G418筛选稳定表达细胞株精要总结

G418筛选稳定表达细胞系总结一

分析转化的功能和表达需要DNA稳定转染至宿主细胞染色体。外源基因进入细胞后，部分能够通过细胞质进入细胞核内，根据细胞类型，至多80％的进入核内的外源DNA得到瞬时表达。极少数情况下，进入细胞的外源DNA通过系列非同源性分子间重组核连接，形成巨大的***结构最终整合进细胞染色体。细胞基因组自由部分表达，所以整合并不一定意味着表达，只有整合到表达区的基因才会表达，而且整合到不同的染色体区段的外源基因的表达的量也是不同的。由于摄取、整合、表达外源基因是小概率事件，通常根据新表型筛选稳定转染体。一般情况下这种新表型由共转染的编码抗生素抗性基因提供。细菌Tn5转座子序列（neo抗性基因）携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。

G418是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成,对原核和真核等细胞都有毒性 ,包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞 ,也包括原生动物和蠕虫。是稳定转染最常用的选择试剂。当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后 ,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达 ,使细胞获得抗性而能在含有Ｇ418的选择性培养基中生长。Ｇ418的这一选择特性 ,已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。

在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转让时不加其它抗生素。其实G418本身有很好的杀菌效果，在用G418进行筛选的过程中很少会发生污染。但有一点，其实我觉得问题也不是很大，那就是：在老外的一本实验手册中提到，在脂质体转染时所用培养基中最好不加任何抗生素。我想他的想法可能是脂质体对细胞膜有影响，可能此时加抗生素对细胞损伤较大。因为庆大霉素、链霉素、G418均是氨基糖甙类药物，其药理

作用完全一样。所以没有必要再用，而且由于另外抗生素的添加实际增加氨基糖甙类药物的浓度，剂量有误差，不利于各实验室之间的交流，在实际操作中，培养液中有抗生素对细胞培养与筛选影响不大。

有人认为用磷酸钙共沉淀转染法筛选稳定整合子较好，但这种观点是很多年以前的观点了，而且只是少数人的观点。我两种方法都用过，但没有特异的比较过，感觉都可以。磷酸钙便宜，但对溶液配置和实验操作要求很高，尤其是溶液的PH 值，要求精确到小数点后2位。脂质体是现在主流的转染试剂，从没有人说这种方法做整合稳定表达不行。非脂质体是这几年发展很快的技术，转染效率低，细胞毒性小，价格也不贵，Qiagen就有一个系列。我个人觉得不必要花太多时间在这方面，自己实验室用得好的技术可以坚持，没有经验的可以选择一个较著名的公司的产品开始，购买之前先下载个说明书看看。有精力就比较一下几种方法，一般的用达到目的就行了。关键是实验设计。

G418和筛选：筛选之前由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/mL，在100ug/mL~1mg/mL的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。由于每种细胞对G418的敏感性不同，一般变动在100ug/ml～

1000ug/ml范围。而且不同的厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定你的细胞对这一批G418的最佳筛选浓度。尽管如此，特性明确的细胞系G418的最佳用量还是稳定的。《分子克隆》给出了几个常用细胞系所需G418的最佳用量。

看下面的一个试验：3×106个细胞电转后，分别接种

1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48 h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。所以汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%！

加药时间

由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。随着细胞的代谢G418的浓度和活性都回下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。这时药物浓度可以降至200ug/ml。

培养液

加药筛选约6天左右，细胞会大量死亡，孔中只剩下的细胞寥寥无几。这时会出现两个问题：1.死亡的细胞会裂解释放出有害物质，导致那些有neo表达的阳性细胞死亡，即非选择性死亡。2.孔中细胞数目很少，细胞之间的信号会变得很弱，也会导致阳性细胞的状态不佳甚至死亡。这个时候需要一种特殊的培养液：假如你要转染3T3细胞，在3T3细胞汇合度达到80%的时候，换液，培养过夜之后收集培养液，通过滤器消毒，和新鲜的培养液按1：1混合备用。再转染后筛选过程中就可以应用这种培养基。

挑选单克隆的优化

为了尽量减少阴性克隆的死亡给阳性克隆造成的不利影响以及增加阳性克隆的得率，可以应用套环法或刮除法结合有限稀释法来筛选阳性克隆。加药后，在高倍镜下，阳性克隆和阴性克隆很容易辨认，在阳性克隆下用记号笔做个标记。然后刮除隐性克隆，消化阳性克隆后继续筛选培养；或则用套环套住阳性克隆，在套环内加胰蛋白酶或EDTA消化，把消化液吸到另外一个新的孔中培养。最后再用有限稀释法把阳性克隆在96孔板中筛选。

鉴定之后

一般经过4周左右的筛选，得到的阳性克隆都比较稳定。但是外源基因如果没有整合到基因组中的话，目的基因还是很容易丢失的。但是外源基因整合到基因组中的概率太小了，而且是随机整合，会导致表达的目的蛋白的量产生很大差异。随着培养时间的延续，那些丢失了外源基因的细胞和很少表达目的基因的细胞会占据优势，强表达目的蛋白的细胞会越来越少。这样再次筛选是必不可少的。只有经过2次以上的筛选之后才能找到那种我们想要的强分泌目的蛋白的，遗传稳定的细胞克隆。

最全的G418筛选稳定表达细胞系总结！（2）

1.G418的配制：取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒，4度保存。

2.细胞培养：取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量接种入多孔培养板中，培养6小时左右开始加药。

3.制备筛选培养基：在100ug/ml～1000ug/ml范围内确定几个梯度，比如先做个100ug/ml、400ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml，按梯度浓度用培养基稀释G418制成筛选培养基。

4.加G418筛选: 吸除培养孔中培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基。

5.换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。方法同4。

6.确定最佳筛选浓度：在筛选10～14天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度。在第一轮就筛选出最佳G418浓度的可能性不大，最有可能的是出现这种情况：用某一浓度G418的量在筛选14天后还不能杀死细胞，而用下一个梯度的 G418的量在10天前就看不到活细胞了。假如是400ug/ml不能杀死细胞，而800ug/ml在第5天就把所有细胞都杀死了，则可以再用500ug/ml、600ug/ml、

700ug/ml进一步筛选，以确定最佳筛选浓度！心得：由于特性明确的细胞系G418的最佳用量还是比较稳定的，所以有时候不需要在这么大范围内进行筛选。比如说你要转染NIH3T3细胞，现在我告诉你我测试过NIH3T3细胞对G418的敏感性，我用的筛选浓度是200 ug/ml。这时你就可以做150ug/ml、200ug/ml、 300ug/ml三个浓度进行筛选。

通过预实验确定了最佳筛选浓度后，就可以做稳定转染了。

a 转染：转染后培养24小时或者更长，到细胞增长接近汇合时按1：4密度传代，继续培养，待细胞密度增至50％～70％汇合时；

b 加G418:去掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度配制好的

G418筛选培养基。

c 换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。当有大量细胞死亡时，可以把G418浓度减半维持筛选。筛选10～14天后，可见有抗性的克隆出现，停药培养，待其逐渐增大后；

d 挑单克隆：制备细胞悬液，细胞计数，用培养基稀释细胞到1

个/10ul。在96孔板中加入培养基150ul/孔，再加入细胞悬液10ul/

孔。待其逐渐增大后转入到48孔中增殖。

e 单克隆鉴定：细胞大量扩增后，提取总RNA，做RT-PCR检测目的基因是否存在。

常见问题：

1.转进去的重组质粒以什么形式存在于细胞内的？

无怪乎两种形式：整合在染色体中和存在于细胞质中。没有经过筛选前大部分转染进细胞的质粒是存在于胞质中的，但是这种质粒是不稳定的，基本上筛选不出这种单克隆，只有稳定整合入染色体的才是我们想要的稳定细胞系。

2.neo基因和目的基因是不是一定会整合在一起？

整合是随机发生的非同源性重组，neo基因表达而目的基因不一定都表达，所以在筛选之后还要用RT-PCR的方法进一步鉴定。

培养基处理的个人技巧

体内的任何细胞被置于体外培养后，对环境都有一个适应过程，期间细胞对培养液具有同化作用，即细胞从培养液中摄取营养的同时，也向培养液排出自己的代谢产物和其它一些物质，其中有排泄物也有促细胞生长因子。这个过程也是细胞同化培养基的过程。细胞越多则其同化作用越强，所以细胞数目多比数目少较易生长。在筛选后期，大批细胞死亡，不换液没有死亡的细胞就会受到死亡细胞的影响，换液后残留的少量细胞对培养基的同化作用不强，也不利于生长。我是用适应性培养基来解决这一问题的：

