薄皮甜瓜果实ACC合成酶cDNA克隆及反义表达载体的构建

薄皮甜瓜果实ＡＣＣ合成酶ｃＤＮＡ克隆及反义表达载体的构建

郭庆勋１，２，秦智伟１＊，丁国华１，３，李景鹏４

（１．东北农业大学园艺学院，黑龙江哈尔滨

１５００３０；２．吉林大学农学部植物科学学院，吉林长春１３００６２；３．哈尔滨师范大学阿城学院，黑龙江阿城

１５０３０１；４．东北农业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨

１５００３０）

摘要：从成熟的薄皮甜瓜（Ｃｕｃｕｍｉｓｍｅｌｏｃｖ．ＱｉｔｉａｎＩ）果肉组织中分离总ＲＮＡ，经ＲＴ－ＰＣＲ扩增得到０．７ｋｂ

的ｃＤＮＡ片段，将其克隆到质粒载体ｐＧＥＭ－ＴＥａｓｙ。测序表明，该基因为７７７ｂｐ，编码２５８个氨基酸，与Ｇｅｎ－Ｂａｎｋ中甜瓜１－氨基环丙烷－１－羧酸合成酶

（１－ａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅ，ＡＣＳ）基因比对，核苷酸同源性为９９％，氨基酸同源性为９８％。克隆片段经双酶切消化，反向插入到植物表达载体ｐＣＡＭ２３０１的Ｅ８启动子和ＮＯＳ终止子之间，构建成Ｅ８调控下ＡＣＳ基因反义表达载体。通过冻融法将携带反义ｃＤＮＡ的植物表达载体质粒转入根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４，得到了完整的Ｔｉ质粒表达载体系统。

关键词：薄皮甜瓜；ＡＣＣ合成酶基因；反义基因；反义表达载体中图分类号：Ｓ６５２．２；Ｑ７８５

文献标识码：Ａ

乙烯是促进果实成熟的激素。它通过信号传递系统协调与成熟相关基因的表达，使果实的色、香、味和质地发生改变直至成熟。跃变型果实

（Ｃｌｉｍａｃｔｅｒｉｃｆｒｕｉｔｓ）的成熟过程是由乙烯引发的。乙

烯在植物体内的合成过程已被阐明［１］。ＡＣＣ（１－氨基环丙烷－１－羧酸）合成酶催化ＳＡＭ（Ｓ－腺苷甲硫氨酸）向ＡＣＣ转化，是乙烯生物合成的限速酶［２］。从各种植物中克隆的ＡＣＣ合成酶基因推导的氨基酸序列都有一定的同源性，而且ＡＣＣ合成酶基因是由多基因家族编码的，基因以组织特异性方式表达［３－４］。当ＡＣＣ合成酶基因的表达受到抑制时，乙烯生成量下降，果实成熟受阻，使贮藏期延长。应用基因工程方法将ＡＣＣ合成酶［５－７］、ＡＣＣ氧化酶［８－９］的反义ｃＤＮＡ导入番茄以降低乙烯的合成，从而控制果实的成熟，得到理想的效果。

薄皮甜瓜原产中国，是典型的跃变型果实［１０－１１］。其不仅具有良好的食用品质，而且有一定的医疗保健作用。但其成熟期短，软化速度快，不耐贮运，

通过杂交转育提高现有品种的耐贮性具有很大的困难，而传统的物理和化学方法一直没有解决其保鲜与贮藏。

因此，借助基因工程手段导入有益外源基因对现有甜瓜品种进行改良成为常规育种的重要辅助途径。作为第一步工作，以ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增并克隆了薄皮甜瓜与成熟相关的ＡＣＣ合成酶ｃＤＮＡ，构建了反义表达载体，为采用植物基因工程手段培育薄皮甜瓜的耐贮保鲜品种打下基础。

１

材料和方法

１．１

材料

以当地主栽品种齐甜一号为试材，成熟甜瓜果

实购自当地市场。

Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α为东北农业大学蔬菜生物技术

实验室保存，中间载体ｐＣＡＭＥ８－ＧＴ为本室构建。

ＴＲＩＺｏｌ试剂为上海生工生物工程技术服务有限公

司产品，Ｍ－ＭＬＶ反转录酶为ＴＯＹＯＢＯ产品，

ｐＧＥＭ－ＴＥａｓｙ为Ｐｒｏｍｅｇａ公司产品，Ｘ－Ｇａｌ、ＩＰＴＧ

和各种限制性内切酶为宝生物（大连）公司产品，氨苄青霉素、卡那霉素为ｓｉｇｍａ公司产品，ＴａｑＤＮＡ聚合酶为ＭＢＩ公司产品，其他生化试剂均为国产分析纯。

收稿日期：２００４－１２－２０

基金项目：黑龙江省科技攻关项目（ＧＢ０１Ｂ４０２－０１）

作者简介：郭庆勋（１９６６－），男，黑龙江人，讲师，博士，主要从事甜瓜分子育种方面的研究。

＊通讯作者Ｅ－ｍａｉｌ：ｑｉｎｚｗ＠ｎｅａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ

第３７卷第１期东北农业大学学报３７（１）：２２￣２７２００６年２月ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｏｒｔｈｅａｓｔＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ

Ｆｅｂｒｕａｒｙ２００６

文章编号

１００５－９３６９

（２００６）０１－００２２－０６

为了进一步确认该克隆的正确性，将该克隆送到上海生工生物工程技术服务有限公司进行核苷酸序列测定，结果见图３。将该序列与ＧｅｎＢａｎｋ的

ＡＣＣ合成酶基因进行比较，结果与甜瓜［１３］、黄瓜［１４］、

冬瓜［１５］的核苷酸的同源性分别为９９％，９６％，

８５％，氨基酸的同源性分别为９８％，９６％，９２％。

１．２方法

１．２．１

甜瓜总ＲＮＡ的提取

取新鲜成熟的甜瓜果肉，按ＴＲＩＺｏｌ［１２］一步法提

取总ＲＮＡ。

１．２．２引物设计

引物根据ＧｅｎＢａｎｋ中葫芦科ＡＣＣ合成酶基因

ｃＤＮＡ的保守序列设计合成１对ＲＴ－ＰＣＲ引物：

５′端１：５′ＴＣＴＣＣＴＣＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＡＣＴＡ３′３′端２：５′ＧＣＡＡＧＡＴＧＡＴＣＣＴＧＧＴＧＡＡ３′

１．２．３第一链ｃＤＮＡ的合成

以提取的总ＲＮＡ为模板，Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１５为引物，

按Ｍ－ＭＬＶ反转录方法反转录合成ｃＤＮＡ第一链。

１．２．４ＰＣＲ扩增

以合成的ｃＤＮＡ第一链为模板，引物１和引物

２为引物对，进行ＰＣＲ扩增，扩增条件为：９４℃

变性１ｍｉｎ，５３℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸２ｍｉｎ，共

３０个循环。扩增完毕，取１０μＬ经１％琼脂糖凝胶

电泳检查。

１．２．５目的片段的克隆与ｃＤＮＡ序列分析

ＰＣＲ产物经１％琼脂糖凝胶电泳得０．７ｋｂ左右

的产物条带，此产物用凝胶回收试剂盒回收，回收的ｃＤＮＡ与ｐＧＥＭ－ＴＥａｓｙ载体连接，转化Ｅ．ｃｏｌｉ

ＤＨ５α感受态细胞。在Ｘ－Ｇａｌ／ＩＰＴＧ培养基上挑取

白色菌落，用碱法小批量抽提质粒，用ＫｐｎＩ／ＳａｃＩ

双酶切后进行电泳鉴定，对阳性克隆进行核苷酸序列分析，阳性克隆质粒命名为ｐＧＥＭ－ＡＣＣ。

１．２．６植物表达载体构建和鉴定

质粒ｐＧＥＭ－ＡＣＣ经限制性内切酶ＫｐｎＩ和ＳａｃＩ

消化后，从胶中回收小片段，与经ＫｐｎＩ和ＳａｃＩ消化的质粒载体ｐＣＡＭＥ８－ＧＴ回收的大片段经Ｔ４连接酶连接。连接产物转化大肠杆菌Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α感受态细胞，在含有卡那霉素（Ｋｍｒ）１００ｍｇ?Ｌ－１的

