木瓜蛋白酶活力测定方法
木瓜蛋白酶活力测定方法
分别精密量取酪蛋白溶液5ml，置3支具塞试管中，置40℃水浴中保温10分钟，各精密加入供试品溶液2ml，摇匀，置40℃水浴中，开始记时，准确反应1小时，立即精密加入三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，置40℃水浴中放置30~40分钟，使沉淀的蛋白质完全凝固，滤过，滤液作为供试品溶液。精密量取酪蛋白溶液5ml置另一具试管，于40℃水浴中保温1小时，精密加入三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，精密加入供试品溶液2ml，置40℃水浴中放置30~40分钟，滤过，滤液作为空白溶液。照分光光度法（中国药典2000年版二部附录IV A），以0.1mol/L盐酸溶液为空白，在275nm的波长处测定空白溶液、供试品溶液和对照品溶液的吸收度，按下式计算：
效价（单位/mg）=A/As＊Cs＊12/2＊稀释倍数/W
式中A为供试品溶液的吸收度减去空白溶液的吸收度：
As为酪氨酸对照品溶液的吸收度：
Cs为酪氨酸对照品溶液的浓度，ug/ml
W为供试品重量，mg;
在上述条件下，释放1ug的酪氨酸的酶量为一个活力单位。
试剂酪蛋白溶液：取酪蛋白1g，加0.05mol/L磷酸氢二钠溶液50ml,置沸水浴中煮30分钟，时时搅拌，冷至室温，加0.05mol/L枸椽酸溶液调节PH至6.0±0.1，并迅速搅拌，防止酪蛋白沉淀，用水稀释至100ml（临用新配）。酶稀释液：取无水磷酸氢二钠3.55g，加水400ml溶解，加乙二胺四醋酸二钠1.1g和盐酸半胱氨酸2.74g，振摇溶解，用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠溶液调节PH6.5±0.1，用水稀释至500ml,混匀（临用新配）三氯醋酸溶液:取三氯醋酸17.99g，加醋酸钠29.94g和冰醋酸18.9ml，加适量水溶解后，加水使成1000ml，摇匀。
酶活力测定对照品溶液的制备:精密称取已105℃干燥至恒重的酪氨酸对照品适量，用0.1mol/L盐酸溶液制成每1ml中约含40ug的溶液。供试品溶液的制备:取本品适量（约相当于木瓜酶活力120万单位），精密称定，加酶稀释液振摇，制成每1ml中含200~300单位的溶液，摇匀。
淀粉酶活力测定
实验技术2008-05-27 18:01:29 阅读213 评论0字号：大中小
一、目的
淀粉是葡萄糖以α-1,4糖苷键及α-1，6
糖苷键连结的高分子多糖，是人类和动物的重要食物，也是食品、发酵、酿造、医药、
纺织工业的基本原料。
淀粉酶是加水分解淀粉的酶的总称，淀粉酶对淀粉的分解作用是工业上利用淀粉的依
据，也是生物体利用淀粉进行代谢的初级反应。小麦成熟期如遇阴雨天气，有的品种会发生严重的穗发芽，造成巨大损失，这是小麦种子中淀粉酶活动的结果。因此，淀粉酶的活性测定，具有理论和应用研究的意义。通过本实验，学习酶活测定的一般方法，巩固并熟练分光光度计的使用。
二、原理
淀粉酶主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和R-
酶，它们广泛存在于动物、植物和微生物界。不同来源的淀粉酶，性质有所不同。植物中最重要的淀粉酶是α-淀粉酶和
β-淀粉酶。
α-淀粉酶随机作用于直链淀粉和支链淀粉的直链部分α-1,4糖苷键，单独使用时最终生成寡聚葡萄糖、α
-极限糊精和少量葡萄糖。Ca2+能使α-淀粉酶活化和稳定，它比较耐热但不耐酸，pH3.6
以下可使其钝化。
β-淀粉酶从非还原端作用于α-1,4糖苷键，遇到支链淀粉的α-1,6
键时停止。单独作用时产物为麦芽糖和β-极限糊精。β-淀粉酶是一种巯基酶，不需要Ca2+及Cl—
等辅助因子，最适pH偏酸，与α-淀粉酶相反，它不耐热但觉耐酸，70℃保温15min 可使其钝化。
通常提取液中α-淀粉酶和β-淀粉酶同时存在。可以先测定（α+β）淀粉酶总活力，然后在70
℃加热15min，钝化β-淀粉酶，测出α-淀粉酶活力，用总活力减去α-淀粉酶活力，就可求出
β-淀粉酶活力。
淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的还原糖与3,5-二硝基水杨酸的显色反应来测定。还原糖作用于黄色的
3,5-二硝基水杨酸生成棕红色的3-氨基-5-
硝基水杨酸，生成物颜色的深浅与还原糖的量成正比。以每克样品在一定时间内生成的还原糖（麦芽糖）量表示酶活大小。
三、仪器、试剂和材料
1.仪器
（1）电子顶载天平
（2）研钵
（3）容量瓶100mL2个