适应性培养基的配制

a 培养同源细胞至半汇合状态时，更换一次培养液，再继续培养24～

48小时后，吸出所有培养液

b 离心：3000～4000rpm 10 min后，吸取上清液

c 虑过：再经直径0.22um滤器过滤，再加入2倍体积的新鲜培养基，

低温冻存备用。

eeflying

1. G418筛选要做预试验确定最佳浓度，将细胞稀释至1000cell/mL，每

孔100uL加入有培养基的24孔板，将每孔中的G418浓度稀释至

0，100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1100ng/mL

等12个级别。培养10-14天，以细胞全部死亡最低浓度为基准，一般400-800左右，筛选时比该浓度再高一个级别，维持使用筛选浓度的一半。

２. 我们掌握是传过10代以后用维持量，但不能不用，因为有时候抗性基因会丢失，如果没有G418，很快会形成优势的。

３. 即是有G418抗性，也不一定有目的基因，单克隆化操作是很重要的。

转染后，每个细胞内目的基因与宿主染色体的整合状况是不同的，目的蛋白表达有的多，有的少，外源蛋白表达少的细胞由于代谢负荷较小，所以生长较快，在生长若干代之后，表达少的细胞会形成优势，长期之后，表达最弱的细胞会由于竞争优势占主要，转绿色荧光蛋白基因后，表达越来越暗就是这个道理。所以，要进行单克隆化操作，使得到的均来自于同一祖先细胞，遗传性状尽量一致，也是对高表达细胞的保护。操作用96孔板法，每代细胞长满后，大多数冻存，留200cell左右就可以进行该操作了，该方法在很多关于单克隆抗体和细胞原代培养书中均有讲述。

1. 可以肯定的是，外源基因与宿主染色体之间的整合是随机的而且不是单拷贝的，这点我们做过FISH验证过，表达量与整合数目，上游序列特性，特定部位DNA立体结构都是相关的，装入了SV40只是增加了表达了数目，但并不能掩盖其它因素对表达的影响。按你的讲法，转染完GFP的细胞应该亮度一致，但实际上差别很大。neo基因也是这样，而且，同一细胞中不同基因的拷贝数不会相同，不同细胞同一基因的数目也不会相同，这点可以用数学关于泊松分布的观点理解。有时，neo表达了，但目的基因丢失了的情况也是有的。

2. 那为什么还要筛选基因？是这样，用概率论的思维来理解，某一细胞内随机含有一定数目拷贝数外源基因基因，那么，一种基因拷贝数

为0的可能性，及所有拷贝均为另一种基因的概率就很小，很大的概率为外源基因的不均质。打个比方，一个大口袋，抓100个红球，再抓100个黄球，然后以从中抓若干个，这些球均为红球的概率有多大呢？应该是很小的。红球就是neo，黄球就是你的目的基因。我们用neo，实际上是筛选的外源基因整合的数目，怎么说呢？用刚才的例子来说，如果我们抓着5个红球，另一次抓着10个红球，可以肯定，第二次抓的球比较多，那么第二次黄球数目比第一次多的概率就很大了。因为二者出现的

概率比是恒定的。

3. 维持就是只要养这种细胞，就要维持。可以再低些，但不能没有。或者隔一定时间从新使用筛选量压一下，我不知你是否干临床，想想抗生素的用药原则，反向思维一下，实际上我们在筛选耐药株呀。

4. neo的产物是酶，过高的G418浓度就要有更多的neo酶来支持，否则细胞也要被毒死的，而此时过多的酶要求会对细胞代谢造成太大负担，细胞可能因此无法完成分裂与增殖，我们曾试过，即使在同一转染阳性细胞，在不同浓度的G418液中生长速度也不同，严重形态也不同。这就是酶与底物的比例关系嘛，这回不用数论的，用米氏方程理解吧。

5. 胰酶的作用不必理会，有的细胞受影响，还有的细胞不受影响，由几代之后，不受影响的细胞会占优势的。

仅是我从临床抗生素和化疗药的使用原则中悟出的道理，实在是个人经验，而且在基础科学领域顶多算票友，我还是想听听诸位专业人士的理解和经验。

在第10天左右就手挑单克隆或者96孔板单克隆操作了

本帖开始我就讲了如何确定基准浓度，筛选浓度是基准浓度的高一级，维持用筛选浓度的一半。

2、核酸贮存液，过滤除菌。

3、培养基：含血清或不含血清的，用于转染细胞的正常培养。

二、操作步骤

（一）克隆目的基因

1、根据GenBank检索的目的基因序列，设计扩增引物，G418筛选稳定表达细胞系总结

汇合度(confluence)也许是我们实验室的翻译，实际上就是指细胞占培养表面的比例，如果细胞铺满了整个容器，我们就认为它们100%汇合，也就是汇合度100%。

最近的一个实验是：3×106细胞电转后，我把电激杯中的细胞分别接种1/4000和1/1000和1/300到24孔板中，48小时后加g418筛选，这个时候接种了1/300细胞的孔会大约50%汇合，而理论上接种了1/4000细胞的孔

会4%左右汇合，今天是筛选后第9天，观察到1/4000孔有两三个小克隆，按道理1/300孔会有20-30个克隆，但实际的情况是它们几乎全部死光了，仅有少数存活细胞！

所以我认为汇合度对g418筛选影响很大，这耽误了我将一个多月。jiangql同意菊花与刀对你的建议。我的感觉G418筛选时间太长，到后来一般会对细胞生长有影响。以下是一些建议，供参考：

首先需要扩增细胞，冻存部分中间产物细胞后，再做克隆化比较合适，否则一旦污染就会全军覆没。

一般5～7天后G418就可以减半维持。

勤换液，去除死细胞，可以减少对存活细胞的影响。

血清浓度可以高到20％，质量要好。

进行真核转染的一般程序：

克隆目的基因（经测序验证）—准备真核表达载体－将目的基因插入表达载体中－转染－筛选－鉴定

下面以pcDNA3为载体，p16为目的基因，介绍真核转染的实验操作。

一、试剂准备

1、 HBS（Hepes-buffered saline）：876mg NaCl溶于90ml ddH2O，加

入1M Hepes,调pH到7.4,补ddH2O至100ml, pH7.4，滤过除菌。

并在上、下游引物的5’-端分别引入酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ，行RT-PCR。

2、回收特异性扩增片段，连入T载体。

3、转化DH5α，质粒制备。

4、酶切初步鉴定，测序证实。

（二）真核重组表达载体的构建：

pcDNA3载体带有在大肠杆菌中复制的原核序列、便于挑选带重组质粒细菌的抗生素抗性基因，以及表达外源DNA序列所必需的所有真核表达组件。

重组质粒与pcDNA3分别用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切

回收插入片段和pcDNA3线性片段

T4连接酶连接

转化DH5α

质粒制备

BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定。

（三）重组pcDNA3转染SHG-44细胞：

1、 G418筛选浓度测定：SHG-44培养于24孔培养板→G418 分别

用100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L加入，各浓度3复孔，设正常对照3复孔。以10-14天细胞全部死亡的浓度为筛选浓度，结果为200mg/L。

2、在转染实验前天接种细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。进行转染当天细胞应达到60%-80%覆盖。一般要求，6孔培养皿（35mm），每孔1-2ml培养基3×105细胞。依据不同大小培养板调整每平方厘米的细胞数量。

典型贴壁细胞平板密度

3、 SHG-44细胞的转染：

(1) 转染当天，加入脂质体/ DNA混合物之前的短时间内，更换1ml新鲜的有血清或无血清培养基。

(2) 准备不同比例的DOSPER/ DNA混合物，以确定每个细胞系的最佳比例。①溶液A：用HBS稀释DNA（pcDNA3、重组pcDNA3）各1.5μg 到总体积50μl（30μg/ml）。②溶液B：用HBS稀释6μl脂质体到终容积50μl（120μg/ml）。③混合溶液A和B，轻柔混合（不要振荡），室温孵育15min，以便脂质体/DNA混合物形成。