ＬＢ平板上筛选阳性菌落，碱法提取质粒并酶切鉴

定，重组质粒命名为ｐＣＡＭＥ８ＡＣＣＴ；重组质粒

ｐＣＡＭＥＡＣＣＴ用反复冻融法转化根癌农杆菌

ＬＢＡ４４０４（Ｒｉｆｒ）感受态细胞，在含有利福平（５０ｍｇ?Ｌ－１）和卡那霉素（５０ｍｇ?Ｌ－１）的ＹＥＢ平板上筛选阳性克隆并进行碱法提取质粒及酶切鉴定。

２结果与分析

２．１ＰＣＲ产物鉴定

将ＰＣＲ产物进行１％琼脂糖凝胶电泳，扩增

片断大小为０．７ｋｂ左右条带（图１），与预计的大小一致。将此片断回收，与载体ｐＧＥＭ－ＴＥａｓｙ连接，经筛选获得阳性克隆质粒ｐＧＥＭ－ＡＣＣ，该质粒经

ＫｐｎＩ／ＳａｃＩ双酶切能切下约０．７ｋｂ片断，ＫｐｎＩ和

ＳａｃＩ单酶切切下约３．０ｋｂ左右载体带

（图２），说明０．７ｋｂ片断已经插入ｐＧＥＭ－ＴＥａｓｙ载体中。

图２ｐＧＥＭ－ＡＣＣ限制酶分析

Ｆｉｇ．２

ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｐＧＥＭ－ＡＣＣｗｉｔｈｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅ

１．分子量标准２．空白对照３．ＰＣＲ产物１．Ｍａｒｋｅｒ２．Ｂｌａｎｋｃｏｎｔｒｏｌ３．ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔ

７７７ｂｐ

２０００ｂｐ１０００ｂｐ７５０ｂｐ５００ｂｐ２５０ｂｐ１００

ｂｐ

１２３

１

２

３

４

７７７ｂｐ

１５０００

ｂｐ１００００ｂｐ７５００ｂｐ５０００ｂｐ２５００ｂｐ２０００

ｂｐ图１ＡＣＳ基因的ｃＤＮＡ序列的ＰＣＲ扩增产物

Ｆｉｇ．１ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＡＣＳｇｅｎｅｃＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅ１．分子量标准２．ＫｐｎＩ消化３．ＳａｃＩ消化４．ＫｐｎＩ／ＳａｃＩ消化１．Ｍａｒｋｅｒ２．ＫｐｎＩｄｉｇｅｓｔｉｏｎ；

３．ＳａｃＩｄｉｇｅｓｔｉｏｎ

４．ＫｐｎＩ／ＳａｃＩｄｉｇｅｓｔｉｏｎ

１０００ｂｐ７５０ｂｐ５００ｂｐ２５０

ｂｐ

郭庆勋等：薄皮甜瓜果实ＡＣＣ合成酶ｃＤＮＡ克隆及反义表达载体的构建?２３?

第１期

１ＴＣＴＣＣＴＣＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＡＣＴＡＴＣＣＡＧＧＡＴＴＴＧＡＴＡＧＡＧＡＴＴＴＧＡＡＡＴＧＧＡＧＡＡＣＣＧＧＡＧＴ１ＬＬＰＴＰＹＹＰＧＦＤＲＤＬＫＷＲＴＧＶ６１ＴＧＡＧＡＴＴＧＴＧＣＣＡＡＴＴＣＡＴＴＧＣＡＣＴＡＧＣＴＣＣＡＡＣＧＧＣＴＴＣＣＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＡＣＣＣＧＣＴＴＴ２１ＥＩＶＰＩＨＣＴＳＳＮＧＦＱＶＴＱＰＡＬ１２１ＡＧＡＡＣＡＡＧＣＴＴＡＣＡＡＡＧＡＡＧＣＴＧＡＡＡＧＴＣＧＣＡＡＣＣＴＡＣＧＴＧＴＣＡＡＡＧＧＣＧＴＡＴＴＧＧＴＴＡＣ４１ＥＱＡＹＫＥＡＥＳＲＮＬＲＶＫＧＶＬＶＴ１８１ＡＡＡＣＣＣＡＴＣＴＡＡＣＣＣＡＴＴＧＧＧＧＡＣＴＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧＡＡＡＴＧＡＡＣＴＣＧＡＣＴＴＧＧＴＴＴＴＴＧＡ６１ＮＰＳＮＰＬＧＴＴＭＴＲＮＥＬＤＬＶＦＤ２４１ＴＴＴＣＡＴＡＡＣＣＴＣＣＡＡＡＧＧＣＡＴＴＣＡＴＴＴＧＡＴＣＡＧＣＧＡＴＧＡＧＡＴＴＴＡＣＴＣＣＧＧＧＡＣＣＧＴＴＴＴ８１ＦＩＴＳＫＧＩＨＬＩＳＤＥＩＹＳＧＴＶＦ３０１ＴＧＧＧＴＣＴＣＣＡＧＧＡＴＴＣＧＴＧＡＧＣＧＣＧＡＴＧＧＡＧＧＴＡＣＴＴＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＡＣＧＡＡＧＡＧＧＡ１０１ＧＳＰＧＦＶＳＡＭＥＶＬＫＥＲＳＮＥＥＥ３６１ＧＧＡＡＧＴＴＴＧＧＡＡＧＡＧＡＧＴＴＣＡＴＡＴＴＧＴＴＴＡＣＡＧＴＴＴＡＴＣＧＡＡＧＧＡＴＴＴＡＧＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧ１２１ＥＶＷＫＲＶＨＩＶＹＳＬＳＫＤＬＧＬＰＧ４２１ＴＴＴＴＣＧＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＡＴＴＴＡＣＴＣＴＡＡＣＧＡＴＧＡＡＡＴＧＧＴＴＧＴＧＧＣＧＧＣＴＧＣＴＡＣＴＡＡＡＡＴ１４１ＦＲＶＧＡＩＹＳＮＤＥＭＶＶＡＡＡＴＫＭ４８１ＧＴＣＴＡＧＣＴＴＴＧＧＧＴＴＧＧＴＴＴＣＡＴＣＴＣＡＡＡＣＡＣＡＡＴＡＴＣＴＴＣＴＴＴＣＡＧＣＴＡＴＧＣＴＡＴＣＣＧＡ１６１ＳＳＦＧＬＶＳＳＱＴＱＹＬＬＳＡＭＬＳＤ５４１ＡＡＧＡＡＡＴＴＴＡＣＧＡＧＡＡＣＣＴＡＴＡＴＴＴＣＧＧＡＧＡＡＴＣＡＡＡＡＧＡＧＧＴＴＧＡＡＡＣＡＡＡＧＡＣＡＧＡＡ１８１ＫＫＦＴＲＴＹＩＳＥＮＱＫＲＬＫＱＲＱＫ６０１ＡＡＴＧＴＴＧＧＴＧＡＧＴＧＧＡＴＴＡＧＡＧＡＡＧＧＣＴＧＧＧＡＴＴＡＡＧＴＧＴＴＴＧＧＡＧＡＧＴＡＡＴＧＣＴＧＧＧＴＴ２０１ＭＬＶＳＧＬＥＫＡＧＩＫＣＬＥＳＮＡＧＬ６６１ＧＴＴＴＴＧＴＴＧＧＧＴＡＧＡＴＡＴＧＡＧＧＣＡＴＴＴＧＴＴＧＧＡＡＴＣＡＧＡＴＡＣＣＴＴＴＧＡＡＡＧＴＧＡＡＴＴＡＡＡ２２１ＦＣＷＶＤＭＲＨＬＬＥＳＤＴＦＥＳＥＬＫ７２１ＧＣＴＡＴＧＧＡＡＧＡＡＧＡＴＴＧＴＴＴＡＣＧＡＡＧＴＧＧＧＴＴＴＧＡＡＴＡＴＴＴＣＡＣＧＡＧＧＡＴＣＡＴＴＴＧＣ２４１ＬＷＫＫＩＶＹＥＶＧＬＮＩＳＲＧＳＦ