（4）具塞刻度试管25Ml15支
（5）试管8支
（6）吸管1mL3支，2mL12支，5mL1支
（7）离心机
（8）离心管
（9）恒温水浴锅
（10）分光光度计
2.试剂
（1）1%淀粉溶液
（2）0.4mol/L氢氧化钠
（3）pH5.6柠檬酸缓冲液称取柠檬酸20.01g，溶解后定容至1000mL，为A
液。称取柠檬酸钠29.41g，溶解后定容至1000mL，为B液。取A液13.7mL与B 液
26.3mL混匀，即为pH5.6之缓冲液。
（4）3,5-二硝基水杨酸精确称取1g3,5-二硝基水杨酸溶于20mL1mol/L
氢氧化钠中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水稀释至100Ml
，盖紧瓶塞，防止CO2进入。
（5）麦芽糖标准液（1mg/ml）称取0.100g麦芽糖，溶于少量蒸馏水，定容至100mL。
3.材料
萌发3天的小麦芽。
四、操作步骤
1.酶液提取
称取2g萌发3天的小麦种子（芽长1cm左右），置研钵中加少量石英砂和2m1
左右蒸馏水，研成匀浆，无损地转入100m1容量瓶中，用蒸馏水定容至100m1，每隔数分钟振荡1
次，提取20min。3000r／min离心l0min，转出上清液备用。
2.a-淀粉酶活力测定
（1）取试管4支，标明2支为对照管，2支为测定管。
（2）于每管中各加酶液lml，在70℃士0.5℃恒温水浴中准确加热15min，钝化β
-淀粉酶。取出后迅速用流水冷却。
（3）在对照管中加入4m10.4mol/L氢氧化钠。
（4）在4支试管中各加入1mlpH5.6的柠檬酸缓冲液。
（5）将4支试管置另一个40℃士0.5℃恒温水浴中保温15min，再向各管分别加入40℃下预热的1％淀粉溶液2m1，摇匀，立即放入40℃恒温水浴准确计时保温5min
。取出后向测定管迅速加入4ml0.4mol/L氢氧化钠，终止酶活动，准备测糖。
3.淀粉酶总活力测定
取酶液5ml，用蒸馏水稀释至100m1，为稀释酶液。另取4支试管编号，2支为对照，2
支为测定管。然后加入稀释之酶液lml。在对照管中加入4m10.4mol氢氧化钠。4支试管中各加1
mlpH5.6之柠檬酸缓冲液。以下步骤重复α-淀粉酶测定第（5）步的操作，同样准备测糖。
4.麦芽糖的测定
（1）标准曲线的制作取25ml刻度试管7支，编号。分别加入麦芽糖标准液（lmg/ml）0,
0.2,0.6,1.0,1.4,1.8,2.0ml，然后用吸管向各管加蒸馏水使溶液达2.0ml
，再各加3，5一二硝基水杨酸试剂2.0m1，置沸水浴中加热5min。取出冷却，用蒸馏水稀释至
25m1。混匀后用分光光度计在520nm波长下进行比色，记录吸光度。以吸光度为纵坐标，以麦芽糖含量（
mg）为横坐标，绘制标准曲线。
（2）样品的测定取步骤2,3中酶作用后的各管溶液2m1,分别放入相应的8支25ml
具塞刻度试管中，各加入2m13,5-
二硝基水杨酸试剂。以下操作同标准曲线制作。根据样品比色吸光度，从标准曲线查出麦芽糖含量，最后进行结果计算。
（A—A0）xVT
五、结果处理
式中A为a-淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖（mg）；
Ao为a-淀粉酶的对照管中麦芽糖量（mg）；
B为（a十β）淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖（mg）；
Bo为（a十β）淀粉酶的对照管中麦芽糖（mg）；
VT为样品稀释总体积（ml）；
VU为比色时所用样品液体积（ml）；
W为样品重（g）。
六、注意事项
（1）酶反应时间应准确计算。
（2）试剂加入按规定顺序进行。
七、思考题
1.淀粉酶活性测定原理是什么？
2.酶反应中为什么加pH5.6的柠檬酸缓冲液？为什么在40℃进行保温？
3.测定酶活力，应注意什么问题？
一、目的
淀粉是葡萄糖以α-1,4糖苷键及α-1，6
糖苷键连结的高分子多糖，是人类和动物的重要食物，也是食品、发酵、酿造、医药、纺织工业的基本原料。
淀粉酶是加水分解淀粉的酶的总称，淀粉酶对淀粉的分解作用是工业上利用淀粉的依据，也是生物体利用淀粉进行代谢的初级反应。小麦成熟期如遇阴雨天气，有的品种会发生严重的穗发芽，造成巨大损失，这是小麦种子中淀粉酶活动的结果。因此，淀粉酶的活性测定，具有理论和应用研究的意义。通过本实验，学习酶活测定的一般方法，巩固并熟练分光光度计的使用。
二、原理
淀粉酶主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和R-
酶，它们广泛存在于动物、植物和微生物界。不同来源的淀粉酶，性质有所不同。植物中最重要的淀粉酶是α-淀粉酶和
