图位克隆技术在分离植物基因中的应用
收稿日期:1999-06-15;修回日期:2000-01-13基金项目:国家自然科学基金资助项目(39770455)
作者简介:景润春(1971-),男,在读博士研究生,现从事植物发育遗传学研究。
1
图位克隆技术的原理及基本技术环节
现在,分离和克隆发育相关基因的方法有很多,如传统的功能克隆(functional cloning),即根据纯化的已知基因的产物推算其相应的核苷酸序列,再据此序列合成寡聚核苷酸探针从cDNA 文库或基因组文库中钓取目的基因。另外,还有近年来发展十分迅速的表型克隆(p honet yp ical clonin g )
112
,例如
差别筛选法(differential screenin g )122、扣除杂交技术(subtractive h y bridization)132、mRNA 差异显示技术(mRNA differential dis p la y reverse transcription -PCR,DDRT -PCR)
142
、代表性差示分析
(representational difference analysis,RAD)152
、抑制性扣除杂交
(suppression subtractive hybridization,SSH)162等。表型克隆技术都普遍存在着依赖于PCR 技术、重复性较差、假阳性率高、对实验材料要求较高、材料间不能存在过多的差异、结果不便确证等缺点。而且,大多数情况下,我们并不知道基因的表达产物,在未知基因的功能信息又无适宜的相对表型用于表型克隆时,最常用的基因克隆技术有图位克隆(map -based gene
clonin g 或p ositional clonin g )172和转座子标签(trans p oson ta g -g in g )182
技术。转座子标签技术是利用转座子从一个基因座转到另一个基因座引起的插入突变,使插入位置的功能基因失活并诱导产生突变型,从而可以检测突变基因的位置并分离该基因。利用转座子标签技术对尚未发现转座子的植物进行基因克隆时,需要将异源的转座子导入该植物,但由于转座子在不同的植物中转座的频率和活性相差很大,并且需要筛选大量的个体来鉴定转座子突变个体,植物基因组中多拷贝基因的存在还会限制转座子标签技术的应用,因而转座子标签技术的应用范围是十分有限的192
。
图位克隆技术是近几年随着各种植物的分子标记图谱的相继建立而发展起来的一种新的基因克隆技术,是根据功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座,在利用分子标记技术对目的基因进行精细定位的基础上,用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNA 文库(包括YAC 、B AC 、TAC PAC 或Cosmid 文库),从而构建目的基因区域的物理图谱,再利用此物理图谱通过染色体步查(chromosome walking)逐步逼
图位克隆技术在分离植物基因中的应用
景润春,黄青阳,朱英国
(武汉大学发育生物学研究中心武汉大学遗传研究所,武汉430072)
摘要:本文综述图位克隆技术的原理及基本技术环节,并与其它基因克隆技术相比较说明图位克隆技术的优缺
点。本文还对近年来图位克隆技术在分离不同的植物发育基因上的广泛应用进行了简要概述,并对其应用前景和近期的预期进展作出展望。
关键词:图位克隆;基因定位;物理图谱;比较作图中图分类号:Q943.2
文献标识码:A
文章编号:0253-9772(2000)03-0180-06
The A pp lication of Ma p -based Gene Clonin g
Method on Isolatin g Genes of Plants
JI NG Run -chun,HUANG Qin g -y an g ,ZHU Yin g -g uo
(Cen ter of Devel opmental Biology an d In st itu te of Genetics,W uh an Un iversit y ,W uh an 430072,Chin a )
Abstract:I n this review,the principle and basis steps of map -based gene cloning on plant were introduced in de -tail.At the same time,the advantages and disadvantage of the method w ere evaluated as compared with the other
methods.The extensive application of the map -based gene cloning method on cloning genes of different plants in the p ast was also summ arized in brief.The p ros p ect and the ex p ected p ro g ress in several y ears were p ro p osed in this p a p er.
Ke y words:m a p -based g ene clonin g ;g ene ma pp in g ;p h y sical ma p ;com p rative ma pp in g 综述
遗传HEREDITAS (Beijing)22(3):180~1852000
181 3期
近目的基因或通过染色体登陆(chromosome landing)1102的方法最终找到包含该目的基因的克隆,并通过遗传转化试验证实目的基因的功能。而且,随着各种植物的高密度遗传图谱和物理图谱的相继构建成功,图位克隆技术在植物的基因克隆中有着更广阔的应用前景。图位克隆技术主要包括4个基本技术环节:目的基因的初步定位;精细定位;构建目的基因区域的物理图谱和精细物理图谱直至鉴定出包含目的基因的一个较小的基因组片段;筛选cDNA文库并通过遗传转化试验证实所获目的基因的功能和序列分析。
目的基因的初步定位(ma pp in g the tar g et g ene)是利用分子标记技术在一个目标性状的分离群体中把目的基因定位于染色体的一定区域内。分子标记是在DNA双螺旋结构理论的基础上建立起来的一类DNA分子水平的遗传标记技术,常用的有限制性片段长度多态性(restriction fragment length poly-morphism,RFLP)1112、RAPD标记(random amplified polymorphic DNA,RAPD)1122、微卫星标记(microsatellite DNA)1132、AFLP标记(am p lified fra g ment len g th p ol y mor p hism,AFLP)1142。利用这些高效分子标记技术结合使用近等基因系1152或集团分离分析1162就可以快速地把目的基因定位于基因组中某染色体的一定区段上。在初步定位的基础上,接下来就要利用高密度的分子标记连锁图对目的基因区域进行区域高密度分子标记连锁分析以便精细定位(fine ma pp in g或hi g h-resolution ma p-p in g)目的基因。虽然以PCR为基础的分子标记的使用使分析较大群体成为可能,但是,精细定位目的基因仍然是图位克隆策略中最艰苦和最耗时的限速步骤1112。利用侧翼分子标记分析1172和混合样品作图1182可以有效地提高精细定位的效率。侧翼分子标记分析是利用初步定位的目的基因两侧的分子标记来鉴定更大分离群体单株以确定标记与目的基因间发生交换的单株,再用这些单株分析两个标记间的所有分子标记以确定与目的基因连锁最紧密的分子标记。利用侧翼分子标记分析已成功地把番茄的叶霉病基因Cf-2精细定位到40kb的区间1172。混合样品作图是在准确鉴定目的基因的表型的基础上,把大群体中的单株分别混合提取DNA并且用目的基因附近的所有分子标记对混合的DNA样品池进行分析,根据所有池中包含有交换的DNA池的比例来确定与目的基因连锁最紧密的分子标记和目的基因附近所有分子标记的顺序。混合样品作图可以极大地提高分子标记分析效率,减小DNA提取的工作量,有利于扩大群体。