图３甜瓜果实ＡＣＣ合成酶ｃＤＮＡ序列和氨基酸序列

Ｆｉｇ．３ｃＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＣｕｃｕｍｉｓｍｅｌｏｎＱｉｔｉａｎＩ

２．２反义植物表达载体的构建及鉴定

ＡＣＣ合成酶ｃＤＮＡ片段可由ｐＧＥＭ－ＡＣＣ上经ＫｐｎＩ和ＳａｃＩ双酶切切下，所得到的ＡＣＣ合成酶基因表达方向为ＳａｃＩ→ＫｐｎＩ。

中间载体ｐＣＡＭＥ８－ＧＴ多克隆酶切位点上内切酶ＫｐｎＩ在５端，ＳａｃＩ在３端，这样从ｐＧＥＭ－ＡＣＣ上经ＫｐｎＩ和ＳａｃＩ双酶切切下的基因片段经Ｔ４连接酶连接，基因的５端连接到中间载体ｐＣＡＭＥ８－ＧＴ的３端，３端连接到中间载体ｐＣＡＭＥ８－ＧＴ的５端，构成植物表达载体ｐＣＡＭＥ８ＡＣＣＴ，其由果实特异启动子Ｅ８调控，转录方向为ＫｐｎＩ→ＳａｃＩ，形成ＡＣＣ合成酶的反义ｍＲＮＡ。重组表达载体质粒ｐＣＡＭＥ８ＡＣＣＴ经ＫｐｎＩ和ＳａｃＩ双酶切切下约０．７ｋｂ左右基因片段，ＫｐｎＩ和ＳａｃＩ单酶切大小约为１．４ｋｂ左右片段，结果见图４，说明目的片段已经插入ｐＣＡＭＥ８－ＧＴ载体中，表明植物表达载体构建正确。载体构建过程如图５。

′′

′

′

′′

?２４?东北农业大学学报第３７卷

图４反义植物表达载体的限制酶分析

Ｆｉｇ．４Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆａｎｔｉｓｅｎｓｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｄｉｇｅｓｔｅｄｗｉｔｈｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅ

１５０００ｂｐ１００００ｂｐ７５００ｂｐ５０００ｂｐ２５００ｂｐ２０００ｂｐ

１０００ｂｐ７５０ｂｐ５００ｂｐ２５０ｂｐ１００ｂｐ

２０００ｂｐ１０００ｂｐ７５０ｂｐ５００ｂｐ２５０ｂｐ１００ｂｐ

１２３４５

Kpn I+Sac I digestion

T4Ligase BamH I+Sac I digestion

T4Ligase

１．分子量标准２．ＫｐｎＩ消化３．ＳａｃＩ消化４．ＫｐｎＩ／ＳａｃＩ消化１．Ｍａｒｋｅｒ２．ＫｐｎＩｄｉｇｅｓｔｉｏｎ３．ＳａｃＩｄｉｇｅｓｔｉｏｎ４．ＫｐｎＩ／ＳａｃＩｄｉｇｅｓｔｉｏｎ

图５

ＡＣＣ合成酶基因反义植物表达载体构建过程Ｆｉｇ．５

ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｓｅｎｓｅｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｖｅｃｔｏｒｏｆＡＣＣｇｅｎｅ

３７９３ｂｐ１４０３７ｂｐ

１４８１５ｂｐ１３００４ｂｐ

１４０７９ｂｐ

Ｔ４ＬｉｇａｓｅＫｐｎⅠ＋ＳａｃⅠｄｉｇｅｓｔｉｏｎＢａｍＨⅠ＋ＳａｃⅠｄｉｇｅｓｔｉｏｎ

ｐＣＡＭＥＡＣＣＴｐＣＡＭ－ＧＴｐＣＡＭＥ８ＡＣＣｐＣＡＭ－Ｅ８ｐＧＥＭ－ＡＣＣ

ｎｏｒｉ

ＡｍｐｒｌａｃⅠＡＣＣｏｒｉ

ＢａｍＨⅠ

ＥｃｏＲⅠ３５ＳＧＵＳ

ＲＢ

３５ＳＥ８

ｌａｃⅠＫｐｎⅠＳａｃⅠＴ－ｎｏｓ

ＫａｍｒＬＢ

Ｔ－ｎｏｓ

ｎｐｔⅡＢａｍＨⅠ

Ｅ８

ＫｐｎⅠＡＣＣＳａｃⅠＥｃｏＲⅠ

３５ＳＧＵＳ

Ｔ－ｎｏｓＲＢ３５ＳＬＢ

Ｔ－ｎｏｓ

ｎｐｔⅡＫａｍｒ

ＢａｍＨⅠ

ＳａｃⅠＴ－ｎｏｓ

ＥｃｏＲⅠ３５Ｓ３５ＳＬＢ

ＫａｍｒＧＵＳ

ＧＵＳＴ－ｎｏｓ

Ｔ－ｎｏｓ

ｎｐｔⅡＲＢ３５ＳＬＢ

Ｔ－ｎｏｓ

ｎｐｔⅡＫａｍｒ

ＢａｍＨⅠ

ＳａｃⅠＴ－ｎｏｓ

ＥｃｏＲⅠ３５ＳＧＵＳＴ－ｎｏｓ

ＲＢ

Ｅ８

ＫｐｎⅠＡＣＣ

郭庆勋等：薄皮甜瓜果实ＡＣＣ合成酶ｃＤＮＡ克隆及反义表达载体的构建?２５?

第１期

３讨论

ＡＣＣ合成酶参与植物生长发育的调控对环境压力作出各种反应。ＡＣＣ合成酶基因由多基因家族编码，其表达有组织特异性和时间特异性，因此不同起源、不同类型、不同品种的甜瓜其ＡＣＣ合成酶基因的同源性也有一定的差异。Ｍｉｋｉ等［１６］从甜瓜成熟果实中克隆出２个ＡＣＣ合成酶基因ＣＭｅ－ＡＣＳ１和ＣＭｅ－ＡＣＳ２，ＣＭｅ－ＡＣＳ１在果实成熟过程中优先表达，这说明ＣＭｅ－ＡＣＳ１对甜瓜果实成熟过程中乙烯的大量产生起着主要作用。

本研究从成熟的薄皮甜瓜（齐甜１号）果肉组织中克隆了ＡＣＣ合成酶ｃＤＮＡ片段，克隆的ｃＤＮＡ片段长７７７ｂｐ，与ＧｅｎＢａｎｋ中报道的ＡＣＣ合成酶基因进行比较，结果与甜瓜、黄瓜、冬瓜的核苷酸的同源性分别为９９％、９６％、８５％，氨基酸的同源性分别为９８％、９６％、９２％，初步证明该基因为甜瓜（香瓜）果实ＡＣＣ合成酶基因。报道的甜瓜ＡＣＣ合成酶基因核苷酸同源性为９９％，氨基酸同源性为９８％，说明该基因为ＡＣＣ合成酶基因。该片段与已有报道存在差异的原因有两个：①本实验使用的是普通ＴａｑＤＮＡ聚合酶，不是高保真ＴａｑＤＮＡ聚合酶，在ＰＣＲ扩增过程中存在错配可能；②可能试验材料的差异，报道的甜瓜是厚皮甜瓜，本实验的甜瓜是薄皮甜瓜。

为了进一步证明该基因为甜瓜ＡＣＣ合成酶基因，构建了果实特异启动子Ｅ８调控的反义ＡＣＣ合成酶基因的植物表达载体，转化甜瓜子叶节，获得转化的再生植株，经ＰＣＲ初步证明该基因已整合到甜瓜基因组ＤＮＡ中，反义ＲＮＡ技术已经成为调控植物基因表达的有力工具。通过反义ＲＮＡ途径抑制乙烯合成途径中限速酶的表达，可延迟果实的成熟。反义ＲＮＡ可能作用机制是转录后有义链和反义链互补形成的复合物干扰了靶基因的表达。本研究构建了薄皮甜瓜ＡＣＣ合成酶ｃＤＮＡ片段的反义表达载体，并以根癌农杆菌介导法导入甜瓜，目前已经获得转基因植株。

［参考文献］

［１］ＹａｎｇＳＦ，ＨｏｆｆｍａｎＮＥ．Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｉｔｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｉｎｈｉｇｈｅｒｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．ＡｎｎＲｅｖＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ，１９８４，３５：１５５－１８９．［２］宋艳茹，谢安勇．乙烯生物合成与果实成熟的调节［Ｊ］．植物学报，１９９４，３６（增刊）：１－１３．

［３］ＷｉｌｌｉａｍＨ．ＡＣＣｓｙｎｔｈａｓｅｉｎｔｏｍａｔｏｉｓｅｎｃｏｄｅｄｂｙａｍｕｌｔｉｇｅｎｅｆａ－ｍｉｌｙｗｈｏｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｉｓｉｎｄｕｃｅｄｄｕｒｉｎｇｆｒｕｉｔａｎｄｆｌｏｒａｌｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ［Ｊ］．ＪＭｏｌＢｉｏｌ，１９９１，２２２：９３７－９６１．