β-淀粉酶。
α-淀粉酶随机作用于直链淀粉和支链淀粉的直链部分α-1,4糖苷键，单独使用时最终生成寡聚葡萄糖、α
-极限糊精和少量葡萄糖。Ca2+能使α-淀粉酶活化和稳定，它比较耐热但不耐酸，pH3.6 以下可使其钝化。
β-淀粉酶从非还原端作用于α-1,4糖苷键，遇到支链淀粉的α-1,6
键时停止。单独作用时产物为麦芽糖和β-极限糊精。β-淀粉酶是一种巯基酶，不需要Ca2+及Cl—
等辅助因子，最适pH偏酸，与α-淀粉酶相反，它不耐热但觉耐酸，70℃保温15min 可使其钝化。
通常提取液中α-淀粉酶和β-淀粉酶同时存在。可以先测定（α+β）淀粉酶总活力，然后在70
℃加热15min，钝化β-淀粉酶，测出α-淀粉酶活力，用总活力减去α-淀粉酶活力，就可求出
β-淀粉酶活力。
淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的还原糖与3,5-二硝基水杨酸的显色反应来测定。还原糖作用于黄色的
3,5-二硝基水杨酸生成棕红色的3-氨基-5-
硝基水杨酸，生成物颜色的深浅与还原糖的量成正比。以每克样品在一定时间内生成的还原糖（麦芽糖）量表示酶活大小。
三、仪器、试剂和材料
1.仪器
（1）电子顶载天平
（2）研钵
（3）容量瓶100mL2个
（4）具塞刻度试管25Ml15支
（5）试管8支
（6）吸管1mL3支，2mL12支，5mL1支
（7）离心机
（8）离心管
（9）恒温水浴锅
（10）分光光度计
2.试剂
（1）1%淀粉溶液
（2）0.4mol/L氢氧化钠
（3）pH5.6柠檬酸缓冲液称取柠檬酸20.01g，溶解后定容至1000mL，为A
液。称取柠檬酸钠29.41g，溶解后定容至1000mL，为B液。取A液13.7mL与B液
26.3mL混匀，即为pH5.6之缓冲液。
（4）3,5-二硝基水杨酸精确称取1g3,5-二硝基水杨酸溶于20mL1mol/L
氢氧化钠中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水稀释至
100Ml
，盖紧瓶塞，防止CO2进入。
（5）麦芽糖标准液（1mg/ml）称取0.100g麦芽糖，溶于少量蒸馏水，定容至100mL。
3.材料
萌发3天的小麦芽。
四、操作步骤
1.酶液提取
称取2g萌发3天的小麦种子（芽长1cm左右），置研钵中加少量石英砂和2m1
左右蒸馏水，研成匀浆，无损地转入100m1容量瓶中，用蒸馏水定容至100m1，每隔数分钟振荡1
次，提取20min。3000r／min离心l0min，转出上清液备用。
2.a-淀粉酶活力测定
（1）取试管4支，标明2支为对照管，2支为测定管。
（2）于每管中各加酶液lml，在70℃士0.5℃恒温水浴中准确加热15min，钝化β
-淀粉酶。取出后迅速用流水冷却。
（3）在对照管中加入4m10.4mol/L氢氧化钠。
（4）在4支试管中各加入1mlpH5.6的柠檬酸缓冲液。
（5）将4支试管置另一个40℃士0.5℃恒温水浴中保温15min，再向各管分别加入40 ℃下预热的1％淀粉溶液2m1，摇匀，立即放入40℃恒温水浴准确计时保温5min
。取出后向测定管迅速加入4ml0.4mol/L氢氧化钠，终止酶活动，准备测糖。
3.淀粉酶总活力测定
取酶液5ml，用蒸馏水稀释至100m1，为稀释酶液。另取4支试管编号，2支为对照，2
支为测定管。然后加入稀释之酶液lml。在对照管中加入4m10.4mol氢氧化钠。4支试管中各加1
mlpH5.6之柠檬酸缓冲液。以下步骤重复α-淀粉酶测定第（5）步的操作，同样准备测糖。
4.麦芽糖的测定
（1）标准曲线的制作取25ml刻度试管7支，编号。分别加入麦芽糖标准液（lmg/ml）0,
0.2,0.6,1.0,1.4,1.8,2.0ml，然后用吸管向各管加蒸馏水使溶液达2.0ml
，再各加3，5一二硝基水杨酸试剂2.0m1，置沸水浴中加热5min。取出冷却，用蒸馏水稀释至
25m1。混匀后用分光光度计在520nm波长下进行比色，记录吸光度。以吸光度为纵坐标，以麦芽糖含量（
mg）为横坐标，绘制标准曲线。
（2）样品的测定取步骤2,3中酶作用后的各管溶液2m1,分别放入相应的8支25ml 具塞刻度试管中，各加入2m13,5-
二硝基水杨酸试剂。以下操作同标准曲线制作。根据样品比色吸光度，从标准曲线查出麦芽糖含量，最后进行结果计算。
（A—A0）xVT
五、结果处理
式中A为a-淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖（mg）；
Ao为a-淀粉酶的对照管中麦芽糖量（mg）；
