强大的引物分析功能了。
荧光定量PCR引物设计
荧光定量PCR引物设计专业的定量PCR设计软件beacon Designer 有时一对100分的引物扩增效率特别低换了一对貌似很烂的引物结果溶解曲线却长得很漂亮扩增效率也蛮高。个人认为这个跟你选择的位置有关看引物Tm值相差是否很高适当降低反应退火温度看看是否有效看所扩增片段GC含量以及产物Tm是否很高比方水稻基cDNA扩增常常用到GC buffer。看所用扩增基因是否为组织特异性表达看RNA是否完整是否降解反转录过程是否完整设好内参正对照最后所有这些都满足还是没扩增出来重新设计引物吧1设计的时候尽量靠近基因的3端这样能最大限度地保证扩增效率2尽量跨越内含子这样可以保证检测有无基因组污染3两条引物的Tm值不要相差太大4产物长度保证在80200bp之间最长300 bp。.如果想同时检测很多对基因的变化最好设计的时候记录下产物的Tm值这对你后面的实验设计读板温度很有帮助。保证在产物Tm80以上一般Tm80以下的峰都是引物二聚体对于水稻等GC含量比较高的基因组产物Tm不要高于94个人观点。如果同时检测很多对基因的表达量变化我会尽量调整所有产物的Tm值与内参产物的Tm相差不太大这样方便实验操作和最后的分析。3相对错配来说我认为dimer和harpin对realtime PCR的影响更大当然也别错配得太邪门了非来一条跟产物出峰在相同位置或者比产物峰还高的错配就死了引物的3端不要有错配。5一
般我们用Primer Premier设计软件我一般先让软件自动搜索正义链或反义链的引物找到一条评分是100的再在它左右合适的位置手动搜索有没有合适和它配对的评分也比较高的 引物一般5分钟之内可以搞定一个基因。实时定量PCR引物设计的具体要求1、引物应用核酸系列保守区设计并具有特异性。最好位于编码区5端的300-400bp区域内可以用DNAMANAlignment软件看看结果。2、不能形成2级结构。 3、引物长度一般在17-25bp之间上下游引物不能相差太大。 4、GC含量在40-60之间45-55最佳。 5、碱基要随机分布尽量均匀。 6、引物自身不能有连续4个碱基的互补。 7、引物之间不能有连续4个碱基的互补。 8、引物5?6?7端可以修饰。 9、3?6?8端不可修饰而且要避开ATGC rich 的区域避开T/C A/G连续结构2-3个。10、引物3端要避开密码子的第三位。11、引物整体设计自由能分布5端大于3?6?7端。12、定量产物长度80-150bp最好最长是300bp。实时定量PCR完全手册方法简介所谓的实时荧光定量PCR 就是通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR 反应中引入了一种荧光化学物质随着PCR 反应的进行PCR 反应产物不断累计荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环收集一个荧光强度信号这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化从而得到一条
手把手教你PCR引物设计来自小木虫
PCR引物设计的黄金法则 1. 引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。 2.引物长度一般在15~30碱基之间。 引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。 3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。 GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。 4.引物3′端要避开密码子的第3位。 如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
5.引物3′端不能选择A，最好选择T。 引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。 6. 碱基要随机分布。 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。 7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。 两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′ 端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Cross dimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。 引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过
PCR引物设计过程
PCR引物设计过程 （一）设计引物前应的准备工作： 1．准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分 2．对片断进行酶切分析，确定一下那些酶切位点不能用3．准备一本所买公司的酶的商品目录，便于查酶的各种数 据及两种酶是否可以配用 （二）引物的结构：5’—保护碱基+酶切位点+引物配对区—3’1．两个酶切位点 2．酶切位点的保护碱基 3．5’端保护碱基 4．3’端保护碱基 5．引物配对区 （三）设计引物所要考虑的问题 1．酶切位点 两个酶切位点应是载体上的，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，否则往往导致两个酶都切不好。因此，两个酶切位点要紧挨在一起，只能切一个，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点，最好隔四个核苷酸。且不能有碱基的交叉，比如AGATCTTAAG，这样的位点比较难切。2．酶的选择
最好使用双酶切效率高的，但两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切，最好使用具有共同buffer，且较常用的酶（如hind3，bamh1，ecor1等），这样可以省钱。 3．Tm的计算。 Tm是由互补的DNA区域决定的，而不互补的区域对DNA 的溶解是没有作用的。因此，对于引物的Tm，只有和模板互补的区域对Tm才有贡献。计算Tm时，只计算互补的区域（除非你的酶切位点也与模板互补）。设计引物的时候，先不管5'端的修饰序列，把互补区的Tm控制在55度以上（我喜欢控制在58以上，具体根据PCR的具体情况，对于困难的PCR，需要适当提高Tm），再加上酶切位点和保护碱基，这样的引物通常都是可用的，即使有小的问题，也可以挽回。 Tm温度高的引物就比较容易克服3’发卡、二聚体及3'非特异结合等问题。简单的计算公式可以用2+4的公式。若你计算的Tm值达到了快90 ，不包括酶切位点。引物公司给你发的单子是包括酶切位点的。自己可以再估计一下。如你设计了带酶切位点的引物，总长分别为29、33个碱基，去掉酶切位点和保护碱基，分别为17、21个碱基。引物公司给的单子是70多度，实际用的只有50度，用55度扩的结果也差不多。
QRT-PCR引物设计protocol