［４］ＫｅｎｄｅＨ．Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ［Ｊ］．ＡｎｎｕｌＲｅｖＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌＰｌ－ａｎｔＭｏｌＢｉｏｌ，１９９３，４４：２８３－３０７．

［５］ＯｌｌｅｒＰＷ，ＬｕＭｗ，ＴａｙｌｏｒＬＰ，ｅｔａｌ．ＲｅｖｅｒｓｉｂｌｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｔｏｍａｔｏｆｒｕｉｔｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅｂｙａｎｔｉｓｅｎｓｅＲＮＡ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４：４３７－４３９．

［６］刘传银，田颖川，沈全光，等．番茄ＡＣＣ合成酶ｃＤＮＡ克隆及其对果实成熟的反义抑制［Ｊ］．生物工程学报，１９９８，１４（２）：１３９－１４６．

［７］罗云波，生吉萍，申琳．番茄中反义ＡＣＣ合成酶基因的导入与乙烯生物合成的控制［Ｊ］．农业生物技术学报，１９９５，３（２）：３８－４３．［８］曹晓风，鲁治滨，朱玉贤，等．番茄乙烯合成酶基因的ｃＤＮＡ克隆及全序列测定［Ｊ］．科学通报，１９９３，３８（２０）：１９０７－１９１０．［９］ＨａｍｉｌｔｏｎＡＪ，ＬｙｃｅｔｔＧＷ，ＧｒｉｅｒｓｏｎＤ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅｇｅｎｅｔｈａｔｉｎｈ－ｉｂｉｔｓｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｔｈｅｈｏｒｍｏｎｅｅｔｈｙｌｅｎｅｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＮａｔｕｒｅ，１９９０，３４６：２８４－２８７．

［１０］王仲田，王兰竹．中国西瓜甜瓜［Ｍ］．北京：中国农业出版社，２０００，４１８－４５１．

［１１］陈雷，秦智伟．甜瓜采后生理和贮藏保鲜研究进展［Ｊ］．北方园艺，１９９９，６：２４－２７．

［１２］郑晓飞．ＲＮＡ实验技术手册［Ｍ］．北京：科学出版社，２００４，２４－２６．

［１３］ＩｓｈｉｋｉＹ，ＯｄａＡ，ＹａｅｇａｓｈｉＹ，ｅｔａｌ．Ｃｌｏｎｉｎｇｏｆａｎａｕｘｉｎｒｅｓｐｏｎｓｉ－ｖｅ１－ａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅｇｅｎｅ（ＣＭｅ－

ＡＣＳ２）ｆｒｏｍｍｅｌｏｎａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡＣＳｇｅｎｅｓｉｎｅｔｉｏｌａｔｅｄｍｅｌｏｎｓｅｅｄｌｉｎｇｓａｎｄｍｅｌｏｎｆｒｕｉｔｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＳｃｉ，２０００，１５９（２）：１７３－１８１．

［１４］ＳｈｉｏｍｉＳ，ＹａｍａｍｏｔｏＭ，ＯｎｏＴ，ｅｔａｌ．ｃＤＮＡｃｌｏｎｉｎｇｏｆＡＣＣｓｙｎｔｈａｓｅａｎｄＡＣＣｏｘｉｄａｓｅｇｅｎｅｓｉｎｃｕｃｕｍｂｅｒｆｒｕｉｔａｎｄｔｈｅｉｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｂｙｗｏｕｎｄｉｎｇａｎｄａｕｘｉｎ［Ｊ］．ＪＪａｐａｎＳｏｃＨｏｒｔＳｃｉ，１９９８，６７：６８５－６９２．

［１５］ＮａｋａｊｉｍａＮ，ＭｏｒｉＨ，ＹａｍａｚａｋｉＫ，ｅｔａｌ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆａｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙＤＮＡｅｎｃｏｄｉｎｇ１－ａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｐｒｏｐ－

ａｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅｉｎｄｕｃｅｄｂｙｔｉｓｓｕｅｗｏｕｎｄｉｎｇ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ，１９９０，３１：１０２１－１０２９．

［１６］ＭｉｋｉＴ，ＹａｍａｍｏｔｏＭ，ＮａｋａｇａｗＨ，ｅｔａｌ．ＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆａｃＤＮＡｆｏｒ１－ａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅｆｒｏｍｍｅｌｏｎｆｒｕｉｔｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ，１９９５，１０７：２９７－２９８．

?２６?东北农业大学学报第３７卷

ＭｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇｏｆａｍｕｓｋｍｅｌｏｎｃＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｅｎｃｏｄｉｎｇａｎａｍｉｎｏ－ｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘｙｌｉｅａｃｉｄ（ＡＣＣ）ｓｙｎｔｈａｓｅａｎｄｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆ

ａｎｔｉｓｅｎｓｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ

ＧＵＯＱｉｎｇ－ｘｕｎ１，２，ＱＩＮＺｈｉ－ｗｅｉ１，ＤＩＮＧＧｕｏ－ｈｕａ１，３，ＬＩＪｉｎｇ－ｐｅｎｇ４

（１．ＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｇｅ，ＮｏｒｔｈｅａｓｔＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＨａｒｂｉｎＨｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ１５００３０，ＰＲＣ；

２．ＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｏｌｌｅｇｅ，ＪｉｌｉｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＣｈａｎｇｃｈｕｎＪｉｌｉｎ１３００６２，ＰＲＣ；３．ＡｃｈｅｎｇＣｏｌｌｅｇｅ，ＨａｒｂｉｎＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＡｃｈｅｎｇＨｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ１５０３０１，ＰＲＣ；

４．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＮｏｒｔｈｅａｓｔＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＨａｒｂｉｎＨｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ１５００３０，ＰＲＣ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＡｃＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｏｆａｎａｍｉｎｏ－ｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘｙｌｉｅａｃｉｄ（ＡＣＣ）ｓｙｎｔｈａｓｅｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ－ＰＣＲ）ｆｒｏｍｓａｒｃｏｃａｒｐｔｉｓｓｕｅｏｆｍａｔｕｒｅｍｕｓｋｍｅｌｏｎ（Ｃｕｃｕｍｉｓｍｅｌｏｃｖ．ＱｉｔｉａｎＩ）ａｎｄｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏａｖｅｃｔｏｒｐＧＥＭ－ＴＥａｓｙ．ＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｃｌｏｎｅｄｆｒａｇｍｅｎｔｓｈａｒｅｄｈｉｇｈｌｙｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙｔｏｔｈｅｃＤＮＡｓｏｆＡＣＣｓｙｎｔｈａｓｅｓｆｒｏｍｏｔｈｅｒＣｕｃｕｂｉｔａｅｐｌａｎｔｓ．ＴｈｅｃｌｏｎｅｄｃＤＮＡｏｆＡＣＣｓｙｎｔｈａｓｅｗａｓｆｕｒｔｈｅｒｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｉｎｔｏｂｉｎａｒｙｖｅｃｔｏｒｐＣＡＭ２３０１ｉｎａｒｅｖｅｒｓｅｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎｗｉｔｈｉｔｓｕｐｓｔｒｅａｍｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｅ８），ｇｉｖｉｎｇａｎｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｐｌａｓｍｉｄｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｔｈｅａｎｔｉｓｅｎｓｅＡＣＣｓｙｎｔｈａｓｅｇｅｎｅ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｃｕｃｕｍｉｓｍｅｌｏｃｖ．ＱｉｔｉａｎＩ；ＡＣＣｓｙｎｔｈａｓｅｇｅｎｅ；ａｎｔｉｓｅｎｓｅｇｅｎｅ；ａｎｔｉｓｅｎｓｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ

郭庆勋等：薄皮甜瓜果实ＡＣＣ合成酶ｃＤＮＡ克隆及反义表达载体的构建?２７?