在精细定位目的基因的基础上,就要确定目的基因区域的近似的物理距离和遗传距离的比值(kb/cM),这就要构建目的基因区域的物理图谱(p h y sical ma p)。物理图谱的实质是基因组克隆和DNA片段的染色体顺序排列。物理图谱可以直接为基因座提供DNA片段,还可以为DNA序列分析提供底物。大尺度物理图谱的构建依赖于稀有位点内切酶的发现和脉冲凝胶电泳技术的确立。大尺度物理图谱的构建目前主要用限制性核酸内切酶图谱分析 以PCR为基础的包括STS 在内的分子标记分析和整个克隆间杂交等方法进行。大尺度物理图谱(YAC、B AC等)的建立可以有效地确定分子标记间的真实的物理距离和证实目的基因区域的分子标记顺序。精细物理图谱(Cosmid、K等)为构建目的区域的饱和分子标记连锁图和减少筛选鉴定候选基因的工作量打下基础。当距离目的基因最近的分子标记与目的基因间具有非克隆区段或重复序列时,就要采用染色体跳跃策略(chromosome j um p in g)来逼近目的基因。筛选和鉴定侯选基因克隆是图位克隆策略中最后的环节,一般而言每100kb的基因片段中要包含有上十个的基因,从cDNA文库中筛选这些基因和从这些侯选基因中鉴定出真正的目的基因也绝非易事。近年来,分离基因组大片段DNA编码的cDNA的技术在不断地创新发展。值得注意的是/外显子捕捉01192和/cDNA直接筛选01202技术。/外显子捕捉0是应用RNA剪接因子的识别功能来识别克隆于载体中的基因组DNA片段,载体本身包含有完成剪接事件所必需的剪接信号,如果插入载体中的基因组DNA片段包含有外显子序列和与剪接信号互补的序列,整个剪接事件就可以完成。/cDNA直接筛选0是一种获得区域特异的cDNA克隆的方法,先将YAC BAC Cos质粒固定起来,然与目的基因高丰度表达的cDNA文库杂交,洗除非特异性吸附后再洗脱下特异性杂交的cDNA,并用PCR方法扩增后克隆。由于鉴定的覆盖目的基因区域的大片段基因组DNA中可能包含有多个基因或者由于筛选技术本身的假阳性,所以在用覆盖目的基因区域的大片段基因组DNA克隆筛选区域特异的cDNA后仍需对目的基因编码的cDNA作进一步证实。现有几种方法来证实目的基因编码的cDNA克隆:￥精细作图来证实某候选基因克隆与目标性状共分离;|证实某候选基因克隆的时空表达模式与目标性状的表现相同;§把候选基因序列与现有已知功能基因序列数据库进行同源性比较,推断其功能;¨比较候选基因序列在野生型与突变型之间的差异,确定在野生型与突变型之间变异的cDNA序列;?转化候选基因,进行遗传互补实验,这是最直接的证明1102。随着图位克隆技术的发展,把目前的各种方法综合使用已成为一大趋势,把染色体步查技术(chromosome walking)和染色体登陆技术(chromosome landin g)有机结合,把物理图谱的构建和精细定位目的基因相统一,并且迅速地吸收利用当前出现的象DNA 芯片(DNA chi p)1212这样的先进技术,对图位克隆技术在植物基因克隆中更好地应用也是十分有益的。
2应用图位克隆技术成功克隆的植物基因
自1992年图位克隆技术首先应用在拟南芥(Arabido p sis thaliana)上成功分离ABI31222基因和FAD31232基因以来,已有二十多个植物基因用此技术成功克隆(见表1)。由于抗性基因的遗传行为比较简单而且抗性性状表型也比较容易鉴定,所以克隆的这些基因主要是对病原(真菌、细菌、病毒和寄生虫)的抗性基因(resistance g ene,R g ene)。可以说,目前R基因的分离和克隆基本上代表了图位克隆技术在植物未知产物功能基因克隆上应用的最新进展1242。所有这些抗性基因的分
景润春等:图位克隆技术在分离植物基因中的应用
遗传H EREDIT AS(Bei j in g)200022卷182
离在很大程度上深化了人们对植物抗病分子机理的认识,使病理分子生物学上升到一个新的水平;同时,为人们运用基因工程手段来改良现有的农作物提供了丰富的物质基础,是人类同大自然作斗争的新的武器。目前还有很多拟南芥信号传导通路(p athwa y)基因正在克隆过程中,有的业已取得重大进展,这些基因的克隆也将在一定程度上深化人们对信号传导分子机理的认识。
3图位克隆技术在植物基因克隆中应用的展望
植物在发育过程中除抗病性状外还表现出许多其他性状,尤其是农作物的许多农艺性状的分子机至今远未为人们所了解;然而,目前应用图位克隆术分离到的基因还主要是对病原的抗性基因,至仍未有一个控制农艺性状的基因用图位克隆技术功克隆,在这方面科学家们正在积极努力尝试。
Gorman等人应用图位克隆技术来分离番茄的孢子不育基因ms14,已成功获得一个含ms14基因的入片段为610kb 的YAC克隆,精细定位和筛选DNA文库的工作正在进行中1592。
另外,花时、粒型大小、籽粒分布密度等许多重要的农艺性状都是数量性状,在数量性状定位的准确性和区间作图的精确程度进一步提高的技术条件下,数量性状基因中主效QTL的图位克隆可望在近期内有所突破。
从表1可见,由于较小的基因组,高密度的分子标记连锁图和较稳定成熟的转化系统等原因使现在图位克隆技术
表1至今用图位克隆技术克隆到的植物基因
基因符号基因名称植物突变表型参考文献ABI3脱落酸信号传导基因拟南芥脱落酸不敏感1222 FAD3X-3脂肪酸去饱和酶基因拟南芥亚油酸饱合度降低1232 AXR1生长素信号传导基因拟南芥生长素抗性1252 AXR3生长素信号传导基因拟南芥生长素抗性1262 ETR1乙烯信号传导基因拟南芥乙烯抗性1272 ABI1脱落酸信号传导基因拟南芥脱落酸不敏感128,292 DET1光控发育调节因子基因拟南芥黄化损伤1302 RPS2假单孢菌抗性基因拟南芥抗病131,322 RPS5多种细菌病和霜霉病抗性基因拟南芥抗病1332 RPP1霜霉病抗性基因拟南芥抗病1342 RPP5霜霉病抗性基因拟南芥抗病1352 RPP8霜霉病抗性基因拟南芥抗病1362 RPM1假单孢菌抗性基因拟南芥抗病1372
RS W1纤维素合成酶基因拟南芥纤维素缺乏1382
CO开花促进基因拟南芥促进开花1392
CL V1根 花分生组织大小控制基因拟南芥分生组织大小变异1402 BRI1油菜素内固醇信号传导基因拟南芥油菜素内固醇不敏感1412
N PR1系统获得性抗性基因拟南芥抗性水平提高1422
CO I1茉莉酸酯介导防御和育性基因拟南芥抗性水平提高和育性恢复1432
Pt o青枯病抗性基因番茄抗病1442 Fen青枯病抗性基因番茄抗病1452
Pr f青枯病抗性基因番茄抗病1462
Mi根节线虫抗性基因番茄抗虫1472
Cf-2叶霉病抗性基因番茄抗病1482
C f-4叶霉病抗性基因番茄抗病1492
Cf-5叶霉病抗性基因番茄抗病1502
I2维管枯萎病抗性基因番茄抗病1512
Xa21白叶枯病抗性基因水稻抗病1522
Xa1白叶枯病抗性基因水稻抗病1532
Pi-b稻瘟病抗性基因水稻抗病1542
D1矮生突变基因水稻矮生1552 Mol真菌广谱抗性基因大麦抗病1562 Cre3线虫抗性基因小麦抗虫1572 Hspro-1线虫抗性基因甜菜抗虫1582
183 3期
主要应用于拟南芥、番茄和水稻等模式植物上160,61,622。随着以比较作图为主要手段的比较基因组研究的兴起,可以利用同科异种间染色体的共线性以拟南芥、番茄和水稻为种间图位克隆中介来克隆其他十字花科、茄科和禾本科植物基因163,64,652。甚至是,生产上十分重要的数量性状的基因在同科异种间也有惊人的共线性,同样也可以用种间图位克隆中介来克隆其他同科异种的重要农艺性状的基因。在这方面的研究中也已取得可喜进展,Kleinhofs研究小组一直致力于以水稻为图位克隆中介来克隆大麦杆锈病抗性基因Rpg1和rpg4的研究,并已建立了3.6个分子标记/0.1cM的区域高密度分子标记连锁图而且鉴定了一个覆盖R pg1区域的水稻BAC克隆,精细作图证明一个20kb水稻基因组片段包含R pg1两侧的分子标记,测序结果确证了一个编码膜蛋白的开放阅读框1662。Moore研究小组在以水稻为图位克隆中介来克隆小麦同源染色体配对基因Ph1方面也取得一定进展1672。可以预见,在不久的将来,在比较基因组学中统一遗传系统理论的指导下,在具有高多态性水平的以PCR为基础的分子标记日趋饱和的背景下1682,应用图位克隆技术在植物中,尤其是以水稻为模式植物的几乎包括了所有重要农作物的禾本科植物中必将取得更加辉煌的成果。目前国内在图位克隆植物基因研究方面已取得长足的进步,华中农业大学张启发教授领导的实验室已完成水稻光敏不育基因p ms1、广亲合基因S5、白叶枯病抗性基因Xa22的物理图谱的构建1692。中国科学院遗传研究所李家洋研究员领导的实验室已成功克隆拟南芥代谢型细胞死亡突变体m od1基因,并证明该基因编码脂肪酸合成通路前期合成酶(私人交流)。本实验室也正致力于采用图位克隆策略来克隆水稻野败型细胞质雄性不育恢复基因R f3的研究,现已与国际水稻研究所合作完成构建大尺度物理图谱的工作,由28个BAC克隆组成的重叠群(conti g)成功覆盖目标区域。