(3) 不要移去培养基，逐滴加入100μl 脂质体/DNA混合物（从培养孔一边到另一边），边加边轻摇培养板。

(4) 37℃孵育6hr。

(5) 6hr后更换转染培养基，加入2-3ml新鲜生长培养基。

(6) 转染24hr后施加筛选压力，改用含G418的培养基培养。

4、 G418筛选：在G418筛选浓度下持续培养14天后，挑出单克隆，扩大培养，同时转染pcDNA3即SHG-44-vect，并设对照组细胞即SHG-44。G418筛选稳定表达细胞系总结

（一）筛选结果鉴定：

（1）基因组DNA提取→PCR鉴定外源基因

（2）SHG-44-重组pcDNA3阳性细胞、SHG-44-vect裂解→聚丙烯酰胺凝胶电泳→免疫印迹鉴定P16蛋白表达（Western-blot）。

（3）测定外源性基因对SHG-44细胞增殖的影响

①流式细胞仪分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3→单细胞悬液→70%酒精固定→裂解细胞→核糖核酸酶消化→碘化丙啶染色→上机分析G1期和G2/M、S期比例。

②细胞生长曲线测定：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组

pcDNA3→5×104/孔接种24孔培养板→24hr后各自用苔盼蓝染色计数细胞

→计算细胞生长抑制百分率。

③软琼脂克隆形成率分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3→104 细胞→0.3%低熔点琼脂糖培养→1-2周后计数不可少于50个细胞的克隆数→计算克隆形成率抑制率。

三、注意事项

1、优化转染条件（脂质体的用量、DNA密度、细胞密度、脂质体和DNA混合孵育时间）每种细胞和质粒均须进行。用于转染的核酸应高度纯化。为避免微生物污染，所用溶液滤过灭菌，以及随后的使用应在无菌条件下，这是细胞惯常的做法。但是，脂质体以及脂质体/ DNA混合物无需滤过除菌。

2、预备脂质体/DNA混合物必须在无血清下进行。但是在随后的脂质体/ DNA与被转染细胞共孵育的过程中，血清又是培养基的一部分。

3、在转染之前更换培养基，可提高转染效率，但所用培养基必

须37℃预温。

4、脂质体/ DNA混合物应当逐滴加入，尽可能保持一致，从培养皿一边到另一边，边加入边轻摇培养皿，以确保均匀分布和避免局部高浓度。

常见问题和解答：

Q：我觉得套环法操作不如96孔办法效率高。

A：也不一定.依据实验目的与要求而定. 如果克隆效率较低的细胞,套环可能更好.用96孔板法,如果不是每孔单个细胞,就不能保证是单克隆.即使是增加到每孔十几个细胞或上百个,一个96孔板也只能培养一万个细胞,十万个细胞就至少需要10个板,100万个细胞就需要100个板,对于转基因细胞筛选或基因打靶,工作量就太大了.且细胞在单独生长条件下,远远不如千万个细胞共同培养活力好. 因此还得看这位朋友使用的是什么细胞,有限细胞系还是无限细胞系,转基因还是非转基因,筛选还是不筛选,需要的单细胞克隆株数量多少?

Q：请问一种细胞如果转染了稳定表达的，含neo抗性基因的质粒后，

如何用G418筛选？我查看了国内、外50几篇文献后发现没有一个定论的说法。即使对于同一种细胞其筛选剂量和筛选时间也不一样。我自己认为，从理论上讲，如果稳定表达最好要一直筛选到细胞传代后。不知这种观点对不对。然而开始筛选的剂量、维持剂量以及筛选持续时间又该如何确定？维持剂量与开始筛选时的剂量是否有一定关系？

A：1. G418筛选要做预试验确定最佳浓度，将细胞稀释至

1000cell/ml，每孔100ul加入有培养基的24孔板，将每孔中的G418浓度稀释至0,100, 200,300, 400,500, 600,700, 800,900, 1000,1100ng/ml等１2个级别, 培养10-14天，以最低细胞全部死亡浓度为基准，一般400-８００左右，筛选时比该浓度再高一个级别，维持使用筛选浓度的一半。

２。我们掌握是传过10代以后用维持量，但不能不用，因为有时候抗性基因会丢失，如果没有G418，很快会形成优势的。

３。即是有G418抗性，也不一定有目的基因，单克隆化操作是很重要的。

Q：请问：能谈一谈单克隆化操作的步骤以及其与目的基因表达的关系吗？

A：转染后，每个细胞内目的基因与宿主染色体的整合状况是不同的，目的蛋白表达有的多，有的少，外源蛋白表达少的细胞由于代谢负荷较小，所以生长较快，在生长若干代之后，表达少的细胞会形成优势，长期之后，表达最弱的细胞会由于竞争优势占主要，转绿色荧光蛋白基因后，表达越来越暗就是这个道理。所以，要进行单克隆化操作，使得到的均来自于同一祖先细胞，遗传性状尽量一致，也是对高表达细胞的保护。操作用96孔板法，每代细胞长满后，大多数冻存，留２００cell左右就可以进行该操作了，该方法在很多关于单克隆抗体和细胞原代培养书中均有讲述，我就不赘述了。

必须指出，单克隆化要做几遍，一遍是不够的，我前十代都是这样的，结果绿色荧光蛋白不但没减弱，反而增强了很多。现在很多代了，很稳定。

Q：1。我的质粒中含有SV40与neo基因，好像就不存在外源蛋白表达少的细胞形成优势这个问题了吧。

2。按您的讲法，筛选要进行10代，那么维持剂量要进行多长时间？如果我使用对照组,在对照组细胞全部死亡后就用维持剂量进行培养行吗？

3。在细胞用胰酶进行传代时，此时细胞膜受到一定影响，如果培养基中存在G418对细胞是否有影响？

4。既然细胞表达neo,从理论上讲是否无论多大浓度的G418对之都无影响？

A：1.可以肯定的是，外源基因与宿主染色体之间的整合是随机的而且不是单拷贝的，这点我们做过FISH验证过，表达量与整合数目，上游序列特性，特定部位DNA立体结构都是相关的，装入了SV40只是增加了表达了数目，但并不能掩盖其它因素对表达的影响。按你的讲法，转染完GFP的细胞应该亮度一致，但实际上差别很大。neo基因也是这样，而且，同一细胞中不同基因的拷贝数不会相同，不同细胞同一基因的数目也不会相同，这点可以用数学关于泊松分布的观点理解。有时，neo表达了，但目的基因丢失了的情况也是有的。

２。那为什么还要筛选基因？是这样，用概率论的思维来理解，某一细胞内随机含有一定数目拷贝数外源基因基因，那么，一种基因拷贝数为0的可能性，及所有拷贝均为另一种基因的概率就很小，很大的概率为外源基因的不均质。打个比方，一个大口袋，抓１００个红球，再抓100个黄球，然后以从中抓若干个，这些球均为红球的概率有多大呢？应该是很小的。红球就是neo，黄球就是你的目的基因。我们用neo，实际上是筛选的外源基因整合的数目，怎么说呢？用刚才的例子来说，如果我们抓着５个红球，另一次抓着１０个红球，可以肯定，的二次抓的球比较多，那么第二次黄球数目比第一次多的概率就很大了。因为二者出现的概率比是恒定的。

３。维持就是只要养这种细胞，就要维持。可以再低些，但不能没有。或者隔一定时间从新使用筛选量压一下，我不知你是否干临床，想想抗生素的用药原则，反向思维一下，实际上我们在筛选耐药株呀。

４。neo的产物是酶，过高的G４１８浓度就要有更多的neo酶来支持，否则细胞也要被毒死的，而此时过多的酶要求会对细胞代谢造成太大负担，细胞可能因此无法完成分裂与增殖，我们曾试过，即使在同一转染阳性细胞，在不同浓度的G418液中生长速度也不同，严重形态也不同。这就是酶与底物的比例关系嘛，这回不用数论的，用米氏方程理解吧。