第１期

克隆构建目的基因的简便方法

克隆构建 一、 PCR 1、PCR 20ul体系，4个Mix，3个回收，1个对照 H2O 10.8ul 94℃3min KOD Buffer 2ul 94℃30s DNTPs 2ul 5X℃30s MgSO4 2ul 68℃Xs Primer F 2ul 68℃10min Primer R 2ul cycle 34 KOD 0.2ul Plasmid 1ul 试剂确保融化完全，枪头触到表面打净，最后用白枪头反复打几次混合溶液，离心3-4s，分装20ul至PCR管。 2、加尾 0.1ul Taq 酶，加入到20ul，微弹，离心，PCR仪上放置15min。 3、回收 配中孔胶，电泳并回收试剂盒回收：熔胶后室温冷却再上柱，PW缓冲液离心过后于超净台上吹干7-9min，电泳检测回收产物。 二、连接 Solution 1 5ul 目的片段 4.5ul 16℃过夜 T-vector 0.5ul 三、转化 1、感受态细胞制备 取5ml无抗LB培养液，加入到灭菌试管中，取60-80ul新鲜菌液，37℃恒温摇床2h；取其中2.4ml倒入2.5ml EP管中，尽量保持4℃低温下12000g离心30s， 沿壁缓缓加入CaCl2溶液，冰上滑动EP管管底使菌体悬浮； 2、转化涂板 加入连接产物时边加边搅，热激时温度略微低于42℃，时间严格控制1min30s 之后冰上静置3min左右，加入300ul LB 无抗培养基，于37℃恒温箱复苏50min，涂板并37℃恒温箱过夜培养。 四、鉴定 1、质粒提取 挑去单克隆菌落，37℃过夜培养，次日提取质粒。 2、酶切鉴定 根据设计引物选择双切酶，20ul体系37℃酶切2h，电泳检测并送去测序。 3、PCR鉴定 将切出片段所属的菌液进行菌液PCR鉴定。

常用的克隆载体

第一章 概 论 第二章 基因疫苗工作 原理 第三章 基因疫苗抗原 基因的筛选和克隆 第四章 基因疫苗的构 建 第五章 基因疫苗制备 第六章 基因疫苗免疫方法 第七章 基因疫苗免疫 效果检测 第八章 影响基因疫苗免疫效果的因素 第九章 基因疫苗安全性 第十章 细菌病基因疫苗 第十一章 病毒病基因 疫苗 第十二章 寄生虫病基 因疫苗 第十三章 肿瘤基因疫 苗 第十四章 控制动物生 长性能的基因疫苗 四、常用的克隆载体 克隆载体就是将目的基因导入宿主细胞进行复制，从而获得大量克隆化片段的运载工具，常用的克隆载体种类很多，主要包括质粒、粘粒和噬菌体等。其中，质粒是目前应用最为广泛 的克隆载体。下面简要介绍作为克隆质粒的特性和结构。 （一）质粒特性 质粒是指在染色体外能够独立复制和稳定遗传的一类环状双链 DNA 分子。有的质粒处于染色体外的游离状态，可以随着染色体的复制而复制，并且通过细胞分裂传递到子代。有的质 粒在一定条件下能够可逆地整合到寄主染色体上。 质粒的表示常根据 1976 年提出质粒命名原则，用小写字母 p 代表质粒，在 p 字母后面 用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或者实验室名称。例如质粒 pUCl8 ，字母 p 代表质粒， UC 是构建该质粒的研究人员的姓名代号， 18 代表构建的一系列质粒的编号。 质粒广泛地分布于原核生物细胞中，也存在于一些真核细胞中。质粒相对分子质量范围为10 6 -2 @ 10 8 。根据质粒在受体细胞内的数量将质粒分为严紧型质粒和松弛型质粒两种类 型。严紧型质粒在每个细胞只有 1 个至几个拷贝；松弛型质粒在每个细胞中有 10-200 个拷贝。 质粒可以分为三种构型，一种是呈现超螺旋的 SC 构型（ scDNA ），一种是开环 DNA （ ocDNA ），另一种是呈线形分子的 L 构型。质粒 DNA 与一般 DNA 分子的理化性质相似，例如溶于水、不溶于乙醇等有机溶剂、能吸收紫外线、可嵌入溴乙锭染料等。实验室常利用这 些理化特性鉴定和纯化质粒。 质粒具有以下几项生物学特性： ? 寄生性：质粒可以在特定的宿主细胞内存在和复制。 ? 稳定性：每种质粒在特定的宿主细胞内保持着一定的拷贝数。 ? 重组性：两种不同的质粒处于同一宿主细胞中或者一种质粒处于一种宿主细胞中，有可能发生质粒与质粒之间或质粒与染色体之间的重组。 ? 不相容性：有相同复制始区的不同质粒不能共存于同一宿主细胞中，其分子基础主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。 ? 传递性：有些质粒在细菌间能够传递，具有传递性的质粒带有一套与传递有关的基 因。

三四章分子克隆载体---答案_完_

第三章分子克隆载体（Molecular cloning vectors） 一、名词解析 1.质粒：质粒是染色体外的遗传因子，能进行自我复制（但依赖于宿主编码的 酶和蛋白质）；大多数为超螺旋的双链共价闭合环状DNA分子（covalently closed circle , cccDNA），少数为线性；大小一般为1～200Kb，有的更大。2.质粒拷贝数：质粒拷贝数(plasmid copy numbers)是指细胞中单一质粒的份数 同染色体数之比值,常用质粒数/每染色体来表示。不同的质粒在宿主细胞中的拷贝数不同。 3.质粒的不相容性：两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容 性，它是指在第二个质粒导入后，在不涉及DNA 限制系统时出现的现象。 不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。 4.质粒的转移性：质粒具转移性。它是指在自然条件下，很多质粒可以通过称 为细菌接合的作用转移到新宿主内。它需要移动基因 mob ，转移基因 tra ，顺式因子 bom 及其内部的转移缺口位点 nic。 5.穿梭质粒：既能在真核细胞中繁殖又能在原核细胞中繁殖的载体。这类载体 必须既有细菌的复制原点或质粒的复制原点，又含有真核生物的复制原点，还具备酶切位点和合适的筛选指标。它用来转化细菌，又可以用于转化真核细胞。 6.α-互补：α-互补是指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完 整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶（β -galactosidase ，由 1024 个氨基酸组成）阴性的突变体之间实现互补。α-互补是基于在两个不同的缺陷β-半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的 7.温和噬菌体：既能进入溶菌生命周期又能进入溶源生命周期的噬菌体。 8.溶源性细菌：具有一套完整的噬菌体基因组的细菌叫溶源性细菌。 9.整合：如果噬菌体的DNA是被包容在寄主细菌染色体DNA中，便叫做已整合 的噬菌体DNA。这中细菌提DNA组入细菌染色体DNA的过程，叫做噬菌体DNA 的整合或插入。 10.溶源化：用温和的噬菌体感染细菌培养物使之形成溶源性细菌的过程叫做溶 源化。

基因克隆载体上的各种常用蛋白标签

基因克隆载体上的各种常用蛋白标签 蛋白标签(proteintag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。 美国GeneCopoeia(复能基因)为客户提供50多种蛋白标签，可以满足客户的不同需求，包括各种最新型的标签，如：SNAP-Tag?、Halo Tag?、AviTag?、Sumo等;也提供齐全的各种常用标签，如eGFP、His、Flag等等标签。 以下是部分蛋白标签的特性介绍，更加详细的介绍可在查询产品的结果列表里面看到各种推荐的蛋白标签和载体。 TrxHIS His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测;二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点： 标签的量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能; His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性; His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究; His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。 可应用于多种表达系统，纯化的条件温和; 可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 Flag标签蛋白 Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK)，同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点： FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。 融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。 FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。

目的基因PCR扩增产物的克隆

目的基因PCR扩增产物的克隆 [实验原理] 1.PCR产物回收 在高离子盐存在的情况下，DNA片断选择性的吸附于离心柱内的硅基质膜上，再通过一系列快速的漂洗、离心的步骤去蛋白液和漂选液，将引物、核苷酸、蛋白酶等杂质去除，最后用低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净DNA从硅基质膜上洗脱。 2.T载体与PCR产物的连接 源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA 分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。因为DNA片断有两个端点，所以切割时出现两种可能，一种是单酶切，另一种是双酶切，这两种酶切方法在基因工程操作中都经常用到。对于单酶切来说，载体与供体的末端都相同，连接可以在任何末端之间进行，这样就导致了大量的自连接产物。为了减少自环的高本底，可对载体进行5’除磷酸处理，原理是连接酶只能连接DNA 片断的3’OH末端与5’端，所以除磷后载体不会自环。一旦有外源片断插入时，由外源片断提供5’端就能与载体进行连接。通过这种方法可大大减少由载体的自身成环造成的高本底。对于双