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收稿日期:1999-04-08;修回日期:1999-09-27作者简介:范
云(1977-),男,汉族,江西人,硕士,专业:遗传学。
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性状发育中的后生效应
范
云,王金发
(中山大学生命科学学院,广州510275)
摘要:后生效应是近几年才定义清楚的一类现象,指所有那些DNA 序列没有改变的基因表达后体细胞的遗传表型
发生改变的现象。它对生物体的性状发育如性别决定、着丝粒的功能决定、果蝇复眼发育、朊病毒致病性的获得及癌的发生等等方面有着重要的影响。多方面的研究表明,导致后生效应的可能原因主要有四个方面:DNA 的甲基化、组蛋白的乙酰化、染色质结构背景的改变和蛋白质构型的变化。关键词:后生效应;性状发育中图分类号:Q344+.1
文献标识码:A
文章编号:0253-9772(2000)03-0185-04
E p i g enetic Effects in the Develo p ment of Characters
FAN Yun,W ANG Jin -fa
(Sc hool o f Li f e Sc ien ces,Zh on g sh an U niversit y ,Gu an g zh ou 510275,Chin a )
Abstract:E p i g enetic effects,which were defined clearl y in recent y ears,are most often used to denote all those so -maticall y heritable chan g es in g ene ex p ression that do not involve chan g es in DNA se q uence.The y affect the deve -l o p ment of or g anismal characters such as sex determination,the functional determination of centromeres,the develo p -ment of Drasophila p s eys,the prion pathogenicity and cancer formation greatly.Studies on many aspects show that there are four main reasons which cause the epigenetic effects;the methylation of DNA,the acetylation of histones,the change of chromatin structure and the alteration of protein configuration.Ke y words:e p i g enetic effects;the develo p ment of characters
综述
遗传HEREDITAS (Beijing)22(3):185~1882000
基因图位克隆的策略与途径
基因图位克隆的策略与途径 拟南芥(Arabidopsis thaliana)是一种模式植物，具有基因组小(125 Mbp ) 、生长周期短等特点，而且基因组测序差不多完成 (The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000)。同时，拟南芥属十字花科(Cruciferae),具有高等植物的一样特点，拟南芥研究中所取得成果专门容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，专门是十字花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活紧密有关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各国政府的重视。 基因(gene是遗传物质的最差不多单位，也是所有生命活动的基础。不论 要揭示某个基因的功能,依旧要改变某个基因的功能,都必须第一将所要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因克隆的几种常用方法介绍如下。 1 、图位克隆 Map-based cloning, also known as positional cloning, first proposed b y Alan Coulson of the University of Cambridge in 1986, Gene isolated b y this method is based on functional genes in the genome has a relativel y stable loci, in the use of genetic linkage analysis or chromosomal abnor malities of separate groups will queue into the chromosome of a specific location, By constructing high-density molecular linkage map, to find mole cular markers tightly linked with the aimed gene, continued to narrow the candidate region and then clone the gene and to clarify its function and biochemical mechanisms. 用该方法分离基因是按照目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先明白基因的DNA 序列，也无需预先明白其表达产物的有关信息。它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力差不多大大减少了(图1)。
植物基因克隆技术的研究进展
植物基因克隆技术的研究进展 随着科学技术的不断发展，人类基因组计划的不断实施，世界生命科技工作者对于植物基因克隆技术的研究不断进步，近年来，我国在基因克隆技术领域也有了长足的进步，在玉米，小麦，大豆，水稻，拟南芥等植物中，已经克隆了许许多多与植物的产量、品质、抗性及农艺性状等相关的基因。文章主要从基因芯片技术，功能克隆、定位克隆、同源序列克隆、PCR擴增技术分别介绍基因克隆技术的现状以及研究进展。 标签：植物；基因克隆技术；研究 植物基因克隆技术在生命科学技术中扮演着越来越重要的角色，而植物基因克隆技术从传统意义上来讲可分为两种不同的方式。正向以及反向的遗传学方式，正向遗传学途径是一种很早的经典的克隆方法，通过研究突变表型性状进行克隆，包括了功能以及表型克隆等较为基本的克隆的方式；反向遗传学途径和正向遗传学途径截然不同，它是通过一些特殊的方法，获得遗传基因片段，然后经过一系列的定位，将之后所研究的基因逆向研究。如定位克隆，同源序列克隆等。除了这两种克隆技术外，随着社会发展，也有一些新的克隆技术产生。 1 基因芯片技术 基因芯片技术是电子克隆技术的典型代表，基因芯片又称DNA芯片、DNA 微阵列，是以预先设计的方式将大量的基因探针固定在玻片、硅片等固相载体上组成的密集分子阵列。基因芯片技术类似于计算机的电子芯片技术，其具有高通量、微型化、连续化、自动化、快速和准确等特点。是一种随着人类基因组计划的进行而发展出的产物，这一发展使得人类对越来越多的微生物和动植物基因组取得了更长远的认识，对其的研究，是全人类对于基因组认识做出的不断地努力的成果，其中不乏许多典型的实例，用cDNA芯片技术对草莓、矮牵牛其基因是如何进行表达的进行研究，进而实现对转基因植物进行形状的观察及控制，可以更好的获悉分子对于基因表达是如何作用以及影响的也有利于获得更为优异更为良好的作物[1]。 基因芯片技术是一种新型的克隆技术，是科技创新和生命科学的很好的结合，代表着人类在基因的克隆方面进展和成就，解决了很多传统克隆不能解决的问题，也讲基因克隆技术引向一种新的思维模式。 2 功能克隆 功能克隆是人类采用最早的基因克隆策略，功能克隆技术从已知蛋白质的功能着手进行研究，其方法原理是先测知基因的编码蛋白质，利用它的信使RNA 进行反转录成cRNA，再利用cDNA做探针，从基因组中获取基因本身，进而完成克隆。