５。胰酶的作用不必理会，有的细胞受影响，还有的细胞不受影响，由几代之后，不受影响的细胞会占优势的。

仅是我从临床抗生素和化疗药的使用原则中悟出的道理，实在是个人经验，而且在基础科学领域顶多算票友，我还是想听听诸位专业人士的理解和经验。

Another answer：

1. 外源基因整合后的基因表达量与整合的位置高度相关，如果整合

发生在活性转录染色质区，则有利于表达。通常用的载体是靠非

同源重组随机整合的，所以为了获得高表达细胞株，需要对重组

克隆进行筛选。某些载体如pcDNA3包含SV40的复制起始位

点，可以是质粒在反式提供大T抗原的细胞系中复制，增强瞬时

表达，有利于提高质粒的随机整合几率。对普通的表达载体来

说，即使抗性基因表达也无法保证外源基因的整合，表达载体随

机整合的结果常常导致目的基因的损坏甚至丢失。

２。关于概率论的思维，我认为红球和黄球的比喻很形象，但未

必准确。因为抗性基因和目的基因有一定的联锁，并不是完全相

互独立的。

G418筛选稳定表达细胞系总结

Q：G418怎么配制？

A：我觉得不能用水配，因为这样PH会变化很大，至少要用PBS。我是配在HEPES溶液中的，具体方法如下：1g包装的G418瓶子中，加入10ml HEPES溶液，浓度为100 mg/ml完全溶解后，0.22 um过滤，－20度保存。HEPES缓冲液配方如下：90 ml 水中，0.8 g NaCl, 0.037 g KCl, 0.0135 g Na2HPO4.2H2O, 0.1 g 葡萄糖，0.5 g HEPES,溶解，NaOH调PH至7.05,定容至100ml。

Good answer:

推荐用HEPES。特别是当细胞对G418不敏感，G418使用浓度高时，如果用水、PBS配置，会极大的改变细胞培养基的pH值，影响细胞的生长。1mol/L HEPES的简单配置：HEPES 11.91g，溶解于40ml的ddH2O，用10mol/L的NaOH调节pH至7.5-8.0，定容至50ml，

0.22um小滤器过滤。HEPES最终使用浓度15-20mM。

Q: 我想一步筛选出高拷贝整合的高表达的细胞克隆，如果我用很高浓度的G418直接加进培养瓶直接筛选，这样做可以吗？我做过G418杀伤曲线，300ug\ml就基本上可以杀死细胞，我想直接用1000ug\ml 来筛选，不知是否可行？会不会有什么问题？

A: G418筛选要做预试验确定最佳浓度，将细胞稀释至1000cell/ml，每孔100ul加入有培养基的24孔板，将每孔中的G418浓度稀释至0,,100, 200,300, 400,500, 600,700, 800,900, 1000,11

.00ng/ml等１2个级别, 培养10-14天，以最低细胞全部死亡浓度为基准，一般400-８００左右，筛选时比该浓度再高一个级别，维持使用筛选浓度的一半。

G418浓度太高也不好，会对细胞的损伤太大，影响增殖。我用过Zeocin，为了加速筛选，用了最低剂量的两倍浓度，结果一个阳性克隆都没筛到，欲速则不达。

Q: 我用24孔板做了G418筛选的浓度梯度，确定最低致死浓度为

600mg/l。我现在用这个浓度筛选我转染后的细胞，我应该保持这个浓度多少天才能确保我筛选完成呢？在这期间可以换液吗？筛选完了之后存活的细胞再培养传代的话，培养基中是否还应该加一定浓度的

G418？如果要加的话什么浓度比较合适？

A: 应该保持这个浓度9天以上，每3天换液一次。筛选完了之后存活的细胞再培养传代的话，培养基中应该加一定浓度的G418，一般在最低致死浓度的60%左右。

Q: 在6孔板里进行NIH3T3细胞转染后的G418筛选，2周后单克隆形成，于是就挑取单克隆，之前6孔板里的细胞很多，用0.125%

typsin+0.25%EDTA消化，1000转/分离心10分钟，肉眼可以看到细胞沉淀，接种至25ml塑料培养瓶中，镜下看密度可以，但是细胞形态成多态性：少量是圆形，大多数是梭形。第2天一看没有细胞贴壁！做了2次都这样，请问我的操作步骤有问题吗？

A: 看了你的操作步骤，个人观点认为你挑出来的不能称之为单克隆，在6 孔板里用G418筛选两周后只是大部分细胞死亡，少数细胞存活并

逐渐生长，只能叫作克隆形成。

我们一般在转染后24h将细胞消化下来（0.25%trypsin +

0.02%EDTA），以1：10或更高的比例传代，贴壁24h后加选择性培养基开始筛选。待大部分细胞死亡，极少数细胞渐形成克隆。再把这些克隆经24孔板、6孔板放大后再进行单克隆化的操作（具体操作方法见附件）。从严格意义上来讲，单克隆化的操作一般要进行2-3次，经此操作后长起来的才能称之为单克隆。另外，在把克隆或单克隆放大的过程中动作一定要轻柔，否则很容易出现你所说的细胞不贴壁死亡的现象，也可以在消化完用正常培养基，待细胞贴壁后再换为含G418的培养基。还有，在多克隆形成后一定要及时冻存，以备后续试验。

你挑选的克隆，不能贴壁原因可能有二;一、细胞很少，那么你接种后，由于密度较低，细胞是接触生长，所以密度太低，细胞难以生存。

二、拟消化下来可能用G418筛选液筛选，这样也会死亡。消化后先用无G418的培养液培养，贴壁后，再换取G428 培养液。

Q:我想问怎样的方法可以把阳性克隆从培养瓶中取下来，书上说用弯头吸管，我试了，不好用，根本就不能完整的吸取总个阳性克隆细胞下来，我想着用刮勺，但进口的特别贵，所需又不多，你看有什么别的好办法吗？谢谢了！

A: 如何挑选克隆。你可以按以下操作方法进行：

【操作方法】

（1）将已形成克隆的培养皿置于显微镜下观察克隆位置，并将各个克隆位置用标记笔标记准确；

（2）在超净台内，弃去培养皿内的培养液；

（3）用镊子夹取一块滤纸块，用0.25%Trypsin消化液浸湿，置于所标记克隆位置处，5-20秒；（有人可提前在一孔中装入0.02%EDTA PBS）

（4）将24孔培养板每孔加G418 选择培养基2ml，用镊子取出已黏附克隆细胞的滤纸快，置于一个孔中的培养基中，涮洗滤纸块数次，以使黏附的细胞脱落下。镜下观察确认细胞已经脱落后，将滤纸块取出弃掉，其它克隆方法转移同上；（有人在细胞贴壁后再选用培养基）（5）将移有克隆细胞的24孔培养板，继续置37℃5%CO2培养箱培养，2-5天；

（6）待细胞长满后，0.25%Trypsin消化液消化，并将细胞转移至6

孔板继续培养，或转入多瓶中扩增，此后可做进一步鉴定工作。

Q: 用G418做HEp-2细胞的建系已经有2个月了，已经在细胞瓶中扩大培养，但发现与正常HEp-2细胞相比，建系的细胞生长得很慢，细胞间的边界也不是很清楚，而且细胞长得不均匀，这样正常吗？为改变这一状态，我该怎么做呢？谢谢！

A: 基本算正常吧。稳定转染的细胞据细胞种类不同其形态都较正常细胞有变化，有的很明显，比如说细胞变大，生长缓慢，细胞界限不明显及细胞爱成堆生长等等；有的则变化不明显。对于稳定转染的细胞，建议筛出单克隆后大量冻存。一方面防止细胞回复，因为你转入的质粒对于细胞而言毕竟是个负担，细胞较倾向于甩掉负担轻装前进，这一点对于肿瘤细胞尤甚；另一方面，如果插入的质粒明显和细胞周期有关的话，这种稳定转染的细胞传不了几代就会死亡。在传代过程中，也可以使用正常培养基，但过一段时间一定要用维持剂量的含G418的培养基压一压，以除去回复的细胞。

