CHO_K1细胞株的建立及其在药物安全性筛选方面的应用

第31卷第2期河北科技大学学报Vol.31,No.2 2010年4月Journal of Hebei University of Science and Technology Apr.2010

文章编号:100821542(2010)022*******

C HO2K1细胞株的建立及其在药物安全性

筛选方面的应用

张之东,陈　慧,郝六平,魏　转,李丽娟

(河北化工医药职业技术学院制药系,河北石家庄　050026)

摘　要:研究了稳定表达h ER G基因的C HO2K1(中国仓鼠卵巢细胞)细胞株及其在药物研发安全性筛选方面的应用。使用Lipofectamine2000系统将h ER G基因转染入CHO2K1细胞,用West2 ern Blot检测其表达,并进一步通过FluxOR TM Thallium Assay K it s验证;同时使用FluxOR TM

Thallium Assay K it s检测Cisapride和Dofetilide对h ER G通道的抑制性。建立了4株稳定表达

h ER G基因的CHO2K1细胞株,Cisap ride和Dofetilide对h ER G通道的IC50分别为86.7nmol?

L-1和28.1nmol?L-1。h ER G基因成功地在C HO2K1细胞株实现了稳定表达,此细胞株可用于

FluxOR TM Thallium Assay K it s系统,用于药物研发安全性筛选,以评估化合物潜在的心脏毒性。

关键词:h ER G;中国仓鼠卵巢细胞;FluxOR TM

中图分类号:TQ464;Q81 文献标志码:A

Establishment of C HO2K1cell lines and it s application

in drug safety screening

ZHAN G Zhi2dong,C H EN Hui,HAO Liu2ping,WEI Zhuan,L I Li2juan (Department of Pharmacy,Hebei Chemical and Pharmaceutical Vacation College,Shijiazhuang Hebei050026,China)

Abstract:CHO2K1(Chinese hamster ovary cell)cell lines stably expressing hER G gene and its application in drug R&D safe2 ty screening were studied.h ER G gene was transfected into CHO2K1cell with Lipofectamine2000,and the expression of hREG was detected by using Western Blot technology and FluxOR TM Thallium Assay K its,proving the inhibition of hER G by detec2 ting Cisapride and Dofetilide.Four cell lines stably expressing hER G gene was established,and IC TM are,respectively,86.7 nmol?L-1,28.1nmol?L-1of Cisapride and Dofetilide.h ER G is transfected into CHO2K1cell lines successf ully,and the cell lines can be used to drug R&D safety screening in FluxOR TM Thallium Assay K its.

K ey w ords:h ER G;CHO2K1;FluxOR TM

人类的h ER G基因(human et her2a2go2go2related gene)编码产物是一种电压门控式的钾离子通道。

h ER G基因是1994年由WARM KE等用小鼠EA G(et her2a2go2go2related gene)基因同源染色体筛选人类海马cDNA文库分离得到的,同年J IAN G等通过候选基因定位法确定了h ER G是先天性长Q T综合征(lo ng Q2T symptom,L Q TS)的致病基因之一[1]。人们对h ER G基因的关注源于其编码的钾离子通道,在心脏动作电位复极过程中发挥重要的作用。基因突变或药物引起该通道的功能异常可能会引起心脏Q T间期延长,进而可引起尖端扭转型室性心动过速(torsades de pointes,TdP)、心室纤颤甚至猝死。TdP是可以

收稿日期:2009211203;责任编辑:张士莹

作者简介:张之东(19712),男,河北东光人,讲师,主要从事化学制药方面的研究。

通讯作者:陈　慧,E2mail:chenhuisjz@https://www.wendangku.net/doc/d33595691.html,

致命的,因此诱导TdP 的危险导致了药物的撤销和不被批准。h ER G 钾通道已作为评价化合物潜在心脏毒性的分子靶标,进行候选化合物h ER G 的安全性筛选,广泛用于新药研发的早期阶段,以利于有效地降低新药研发成本和风险。

FluxOR TM Thallium Assay K it s 试剂盒是Invit rogen 公司于近期推出的最新的h ER G 通道高通量筛选试剂盒,该试剂盒满足了药物研发过程中化合物对h ER G 通道的安全性筛查。较之传统意义上的膜片钳技术耗时、耗力、耗资,该方法省时、省力、成本低,并且能在真正意义上达到药物研发过程中的高通量筛选要求。