QRT-PCR引物设计 概述： 在QRT-PCR过程中，由于涉及到模板定量，所以要求引物特异性强，并且不能扩增出基因组DNA（如果用DNA酶处理干净另当别论），所以要求跨外显子设计（可以不用考虑基因组DNA污染），或跨内含子设计（检验DNA酶是否处理干净，即无基因组DNA污染）。下面是自己在设计过程的一些心得体会，与大家分享之！ 要求： 1.上下游引物的长度一般为18-30bp之间，且Tm值在58-62℃之间，上下游引物的Tm值相差最好不超 过2℃。 2.GC=30-80%； 3.应避免引物中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现。引物的3’端最好不 为G或/和C。引物3’端的5个碱基不应出现2个G或/和C。 4.PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80～150 bp最为合适（可 以延长至300 bp）； 5.要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在； 6.而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好 是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响； 7.至于设计软件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMER EXPRESS都可以的； 8.关于BLAST的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，在已经发现并在GENEBANK中公 开的不物种基因序列当中，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列，如和你的目标序列之外的序列相同的序列，则可能扩出其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而不能用； 9.避免引物内出现反向重复序列形成发夹二级结构，同时也应避免引物间配对形成引物二聚体。 设计方案： I. 跨内含子设计方案（尽量不采用，如果方法II没有合适的引物，在考虑I） 1.上下游引物分别在两个外显子上，如下图所示，这样设计的引物可以检验是否有基因组DNA污染； FP II．跨外显子设计方案（尽量采用这种方案设计） 1.上游（A）或下游（B）或上下游引物（C）跨在两个外显子上，如下图所示，这样设计的引物不能从 基因组DNA扩增,从而消除基因组DNA污染的影响（这要求目的基因具有较多的外显子，从而有较多的选择，引物本身质量可能不好，同时注意：引物在两个外显子上分布，在“内侧”要少些，<8bp 左右）。
PCR扩增的原理和操作步骤
PCR扩增反应的操作 第一节PCR扩增反应的基本原理 一、聚合酶链式反应（PCR）的基本构成 PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等。 PCR基本原理: 是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3'末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA 得到极大程度的扩增。在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适2+等。反应时先聚合酶、MgdNTP溶液、耐热Taq DNA量的缓冲液、微量的DNA膜板、四种将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5'→3'方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成（见图）。 1．模板DNA的变性 模板DNA加热到90~95℃时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些。故PCR中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。对于高G-C含量的模板DNA 在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO），并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97℃，时间适当延长，即所谓的热启动。 2．模板DNA与引物的退火 将反应混合物温度降低至37~65℃时，寡核苷酸引物与单链模板杂交，形成DNA 模板-引物复合物。退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核苷酸的碱基组成。一般要求引物的浓度大大高于模板DNA的浓度，并由于引物的长度显着短于模板的长度，因此在退火时，引物与模板中的互补序列的配对速度比模板之间重新配对成双链的速度要快得多，退火时间一般为1～2min。3．引物的延伸 DNA模板-引物复合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条与模板DNA链互补的新链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。延伸所需要的时间取决于模板DNA的长度。在72℃条件下，Taq DNA聚合酶催化的合成速度大约为40～60个碱基/秒。经过一轮“变性-退火-延伸”循环，模板拷贝数增加了一倍。在以后的循环中，新合成的DNA 都可以起模板作用，因此每一轮循环以后，DNA拷贝数就增加一倍。每完成一个
PCR技术(包含引物设计)
聚合酶链式反应（PCR） 原理： DNA的半保留复制时，双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验条件下，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。PCR类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性 - 退火(复性）- 延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至40~60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板 - 引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环就可获得更多的?半保留复制链?，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。PCR技术分类（常用） （1）反向PCR技术(Inverse PCR, IPCR)：反向PCR是克隆已知序列旁侧序列的一种方法．主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化基因组DNA．后酶切片段自身环化．以环化的DNA作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。该扩增产物是线性的DNA片段，大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA 序列内部的酶切位点分布情况。用不同的限制性内切酶消化，
荧光定量PCR引物设计说明
荧光定量PCR引物设计 专业的定量PCR设计软件：beacon Designer 有时一对100分的引物扩增效率特别低，换了一对貌似很烂的引物，结果溶解曲线却长得很漂亮～扩增效率也蛮高。个人认为这个跟你选择的位置有关 看引物Tm值相差是否很高，适当降低反应退火温度，看看是否有效 看所扩增片段GC含量以及产物Tm是否很高，比方水稻基cDNA扩增常常用到GC buffer。 看所用扩增基因是否为组织特异性表达 看RNA是否完整是否降解，反转录过程是否完整 设好参正对照 最后，所有这些都满足还是没扩增出来，重新设计引物吧， （1）设计的时候尽量靠近基因的3'端，这样能最大限度地保证扩增效率 （2）尽量跨越含子，这样可以保证检测有无基因组污染 （3）两条引物的Tm值不要相差太大 （4）产物长度保证在80～200bp之间，最长300 bp。.如果想同时检测很多对基因的变化，最好设计的时候记录下产物的Tm值，这对你后面的实验设计读板温度很有帮助。保证在产物Tm80以上（一般T =80以下的峰都是引物二聚体）， m 对于水稻等GC含量比较高的基因组，产物Tm不要高于94(个人观点)。如果同时检测很多对基因的表达量变化，我会尽量调整所有产物的Tm值与参产物的Tm 相差不太大，这样方便实验操作和最后的分析。 （3）相对错配来说，我认为dimer和harpin对realtime PCR的影响更大（当然，也别错配得太邪门了，非来一条跟产物出峰在相同位置或者比产物峰还高的错配就死了），引物的3'端不要有错配。 （5）一般我们用Primer Premier设计软件，我一般先让软件自动搜索正义链或反义链的引物，找到一条评分是100的，再在它左右合适的位置手动搜索有没有合适和它配对的评分也比较高的引物，一般5分钟之可以搞定一个基因。 实时定量PCR引物设计的具体要求