B为（a十β）淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖（mg）；
Bo为（a十β）淀粉酶的对照管中麦芽糖（mg）；
VT为样品稀释总体积（ml）；
VU为比色时所用样品液体积（ml）；
W为样品重（g）。
六、注意事项
（1）酶反应时间应准确计算。
（2）试剂加入按规定顺序进行。
七、思考题
1.淀粉酶活性测定原理是什么？
2.酶反应中为什么加pH5.6的柠檬酸缓冲液？为什么在40℃进行保温？
3.测定酶活力，应注意什么问题？
木瓜蛋白酶活力测定方法
木瓜蛋白酶活力测定方法 分别精密量取酪蛋白溶液5ml，置3支具塞试管中，置40℃水浴中保温10分钟，各精密加入供试品溶液2ml，摇匀，置40℃水浴中，开始记时，准确反应1小时，立即精密加入三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，置40℃水浴中放置30~40分钟，使沉淀的蛋白质完全凝固，滤过，滤液作为供试品溶液。精密量取酪蛋白溶液5ml置另一具试管，于40℃水浴中保温1小时，精密加入三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，精密加入供试品溶液2ml，置40℃水浴中放置30~40分钟，滤过，滤液作为空白溶液。照分光光度法（中国药典2000年版二部附录IV A），以0.1mol/L 盐酸溶液为空白，在275nm的波长处测定空白溶液、供试品溶液和对照品溶液的吸收度，按下式计算： 效价（单位/mg）=A/As＊Cs＊12/2＊稀释倍数/W 式中A为供试品溶液的吸收度减去空白溶液的吸收度： As为酪氨酸对照品溶液的吸收度： Cs为酪氨酸对照品溶液的浓度， ug/ml W为供试品重量，mg; 在上述条件下，释放1ug的酪氨酸的酶量为一个活力单位。 试剂酪蛋白溶液：取酪蛋白1g，加0.05mol/L磷酸氢二钠溶液50ml,置沸水浴中煮30分钟，时时搅拌，冷至室温，加0.05mol/L枸椽酸溶液调节PH至6.0±0.1，并迅速搅拌，防止酪蛋白沉淀，用水稀释至100ml（临用新配）。酶稀释液：取无水磷酸氢二钠3.55g，加水400ml溶解，加乙二胺四醋酸二钠1.1g和盐酸半胱氨酸2.74g，振摇溶解，用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠溶液调节PH6.5±0.1，用水稀释至500ml,混匀（临用新配）三氯醋酸溶液:取三氯醋酸17.99g，加醋酸钠29.94g和冰醋酸18.9ml，加适量水溶解后，加水使成1000ml，摇匀。 酶活力测定对照品溶液的制备:精密称取已105℃干燥至恒重的酪氨酸对照品适量，用0.1mol/L盐酸溶液制成每1ml中约含40ug的溶液。供试品溶液的制备:取本品适量（约相当于木瓜酶活力120万单位），精密称定，加酶稀释液振摇，制成每1ml中含200~300单位的溶液，摇匀。 淀粉酶活力测定 实验技术 2008-05-27 18:01:29 阅读213 评论0字号：大中小 一、目的 淀粉是葡萄糖以α-1,4糖苷键及α-1，6 糖苷键连结的高分子多糖，是人类和动物的重要食物，也是食品、发酵、酿造、医药、 纺织工业的基本原料。 淀粉酶是加水分解淀粉的酶的总称，淀粉酶对淀粉的分解作用是工业上利用淀粉的依 据，也是生物体利用淀粉进行代谢的初级反应。小麦成熟期如遇阴雨天气，有的品种会发生
胰蛋白酶活性测定
实验一胰蛋白酶活性测定 实验目的：掌握测定胰蛋白酶浓度、活性、比活的原理与方法。 实验原理：胰蛋白酶相对分子量23.7 KD，主要水解肽链中碱性氨基酸与其它氨基酸相连接的肽键，此外还能水解碱性氨基酸形成的酯键，如把人工合成的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（N-benzuyl-L-argine ethyl ester, BAEE）水解为H-苯甲酰-L-精氨酸（BA）。 胰蛋白酶所催化的上述反应中，产物BA对253 nm 的光吸收远大于BAEE，因此可以在实验起始点把253 nm 的消光值调为零，然后记录反应体系对253 nm 的消光值的增量，并把这个增量作为测定胰蛋白酶的活性指标。 酶活单位定义：在底物BAEE浓度1m mol/L，光程1 cm，波长253nm，温度25 0C，测量体积3mL,.条件下吸光值每分钟递增0.001（A/min=0.001）为1个BAEE酶活单位。 胰蛋白酶制剂中蛋白质浓度含义： 胰蛋白酶含量一般E1%表达。这个值的含义是：浓度为1% 酶蛋白，在1cm光径下，对紫外280nm 的消光值。不同厂家、不同产品的E1%值有很大差别。E1% 值越高，表明酶制剂中酶蛋白含量越高。 由于酶制剂中蛋白质含量各不相同，所以用酶制剂配制E1%的蛋白质溶液时，按照厂家对产品的E1% 的测定值配制溶液。 在本实验中，胰蛋白酶酶蛋白样品采用SIGMA 公司生产的产品,生产公司对展品的描述是对280nm紫外吸收值15.3，配制胰蛋白酶标准溶液可根据厂家的这个说明。 器材以试剂：器材，电子天平，紫外分光光度计，微量加样器。试剂：标准胰蛋白酶，N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯，HCI, Tris。 1．胰蛋白酶活性测定： 1）配制E1%的胰蛋白酶溶液