1　材料和方法

1.1　材料

1.1.1　主要试剂及装置

DM EM 培养基,胎牛血清,Lipofectamine 2000系统,FluxOR TM Thallium Assay K it s 和G418,购于In 2vit rogen 公司;Protease Inhibitor Cocktail ,Monoclo nal Anti 2Actin ,Cisapride 和Dofetilide ,购于Sigma 2Aldrich 公司;质粒抽提试剂盒,购于Q IA GEN ;蛋白Marker ,购于B IO 2RAD ;Anti 2Myc Tag ,购于Milli 2pore ;Anti 2mouse Ig G ,HRP 2Linked Antibody ,购于CELL SIGNAL IN G 公司;Western 及IP 细胞裂解液,购于上海碧云天生物技术有限公司;ECL Western Blot 分析装置,购于GE 公司。

1.1.2　菌种和细胞

大肠杆菌Top 210及C HO 2K1细胞,均为本实验室保存;表达载体pCMV 2EN TR Y 2H ER G (p h ER G )购于ORIGEN E 公司。

1.2　方法

1.2.1　细胞培养

C HO 2K1细胞培养基为DM EM 补加10%(体积分数)胎牛血清(FBS ),温度为37℃,于5%(体积分数)CO 2恒温培养箱中培养。细胞复苏之后,在25cm 2方瓶中传代培养。细胞长满瓶底面积约90%时,用0.25%(质量分数)胰酶消化,1∶10进行传代。转染前1日,对消化后细胞计数,稀释细胞数至1×105个/mL ,转移至6孔板,2mL/孔,培养至第2天汇合度大约在60%左右,备用。

1.2.2　质粒准备

质粒抽提使用无内毒素质粒抽试剂盒。提取后,采用核酸电泳确定分子质量的大小,同时使用微量核酸定量仪ND 21000(Nano Drop Technologies 公司提供)测定A 260/A 280,比值为1.80～1.95方可使用,同时进行质粒定量。

1.2.3　转染过程

A 液:分别使用无血清的DM EM 250μL ,稀释1,2,4μg 质粒DNA 。

B 液:使用无血清的DM EM 250μL ,加入Lipofectamine 200010μL ,室温放置5min 。将A 液和B 液混合,温和吹打均匀,室温放置20min 。将混合液逐滴沿培养孔的边缘加入到6孔培养板中,前后摇动混合均匀,放入培养箱培养。6h 后,弃去培养液,添加2mL 新鲜的含10%(体积分数)FBS 的DM EM 。继续培养48h 后,消化培养孔内细胞,使用含G418(800μg/mL )的DM EM 完全培养基吹打,后转移至培养皿中培养,3d 换液1次。

1.2.4　单克隆筛选

标记疑似单克隆位置处,用0.25%(体积分数)Tryp sin 2ED TA 消化液浸湿滤纸(滤纸尺寸<5mm ×5mm ),置于所标记克隆位置处,20s 左右放入已经含有G418选择培养基2mL 的溶液中,涮洗滤纸块数次,以使黏附的细胞脱落。预先对96孔板除第1排之外的所有孔加含10%(体积分数)胎牛血清的细胞培养液,0.1mL/孔。将上述细胞液接种于96孔板的第1排,0.2mL/孔,从中吸取0.1mL 细胞溶液接种于第2排,混合后,从第2排中吸取0.1mL 接种于第3排……一直到第8排,最后一排丢弃0.1mL 细胞液。培养2周左右,转移至24孔板中扩大培养,继续6孔板,待细胞长密之后,计数,通过有限稀释法,至细胞数为5个/mL ,铺96孔板,每孔0.1mL ,将剩余细胞冻存。培养2周左右,转移至24孔板中扩大培养,采用Western Blot 分析装置验证。

831河北科技大学学报 2010年　

1.2.5　免疫印迹分析

样品经10%(体积分数)SDS 2PA GE 凝胶电泳,100V 转膜2h ,将蛋白转移至孔径为0.45μm 的PVDF 膜。在封闭液(PBST +5%(体积分数)BSA )中于37℃孵育1h 。加入用封闭液稀释5000倍的一抗,于37℃孵育2h ;使用PBS 洗膜3次,每次10min ,用封闭液稀释2500倍的HRP 标记二抗,于37℃孵育1h 。使用PBS 洗膜3次,每次10min ,浸于Western Blot 分析装置3min ,曝光,洗片。