克隆载体与表达载体---—朕已阅

一部分：概念解析 二部分：问题解答 克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。 克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。) 其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。 是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。 表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。 （RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。根据发现者的名字，命名为Shine-Dalgarno序列，简称S-D序列。 由于它正好与30S小亚基中的16s rRNA3’端一部分序列互补，因此S-D序列也叫做核糖体结合序列。 真核生物存在于真核生物mRNA的一段序列，其在翻译的起始中有重要作用。加Kozark sequence(GCCACC), Kozak sequence是用来增强真核基因的翻译效率的。是最优化的ATG环境，避免ribosome出现leaky scan） 克隆载体目的在于复制足够多的目标质粒，所以常带有较强的自我复制元件，如复制起始位点等，往往在菌体内存在多拷贝，所以抽质粒会抽出一大堆。但不具备表达元件。而表达质粒有复杂的构成，为的是控制目标蛋白的表达，如各种启动子（T7），调节子（LacZ）等，而且以pET为代表的表达载体在菌体内都是低拷贝的，防止渗漏表达。 克隆载体只是把你要的基因片段拿到就可以了，不管读码框什么的，但是表达载体是不但要你的目的基因连在上面，而且要表达蛋白，所以就要求你的读码框不能乱了，否则就不能得到你想到的表达产物。 1.载体即要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。 2. 载体的分类 按功能分成：（1）克隆载体: 都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。（2）表达载体:具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs

目的基因克隆之欧阳光明创编

一、目的基因克隆的策略有哪些？其理论依据什么？如何根据具体条件，如目的性状的特点，已知控制目的性状的基因的信息合理选择基因克隆的方法？ 欧阳光明（2021.03.07） 1、主要有以下几个克隆的策略： （1）PCR法分离目的基因：从蛋白质的一级序列分析得到核酸序列的相关信息，设计简并引物，通过对mRNA进行反转录得到cDNA，以cDNA为模板，然后将目的基因通过PCR方法扩增，或者直接从基因组DNA扩增的方法。 （2）核酸杂交的方法：通过对蛋白质的氨基酸序列分析，设计简并引物，通过核酸杂交的方法从基因文库中筛选得到目的基因。（3）免疫学筛选法分离目的基因：利用免疫学原理，通过目的蛋白的特异抗体与目的蛋白的专一结合，从表达文库中分离目的蛋白基因。 2、若控制该性状的目的蛋白质不容易分离纯化，这PCR方法比较适宜，若蛋白质分离纯化容易，且有现成的基因文库，则后两种方法较为简单。 二、蛋白组学方法克隆目的基因的理论依据是什么？有哪些技术环节？要用到哪些技术？ 1、理论依据：以分离纯化的目的蛋白为研究起点，通过对目的蛋白的一级结构分析，获得起码的氨基酸序列信息后，反推可能的

DNA序列，然后设计引物，从cDNA中将目的基因扩增出来，或者设计核酸探针，通过杂交技术将目的基因从基因文库中筛选出来。或通过抗体抗原免疫反应从表达文库中将该基因分离出来。 2、技术环节是确定并制备出高纯度的蛋白质。 3、所需要的实验技术有：蛋白质的双向电泳技术，由第一向的等电聚焦电泳和第二向的SDS-PAGE电泳组成；蛋白质氨基酸序列分析。 三、基因组学方法克隆基因的策略有哪些？各有什么特点？如何选择恰当的基因组学方法克隆目的基因？ 1、基因文库筛选方法 通过对基因文库的筛选将目的基因分离出来，一般有两种方法：核酸杂交法，原理是分子杂交；PCR筛选法，通过ＰＣＲ方法将目的基因分离出来，对于以混合形式保存的文库，先将文库分成几份，每份为一个“反应池”进行PCR反应，待选出阳性池后，将阳性池的混合克隆稀释，然后等量分置96孔板中，进行横向池及纵向池的ＰＣＲ反应，然后将阳性菌落群进行稀释，重复上述工作，直到筛出阳性单克隆。 2、图位克隆目的基因 利用分子标记技术对目的基因进行精细定位，利用分子标记技术对目的基因进行精细定位，用获得的与目的基因紧密连锁的分子标记筛选基因文库的方法。主要有染色体步移法、染色体登陆、跳查和连接法；外显子捕捉和cDNA直选法等。 3、插入突变分离克隆目的基因

克隆载体与表达载体

克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。 克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。) 其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。 是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。 表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。 表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表 达载体。其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元件中，有一 个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。 （RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们 是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由 3—9bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。根据发现者的名字，命名为Shine-Dalgarno序列，简称S-D序列。 由于它正好与30S小亚基中的16s rRNA3’端一部分序列互补，因此S-D序列也叫做核糖体结合序列。 真核生物存在于真核生物mRNA的一段序列，其在翻译的起始中有重要作用。加Kozark sequence(GCCACC), Kozak sequence是用来增强真核基因的翻译效率的。是最优化的ATG环境，避免ribosome出现leaky scan） 克隆载体目的在于复制足够多的目标质粒，所以常带有较强的自我复制元件，如复制起始位点等，往往 在菌体内存在多拷贝，所以抽质粒会抽出一大堆。但不具备表达元件。而表达质粒有复杂的构成，为的是控制目标蛋白的表达，如各种启动子（T7），调节子（LacZ）等，而且以pET为代表的表达载体在菌体内都是低拷贝的，防止渗漏表达。 克隆载体只是把你要的基因片段拿到就可以了，不管读码框什么的，但是表达载体是不但要你的目的基因连在上面，而且要表达蛋白，所以就要求你的读码框不能乱了，否则就不能得到你想到的表达产物。 1.载体即要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。 2. 载体的分类 按功能分成：（1）克隆载体: 都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是 用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。（2）表达载体 :具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。 按进入受体细胞类型分：（1）原核载体（2）真核载体（3）穿梭载体（sbuttle vector）指在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间）. 克隆载体顾名思义就是质粒拷贝数比较高,在做上游克隆时比较方便, 其重点在于质粒的复制.

基因工程原理讲义：目的基因的克隆

第九讲目的基因的克隆 中国科学院遗传与发育生物学研究所 2017年8月

目录 一、基因克隆的一般概念 1．基因克隆定义 2．“克隆”的不同含义 3．基因克隆的过程 4．DNA片段的产生与分离 5．基因文库 二、基因克隆与分离的实验策略 1．物理策略 2．生物策略 3．克隆样品的选择 4．基因文库库容测算 三、cDNA基因克隆 1．概述 2．cDNA文库的构建 3．低丰度mRNA之cDNA克隆 4．稀少mRNA的cDNA克隆 5．全长cDNA的合成 6．cDNA克隆的优越性 四、基因组DNA克隆

1．cDNA克隆的局限性 2．基因组DNA克隆的优越性 3．构建基因组文库的载体类型五、基因定位定隆 1．基因定位克隆概述 2．RFLP分子标记 3．RFLP作图原理与步骤 4．染色体步移 5．大尺度物理图谱的构建

目的基因的克隆 一、基因克隆的概念 1．基因克隆的定义 基因克隆亦叫做DNA克隆(DNA cloning)，它是指将外源基因或DNA片段插入到克隆载体的分子上，构成重组的DNA群体，并转化到寄主细胞进行复制和繁殖，以便从大分子DNA或DNA片段混合物中分离纯化目的基因或特定DNA片段的实验操作，叫做基因克隆。严格地说，基因克隆应叫做DNA克隆，因为被克隆的是基因组的全部(理论上)的DNA片段，而并不是所有的DNA片段都编码有基因。 *要注意基因克隆与基因分离两者在概念上的差别！完成了基因克隆并不等于完成了基因的分离！尽管两者之间存在密切的相互关系。因此在日常交谈中或是一般文字叙述中，甚至于某些正式有关文件中，常把“基因克隆”与“基因分离”等同使用，不作区分，是不妥当的。 *有时我们所说的基因克隆，即所谓的“分子克隆”(Molecular cloning)，实质上包含着目的基因的分离与鉴定两个主要的内容，基因克隆的全过程包括如下四个步骤：