蛋白酶活力的测定
实验三蛋白酶活力的测定 一、目的 掌握用分光光度计法测定蛋白酶活力的原理与操作技术。 二、原理 蛋白酶水解酪蛋白，其产物酪氨酸能在碱性条件下使福林——酚试剂还原，生成鉬蓝与钨蓝，以比色法测定。 三、试剂及仪器 1．福林—酚试剂 称取50g钨酸钠(Na2WO4?2H2O)，12.5g钼酸钠(Na2MoO4?2H2O)，置入1000mL原底烧瓶中，加350mL水，25mL85%磷酸，50mL浓盐酸，文火微沸回流10h，取下回流冷凝器，加50g硫酸锂(Li2SO4)和25mL水，混匀后，加溴水脱色，直至溶液呈金黄色，再微沸15min，驱除残余的溴，冷却，用4号耐酸玻璃过滤器抽滤，滤液用水稀释至500mL。 使用时用2倍体积的水稀释。 2．0.4mol/L碳酸钠溶液：称取42.4g碳酸钠，用水溶解并定容至1000mL。 3．0.4mol/L三氯乙酸溶液：称取65.5g三氯乙酸，用水溶解并定容至1000mL。 4．2%酪蛋白溶液 称取2.00g酪蛋白(又名干酪素)，加约40mL水和2~3滴浓氨水，于沸水浴中加热溶解，冷却后，用pH7.2磷酸缓冲溶液稀释定容至100mL，贮存于冰箱中。 5．pH7.2磷酸缓冲液 0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液：称取31.2g磷酸二氢钠(NaH2PO4?2H2O)，用水溶解稀释至1000mL； 0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液：称取71.6g磷酸氢二钠(Na2HPO4?12H2O)，用水溶解稀释至1000mL； pH7.2磷酸缓冲溶液：取28mL 0.2mol/L磷酸二氢钠溶液和72mL 0.2mol/L磷酸氢二钠溶液，用水稀释至1000mL。 6．标准酪氨酸溶液： 准确称取0.1g DL-酪氨酸，加少量0.2mol/L盐酸溶液(取1.7mL浓盐酸，用水稀释至100mL)，加热溶解，用水定容至1000mL，每毫升含DL-酪氨酸100微克。 7．仪器：分光光度计、试管 四、操作步骤 1．标准曲线绘制 在上述各管中各取1mL，分别加入5mL 0.4mol/L碳酸钠溶液，1mL福林—酚试剂，于400C水浴显色20min，在680nm波长下测吸光度，绘制标准曲线，在标准曲线上求得吸光度
木瓜蛋白酶酶活力检测方法
木瓜蛋白酶酶活力检测方法 南宁庞博生物工程有限公司企业标准 Q/NPB 01-2019 食品添加剂木瓜蛋白酶制剂 1、范围 本标准规定了食品添加剂木瓜蛋白酶制剂的原辅料要求、技术要求、试验方法、检验规则、标志、包装、运输、贮存。 本标准适用于以木瓜果乳汁为原料，添加葡萄糖，经浸泡提取、过滤、浓缩、干燥、调配粉碎、包装等工艺制成的食品添加剂木瓜蛋白酶制剂。 2、规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T 191-2019 包装储运图示标志 GB/T 601-2002 化学试剂标准滴定溶液的制备 GB/T 602-2002 化学试剂杂质测定用标准溶液的制备 GB/T 603-2002 化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备 GB 2760 食品添加剂使用卫生标准 GB/T 4789.2-2019 食品卫生微生物检验菌落总数的测定 GB/T 4789.3-2019 食品卫生微生物检验大肠菌群计数 GB/T 4789.4-2019 食品卫生微生物检验沙门氏菌检测 GB/T 4789.6-2019 食品卫生微生物检验致泻大肠埃希氏菌检测 GB/T 4789.10-2019 食品卫生微生物检验金黄色葡萄球菌检验 GB/T 5009.3-2019 食品中水分的测定 GB/T 5009.74-2019 食品添加剂中重金属限量试验 GB/T 5009.75-2019 食品添加剂中铅的测定 GB/T 5009.76-2019 食品添加剂中砷的测定 GB 5749-2019 生活饮用水卫生标准 GB/T 6682-2019 分析实验室用水规格和试验方法 GB 7718 预包装食品标签通则 GB/T 8170-2019 数值修约规则与极限数值的表示和判定 GB/T 20880-2019 食用葡萄糖 JJF 1070 定量包装商品净含量检验规则 NY/T 691-2019 番木瓜