【高中生物】功能基因的克隆及生物信息学分析
（生物科技行业）功能基因的克隆及生物信息学分析
功能基因的克隆及其生物信息学分析 摘要：随着多种生物全基因组序列的获得，基因组研究正从结构基因组学（structuralgenomics）转向功能基因组学(functionalgenomics)的整体研究。功能基因组学利用结构基因组学研究获得的大量数据与信息评价基因功能(包括生化功能、细胞功能、发育功能、适应功能等)，其主要手段结合了高通量的大规模的实验方法、统计和计算机分析技术[1]，它代表了基因分析的新阶段，已成为21世纪国际生命科学研究的前沿。功能基因组学是利用基因组测序获得的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使生物学研究从对单一基因或蛋白的研究转向多个基因或蛋白同时进行系统的研究，是在基因组静态的组成序列基础上转入对基因组动态的生物学功能学研究[2]。如何研究功能基因，也成为我们面临的一个课题，本文就克隆和生物信息学分析在研究功能基因方面的应用做一个简要的阐述。 关键词：功能基因、克隆、生物信息学分析。 1.功能基因的克隆 1.1图位克隆方法 图位克隆又称定位克隆，它是根据目标基因在染色体上确切位置，寻找与其紧密连锁的分子标记，筛选BCA克隆，通过染色体步移法逐步逼近目的基因区域，根据测序结果或用BAC、YAC克隆筛选cDNA表达文库寻找候选基因，得到候选基因后再确定目标基因。优点是无需掌握基因产物的任何信息，从突变体开始，逐步找到基因，最后证实该基因就是造成突变的原因。通过图位克隆许多
控制质量性状的单基因得以克隆，最近也有报道某些控制数量性状的主效基因（控制蕃茄果实大小的基因克隆[3]、控制水稻成熟后稻谷脱落基因克隆[4]以及小麦VRN2基因克隆[5]等）也通过图位克隆法获得。 1.2同源序列克隆目的基因 首先根据已知的基因序列设计PCR引物，在已知材料中扩增到该片段，并经克隆测序验证，利用放射性同位素标记或其他非同位素标记该PCR片段作为探针，与待研究材料的cDNA文库杂交，就可以获得该基因cDNA克隆，利用克隆进一步筛选基因组文库，挑选阳性克隆，亚克隆并测序，从中就可以筛选到该基因的完整序列。 1.3结合连锁和连锁不平衡的分析方法 结合连锁和连锁不平衡的分析方法是未知基因克隆研究领域发展的新方向[6]。(Linkagedisequilibrium,LD)。与连锁分析不同,连锁不平衡分析可以利用自然群体中历史发生的重组事件。历史上发生的重组使连锁的标记渐渐分布到不同的同源染色体上,这样就只有相隔很近的标记才能不被重组掉,从而形成大小不同的单倍型片段(Haplotypeblock)。这样经过很多世代的重组,只有相隔很近的基因,才能仍处在相同的原始单倍型片段上,基因间的连锁不平衡才能依然存在。所以基于连锁不平衡分析,可以实现目的基因的精细定位。林木大多为自由授粉的异交物种,所以连锁不平衡程度很低,林木基因组中的LD可能会仅局限于非常小的区域,这就为目的基因的精细定位提供了可能,结合SNP检测技术,科学家甚至可以将效应位点直接与单个的核苷酸突变关联起来,进行数量性状寡核苷酸
植物基因克隆实验指导
植物基因克隆实验规则 一、植物基因克隆实验课的目标 根据基因克隆实验操作的整体性和连贯性特点, 将该实验设计为综合性实验课程，实验内容设计上完全抛弃了原来分散的、孤立的单纯学习某一实验技术的缺陷, 将单个实验综合为系统的、连贯的系列型大实验，注重科研成果在教学中的应用，我们从以往的科研项目中选取了部分研究内容用于学生的综合性实验教学，这是基于教学实验与实际科学研究实验之间的新的实验教学模式。 整套实验围绕洋甘菊倍半萜生物合成途径中关键酶基因HMGR的克隆这一研究课题进 行操作, 设计的实验内容具有极强的连续性和综合性，让学生在独立实践操作中学习基因克隆的基本研究方法和体会科学研究的严密逻辑和培养科研理念。 我们将实验内容设置为8个部分, 实验内容前后衔接紧密, 环环相扣, 不可分割, 前一个实验的结果是下一个实验的材料。该课程使学生获得了整个类似科研实践过程的训练和体验, 学习了从事科研工作的基本功, 对完成自己的毕业论文及将来从事生命科学研究奠定了科 研基础。 二、实验的进行程序和要求 1、预习学生在课前应认真预习实验指导以及教材有关章节，必须对该次实验的目的要求、实验内容、基本原理和操作方法有一定的了解。 2、讲解教师对该实验内容的安排及注意事项进行讲解，让学生有充分的时间按实验指导的要求进行独立操作与观察。 3、独立操作与观察除个别实验分组进行外，一般由学生个人独立进行操作和观察。在实验中要按实验指导认真操作，仔细观察，作好记录。有关基本技能的训练，要按操作程序反复练习，以达到一定的熟练程度。
4、演示每次的实验都备有演示内容，其目的是帮助学生了解某些实验中的难点，扩大在实验课有限时间内获得更多感性知识的机会。 5、作业实验报告参照硕士毕业论文的格式写，必须强调科学性，实事求是地记录、分析、综合。在实验结束时呈交。 6、小结每次实验结束后，由师生共同小结本次实验的主要收获及今后应注意的问题。 三、实验规则和注意事项 1、每次上课前，必须认真阅读实验指导，明确本次实验的目的要求、实验原理和注意事项，熟悉实验内容、方法和步骤。 2、上实验课时必须携带实验指导、记录本及文具等。进入实验室要按规定座位入座。 3、实验时要遵守纪律，听从教师指导，保持肃静。有问题时举手提问，严禁彼此谈笑喧或随意走动，也不得私自进行其他活动。 4、实验时要遵守实验操作规程，严格按照教师的安排和实验指导的要求进行。操作观察要认真仔细，边做、边看、边想，认真做好实验记录。 5、要爱护仪器和器材设备，注意节约实验材料、药品和水电。如有损坏器材应立即报告并主动登记、说明情况。 6、实验结束后，应清理实验台面，认真清理好仪器、药品及其他用品，放回原处，放好凳子，方可离开实验室。值日生要负责清扫地面，收拾实验用品，处理垃圾，关好水、电、门窗后再离开。
拟南芥的图位克隆技术
拟南芥基因的图位克隆技术 浙江大学生命科学学院徐冰 浙江杭州310029 1 国内外研究现状 拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，具有基因组小（125 Mbp）、生长周期短等特点，而且基因组测序已经完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。同时，拟南芥属十字花科（Cruciferae），具有高等植物的一般特点，拟南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，特别是十字花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活密切相关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各国ZF的重视。 从遗传学的观点来看，基因克隆的途径可概括为正向遗传学和反向遗传学两种。正向遗传学途径指的是通过被克隆基因的产物或表现型突变去进行；反向遗传学途径则指的是依据被克隆基因在染色体上的位置来实现。虽然一些模式生物（如拟南芥）的基因组测序已经完成，但还有40%的基因（在拟南芥中）的功能还是未知的。 图1 图位克隆所需努力的比较（1995年和2002年）（Jander等，2002） 图位克隆（map-based cloning）又称定位克隆（positional cloning），1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出（Coulson等，1986），用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力已经大大减少了（图1）。 目前完成整个拟南芥的图位克隆过程大约需要一年时间。在这个过程中，我们从筛选突变体开始，逐渐找到和表型相关的基因。这和反向遗传学的方法正好相反。图位克隆能实现，关键在于全基因组测序计划的完成和各种分子标记的发现。这些数据被储存在专门的数据库中