基因克隆的质粒载体

基因克隆的质粒载体 在大肠杆菌的各种菌体中找到了许多种不同类型的质粒，其中已经作了比较详尽研究的主要有F质粒、R质粒和Col质粒。 ①F质粒又叫F因子或性质粒（sex plasmid）。它们能够使寄主染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去。 ②R质粒通称抗药性因子。它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且通常能够将此种抗性转移到缺管该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。 ③Col质粒即所谓产生大肠杆菌素因子。它们编码有控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌是一类可以使不带有Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。 第一节质粒的一般生物学特性一．质粒DNA 细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成份。绝大多数的质粒都是由环形双DNA组成的复制子（图4-1）。 质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状，但在一定的条件下又可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型： 1．当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形DNA（cccDNA），这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型； 2．如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA（ocDNA），此即OC构型； 3．若质粒DNA经过适当的核酸内切限制酶切割之后，发生双链断裂形成线性分子（IDNA），通称L构型（见图4-2）。 在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒DNA，尽管分子量相同，仍具有不同的电泳迁移就绪。其中走在最前沿的是SC DNA，其后依次是L DNA和OC DNA（图4-3）。 凡经改建而适于作为基因克隆载体的所有质粒DNA分子，都必定包括如下三种共同的组成部分，即复制基因（replicator）、选择性记和克隆位点。 二．质粒DNA编码的表型 质粒DNA仅占细胞染色体组的1%～3%左右，但却编码着一些重要的非染色体控制的遗传性状。其中对抗菌素的抗性最质粒的最重要的编码特性之一。

分子克隆载体

分子克隆载体（vector） 载体（vector）是指运载外源DNA有效进入受体细胞内的工具。载体同外源DNA在体外重组成DNA 重组分子，在进入受体后形成一个复制子，即形成在细胞内能独自进行自我复制的遗传因子。重组DNA 技术中最常用的载体有质粒、噬菌体λ，柯斯质粒（cosmid）和噬菌体M13。 载体（vector）是指运载外源DNA有效进入受体细胞内的工具。载体同外源DNA在体外重组成DNA重组分子，在进入受体后形成一个复制子，即形成在细胞内能独自进行自我复制的遗传因子。因此，作为载体应该满足以下几方面的要求：①有某种限制酶的一个切点，最好是有许多种限制酶的切点，而且每种酶的切点只有一个；②外源DNA插入后不影响载体在受体细胞中进行自我复制，载体应对受体细胞无害，以及载体能接纳尽可能大的外源DNA片段；③有利于选择的标记基因，可以很方便地知道外源DNA已经插入，以及把接受了载体的受体细胞选出；④具有促进外源DNA表达的调控区。 重组DNA技术中最常用的载体有质粒、噬菌体λ，柯斯质粒（cosmid）和噬菌体M13。它们的受体细胞都是大肠杆菌。这四种载体的大小和结构尽管各不相同，但它们的共同特点是：①都能在大肠杆菌中自主复制，而且能连同所带的外源DNA一起复制；②都很容易同细菌DNA分开并加以纯化；③都有一段DNA对于它们自身在细菌中的增殖不是必需的。因此，外源DNA可以插入这一段DNA中，或是置换这一段DNA而不影响载体的复制。根据这一特点，载体又可分成插入型和置换型两大类。 质粒能通过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移，可以独立复制，也可整合到细菌染色体DNA中，随着染色体DNA的复制而复制。 载体可以分为：克隆载体、表达载体及穿梭载体。 1.克隆载体(cloning vector):通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。将重组后的载体引入到宿主细胞中，并在宿主细胞中大量繁殖。常见的载体有质粒，噬菌粒，酵母人工染色体。 对载体的要求一种用作克隆载体的理想质粒一般具备下述特点：①具有松驰型复制子（如ColE1），复制子（replicon）是质粒自我增殖所必不可少的基本条件，并可协助维持使每个细胞含有一定数量的质粒拷贝。②在复制子外存在几个单一的酶切位点（或多克隆位点），以便目的DNA片段插入。③具有插入失活的筛选标记，理想的质粒载体应具有两种抗菌素抗性标志，如氨苄青霉素抗性基因（Amp r）和四环素抗性基因（Tet r）等，以便从

克隆载体及其主要功能

.克隆载体及其主要功能 载体是克隆基因的关键组分，载体使重组DNA分子能够在受体细胞中复制。质粒和噬菌体是两种天然的DNA载体。目前，能在不同受体细胞中使用的载体有数百种，其中，可以在大肠杆菌中使用的载体数目最多。 质粒pBR322是一种典型的大肠杆菌克隆载体，它全长仅为4.3kb。pBR322带有两种抗生素抗性基因：b -内酰胺酶基因和四环素抗性基因，前者修饰并消除氨苄青霉素对大肠杆菌的毒性。通常，目的基因插入载体质粒将破坏四环素抗性功能。因此，使用含有氨苄青霉素和四环素的培养基，我们可以鉴别大肠杆菌的转化细胞：带有重组质粒的转化细胞只能在含氨苄青霉素、不含四环素的培养基上生长；另一方面，原受体细胞不能在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上生长；而有载体质粒但没有目的基因的转化细胞能在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上生长。另外，pBR322是一种松弛型质粒，在培养液中加入氯霉素可以使转化细胞中的质粒拷贝数由通常的15个增至1000-3000个，此间，大肠杆菌的染色体并不复制。 在细菌中，噬菌体载体是另外一类常用的克隆载体。和质粒不同的是，噬菌体载体通过感染过程即转导进入宿主大肠杆菌细胞。通常，作为克隆载体的噬菌体，都经过一定的突变和缺失处理。因此，这类噬菌体进入大肠杆菌细胞之后，并不像一般噬菌体那样在宿主染色体上整合，而是直接进入裂解周期：大量复制噬菌体、裂解宿主细胞，最终在培养基上形成含有大量噬菌体拷贝的噬菌斑。 和质粒载体相比，噬菌体载体能够克隆更长的DNA片断。 3.重组克隆筛选 3.1.抗性基因插入失活筛选法 根据抗生素抗性基因插入失活原理而设计的插入失活法是重组体常用的筛选方法。如非重组的pBR322质粒DNA上的四环素和氨苄青霉素抗性基因都是正常的, 表型为AprTcr。带有这种质粒的受体菌可以在加有四环素和氨苄青霉素的双抗性平板上生长。但是, 如果在该质粒的四环素抗性基因内插入外援片段, 就会造成四环素抗性基因失活, 变成AprTcs, 携带这种质粒的宿主菌可以在氨苄青霉素的平板上生长, 而不能在四环素抗性平板上生长。 3.2. 蓝白斑筛选法 根据抗生素抗性基因插入失活原理而设计的插入失活法需要进行菌落平板的影印复制, 才能够将所需的重组体挑选出来, 大大增加了筛选的工作量。后来, 人们设计了以β-半乳糖苷酶的产生作为颜色筛选标记的载体, 简化了筛选程序, 提高了灵敏度。这类载体系统包括M13噬菌体、pUC质粒系统、pEGM质粒系统。它们的共同特点是载体上携带一段细菌的lacZ基因, 它编码β-半乳糖苷酶的一段146个氨基酸的α-肽, 载体转化的受体菌为lacZΔM15基因型。这样, 载体同宿主通过互补, 具有完整的β-半乳糖苷酶的活性。如果在载体的lacZ基

PCR技术克隆目的基因全过程

实验：目的基因克隆（PCR技术） 【课前预习】 PCR (polymerase chain reaction) 反应的基本原理。 【目的要求】 1．学习和掌握PCR 反应的基本原理与实验技术方法。 2．认真完成每一步实验操作，详细记录实验现象和结果并加以分析和总结。 【基本原理】 类似于DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA 经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR 扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA 与引物的退火(复性)：模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA 模板--引物结合物在TaqDNA 聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4 分钟，2～3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。【实验用品】 1．材料：重组质粒DNA作为模板 2．器材和仪器：移液器及吸头，硅烷化的PCR 小管，DNA扩增仪(PE 公司)，琼脂糖凝胶电泳所需设备(电泳槽及电泳仪)，台式高速离心机 3．试剂： ①10×PCR 反应缓冲液：500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris·Cl, 在25℃下, pH9.0, 1.0％Triton X-100。 ②MgCl2 ：25mmol/L。 ③ 4 种dNTP 混合物:每种 2.5mmol/L。 ④Taq DNA聚合酶5U/μl。 ⑤T4 DNA连接酶及连接缓冲液：