1.2.6　FluxOR TM Thallium Assay

实验前1日下午铺96孔板2行,前3个孔为W T 2CHO 2K1细胞(野生型),其余为稳定转染h ER G 的CHO 2K1细胞。

2　结果与分析

2.1　CH O 2K 1细胞的稳定转染

2.1.1　G418最佳筛选质量浓度的确定

在进行转染时,由于Lipofectamine 对细胞膜有损害作用,因而在转染过程中使用的培养基中均未加入双抗(转染后的后续培养过程中也不加入,因为链霉素和G418均为氨基糖苷类抗生素)。由于每种细胞对G418的敏感程度是不一样的,一般变动范围为100～1000μg /mL ,而不同厂家生产的相同质量浓度的G418的活性可能也不尽相同,因而在做转染之前需进行最佳筛选质量浓度的确定。分别使用100,200,400,600,800,1000μg /mL ,配制筛选质量浓度,铺6孔板,细胞数为20000个/孔。根据培养基的颜色和细胞生长情况,每3d 左右更换一次培养基,10～14d 能够杀死所有细胞的最小G418的质量浓度即为最佳筛选质量浓度。由实验得知最佳筛选质量浓度为800μg/mL

。

图1　Western Blot 分析Fig.1　Western Blot analysis

2.1.2　CHO 2K1的稳定转染后的Western

Blot 鉴定

96孔板中细胞长至孔内1/10左右时,转

移至24孔板,长满后消化取2/3裂解,剩余

继续传代。细胞裂解提取总蛋白的过程全部

在4℃进行,裂解上清液分装并立即冻存于

超低温冰箱。取部分裂解上清液进行West 2

ern Blot 分析,结果见图1。

由图1可见2条带大小均在120kD 左右。据文献报道,h ER G 基因稳定转染的H E K293细胞,Western Blot 分析结果显示为2条带,大小分别为135kD 和155kD ,这是由于不同的糖基化位点造成的[223]。1B12,1G5,3H3,4F8为稳定转染的CHO 2K1细胞系;空白为野生型CHO 2K1细胞。将50μL 粗蛋白用6倍的样品缓冲液稀释,用10%(体积分数)丙烯酰胺凝胶进行SDS 2PA GE 电泳,免疫印迹结果用化学发光法进行检测。

2.2　FluxOR T M Thallium Assay Kits 在药物研发安全性筛选中的应用

2.2.1　Cisapride 对h ER G 钾离子通道的抑制作用

Cisap ride (西沙必利),化学名为(+/-)2顺式242氨基252氯2N 2[12[32(42氟苯氧基)丙基]232甲氧基242哌啶基]222甲氧基苯甲酰胺,为胃肠激动剂,促进胃肠动力作用极强,疗效显著。但在1996年出现了心脏毒性的报道,其原因是它能抑制h ER G 钾离子的通道。FDA 在1998年已经发出用药警告,2000年7月起该药在英国、美国和加拿大被停用。法国尽管对该药有一定限制,但仍允许该药继续用于儿科。Cisapride 为h ER G 钾离子通道,临床上可引起Q T 间期延长,甚至晕厥和心源性猝死。

在FluxOR TM Thallium Assay K it s 系统中,使用稳定转染h ER G 基因的CHO 2K1细胞为模型,W T 2CHO 2K1细胞为空白对照,检测Cisap ride 对h ER G 钾离子通道的抑制作用,见图2,其中箭头指示位置表示施加TI +/K +刺激,荧光激发光波长为490nm ,吸收光波长为525nm 。

如图2所见,在W T 2C HO 2K1细胞中,在加入TI +/K +刺激液后,荧光值没有发生显著变化;而在CHO 2K12h ER G (未加入抑制剂Cisapride )细胞中,加入TI +/K +刺激液后荧光值发生显著变化,在90s 左右,几乎达到了基底值的3倍。这是因为h ER G 通道对TI +/K +的通透性引起的,而在W T 2C HO 2K1细胞

9

31　第2期 张之东等　CHO 2K1细胞株的建立及其在药物安全性筛选方面的应用

图2　在FluxOR TM Thallium Assay Kit s 系统中Cisap ride 对h ER G 钾离子通道的抑制Fig.2　Cisapride ’s inhibition of the h ER G potassium channel in FluxOR TM Thallium Assay Kits