植物基因的克隆｜植物基因克隆的基本步骤
植物基因的克隆 08医用二班姚桂鹏0807508245 简介 克隆（clone）是指一个细胞或一个生物个体无性繁殖所产生的后代群体。通常所说的基因克隆是指基于大肠埃希菌的DNA片段（或基因）的扩增，主要过程包括目标DNA的获取、重组载体的构建、受体细胞的转化以及重组细胞的筛选和繁殖等。本文主要介绍植物基因的特点、基因克隆的载体、基因克隆的工具酶、基因克隆的策略以及植物目的基因的分离克隆方法等内容。 关键词 植物基因基因克隆载体工具酶克隆策略分离克隆方法 Plant gene cloning Introduction Cloning (clone) refers to a cell or an individual organisms asexual reproduction produced offspring. Usually said cloning genes means
based on escherichia coli segment of DNA (or genes), including the main course target DNA, restructuring of the carrier, transformation of receptor cells and reorganization of screening and reproductive cells. This paper mainly introduces the characteristics of plant gene and gene cloning and carrier, gene clone tool enzyme, gene cloning and plant gene strategy of separation cloning method, etc. Keywords Plant gene cloning tool enzyme gene cloning vector method of separation of cloning strategy 一、植物基因的结构和功能 基因（gene）是核酸分子中包含了遗传信息的遗传单位。一般来说，植物基因都可分为转录区和非转录的调控区两部分。 （一）植物基因的启动子 启动子（promoter）是指在位于结构基因上游决定基因转录起始的区域，植物积阴德启动子包括三个较重要的区域，一时转录起始位点，而是转录起始位点上游25~40bp的区域，三是转录起始位点上游-75bp处或更远些的区域。 （二）植物基因的增强子序列
4植物基因克隆的策略与方法
4植物基因克隆的策略与方法 基因的克隆确实是利用体外重组技术,将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中。基因克隆的要紧目标是识不、分离特异基因并获得基因的完整的全序列,确定染色体定位,阐明基因的生化功能,明确其对特定性状的遗传操纵关系。通过几十年的努力由于植物发育,生理生化,分子遗传等学科的迅速进展,使人们把握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识,再运用先进的酶学和生物学技术差不多克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆,育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。我们实验室对天麻抗真菌蛋白基因作了功能克隆的研究(舒群芳等,1995;舒群芳等,19 97),为了克隆植物基因也探讨了其它克隆方法,本文论述基因克隆的策略、方法及取得的一些进展。 1功能克隆(functional Cloning) 功能克隆确实是按照性状的差不多生化特性这一功能信息,在鉴定和已知基因的功能后克隆(Collis,1995)。其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库,DNA文库中基因的选择按照情形要紧可用二种方法进行,(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,据此合成寡核苷酸探针 从cDNA库或基因组文库中选择编码基因,(2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针,从cDNA入载体表达库中选择相应克隆。功能克隆是一种经典的基因克隆策略,专门多基因的分离利用这种策略。 Hain等从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯乙烯合成酶基因(Vst1和Vst2),葡萄中抗菌化合物白藜芦醇的存在,能够提升对灰质葡萄孢(B otrytis cinerce)的抗性,在烟草和其它一些植物中无二苯乙烯合成酶,因此克隆该基因通过转基因后,对有些植物产生对灰质葡萄孢的抗性专门有意义(H ain等,1985)。Kondo等1989年对编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的基因组DN A做了克隆和序列分析(Kondo等,1989)。周兆斓等构建了水稻cDNA文库,分离了编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的cDNA(周兆斓等,1996)。植物蛋白酶抑制剂是一类天然的抗虫物质,它可抑制摄食害虫对蛋白质的消化,使害虫因 缺乏所需氨基酸而导致非正常发育或死亡。胡天华等人从烟草中分离出流行于我国的黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic virus)(CMV),并克隆了编码该
植物基因克隆
来自dxy 22003luocong 植物基因全长克隆几种方法的比较 基因是遗传物质基本的功能单位，分离和克隆目的基因是研究基因结构、揭示基因功能及表达的基础，因此，克隆某个功能基因是生物工程及分子生物学研究的一个重点。经典克隆未知基因的方法比如通过筛选文库等有个共同的弊病, 即实验操作繁琐, 周期较长、工作量繁重,且不易得到全长序列。又由于在不同植物中目的基因mRNA丰度不同，所以获得目的基因的难易程度又不一样，特别是对于丰度比较低的目的基因即使使用不用的方法也不一定能获得成功。近年来随着PCR技术的快速发展和成熟.已经有多种方法可以获得基因的全长序列, 比如经典的RACE技术，染色体步移法和同源克隆法等，本文主要综述几种重要的克隆方法的原理和运用，并且比较分析这几种方法的优缺点，为你的实验节约时间和成本。 1 RACE技术 1985年由美国PE-Cetus公司的科学家Mulis等[1]发明的PCR技术使生命科学得到了飞跃性的发展。1988年Frohman等[2] 在PCR技术的基础上发明了一项新技术, 即cDNA末端快速扩增技术( rapid amplification of cDNA ends, RACE), 其实质是长距PCR( long distance, PCR)。通过PCR由已知的部分cDNA 序列, 获得5′端和3′端完整的cDNA, 该方法也被称为锚定PCR ( anchored PCR) [3] 和单边PCR( one-sidePCR) [4]。RACE技术又分为3?RACE和5?端RACE。3′RACE 的原理是利用mRNA 的3′端天然的poly(A) 尾巴作为一个引物结合位点进行PCR, 以Oligo( dT) 和一个接头组成的接头引物( adaptor primer, AP)反转录mRNA得到加接头的第一链cDNA。然后用一个正向的基因特异性引物( gene-specific primer, GSP) 和一个含有接头序列的引物分别与已知序列区和poly(A) 尾区退火, 经PCR扩增位于已知序列区域和poly( A) 尾区之间的未知序列，若为了防止非特异性条带的产生, 可采用巢式引物( nested primer) 进行第二轮扩增, 即巢式PCR( nested PCR) [5，6]。5?RACE 跟3?RACE原理基本一样，但是相对于3?RACE来说难度较大。 5'-RACE受到诸多因素的影响而常常不能获取全长，因此研究者都着手改进它。这些措施主要是通过逆转录酶、5'接头引物等的改变来实现的，因此出现了包括基于“模板跳转反转录”的SMART RACE技术( switching mechanism at 5′ end of RNA transcript) [7] , 基于5′脱帽和RNA酶连接技术的RLM-RACE技术(RNA ligase mediated RACE)[8], 利用RNA连接酶为cDNA第一链接上寡聚核苷酸接头的SLC RACE技术(single strand ligation to single-stranded cDNA)[9] , 以及以内部环化的cDNA第一链为模板进行扩增的自连接或环化RACE技术(self-ligation RACE or circular RACE)[10]，和通过末端脱氧核苷酸转移酶( TdT)加尾后引入锚定引物的锚定RACE技术( anchored RACE)[11]。 笔者主要介绍两种比较新的RACE技术，基于…模板跳转?的SMART RACE 技术和末端脱氧核苷酸转移酶( TdT)加尾技术。 1.1基于‘模板跳转’的SMART RACE技术[7，12]