目的基因T载体克隆实验步骤

PCR产物的T载体克隆 实验原理 一.重组质粒的构建： 重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2 、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。 DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA 连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP 复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。 很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3’端加上一个突出的碱基A。pUCm-T载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3’端带有一个突出的T。这样，pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对，在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中，形成含有目的片断的重组载体。 连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度，即12-16℃，连接12-16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。 二.感受态制备原理 细菌在0 C CaCl2低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的状态。 三.β-半乳糖甘酶显色反应选择法（蓝白筛选）原理 LacZ基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因，可以编码β—半乳糖核苷酶。β—半乳糖核苷酶是由4个亚基组成的四聚体，可催化乳糖的水解．用X-Gal为底物进行染色时，呈蓝色。 现在一些特定的质粒（比如pUC/pBS等），常带有β—半乳糖核苷酶的调控序列和β—半乳糖核苷酶N端146个氨基酸（α肽段）的编码序列，在这个编码序列里还插入一个多克隆位点（MCS）,它并不影响lacZ的表达。另外，常用的大肠杆菌带有β—半乳糖核苷酶C端部分序列（β肽段），的编码序列。在各自独立的情况下，这些质粒与大肠杆菌各自编码的β—半乳糖核苷酶片段都没有酶的活性。只有当携带α肽编码信息的克隆载体成功进入宿主细胞，在培养基诱导物IPTG的诱导下，载体质粒能够合成β—半乳糖核苷酶N端（α肽段），这样就与宿主细胞合成的β—半乳糖核苷酶C端部分序列（β肽段）互补，形成完整的β—半乳糖核苷酶活性蛋白。 而当外源基因插入到此种载体质粒lacZ的多克隆位点后，会造成lacZ基因不能表达，从而不能合成β—半乳糖核苷酶；而对于空载体，lacZ基因正常表达，通过α互补合成β—半乳糖核苷酶，分解培养基里的色素底物X-gal，最终形成蓝色的化合物，出现蓝色菌斑。

第三章原核生物分子克隆载体

第三章分子克隆载体 §3.1 质粒载体 质粒是独立于寄主染色体以外的自主复制的共价、闭合、环形的双链DNA分子(covalently closed circular DNA, cccDNA)。除了酵母的杀伤质粒(Killer plasmid)是RNA质粒外，所有的质粒都是DNA。但是质粒DNA的复制又必须依赖于寄主提供核酸酶及蛋白质。 质粒DNA分子大小：小的仅有103KD，仅能编码2-3种蛋白质；大的可达105KD，两者相差上百倍。 质粒DNA与寄主染色体DNA间的关系：一般情况下，质粒DNA可持续地处于寄主染色体外的游离状态，但在一定条件下又可以可逆地整合到寄主染色体上，并随之一道复制和细胞分裂而传到后代。 一、质粒的一般特征 1.质粒DNA编码的表型 质粒DNA的分子量较小，仅占细胞染色体的一小部分，一般约为3%，但却编码着重要的遗传性状： a.抗性特征：抗菌素抗性、重金属抗性、毒性阴离子抗性，以及其它抗性。 b.代谢特征：抗菌素及细菌素合成；简单的碳水化合物(例如乳糖、蔗糖等)的新陈代谢；复杂碳水化合物(甲苯、苯胺)及卤代化合物的新陈代谢；蛋白质新陈代谢；…… c.修饰寄主生活方式的因子：大肠杆菌肠毒素的合成；金黄色葡萄球菌剥脱性毒素的合成； 2.质粒DNA的转移 ①接合型质粒和非接合型质粒 *接合型质粒(conjugative plasmid)：又叫自我转移质粒，具有自我复制基因。控制细菌配对和质粒接合转移的基因； *非接合型质粒(non- conjugative plasmid)：亦叫不能自我转移的质粒，具有自我复制基因，但失去了控制细胞配对和接合转移的基因，因此不能够从一个细胞转移到另一个细胞。 ②质粒DNA的转移过程 质粒自主转移 质粒的辅助转移 质粒的重组转移 3.质粒DNA的复制类型 根据寄主细胞中所含拷贝数的多少，讲质粒分为：

目的基因的克隆表达

目的基因的克隆表达 一．PCR 1.原理 DNA在高温时发生解链，温度降低时又可复性成双链。根据DNA的半保留复制原则，通过控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶，dNTP完成特定基因的体外复制。2. 反应体系 LA Taq DNA聚合酶0.25*6=1.5ul 10* buffer 2.5*6=15 ul dNTP 4*6=24 ul P1 1*6=6 ul P2 1*6=6 ul 模板1*5=5 ul 水15.25*6=92 ul 3. 注意事项：先加多的再加少的；模板最后加；设置阴性对照， 不加模板，加入等量的水 4.反应过程 （1）预变性：94℃,1min (2)变性：90℃,30s (3)退火：45-60℃，45 s （4）延伸:72℃,2min (5)2,3,4,5步循环

（6）72℃,10min （7）16℃，保温 二．琼脂糖凝胶电泳 1.原理：若将一种分子置于电场中，它会以一定的速度向适当的电极移动。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。由于琼脂糖凝胶是一种无反应活性的稳定的支持介质，故电泳的迁移率与分子的摩擦系数成反比。已知摩擦系数是分子大小，极性及介质粘度的函数。因此，根据分子大小的不同，构型或形状的差异以及所带的净电荷的多寡，便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。在凝胶电泳中，加入适量的溴乙啶或Glodview染料，它能对核酸分子进行染色，而不与琼脂糖凝胶相结合，然后将电泳标本放在紫外线下观察，可清晰地检测到发出绿色荧光的DNA谱带位置。 2.具体操作 1.制胶 （1）称量0.25g琼脂糖和25ml缓冲液TBE，混合均匀 （缓冲液TBE的作用：用于稳定体系酸碱度，使溶液两极的PH保持基本不变；是溶液具有一定的导电性，利于DNA的迁移） （2）在微波炉中打化，每20s摇一下 （3）按每10ml培养基加0.5 ul的比例加入Glodview核酸染料，使DNA带上绿色荧光标记

目的基因的克隆与及表达

分子生物学大实验—目的基因的克隆与及 表达 第一节基因操作概述 (2) 一、聚合酶链式反应(PCR) (2) 二、质粒概述 (4) 三、凝胶电泳 (5) 四、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 (6) 五、重组质粒的连接 (7) 六、限制性内切酶消化 (7) 七、SDS-PAGE蛋白质电泳 (7) 第二节材料、设备及试剂 (7) 一、材料 (8) 二、设备 (8) 三、试剂： (9) 第三节操作步骤 (10) 一、目的基因的获得： (10) 二、pET-21bT（pET-21bR、pET-21b）载体的获得： (11) 三、pET-21b等与目的片段的连接作用 (12) 四、转化大肠杆菌DH5α进行阳性克隆子筛选与鉴定

(13) 五、转化转化大肠杆菌BL21plyst，摇菌进行SDS-PAGE 电泳。 (14) 六、融合蛋白的毒力测定 (16) 第四节本实验的实验报告 (16)

第一节基因操作概述 一、聚合酶链式反应(PCR) PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。它包括三个基本步骤：(1)变性(Denature)：目的双链DNA片段在94℃下解链；(2)退火(Anneal)：两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对；(3)延伸(Extension)：在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNA为模板进行合成。由这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25～35轮循环就可使DNA 扩增达106倍。 （一）、PCR反应中的主要成份 1、引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：(1)引物长度约为16～30bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费，且难以合成。(2)引物中

目的基因克隆

目的基因的克隆 摘要 基因克隆是经无性繁殖获得基因许多相同拷贝的过程。本实验以水稻基因为模板，通过PCR扩增出1.0bp左右的片段，用SacI、KpnI将片段进行双酶切，与pUC18载体连接获得重组子，将其转化到大肠杆菌感受态细胞中并提质粒酶切验证进行筛选鉴定。 关键词：基因克隆；扩增；连接；转化；酶切 1 引言 蛋白激酶催化的蛋白磷酸化和蛋白磷酸酶催化的去磷酸化作用在植物细胞感受各种环境信号及其信号传导与放大过程中起着重要作用，其中促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)的作用受到广泛重视。本实验旨在筛选并鉴定出水稻MAPK的阳性克隆。 2 材料与方法 2.1 实验材料 2.1.1 试剂和缓冲液 Tag酶，10×PCR Buffer，dNTPs，引物，模板，琼脂糖，溴酚蓝，TE，TAE，EB， DNA marker，质粒，SacI，KpnI，无菌水，乙醇，NaAc，T 4 连接酶，E.coli，CaCl 2 （灭 菌），LB固液体培养基，氨苄青霉素（Amp），溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，70%乙醇。 2.1.2 仪器耗材 PCR仪，掌上离心机，枪头，1.5mL离心管，PCR管，冰盒，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，移液枪一套，微波炉，水浴锅，灭菌锅，Tip，eppendorf管，控温摇床(37℃)，冷冻离心机，冰箱（-20℃、‐70℃），超净工作台，培养箱(37℃)，分光光度计，三角瓶，6cm平皿，酒精灯，三角玻棒，酒精棉球，火柴，制冰机，试管，培养皿，试剂瓶，超净工作台。 2.2 实验方法 2.2.1 目的基因的获得