分光光度法测定蛋白酶酶活
分光光度法测定蛋白酶酶活 1适用范围 本方法适用于中性蛋白酶、酸性蛋白酶酶活的测定。 2测定原理 蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素（酪蛋白）底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生产钼蓝和钨蓝，用分光光度计于波长680nm下测定溶液吸光度。酶活力与吸光度成正比，由此可以计算产品的酶活力。 酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，10min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。 3仪器和设备 3.1分析天平：精度为0.0001g。 3.2紫外分光光度计。 3.3恒温水浴锅：精度±0.2℃。 3.4PH计：精度为0.01PH单位。 4试剂和溶液 除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和蒸馏水。 4.1福林（Folin）试剂 市售分析纯福林试剂。 4.2福林使用溶液 一份福林试剂与两份水混合，摇匀。 4.3碳酸钠溶液（42.4g/L） 称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，用水溶解并定容至1000ml。 4.4三氯乙酸c（CCl3COOH）=0.4mol/L 称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。 4.5氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L 称取氢氧化钠片剂20.0g，加水900ml并搅拌溶解，待溶液到室温后加水定容至1000ml，摇匀。 4.6盐酸溶液c（HCL）＝1 mol/L及0.1 mol/L
1 mol/L HCL:取90mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。 0.1 mol/L HCL：取9mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。 4.7缓冲溶液 4.7.1磷酸缓冲液（pH＝7.5，适用于中性蛋白酶） 称取磷酸氢二钠（Na2HPO4?12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4?12H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。 4.7.2乳酸缓冲液（pH＝3.0，适用于酸性蛋白酶） 甲液：称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。 乙液：称取乳酸钠（70％）16g，加水溶解并定容至1000 mL。 使用溶液：取甲液8 mL，加乙液1 mL，混匀，稀释一倍，即成0.05mol/L乳酸缓冲溶液。4.810g/L酪素溶液 称取酪素（固定厂家生产，不同厂家产品对实验结果有影响）1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液（若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3滴）湿润后，加入适量的缓冲溶液（测中性蛋白酶加磷酸缓冲液，测酸性蛋白酶加乳酸缓冲液）约80 mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直到完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用适宜的ｐH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。 4.9L－酪氨酸标准溶液（100μg/mL） 称取预先于105℃干燥至恒重的L－酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g，用1mol/L盐酸60 mL 溶解后再用蒸馏水定容至100 mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。 吸取1mg/ mL酪氨酸标准溶液10.00 mL，用0.1mol/L盐酸定容至100 mL，即得到100ug/ mL L－酪氨酸标准溶液。此溶液在冰箱内贮存或立即使用。 5分析步骤 5.1标准曲线的绘制 5.1.1L—酪氨酸标准溶液：按表1配置。L—酪氨酸稀释液应在稀释后立即进行测定。 表1