整理)慢病毒稳转细胞株步骤

稳转慢病毒 一、所需试剂 1、慢病毒载体（详细信息见附录及《质粒的扩增提取》）（大肠杆菌-80℃保存2-3年，质粒-20℃保存2-3年，病毒液-80℃保存1年） （1）载体质粒：两端的LTR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，含宿主RNA聚合酶识别部分 （2）包装质粒（psPAX2）：包含了pol、gag包装成分 （3）包膜质粒（pMD2.G）：用其他病毒的包膜蛋白代替了env基因. 三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力的病毒载体。 2、包装细胞：293T细胞 3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒 4、转染试剂：XTREME-GENE（-20℃保存，不可分装），一种脂质与其他组份构成的混合物 5、浓缩试剂（配好后4℃保存，原材料室温保存）：5X PEG8000/NaCl溶液（聚乙二醇）：NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中，高压蒸汽灭菌 **也可直接从公司买来病毒液（-80℃封口膜封口冻存管保存，4℃保存3天）：滴度一般为108TU/ml 6、10mg/ml polybrene（-20℃分装保存）：溴化己二甲铵。是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene 能提高感染效率2～10 倍。有一定细胞毒性，需要摸索浓度（1～10μg/ml） 7、无血清培养基：optimen 8、贴壁细胞（复后3代以上的细胞） 9、puromycin：嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞 二、具体步骤 <一>病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转） 第一天 1、种板，10×105个293T细胞，加入全培养基双抗DMEM 4-5ml，过夜 2、配制5X PEG8000/NaCl溶液 称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min；保存在4℃ 第二天 2、加入2ml全培养基DMEM 3、将1加入2，孵育10h，换成5ml全培养基

2020年整理)慢病毒稳转细胞株步骤

作者：空青山 作品编号：89964445889663Gd53022257782215002 时间：2020.12.13 稳转慢病毒 一、所需试剂 1、慢病毒载体（详细信息见附录及《质粒的扩增提取》）（大肠杆菌-80℃保存2-3年，质粒-20℃保存2-3年，病毒液-80℃保存1年） （1）载体质粒：两端的LTR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，含宿主RNA聚合酶识别部分 （2）包装质粒（psPAX2）：包含了pol、gag包装成分 （3）包膜质粒（pMD2.G）：用其他病毒的包膜蛋白代替了env基因. 三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力的病毒载体。 2、包装细胞：293T细胞 3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒 4、转染试剂：XTREME-GENE（-20℃保存，不可分装），一种脂质与其他组份构成的混合物 5、浓缩试剂（配好后4℃保存，原材料室温保存）：5X PEG8000/NaCl溶液（聚乙二醇）：NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中，高压蒸汽灭菌 **也可直接从公司买来病毒液（-80℃封口膜封口冻存管保存，4℃保存3天）：滴度一般为108TU/ml 6、10mg/ml polybrene（-20℃分装保存）：溴化己二甲铵。是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene 能提高感染效率2～10 倍。有一定细胞毒性，需要摸索浓度（1～10μg/ml） 7、无血清培养基：optimen 8、贴壁细胞（复苏后3代以上的细胞） 9、puromycin：嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞 二、具体步骤 <一>病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转） 第一天 1、种板，10×105个293T细胞，加入全培养基双抗DMEM 4-5ml，过夜 2、配制5X PEG8000/NaCl溶液 称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min；保存在4℃ 第二天

转染步骤及经验(精华)

转染步骤及经验（精华） 一、基础理论 转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。 二、转染操作流程（以常用的6孔板为例） (1) 细胞培养： 取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37℃5%CO2培养箱中培养至70%～90%汇合。(不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞)。 (2) 转染液制备： 在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量) A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL， B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100μL； 轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。 (3) 转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL不含血清及PS的培养液。 (4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，37℃温箱置6～8小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。 三、转染注意事项 1. 血清 A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。 B．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。 C. 对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用一种营养丰富的无血清培养基OPTI-MEMⅠ培养基， 或者在转染培养基中使用血清。对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE 2000。无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍，注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。 2.抗生素（PS） 抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样，在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血

最全的G418筛选稳定表达细胞系总结4

(一)筛选结果鉴定: （1)基因组ＤＮＡ提取→PＣR鉴定外源基因 （２)SHG－44-重组pcDNA3阳性细胞、SHG-４4-vect裂解→聚丙烯酰胺凝胶电泳→免疫印迹鉴定Ｐ16蛋白表达(Westeｒn-blot)。 (3)测定外源性基因对ＳHＧ-４４细胞增殖的影响 ①流式细胞仪分析：SHG-４4、ＳHＧ－44-vect、SＨG-44-重组ｐｃDＮA3→单细胞悬液→７0%酒精固定→裂解细胞→核糖核酸酶消化→碘化丙啶染色→上机分析G1期和G2/M、Ｓ期比例。 ②细胞生长曲线测定：SHG-4４、SHＧ-4４-vect、SＨG-44-重组ｐcＤ NA3→5×104/孔接种２4孔培养板→２４hr后各自用苔盼蓝染色计数细胞→计算细胞生长抑制百分率。 ③软琼脂克隆形成率分析:SHG－44、SＨＧ-44－vect、ＳHG-44－重组pｃDNA3→1０4细胞→0.3％低熔点琼脂糖培养→１－２周后计数不可少于５0个细胞的克隆数→计算克隆形成率抑制率。 三、注意事项 1、优化转染条件(脂质体的用量、DNA密度、细胞密度、脂质体和ＤNA 混合孵育时间)每种细胞和质粒均须进行。用于转染的核酸应高度纯化。为避免微生物污染，所用溶液滤过灭菌，以及随后的使用应在无菌条件下,这是细胞惯常的做法。但是，脂质体以及脂质体／DNA混合物无需滤过除菌。 ２、预备脂质体/DNA混合物必须在无血清下进行。但是在随后的脂质体／ＤＮＡ与被转染细胞共孵育的过程中,血清又是培养基的一部分。 3、在转染之前更换培养基,可提高转染效率，但所用培养基必须37℃预温。 ４、脂质体／DNA混合物应当逐滴加入，尽可能保持一致，从培养皿一边到另一边,边加入边轻摇培养皿,以确保均匀分布和避免局部高浓度。 常见问题和解答： Q：我觉得套环法操作不如９6孔办法效率高。 A：也不一定.依据实验目的与要求而定.如果克隆效率较低的细胞,套环可能更好.用９6孔板法,如果不是每孔单个细胞,就不能保证是单克隆．即使是增加到每

稳定转染细胞株的制备

稳定转染细胞株的制备 带质粒的大肠杆菌的激活和扩增 （1）取-80℃冻存的带有质粒的大肠杆菌在室温解冻，或者放置37℃恒温水中约 2min,待冰完全融解即可使用。 （2）LB 培养基的制备按照如下配方配制 胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L 酵母提取物(Yeast extract) 5g/L 氯化钠(NaCl) 10g/L 用 NaOH 调节该培养基的 pH,使其达到 7.4，高温高压灭菌后室温保存，使用时加入氨苄青霉素(浓度为 0.1mg/ml) （3）LB 固体培养基的制备到 200mlLB 液体培养基加入 3g 琼脂混匀后高温高压灭菌，待冷却至约55℃时在无菌条件下加入氨苄青霉素摇匀，分别倒入 6-7 个培养皿中，用封口膜封边，并倒置放于4℃保存。 （4）扩增用接种环按照四线法将解冻后的工程菌涂布接种到 LB 固体培养基上，待凉干后，用封口膜将培养皿封闭，然后倒置于37℃恒温箱中培养过夜(不能摇晃)，根据情况可适当延长培养时间。观察培养基上的单克隆工程菌，待长出后，用接种环将一个单克隆工程菌转移接种到 10mlLB 液体培养基中，放入掁荡培养箱中37℃摇荡培养过夜，第二天观察，待 LB 液体培养基变浑浊后，4℃ 冰箱保存，以待进行下一步质粒的提取。 质粒的提取 准备质粒提取盒和扩增的带质粒大肠杆菌培养液 （1）取 75ml 扩增变浑浊的 LB 液体培养基置于试管中。 （2）5,000×g 离心 10 分钟，弃去上清液，将试管倒置在滤纸上空干。 （3）取出质粒提取盒，用 3ml 细胞重悬浮液对试管中的细胞进行重悬浮。 （4）加入 3ml 细胞裂解液，轻轻摇晃试管混匀，室温下孵育 3 分钟，产生白色絮状沉淀，然后加入 5ml 中和液混匀 （5）将 Clearing Column(兰色)放入一新的 50ml 离心管，将上述试管中裂解后的液体倒入兰管，孵育 2 分钟，1500×g 离心 5 分钟，效果不佳的话可再离心一次，离心液待用。 （6）将 Binding Column(白色)放入一新的 50ml 离心管，取上述离心液倒入白管，1500×g 离心 3 分钟，弃去离心液。 （7）在白管中加入 5ml 内毒素清洗液(需加异丙醇)，1500×g 离心 3 分钟，弃去离心液，在白管中再加 20ml 柱洗液(含有乙醇)，1500×g 离心 5 分钟，弃去离心液后，继续1500×g 离心 10 分钟，以保证彻底除去乙醇。 （8）取出白管，在滤纸上轻敲白管顶端的尖嘴，以保证去除试管中的乙醇，并用滤纸擦去白管外壁上的乙醇。 （9）把白管放入一个新的 50ml 离心管中，加入 600μl 无核酸酶的水(要把水加到白管中的 DNA 结合膜上),然后 1500-2000×g 离心 5 分钟 （10）收集离心管中的滤液，并转到 1.5mlEP 管中，密封，-20℃保存。 提取质粒的 DNA 电泳鉴定 （1）制胶取 0.15g 琼脂糖，15ml 1×TAE 混匀，微波炉加热 20 分钟，使之熔化，待自然冷却 60-70℃ 时，加入 0.25μl EB,轻轻混匀。 （2）将冷却至约60℃ 的凝胶倒入准备好的胶床内，厚度约 5mm,室温静置 1h,待胶固化后，置于电泳槽中，样品端位于负极。