植物基因克隆的策略与方法
植物基因克隆的策略与方法 基因的克隆就是利用体外重组技术,将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中。基因克隆的主要目标是识别、分离特异基因并获得基因的完整的全序列,确定染色体定位,阐明基因的生化功能,明确其对特定性状的遗传控制关系。通过几十年的努力由于植物发育,生理生化,分子遗传等学科的迅速发展,使人们掌握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识,再运用先进的酶学和生物学技术已经克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆,育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。我们实验室对天麻抗真菌蛋白基因作了功能克隆的研究(舒群芳等,1995;舒群芳等,1997),为了克隆植物基因也探讨了其它克隆方法,本文论述基因克隆的策略、方法及取得的一些进展。 1 功能克隆(functional Cloning) 功能克隆就是根据性状的基本生化特性这一功能信息,在鉴定和已知基因的功能后克隆(Collis,1995)。其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库,DNA文库中基因的筛选根据情况主要可用二种办法进行,(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,据此合成寡核苷酸探针从cDNA库或基因组文库中筛选编码基因,(2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针,从cDNA入载体表达库中筛选相应克隆。功能克隆是一种经典的基因克隆策略,很多基因的分离利用这种策略。 Hain等从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯乙烯合成酶基因(Vst1和Vst2),葡萄中抗菌化合物白藜芦醇的存在,可以提高对灰质葡萄孢(Botrytis cinerce)的抗性,在烟草和其它一些植物中无二苯乙烯合成酶,因此
功能基因的克隆及生物信息学分析
功能基因的克隆及其生物信息学分析 摘要：随着多种生物全基因组序列的获得，基因组研究正从结构基因组学（structural genomics）转向功能基因组学(functional genomics)的整体研究。功能基因组学利用结构基因组学研究获得的大量数据与信息评价基因功能(包括生化功能、细胞功能、发育功能、适应功能等)，其主要手段结合了高通量的大规模的实验方法、统计和计算机分析技术[1]，它代表了基因分析的新阶段，已成为21世纪国际生命科学研究的前沿。功能基因组学是利用基因组测序获得的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使生物学研究从对单一基因或蛋白的研究转向多个基因或蛋白同时进行系统的研究，是在基因组静态的组成序列基础上转入对基因组动态的生物学功能学研究[2]。如何研究功能基因，也成为我们面临的一个课题，本文就克隆和生物信息学分析在研究功能基因方面的应用做一个简要的阐述。 关键词：功能基因、克隆、生物信息学分析。 1.功能基因的克隆 1.1 图位克隆方法 图位克隆又称定位克隆，它是根据目标基因在染色体上确切位置，寻找与其紧密连锁的分子标记，筛选BCA克隆，通过染色体步移法逐步逼近目的基因区域，根据测序结果或用BAC、YAC克隆筛选cDNA表达文库寻找候选基因，得到候选基因后再确定目标基因。优点是无需掌握基因产物的任何信息，从突变体开始，逐步找到基因，最后证实该基因就是造成突变的原因。通过图位克隆许多控制质量性状的单基因得以克隆，最近也有报道某些控制数量性状的主效基因（控制蕃茄果实大小的基因克隆[3]、控制水稻成熟后稻谷脱落基因克隆[4]以及小麦VRN2 基因克隆[5]等）也通过图位克隆法获得。
图位克隆基因研究进展
图位克隆基因研究进展 宋成标 摘要图位克隆是在不清楚基因产物结构和功能的情况下，根据基因在染色体上都有稳定的基因座实现的。随着各种分子标记技术和高质量基因组文库构建技术的发展，图位克隆现已经成为分离生物体基因的一种常规技术。本文主要概述了图位克隆的一般步骤，包括目的基因的初步定位、精细定位和遗传做图、染色体步行和登陆及利用功能互补实验鉴定目的基因。最后，对图位克隆技术存在的局限和发展前景作了初步的分析。 关键词图位克隆, 分子标记, 精细定位, 基因组文库 Abstract Map-based cloning is based on the functional genes have their particular gene locus on chromosomes,when we know about the structure and function of gene products unclearly.With the rapid development of molecular marker technologies and constructing high quality genomic library technologies, map-based cloning had already become a common bio—technique for gene isolation. This article summarized mainly the processes of the map-based cloning in principle,including first-pass mapping of candidate gene、fine scale-mapping and building genetic map、chromosome walking or landing and finally complement experiment for identifing candidate gene. Finally the problems and the prospects in the map-based cloning are analyzed Keywords Map-based cloning, Molecular marker, Fine maping, Genomic library 从遗传学观点来看，基因克隆有两条途径：正向遗传学途径和反向遗传学途径。正向遗传学途径指的是通过被克隆基因的产物或表型突变去进行，如传统的功能克隆及近年来迅速发展的表型克隆；反向遗传学途径是根据被克隆的目的基因在染色体上都有稳定的位置来实现的。由于在多数情况下，我们并不清楚基因产物的结构和功能，很难通过正向遗传学途径克隆基因，而反向遗传学途径则显示了较好的前景。其中可以利用的主要有三种方法，分别是转座子标签法、随机突变体筛选法和图位克隆法。转座子标签法中受转座子的种类、转座频率及有些植物存在内源转座子等的影响，随机突变体筛选法则随机性较大且不能控制失活基因的种类和数量等，限制了它们的应用。图位克隆（map-based cloning）又称为定位克隆（positional cloning），1986年首先由剑桥大学的Coulson 等提出，用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。