蛋白酶活力测定方法
酸性蛋白酶产品概述: 蛋白质由氨基酸组成，是自然界中发现的最复杂的有机化合物之一。由盐酸和蛋白酶分解成易被高等动物的肠道和微生物有机体的细胞膜吸收的氨基酸。包括人类在内的每种动物，必须要有足够的蛋白质来维持自身生长，来生成每个细胞所必需的氨基酸，一些特种蛋白质还是某些特殊细胞、腺体分泌物、酶和激素的功能性组成元素。蛋白酶是指一些有催化功能的酶，能够水解（断裂）蛋白质，因此也被称为蛋白水解酶。蛋白水解酶在许多的生理和病理过程中发挥着重要作用，在食品和乳品加工业也有着广泛应用。工作机理 蛋白水解酶制剂本产品能在酸性条件下水解蛋白质食品中的缩氨酸键，释放氨基酸或者多肽。在酒精、葡萄酒、果汁、啤酒、黄油和酱油生产中，添加酸性蛋白酶可澄清发酵液中的雾气。酵母在发酵阶段的生长可以通过悬浮蛋白质转化的氨基酸来加以促进，从而加速发酵并提高产量。本产品是一种酸性蛋白酶制剂，在酸性条件下具有较高活性，由酸性蛋白酶高产菌株——曲霉菌深层发酵而成。它广泛应用于饲料、纺织、废水处理和果汁提纯方面。 酸性蛋白酶（Acid protease ）是指蛋白酶具有较低的最适pH，而不是指酸性基团存在于酶的活性部位，酸性蛋白酶的最适PH从2左右（胃蛋白酶）到4左右。从酶的活力-PH曲线分析，在酶的活性部位中含有一个或更多的羟基。这一类蛋白酶中研究最彻底的是胃蛋白酶。（酸性蛋白酶537容易失活）
简介：酸性蛋白酶是由隆科特黑曲霉优良菌种经发酵精制提炼而成，它能在低PH条件下，有效水解蛋白质，广泛应用于酒精、白酒、啤酒、酿造、食品加工、饲料添加、皮革加工等行业。 1、产品规格：，规格有5万u/g～10万u/g 液体型为黑褐色液体，规格有50000u/ml～10000u/ml. 2、酶活力定义：一个酶活力单位是1g酶粉或1ml酶液在40℃，PH3.0条件下，1分钟水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位（u/g或u/ml） 特性1、温度范围为：最适温度范围为40℃-50℃2、PH为：最适PH范围为2.5～3.5 使用方法 1、白酒工业： 本品用以淀粉为原料的生产酒精及白酒行业，提高出酒率0.25%个酒分，提高发酵速度。 2、食品工业： 食品上用以淀粉改良，提高食品风味、改良品质，因能提高氨基酸含量 3、啤酒生产： 能有效阻断双乙酰生成，缩短啤酒成熟期。 4 饲料添加剂：提高饲料利用率。 5、毛皮软化： 提高上色率，手感丰满，增加毛皮光泽。
木瓜蛋白酶提取实验记录
木瓜蛋白酶实验记录 2016.11.3 实验前准备： 所需试剂的配制： 饱和硫酸铵：取150ml蒸馏水，放入冰桶中，不断加入硫酸铵固体，直至沉淀不能溶解，过滤取滤液，保存在4℃冰箱中。 酶保护剂：准确称量1.21g的半胱氨酸于100ml蒸馏水中，调节PH 至9.0，溶解半胱氨酸，再加入0.1871g的EDTA，定容至250ml，转入棕色瓶中。 预实验：确定实验的可行性 酶液提取： ①用薄的不锈钢刀片沿未成熟的番木瓜的纵线将果皮割破，深度为2~3mm，根据果实大小的不同，每个果实可以5~10条刀口。 ②将木瓜放于一个大烧杯中，使木瓜乳汁流入大烧杯中。 ③收集5ml乳汁加入95ml蒸馏水水，匀速轻柔搅拌1h，得浆液。 ④浆液用8层纱布进行过滤,将所得液分装到离心管中，用离心机在3500r/min的条件下，离心15min。 ⑤收集上清液至一洁净的试管中，既得木瓜蛋白酶原液，-20℃存取10ml酶原液。 ⑥分装木瓜蛋白酶原液，加入2ml酶保护剂（0.04mol/L的半胱氨酸和0.002mol/L的EDTA），混匀后如下表加入试剂。
对静置的酶液继续处理
2016．11.4 试剂配制 考马斯亮蓝G-250染液（0.01%）：称取0.1g考马斯亮蓝G-250固体粉末，溶于50mL 95%乙醇中（95%乙醇取实验室无水乙醇47.5mL加2.5mL蒸馏水）再加入86% 磷酸100mL，倒入1000mL容量瓶加蒸馏水定容至1000mL。静置1h后，取棕色试剂瓶用乙醇清洗干净用滤纸过滤溶液后封存。 重提木瓜蛋白酶 实验设置对照 一组开始即加入酶保护剂编号酶B*、一组加硫酸铵之前才加酶保编号酶*。 ①用薄的不锈钢刀片沿未成熟的番木瓜的纵线将果皮割破，深度为2~3mm，根据果实大小的不同，每个果实可以5~10条刀口。 ②将木瓜放于一个大烧杯中，使木瓜乳汁流入大烧杯中。 ③收集10ml乳汁加入190ml蒸馏水水，匀速轻柔搅拌1h，得浆液。 ④浆液用8层纱布进行过滤,将所得液分装到离心管中，用离心机在3500r/min的条件下，离心15min。 ⑤收集上清液至一洁净的试管中，既得木瓜蛋白酶原液，-20℃存取