最全的G418筛选稳定表达细胞系总结5

Q：G418怎么配制？ A：我觉得不能用水配，因为这样PH会变化很大，至少要用PBS。我是配在HEPES 溶液中的，具体方法如下：1g包装的G418瓶子中，加入10ml HEPES溶液，浓度为100 mg/ml完全溶解后，0.22 um过滤，－20度保存。HEPES缓冲液配方如下：90 ml 水中，0.8 g NaCl, 0.037 g KCl, 0.0135 g Na2HPO4.2H2O, 0.1 g 葡萄糖，0.5 g HEPES,溶解，NaOH调PH至7.05,定容至100ml。 Good answer: 推荐用HEPES。特别是当细胞对G418不敏感，G418使用浓度高时，如果用水、PBS配置，会极大的改变细胞培养基的pH值，影响细胞的生长。1mol/L HEPES 的简单配置：HEPES 11.91g，溶解于40ml的ddH2O，用10mol/L的NaOH调节pH至7.5-8.0，定容至50ml，0.22um小滤器过滤。HEPES最终使用浓度 15-20mM。 Q: 我想一步筛选出高拷贝整合的高表达的细胞克隆，如果我用很高浓度的G418直接加进培养瓶直接筛选，这样做可以吗？我做过G418杀伤曲线，300ug\ml 就基本上可以杀死细胞，我想直接用1000ug\ml来筛选，不知是否可行？会不会有什么问题？ A: G418筛选要做预试验确定最佳浓度，将细胞稀释至1000cell/ml，每孔100ul 加入有培养基的24孔板，将每孔中的G418浓度稀释至0,,100, 200,300, 400,500, 600,700, 800,900, 1000,11 .00ng/ml等１2个级别, 培养10-14天，以最低细胞全部死亡浓度为基准，一般400-８００左右，筛选时比该浓度再高一个级别，维持使用筛选浓度的一半。 G418浓度太高也不好，会对细胞的损伤太大，影响增殖。我用过Zeocin，为了加速筛选，用了最低剂量的两倍浓度，结果一个阳性克隆都没筛到，欲速则不达。 Q: 我用24孔板做了G418筛选的浓度梯度，确定最低致死浓度为600mg/l。我现在用这个浓度筛选我转染后的细胞，我应该保持这个浓度多少天才能确保我筛选完成呢？在这期间可以换液吗？筛选完了之后存活的细胞再培养传代的话，培养基中是否还应该加一定浓度的G418？如果要加的话什么浓度比较合适？

Neon电转染操作步骤

Protocol for Neon transfection system (100 μl Tips) 电穿孔技术的原理 电穿孔技术是利用脉冲电场改变细胞膜的状态和通透性,达到将DNA导入细胞以及促使细胞发生融合的目的。该技术目前一方面应用于细菌、真菌、植物、昆虫和哺乳动物细胞的基因转移,另一方面应用于细胞融合,制备杂交细胞和动物克隆等 影响电穿孔效率的因素 电场强度:电压太低时,细胞膜的改变不足以允许DNA分子通过,而电压过高时又会造成细胞的不可逆损害。对于大多数哺乳动物细胞而言,250~2500V/cm的电压可获得有效转染[2,3]。电脉冲形状和长度:电脉冲形状主要有指数衰减式和方波两种,一般需20~100毫秒。缓冲液:通常使用甘露醇和蔗糖等非离子缓冲液,但有报道认为HEPES缓冲液的转染效率更高,血清也可以提高转染效率[4]。其它诸如转染温度、DNA浓度和构象等均会对转染效果产生影响。 1.Cultivate the required number of cells (5×105-2×106 adhere cell per each 100ul Neon Tip), the cells should be 70-90% confluent on the day of experiment. 实验前培养足够量的细胞（对于100ul的tip，每个tip需要5×105-2×106 贴壁细胞，可以根据实际情况调整），并使其在实验当天达到70%-90%的汇合度。 2.Pre-warm an aliquot of culture medium containing serum, DPBS and so on.预热实验所需的 culture medium，DPBS等。 3.Prepare 6-well plate by filling the wells with 2.0 ml of culture medium containing serum and supplements without antibiotics and pre-incubate plate in a humidified 37℃/5% CO2 incubator. 准备6孔板，在每孔中加入2.0 mL 不含抗生素的正常培养基，放到倒培养箱中预热。 4.Aspirate the media from cells and rinse the cells using DPBS, trypsinize the cells using Trypsin/EDTA, after neutralization, harvest the cells in growth medium with serum. 用DPBS漂洗细胞两次，加入Trypsin/EDTA消化细胞，再加入生长培养基终止消化，收集细胞。 5.Count cells to determine the cell density, transfer enough cells for Neon transfection into a 1.5 ml microcentrifuge tube or a 15 ml cornial tube and centrifuge the cells at 100-400 × g for 5 minutes at room temperature. 对消化的细胞进行计数，确定细胞的密度，取出足够转染用的细胞，转移到新的1.5 mL 或者15 mL的离心管中，100-400 × g，室温离心5min。 6.Wash the cells with DPBS by centrifugation at 100-400 ×g for 5 minutes at room temperature. 用DPBS漂洗一次，同上条件离心。 7.Aspirate the DPBS and resuspend the cell pellet in Resuspension Buffer R in a final density of 1.0 × 107 cells/mL. Gently pipette the cells to obtain a single cell suspension. 弃DPBS,用适量的Buffer R重悬细胞，使细胞密度达到1.0 ×107 cells/mL.（该密度仅适用于每个

细胞转染技术原理及应用

细胞转染技术原理及应用 常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染后24-72小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称稳定转染，外源DNA 既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。 转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。一些传统的转染技术，如DEAE右旋糖苷法，磷酸钙法，电穿 孔法，脂质体法各有利弊 近年来国际上推出了一些阳离子聚合物基因转染技术，以其适用宿主范围广，操作简便，对细胞毒性小，转染效率高受到研究者们的青睐。其中树枝状聚合物（Dendrimers）和聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEI）的转染性能最佳，但树枝状聚合物的结构不易于进一步改性，且其合成工艺复杂。聚乙烯亚胺是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子，每相隔二个碳个原子，即每“第三个原子都是质子化的氨基氮原子，使得聚合物网络在任何pH 下都能充当有效的“质子海绵”(proton sponge)体。这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种属细胞，其效果好于脂质聚酰胺，经进一步的改性后，其转染性能好于树枝状聚合物，而且它的细胞毒性低。大量实验证明，PEI是非常有希望的基因治疗载体。目前在设计更复杂 的基因载体时，PEI经常做为核心组成成分。 线型PEI（Line PEI,LPEI）与其衍生物用作基因转染载体的研究比分枝状PEI（Branched PEI,BPEI）要早一些，过去的研究认为在不考虑具体条件，LPEI/DNA转染复合物的细胞毒性较低，有利于细胞定位，因此与BPEI相比应该转染效率高一些。但最近研究表明BPEI 的分枝度高有利于形成小的转染复合物，从而提高转染效率，但同时细胞毒性也增大。超高分枝的、较柔性的PEI衍生物含有额外的仲胺基和叔胺基，在染实验中发现这种PEI的毒性 低，但转染效率却较高。 GenEscort是采用各种分枝状和超高分枝状的小分子PEI与各种含有生理条件下可降解键的交联剂交联，合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物。聚合物的分枝结构使得其具有较高的正电性，因此易于高效地包裹各种DNA、RNA分子及质粒形成小的纳米颗粒，从而提高转染效率，当所形成复合物进入细胞以后，其中所含的生理条件下可降解的化学键在细胞内水解，使交联聚合物分解为无细胞毒性的小分子PEI，这样结构的转染试剂在体外应用可以获得高的转染效率和低的细胞毒性，其可降解性对体内应用也具有重要的意义。

lipo2000转染操作步骤

Stealth? RNAi or siRNA Transfection 以24孔板为例，其余规格的转染见表1 1 中板，细胞密度为30-50%适宜。 注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。 2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下： A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Plasmid DNA Transfection DNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。 1 中板。 贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到90%以上时转染 悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。 2 转染。 A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。

Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection *：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参考 **：6孔板细胞质粒转染量1-2ug足以。 ***：6cm dish细胞质粒转染量4-6ug足以。

如何选择合适的细胞稳转株

如何选择合适的细胞稳转株 细胞稳转株是一种经过特定基因修饰的细胞株，可根据实验所需表达外源基因、进行基因敲除、敲入、以及精确改变基因序列（如点突变）。对比一般瞬转方法，利用细胞稳转株开展实验能够获得长期而稳定的特定性状，因此有助于增强实验的可重复性。细胞稳转株除了可用于基因调控研究，也非常适合于长周期的药物筛选和药理学研究、重组蛋白和抗体生产等实验。载体家凭借其资源完备的载体定制平台，通过病毒转导常规肿瘤细胞的方式可构建多种应用类型的细胞稳转株。 过表达模型细胞稳转株 通过慢病毒系统或转座子系统将外源基因表达框稳定整合进靶细胞基因组，实现外源基因在靶细胞的长期稳定表达。对比瞬转方法，构建过表达稳转株可避免瞬转中因转染效率导致的表达效率不一致的问题。构建好的细胞株中的外源基因不会因为细胞传代而丢失，可以持续表达特定的基因或ncRNA序列用以基因功能研究，重复实验时不需要对细胞重新转染质粒，大为节省了实验时间。 诱导表达模型细胞稳转株 采用Tet-on系统进行诱导表达目的基因，虽然可以直接进行质粒瞬转，但是载体家亦提供该类载体的慢病毒包装以构建相关的稳转细胞株。构建好的Tet-On系统细胞株同时表达tTS和rtTA 两种转录调控因子,而目的基因的表达可受四环素调控。其中tTS在四环素不存在的情况下会结合目的基因的上游TRE启动子，抑制目的基因表达。在细胞体系中添加四环素或其类似物后，rtTA进行响应并结合TRE启动子，激活目的基因表达。 shRNA干扰模型细胞稳转株 shRNA稳转株一般使用慢病毒或逆转录病毒在靶细胞基因组中导入shRNA表达框，实现shRNA在细胞系中的长期稳定表达。不同于siRNA瞬转，shRNA稳转株可内源性地稳定表达siRNA效果，不受转染效率影响，从而获得更稳定的基因敲低效果 CRISPR基因编辑细胞稳转株 构建CRISPR基因编辑细胞稳转株是当今研究基因和细胞功能关系的流行工具。通过gRNA引导Cas9靶向靶细胞基因组特定序列的CRISPR基因编辑，如基因敲除、敲入和定点突变，可以从DNA水平修饰靶细胞的基因序列。载体家提供两种gRNA表达模式，第一种是转导gRNA/Cas9共表达载体，gRNA和Cas9在细胞株中同时表达。第二种是构建Cas9表达稳转株，再根据实验需求导入gRNA表达载体。使用单Cas9表达稳转株可以获得更大的实验灵活性，如导入多个gRNA打靶GOI，或者多个gRNA与多种Cas9（野生型Cas9, Cas9n, dCas9等）之间进行搭配等。

G418筛选稳定表达细胞系经验总结

G418筛选稳定表达细胞系经验总结 我做了稳定转染，从G418浓度确定到最后的单克隆化鉴定。有自己的体会也有其他战友遇到的情况, 和大家分享. 没有总结好的地方，大家补充。 筛选之前确定G418浓度： 1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。 2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418。在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。 3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50% 4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。6个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到一个具体试验：3x1024孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。 加药时间和维持浓度 1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。这时药物浓度可以降至200ug/ml。 2，加抗生素的时机，主要是考虑插入到细胞基因组的抗性基因是否已经得到表达。一般是转染48小时后加入抗生素。挑出单克隆后就可以用维持浓度，一般是筛选浓度的。1/2． . 关于维持浓度，有人说细胞会出现对抗生素的抗性，应不断提高其浓度。而且，如果你要挑选到几个阳性克隆中较高表达的克隆的话，可以调整抗生素的浓度。当然，抗性基因高表达，目的基因不一定就跟着高表达。 筛选时的培养液 加药筛选约6天左右，细胞会大量死亡，孔中只剩下的细胞寥寥无几。这时会出现两个问题： 1，死亡的细胞会裂解释放出有害物质，导致那些有neo表达的阳性细胞死亡，

细胞转染的详细过程

细胞转染的详细过程 1、准备工作如下： 1)从pFastBacTM construct中纯化重组的bacmind DNA(500ng/μl溶于TE中) 从相应的pFastBacTM construct对照中纯化bacmind DNA(500ng/μl溶于TE中)。 细胞培养在适合的培养基中。 细胞转染剂Cellfectin（4℃储存）无任何添加物（例如：FBS，抗生素等）的细胞培养基。用于细胞培养的完全生长培养基（例如：Sf-900ⅡSFM TNMFH 或其他适合的培养基）。2)在6孔板或是35毫米dish上，每孔培养9*105Sf9细胞，细胞培养于2ml含抗生素的生长培养基中。 3)细胞在27℃孵育至少一小时。 4)对于每一个转染的样品，准备bacmid DNA：与细胞转染剂在12*75mm消毒管中进行如下混合： 用100μl无血清培养基稀释1μl纯化的bacmid DNA。 用100μl无血清培养基稀释6μl 细胞转染剂。 将bacmind DNA与细胞转染剂进行混合，动作要轻柔，混合物在室温下孵育45分钟。 5)当DNA与脂质体进行孵育时，移去细胞原有的培养基并用2ml无血清培养基洗一次，移去用来清洗的无血清培养基。 6)在每一个含有DNA与脂质体混合物的管子中加入0.8ml无血清培养基，轻柔混合，分别把DNA与脂质体混合物加入含有细胞的孔中。 7)细胞在27℃孵育5小时。 8)从细胞中移去DNA与脂质体混合物加入2ml完全生长培养基。 9)将细胞在27℃进行孵育，实验人员必须每日观察，记录转染细胞的生长状态，细胞在转染后48小时长势应该比较良好，但72小时后直至可以看到明显的病毒感染的细胞病变。 2、第一代代病毒的收集与保存 1)当转染的细胞呈现出感染后期的形态时，收集每孔含有病毒的上清，转移到灭菌的15ml 压盖管中。 2)以500*g离心5分钟，从而移去上清中所含有的细胞及大的碎片。 3)将离心后的上清移到新的15ml压盖管中，用来保存第一代病毒，存放于4℃避光保存。 3、病毒的保存 1)病毒存放于4℃避光保存。 2)如果用的是无血清培养基，则加入终浓度为2%的FBS 。血清蛋白可以作为蛋白酶的底物。 3)长期保存时将一部分病毒储存在-80℃用于病毒的重新扩增。 4)病毒的常规储存不要低于4 ℃.病毒经过反复冻融会使其滴度下降10 到100倍。 4、杆状病毒的扩增 1)准备sf9细胞，2*106/孔，在室温孵育1小时。 2)在孵育1小时以后，用倒置显微镜观察昆虫细胞的贴壁情况。 3)在每孔中加入适量的P1代病毒。 4)在27℃进行孵育48小时。 5)在感染后48小时，收集每孔含有病毒的上清，转移到灭菌的15ml压盖管中。以1000*g 离心5分钟，从而移去上清中所含有的细胞及大的碎片。 5、病毒空斑分析 1)准备工作如下： 澄清的杆状病毒保存于4℃ 培养在适当培养基中的sf9细胞（30ml 5*105/ml对数生长期的细胞用于每一个滴度的杆状