随着模式物种（拟南芥、水稻）全基因组测序的完成，各种分子标记技术的发展促进了高密度分子标记连锁图谱的建立和各种数据库的完善。图位克隆技术越来越成熟，已经成为分离生物基因的一种常规方法。本文将对图位克隆技术的相关策略作一介绍。 1图位克隆的策略 自1992年图位克隆技术首次在拟南芥中克隆到ABI3(Girauda et al., 1992)基因和F AD3 (Arondel et al., 1992)基因以来，图位克隆技术在其它相关技术快速发展的支持下迅速发展起来。它是依据功能基因在生物基因组中都有相对稳定的基因座，在利用分子标记技术对目的基因进行精细定位的基础上，用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选已构建的DNA文库（如Cosmid、YAC、BAC等文库），构建出目的基因区域的遗传图谱和物理图谱，再利用此物理图谱通过染色体步行、跳跃或登陆的方式获得含有目的基因的克隆，最后通过遗传转化和功能互补实验来验证所获得的目的基因（图1）。 初步定位（First-pass maping）-------构建遗传图谱（constructing genetic map）-----精细定位（fine maping）---------构建物理图谱( constructing physical map)------染色体步移、登陆（chromosomal walking、landing）-------确定侯选基因（Consider candidate genes）----遗传互补验证目的基因（Through genetic complementation (transformation) to identify candidate gene）（请帮我画一个简易图表，把内容填进去） 图1 图位克隆的主要步骤 Figure 1 Key steps in map-based cloning process
基因图位克隆的策略与途径拟南芥
基因图位克隆的策略与途 径拟南芥 Ting Bao was revised on January 6, 20021
拟南芥基因克隆的策略与途径 拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，具有基因组小（125 Mbp）、生长周期短等特点，而且基因组测序已经完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。同时，拟南芥属十字花科（Cruciferae），具有高等植 物的一般特点，拟南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，特别是 十字花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活密切相关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物 学及各国政府的重视。 基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的 功能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因克隆 的几种常用方法介绍如下。 1、图位克隆 Map-based cloning, also known as positional cloning, first proposed by Alan Coulson of the University of Cambridge in 1986, Gene isolated by this method is based on functional genes in the genome has a relatively stable loci, in the use of genetic linkage analysis or chromosomal abnormalities of separate groups will queue into the chromosome of a specific location, By constructing high-density molecular linkage map, to find molecular markers tightly linked with the aimed gene, continued to narrow the candidate region and then clone the gene and to clarify its function and biochemical mechanisms.图位（map-based clonig）又称克隆（positoinal cloning），1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出。用该方法分离基因是根据功能基因在中都有相对较稳定的基因座，在利用分离群体的遗传连锁分析或将基因伫到染色体的1 个具体位置的基础上，通过构建高密度的分子连锁图，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，不断缩小候选区域进而克隆该基因，并阐明其功能和生化。 用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力已经大大减少了（图1）。
什么是克隆植物的克隆教案-浙科版高中生物选修3
第一节什么是克隆第二节植物的克隆 课标解读 重点难点 1.比较有性繁殖与无性繁殖，简述克隆的含义。 2.通过举例，概述克隆的基本条件。 3.结合单细胞培养成完整植株的示意图，理解细胞的全能性 及简述植物组织培养的程序。 4.联系植物克隆的实例，阐明植物克隆的概念、成就及应用 前景。 1.克隆的定义及其基本条 件。(重点) 2.植物细胞的全能性的含 义。(重点) 3.植物组织培养。(重难点) 无性繁殖与克隆 1.克隆就是无性繁殖，即只要不通过两个分子、两个细胞或两个个体的结合，只由一个模板分子、母细胞或母体直接形成新一代分子、细胞或个体。 2．在分子水平上，基因克隆是指某种目的基因的复制、分离过程。 3．在细胞水平上，细胞克隆技术应用在杂交瘤制备单克隆抗体的操作中。 4．在个体水平上，植物可由母体的特定部位或结构产生新个体，而动物的克隆较复杂，经历了由胚胎细胞克隆到体细胞克隆的发展过程。 5．克隆的基本条件：具有完整基因组的细胞核的活细胞；能有效调控细胞核发育的细胞质物质；完成胚胎发育的必要的环境条件。 1．克隆技术的发展经历了哪几个阶段？请尝试举例加以说明。 【提示】微生物克隆，如菌落的形成；遗传工程克隆，如DNA克隆或基因克隆；个体水平上克隆，如克隆动物。 植物细胞的全能性 1.基本含义：植物体的每一个生活细胞，都具有发育成完整植株的潜能。 2．全能性的原因：每个细胞都含有本物种所特有的全套遗传物质。 3．特点：不同植物或同种植物不同基因型个体间，细胞全能性的表达程度大不相同。 2．有人说只要找到秋海棠的一个细胞，就能再生出秋海棠，这依据的生物学原理是什么？ 【提示】能让一个细胞发育成一个个体，依据的是细胞的全能性。
植物基因克隆技术及其发展方向
植物基因克隆技术及其发展方向 摘要：基因是染色体上具有一定座位的遗传单位，是DNA分子中一定长度的核苷酸序列。植物的生长发育是在多种代谢和生理过程基础上所发生的基因在时空上表达的综合现象，开发和分离潜在的各种有价值的基因并深入研究其表达机理，对作物品种的改良具有重要意义。因此对植物基因的克隆并发展与之相关的技术已引起人们的日益关注和投入，近年来其研究方法不断改进，新技术不断涌现，这为进一步研究诸如各种调节植物生长发育的基因、逆境与防御反应的基因、植物细胞凋亡的基因等提供了新的途径。 关键词：植物基因克隆基因植物基因转化 正文: 植物基因的克隆技术是生命科学研究的重要组成部分,是现代生命科学技术中最核心的内容,它是随着20世纪70年代初DNA体外重组技术的发明而发展起来的,其目标是识别和分离特异基因并获得基因完整序列,确定其在染色体上的位置,阐明其生化功能,并利用生物工程手段应用到生产实践中。 一、常用的目的基因克隆技术 1、1、通过已知基因产物的分析和鉴定 这类技术主要通过生物化学和病理学研究分离鉴定有关基因的蛋白产物，并对蛋白质氨基酸顺序进行分析，推断出编码该蛋白质的基因序列，然后通过抗体、寡聚核苷酸探针或PCR制备的探针对文库进行筛选来分离目的基因。如植物抗病虫基因工程中常用的苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因（Bt基因）、豇豆胰蛋白酶抑制基因（CpTI 基因）、病毒外壳蛋白基因（CP基因）等。当其他植物的同类基因已分离到并且核苷酸序列保守性较高时，也可直接用这些已知的基因片段作探针对未克隆到该基因的植物基因文库进行筛选，也可分离到未知的新基因。 2、通过遗传表型分析 （1）基因标鉴法。该法是利用转座子或T-DNA插入植物的基因组中引起某一基因失活产生一些突变体，然后用相应转座子或T-DNA 对突变体文库进行筛选，以选到的阳性克隆片段为探针，再筛选野生型植物因文库分离目的基因。如将一株带有功能的转位因子系统的植物与另一株在遗传上有差异的同种植物杂交，在杂交后代中筛选由于转位因子插入到某一特定基因序列中导致表型破坏或改变的突变株，用该纯合突变株构建基因文库，然后将转位因子用同位素标记作探针，从该文库中筛选出带有同源转位因子的目的基因。该法主要限于