中通透性很低。在加入Cisapride

后,由于其对h ER G 通道的抑制,

降低了h ER G 通道对TI +/K +的通

透,荧光值显著降低。随着Cisa 2

pride 浓度的增大,荧光值变小,呈

浓度依赖性,当浓度达到1000

nmol/L 和3000nmol/L 时,几乎与

W T 2C HO 2K1细胞平齐,抑制率接

近100%。Cisap ride 对h ER G 通道

IC 50为86.7nmol/L ,参见图3,其

中ΔF/F =(荧光值-基线值)/基

线值,基线值=平均值(4次),荧光

激发光波长为490nm ,吸收光波长

为525nm 。据文献报道,使用膜片

钳技术测定的IC 50为 6.5～44

nmol/L [1,425],与本系统接近。

2.2.2　FluxOR TM Thallium Assay K it s 在药物

研发安全性筛选中的应用举例

以Dofetilide (多非利特)为例,说明Flux 2

OR TM Thallium Assay K it s 在药物研发安全性

筛选中的应用。Dofetilide 为选择性I 型钾离

子通道阻滞剂,是由美国Pfizer 公司开发的抗

心律失常药物,主要用于治疗心衰、心律失常和

心房颤动,2000年5月获FDA 批准在美国首

次上市(商品名为Tiko syn ),化学名为N 2[42

[22[甲基[22[42(甲磺酰胺基)苯氧基]乙基]氨

基]乙基]苯基]甲磺酰胺。Dofetilide 直接作用

于h ER G 通道,抑制K +内流。Dofetilide 可作

为阳性化合物检测FluxOR TM Thallium Assay

Kit s 系统的稳定性。

在FluxOR TM Thallium Assay K it s 系统

中,不同浓度的Dofetilide 对h ER G 通道的作

用见图4,其中ΔF/F =(荧光值-基线值)/基

线值,基线值=平均值(4次);c 为多非利特浓

度;荧光激发光波长为490nm ,吸收光波长为

525nm 。如图4所示,当Dofetilide 的浓度大

于1000nmol/L 时,其对h ER G 通道的抑制率

接近100%,完全抑制。据文献报道,Dofetilide

对h ER G 的IC 50为10～110nmol/L [628],可以

认为与本系统相同。FluxOR TM Thallium As 2

say K it s 系统可取代膜片钳技术用于药物研发

安全性筛选。

3　讨　论

通过Lipofectamine 2000系统对CHO 2K1

细胞株转染,并经过Western Blot 鉴定检测,确

041河北科技大学学报 2010年　

定已经成功构建了稳定表达h ER G 基因的4株C HO 2K1细胞株。1994年研究人员发现了遗传性心律失常L Q T 的2个新的基因位点,分别位于染色体7q35—7q36和3p21—3p24,其中h ER G 基因位于7q35—7q36,与L Q T2位于同一染色体同一部位并与之紧密连锁。现已发现在h ER G 上有200多个不同的突变位点,这些突变均导致L Q TS 。一些抗心律失常药物如第3类抗心律失常药通过抑制h ER G 钾通道引起获得性L Q T2,一些非抗心律失常药物如三环类抗抑郁药(丙米嗪、阿米替林)、52羟色胺摄取抑制剂、组胺受体拮抗剂、氟喹诺酮类抗生素、某些抗肿瘤药物等亦可通过改变h ER G 钾通道结构及功能而引起L Q T2。因此h ER G 相关的获得性LQ T2已成为评价新药安全性的一个重要指标,一些药物由于抑制了h ER G 钾通道诱发心律失常而被禁止销售,如西沙比利、特那非丁、格雷沙星等[9]。所以稳定表达h ER G 基因的CHO 2K1细胞可以用于FluxOR TM Thallium Assay K it s 系统,用于药物研发安全性筛选。

Cisap ride 和Dofetilide 对h ER G 通道的IC 50分别为86.7nmol/L 和28.1nmol/L ,与文献报道的使用膜片钳技术的测定值接近。构建的稳定表达h ER G 基因的C HO 2K1细胞株能检测Cisapride 和Dofetilide 的稳定性,基因转染的方法有多种类型,如经典的磷酸钙沉淀法、脂质体转染法和电穿孔法[10]。阳离子脂质体表面带正电荷,与带负电荷的基因结合成复合物,此复合物吸附于细胞表面并将DNA 释放进入细胞。阳离子脂质体介导的基因转染具有转染效率高、重复性好、相对安全、细胞毒性小等优点。采用此方法构建的稳定表达h ER G 基因的CHO 2K1细胞株在药物研发安全性筛选中发挥了重要作用[11]。

4　结　语

建立了4株稳定表达h ER G 基因的C HO 2K1细胞株,并可成功地用于FluxOR TM Thallium Assay K it s 系统,用于药物研发安全性筛选。Cisap ride 和Dofetilide 对h ER G 通道的IC 50分别为86.7nmol/L 和28.1nmol/L ,与文献报道的使用膜片钳技术的测定值接近。以表达h ER G 基因的CHO 2K1细胞株为基础,FluxOR TM Thallium Assay Kit s 系统可用于药物研发安全性筛选,以评估化合物潜在的心脏毒性。参考文献:

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