PCR的基本步骤及注意
（DNApolymerase I）最早于1955年发现，而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性,因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。现今所使用的酶(简称Taq polymerase), 则是于1976年从温泉中的（Thermusaquaticus）分离出来的。它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酶，但它被广泛运用则于80年代之后。PCR最初的原始雏形概念是类似修复复制，它是于1971年由 Dr. Kjell Kleppe提出。他发表了第一个单纯且短暂复制（类似PCR 前两个周期反应）的实验。而现今所发展出来的PCR则于1983由 Dr. Kary B. Mullis发展出的，Dr. Mullis当年服务于PE公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。Dr. Mullis 并于1985年与Saiki等人正式发表了第一篇相关的论文。此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis也因此获得了1993年化学奖。 PCR原理 DNA的是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计，DNA 聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。 发现耐热DNA聚合酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩扩增放大几百万倍。 [PCR反应体系与反应条件] 1.标准的PCR反应体系 10×扩增缓冲液10μl 4种dNTP混合物200μl 引物10～100μl 模板DNA ～2μg
PCR引物设计方法
如何设计PCR引物 查找目的基因序列并不能直接用于我们研究所用，因为查找到的基因序列只能算是基因的电子序列，并不是我们研究要用的现实中的序列，如何获得现实的基因序列呢？这就需要我们根据基因的电子序列来设计引物了，通过引物借助PCR方法才能获得我们的目的基因序列。接下来，我们(汉恒生物)将介绍一下PCR方法并讲述如何设计引物。 PCR（polymerase chain reaction），即聚合酶链反应，又称基因体外扩增技术，是由一对引物介导、能在体外对特定DNA 片段进行快速酶促扩增的技术。PCR能把很微量的遗传物质在数小时内扩增数百万倍达到检测水平．使原来无法进行分析和检测的许多项目得以完成。PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。 1.引物的特异性 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。 2.避开产物的二级结构区 某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。 3.长度 寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27mer。引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T）Ln值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74℃),不能保证产物的特异性。 4.G+C含量 G+C含量一般为40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。 5.碱基随机分布
PCR引物设计原则
引物设计原则 https://www.wendangku.net/doc/d71330831.html,/st50195/Info_11672.html 最近更新时间：2011年4月26日 提供商：上海沪宇生物科技有限公司资料大小：0K 文件类型：下载次数：0次 资料类型：浏览次数：61次 相关产品： 详细介绍： PCR引物设计的原则 引物设计有3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。 具体实现这3 条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度(primer length)，产物长度(product length)，序列Tm 值(melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability, 用?G 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构(duplex formation and hairpin)的能值，在错配位点(false priming site)的引发效率，引物及产物的GC 含量(composition)，等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。根据有关参考资料和笔者在实践中的总结，引物设计应注意如下要点： 1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应[2]。 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加[2]。 3. 引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5’端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。
PCR的基本步骤及注意
DNA聚合酶（DNApolymerase I）最早于1955年发现，而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性,因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。现今所使用的酶(简称Taq polymerase), 则是于1976年从温泉中的细菌（Thermusaquaticus）分离出来的。它的特性就在 于能耐高温，是一个很理想的酶，但它被广泛运用则于80年代之后。PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制，它是于1971年由 Dr. Kjell Kleppe提出。他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似PCR前两个周期反应）的实验。而现今所发展出来的PCR则于1983由 Dr. Kary B. Mullis发展出的，Dr. Mullis当年服务于PE公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。