水稻基因的图位克隆技术
水稻基因的图位克隆技术 吴自明 (江西农业大学,作物生理生态与遗传育种教育部重点实验室,农业部双季稻生理生态与栽培重点实验室,江西省作物生理生态与遗 传育种重点实验室,江西南昌330045) 摘要 综述了水稻图位克隆技术的原理、技术环节及其在水稻基因克隆上的应用,分析了当前存在的主要问题,并对其应用前景作出了展望。 关键词 水稻;图位克隆;基因 中图分类号 S 511 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2008)34-14905-02 Map based C lo ning T echnique of R ice Genes WU Zi m ing (Key Laboratory of C rop Ph ysiology,Ecol ogy and Genetic B reeding,Mi nistry of Ed ucation,Key Laboratory of Ph ysiology,Ecology and C ultivati on of Double C roppin g Rice,Mini stry of Agriculture,Key Lab oratory of Crop Physi ology,Ecology an d Genetic Breedin g of Jian gxi Province,Jiangxi Agricultural Uni versi ty,Nanchang,Jiangxi 330045)Abstract The p rinciple an d tech nical links of m ap based gene cloni ng techniq ue i n rice an d its applications in the gene cloni ng of rice were s um ma rized .And the mai n existing problems at present were analyzed .And its applicati on foregrou nd was p redicted.Key w ords Rice;Map based cloni ng;Gene 基金项目 江西省教育厅项目(GJJ09477);江西农业大学博士启动基 金;江西农业大学校自然科学基金。 作者简介 吴自明(1974-),男,江西鄱阳人,副教授,从事植物分子 生物学研究。 收稿日期 2008 10 06 近年来,水稻基因组研究进展非常迅速,高密度遗传图谱和物理图谱的构建,全基因组序列的公布,数以万计ES T 、全长c DN A 等序列及功能分析数据的释放以及新型水稻分子标记及其高效检测技术的发展等,为基因的图位克隆带来了新的思路和方法。同时,这些新的进展也能够使基因的精细定位和物理图谱构建等相关工作大大简化,使基因的图位克隆朝着更加简便、快速的方向发展。1 图位克隆技术原理 图位克隆(Ma p based Cloning)又称定位克隆(Positional Cloning),1986年首先由剑桥大学的Alan Co ulson 提出[1]。用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行,无需预先知道基因的D N A 序列,也无需预先知道其表达产物的有关信息,而是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。实现基因图位克隆的关键是筛选与目标基因连锁的分子标记。 近几年来,水稻各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的日趋完善,在很大程度上得益于以粳稻日本晴和籼稻9311为代表的基因组测序的完成[2-3]。目前已有几十种技术可用于分子标记筛选,其中最常用的是简单序列长度多态性(SSLPs)、单核苷酸多态性(SNPs)和插入缺失多态性(Inser tio n/Deletio n,InDel)[4-7]。Shen 等利用日本晴和9311基因组序列构建了水稻基因组水平的D NA 多态性数据库,其中包括1703176个单核苷酸多态性(Single Nucleo tide Polymor phis m,SNP)和479406个插入缺失多态性(InDel)[8]。Fe ltus 等通过对除去多重拷贝序列及低质量序列后的日本晴和9311基因组草图的比对分析,得到408898个D N A 多态性,包括SNP 和单碱基I nD el [9],这些差别的核苷酸通常位于非编码区[10]。 目前,常把SNP 多态性转化成基于P CR 的剪切扩增多态性(Cle ave d Amplified P olymorphic Se que nc es,CAPS)或CAPS 衍生的dCAPS 标记[11-12]。CAPS 标记是PCR 反应和酶切相结 合产生的一种分子标记。如果不同材料间在PCR 扩增区域有S NP 位点,且该位点是限制性内切酶作用位点,那么不同 材料的PCR 扩增产物经特定的酶切后,再进行琼脂糖凝胶电泳就会表现多态性。当SNP 恰好位于限制性酶切位点比较少时,这种情况可以在CAPS 标记的基础上通过在扩增引物中引入错配碱基,则可以结合SNP 位点引入新的限制性内切酶作用位点,产生和CAPS 标记类似的多态性,这就是dCAPS 的方法。用CAPS 或dCAPS 的方法则可以将几乎所有的SNP 位点转化成以P CR 为基础的分子标记[12] 。 2 图位克隆技术环节 2.1 构建遗传作图群体 对于基因图位克隆而言,构建特殊的遗传作图群体是筛选与目标基因紧密连锁分子标记的关键环节。常用的作图群体有F 2、近等基因系、重组自交系等群体,水稻常用F 2群体。创建F 2群体应注意优先选择基因组已测序的日本晴、9311和培矮64S 等品种为亲本之一。2.2 基因初定位 一般说来,当标记为显性遗传时,欲获得最大遗传信息量的F 2群体,需借助于进一步子代测验,以分辨F 2中的杂合体。为此,Mic helmo re 等发明分离群体分组分析法(Bulke d Se gre ga nt Ana lysis,BS A)以筛选目标基因所在局部区域的分子标记[13]。其原理是将目标基因的F 2(或BC)代分离群体各个体仅以目标基因所控制的性状按双亲表型分为2群,每一群中各个体D N A 等量混合,形成2个D N A 混合池(如抗病和感病、不育和可育),并且用目的基因附近的所有分子标记对混合D NA 样品池进行分析,根据所有池中包含有交换的DN A 池的比例来确定与目的基因连锁最紧密的分子标记和目的基因附近所有分子标记的顺序。混合样品作图可以极大提高分子标记分析效率,减小D NA 提取工作量。 2.3 基因精细定位 一旦把目标基因初步定位在2个标记之间后,就可以从国际水稻基因组测序计划(IRG SP)公布的序列中下载这2个标记区域的部分P AC/BAC 克隆序列。利用软件SSRI T 搜索克隆序列中的微卫星序列,然后选择合适的微卫星序列进行特异PCR 引物的设计。也可以直接借助于公共数据库的序列进行比较,如寻找R GP 基因组数据库(粳稻)与中国华大基因组数据库(籼稻)的单核苷酸多态性(SNP)序列差异,设计CAPS 或dCAPS 标记和插入/缺失多态 安徽农业科学,J ou rn al of An hui Agri.Sci.2008,36(34):14905-14906 责任编辑 张彩丽 责任校对 张士敏