维真生物-稳转株的制备

稳转株的制备 实验原理： 利用哺乳动物系统生产蛋白的方式有两种：瞬时转染和稳转株筛选。通过稳定细胞系构建筛选稳定表达细胞株。针对瞬时转染，外源基因在短时间转录翻译得到的蛋白量较少，能够满足小量蛋白制备，大量生产成本很高。相对于此，稳定转染的是将外源基因整合到细胞自身的基因组上，随着细胞的生长分裂外源基因可以稳定转染表达，同时经过抗生素加压筛选，最终得到能够稳定转染表达蛋白的细胞株，稳转株生产蛋白稳定性更好，批次差异性更小。 稳定转染的应用

影响稳定转染的因素 1、外源基因整合的几率 决定了稳转株筛选的简易程度，有利于稳定转染细胞的获得； 2、插入外源基因片段的拷贝数 一般情况下，低拷贝或者单拷贝可以降低人为因素的干扰； 3、整合位点转录活跃度 整合位点转录活跃度决定了稳转株筛选细胞后稳转株中外源基因片段的表达质量； 4、外源基因片段整合到细胞后的稳定性 不同的整合位点决定了外源片段在染色体中的稳定性，有些区域易发生重组或者丢失，从而使稳转株筛选后出现丢失的现象。 制备稳转株的实验步骤

一．准备及预实验 1、确定细胞系相关信息：需包括如下内容 注：务必保证细胞无支原体污染，方可进行稳转株构建！ 2、查阅慢病毒感染该细胞的MOI值 3、预实验确定筛选药物用量： （1）查阅Puromycin/Blastincidin在目的细胞中稳转株筛选的致死用量信息；参考查阅得到的数据，确定3个药物浓度梯度（如没有相关信息，则需将药物浓度梯度范围增大，数量增多至6个）； （2）D0将细胞铺于6孔板中，使D1细胞融合度约90%；D1按（1）中设置的药物梯度，加入药物； （3）D4换液，并重新加入药物； （4）D7观察，找到致死率100%的孔，该孔使用的药物浓度，即为药物筛选浓度。 二．稳转株筛选及构建 注：以下实验参数，按1株稳转株为例描述，实验需考虑有无对照稳转株！ 1、细胞铺板：D0将细胞接种于6孔板中（4个孔），使D1细胞融合度约70%

G筛选稳定表达细胞系经验总结图文稿

G筛选稳定表达细胞系 经验总结 Company number【1089WT-1898YT-1W8CB-9UUT-92108】

G418筛选稳定表达细胞系经验总结 我做了稳定转染，从G418浓度确定到最后的单化鉴定。有自己的体会也有其他战友遇到的情况,和大家分享.没有总结好的地方，大家补充。 筛选之前确定G418浓度： 1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。 2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418。在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。 3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50% 4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。一个具体试验：3x106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个，按比例1/300孔内应该有几十个，事实上，它们几乎全死光了，只有几个。 加药时间和维持浓度

最全的G418筛选稳定表达细胞系总结2

Protocal 1.G418的配制：取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒，4度保存。 2.细胞培养：取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量接种入多孔培养板中，培养6小时左右开始加药。 3.制备筛选培养基：在100ug/ml～1000ug/ml范围内确定几个梯度，比如先做个100ug/ml、400ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml，按梯度浓度用培养基稀释G418制成筛选培养基。 4.加G418筛选: 吸除培养孔中培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基。 5.换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。方法同4。 6.确定最佳筛选浓度：在筛选10～14天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度。在第一轮就筛选出最佳G418浓度的可能性不大，最有可能的是出现这种情况：用某一浓度G418的量在筛选14天后还不能杀死细胞，而用下一个梯度的G418的量在10天前就看不到活细胞了。假如是400ug/ml不能杀死细胞，而800ug/ml在第5天就把所有细胞都杀死了，则可以再用 500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml进一步筛选，以确定最佳筛选浓度！心得：由于特性明确的细胞系G418的最佳用量还是比较稳定的，所以有时候不需要在这么大范围内进行筛选。比如说你要转染NIH3T3细胞，现在我告诉你我测试过NIH3T3细胞对G418的敏感性，我用的筛选浓度是200 ug/ml。这时你就可以做150ug/ml、200ug/ml、300ug/ml三个浓度进行筛选。 通过预实验确定了最佳筛选浓度后，就可以做稳定转染了。 a 转染：转染后培养24小时或者更长，到细胞增长接近汇合时按1：4密度传代，继续培养，待细胞密度增至50％～70％汇合时； b 加G418:去掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度配制好的G418筛选培养基。 c 换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。当有大量细胞死亡时，可以把G418浓度减半维持筛选。筛选10～14天后，可

细胞转染的操作步骤

细胞转染的操作步骤 转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。红外碳硫仪理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。 >需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。 一、细胞传代 1. 试验准备：200ul/1mlTip头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。 2. 弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。 3. 用Tip头加入1ml Trypsin液，消化1分钟。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。 4. 加入1ml的含血清培养基终止反应。 5. 用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。 6. 将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。 7. 用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X10⁶个细胞加入一个35mm培养皿。8. 将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。 9. 将培养皿转入培养箱中培养，第二天转染。 二、细胞转染 1. 转染试剂的准备 ①将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。 ②震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡。 2. 选择合适的混合比例（1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量）来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。 3. 将混合液在室温放置10―15分钟。 4. 吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。 5. 加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。 6. 到时后，红外碳硫仪根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24－48小时。三、第二次细胞传代1. 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。 2. 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X10 个细胞/35mm培养皿将细胞重新转入培养皿中。 3. 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。

稳定细胞株筛选

稳定株构建 FAQ 转自微博思路迪慢病毒包装 1，什么是瞬时转染和稳定转染？ 答：瞬时转染：顾名思义，外源片段的表达时间短暂。这主要是因为外源导入的裸露的载体整合入基因组的几率非常低，所以以染色体外(episomal)形式存在，不能随细胞分裂而一同复制导致最后拷贝数被稀释导致的。而且考虑到细胞分裂会稀释质粒的量，所以起初转染的质粒拷贝数极高。这就导致瞬时转染呈现一个高拷贝到低拷贝迅速降低的过程，且无法在这个系统上实现可诱导表达。稳定转染：是相对瞬时转染而言，进入细胞的质粒整合入细胞基因组中，并能随细胞分裂稳定传递下去。在这个系统中，质粒表达稳定，拷贝数低，且能实现诱导表达。稳定转染并不是一种与瞬时转染不同的方法，只是对瞬时转染的细胞进行筛选，得到稳定整合的细胞株。稳定整合的几率因基因传递的方法而异，跨度可以从10-8到10-1。因此，对于有的转染方法，比如化学试剂介导的转染，其整合几乎可以忽略不计。质粒载体整合的位点并不是完全随机分布，依据不同的基因传递方法，呈现不同的靶向倾向性，所以是一种半随机整合。不同基因传递方法对质粒稳定表达的影响见表XXXX。 2，设计稳定株构建实验需要考虑的因素有哪些？ ?答：稳定整合试验中需要考虑的几个关键因素有： ?1)，外源插入片段的拷贝数。多数情况下，低拷贝甚至是单拷贝可以减少人为实验因素的干扰。 ?2)，整合的几率，这不仅决定了稳定株筛选的难易程度，而且还可以帮助人们更容易得到混合稳定株。 ?3)，整合位点的转录活跃度，决定了稳定株中外源片段的表达质量。最理想的状况是单拷贝，但转录活性比较高。 ?4)，整合后的稳定性。不同的整合位点决定了外源片段在染色体中的稳定性，有些区域易发生重组或者丢失，从而导致稳定株再次丢失的情况。 ?5)，最好使用混合稳定株或者获得多个不同单克隆稳定株。因为稳定整合往往伴随这插入失活宿主内源基因，所以实验时通过使用混合稳定株， 或者对多个单克隆稳定株进行比较，可以帮助研究人员获得更精确的实 验数据。 3，什么时候需要稳定细胞株？ ?答：以下实验，构建稳定细胞株而不是瞬时转染更能满足实验要求：