Dr. Mullis 并于1985年与Saiki等人正式发表了第一篇相关的论文。此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。随后PCR技术在生物科研和临床应 用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。 PCR原理 DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。 发现耐热DNA聚合酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高 温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便 它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单 链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板 --引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对 与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延 伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一 个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 编辑本段[PCR反应体系与反应条件] 1.标准的PCR反应体系 10×扩增缓冲液10μl 4种dNTP混合物200μl 引物10～100μl
PCR引物流程设计详解
本文目的：复制出IL-4基因片段 一、查找基因序列 1、进入NCBI主页，下拉选框选择Nucleotide，在搜索栏输入要查找的目的基因，即IL-4，点击搜索 2、在搜索结果选择灵长类（Homo sapiens） 2、在灵长类IL-4基因中选择需要的mRNA序列 3、查看基因的相关信息 外显子区域 CDs区域 4、点击FASTA格式，并将序列保存到文档 二、使用primer premier设计引物 1、建立新文件，将所得的序列复制进输入框内 2、点击搜索按钮，搜索引物 3、设置引物设计参数（因为在之前查找基因序列的时候获知，外显子区域分别为：1-200、201-248、249-425、426-618，又知在引物设计时引物位置最好跨越一个内含子，PCR产物长度通常为100-150bp，故设定上游引物位置为201-248，下游引物位置为249-425，产物长度为100-150bp） 4、确认条件后，显示搜索结果 4、双击选中得分最高的引物查看引物情况 （上图为上游引物情况，下图为下游引物情况） 5、将设计的上下游引物复制出来，保存到文档中 三、使用oligo对设计的引物进行评价
1、建立新文件，将从cnki上获得的cDNA复制进输入框，并点击accept接收 2、接收后显示出该序列的相关信息 3、点击edit按钮录入用primer设计的上游引物，每一次输入新数据后都需要点击accept按钮接收 4、同理，录入下游引物 5、分析上下游引物二聚体形成情况 6、分析上下游引物发卡形成情况 7、分析上下游引物GC% 8、检测上下游引物与PCR模板其它位置错配情况 9、分析PCR整体情况 四、引物特异性检验（primer blast） 1、进入NCBI主页，并选择blast 2、选择primer blast 3、在输入框内输入模板序列和上下游引物，并设定对比数据库，点击primer进行对比get 4、查看blast结果 Blast结果显示，尽管IL-4与其它基因有相似区，但是引物的3’端没有完全互补。故设计的引物能特异性的扩增出目的基因
PCR技术克隆目的基因全过程
实验：目的基因克隆（PCR技术） 【课前预习】 PCR (polymerase chain reaction) 反应的基本原理。 【目的要求】 1．学习和掌握PCR 反应的基本原理与实验技术方法。 2．认真完成每一步实验操作，详细记录实验现象和结果并加以分析和总结。 【基本原理】 类似于DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA 经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR 扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA 与引物的退火(复性)：模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA 模板--引物结合物在TaqDNA 聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4 分钟，2～3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。【实验用品】 1．材料：重组质粒DNA作为模板 2．器材和仪器：移液器及吸头，硅烷化的PCR 小管，DNA扩增仪(PE 公司)，琼脂糖凝胶电泳所需设备(电泳槽及电泳仪)，台式高速离心机 3．试剂： ①10×PCR 反应缓冲液：500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris·Cl, 在25℃下, pH9.0, 1.0％Triton X-100。 ②MgCl2 ：25mmol/L。 ③ 4 种dNTP 混合物:每种 2.5mmol/L。 ④Taq DNA聚合酶5U/μl。 ⑤T4 DNA连接酶及连接缓冲液：
引物设计和PCR经验
primer5和Oligo结合设计引物步骤及心得 一、引物设计step by step 1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。 2、用Primer Premier5搜索引物 ①打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence,出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer，进入引物窗口。 ②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。在Search Parameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300～500bp. ③点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。 ④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。此窗口中需要着应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物重查看的包括：T m 值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。该窗口的最下面和下游引物的T m 列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo来完成，Oligo自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5.⑤在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏，选择File-Print-Current pair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档，里面有该引物的详细信息。 3、用Oligo验证评估引物