分光光度法测定蛋白酶酶活知识讲解
分光光度法测定蛋白 酶酶活
分光光度法测定蛋白酶酶活 1适用范围 本方法适用于中性蛋白酶、酸性蛋白酶酶活的测定。 2测定原理 蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素（酪蛋白）底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生产钼蓝和钨蓝，用分光光度计于波长680nm下测定溶液吸光度。酶活力与吸光度成正比，由此可以计算产品的酶活力。 酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，10min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。 3仪器和设备 3.1分析天平：精度为0.0001g。 3.2紫外分光光度计。 3.3恒温水浴锅：精度±0.2℃。 3.4PH计：精度为0.01PH单位。 4试剂和溶液 除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和蒸馏水。 4.1福林（Folin）试剂 市售分析纯福林试剂。 4.2福林使用溶液 一份福林试剂与两份水混合，摇匀。 4.3碳酸钠溶液（42.4g/L） 称取无水碳酸钠（Na 2CO 3 ）42.4g，用水溶解并定容至1000ml。 4.4三氯乙酸c（CCl 3 COOH）=0.4mol/L 称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。 4.5氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L 称取氢氧化钠片剂20.0g，加水900ml并搅拌溶解，待溶液到室温后加水定容至1000ml，摇匀。
4.6盐酸溶液c（HCL）＝1 mol/L及0.1 mol/L 1 mol/L HCL:取90mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。 0.1 mol/L HCL：取9mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。 4.7缓冲溶液 4.7.1磷酸缓冲液（pH＝7.5，适用于中性蛋白酶） 称取磷酸氢二钠（Na2HPO4?12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4?12H2O） 0.5g，加水溶解并定容至1000mL。 4.7.2乳酸缓冲液（pH＝3.0，适用于酸性蛋白酶） 甲液：称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。 乙液：称取乳酸钠（70％）16g，加水溶解并定容至1000 mL。 使用溶液：取甲液8 mL，加乙液1 mL，混匀，稀释一倍，即成0.05mol/L乳酸缓冲溶液。 4.810g/L酪素溶液 称取酪素（固定厂家生产，不同厂家产品对实验结果有影响）1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液（若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3滴）湿润后，加入适量的缓冲溶液（测中性蛋白酶加磷酸缓冲液，测酸性蛋白酶加乳酸缓冲液）约80 mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直到完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用适宜的ｐH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。 4.9L－酪氨酸标准溶液（100μg/mL） 称取预先于105℃干燥至恒重的L－酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g，用 1mol/L盐酸60 mL溶解后再用蒸馏水定容至100 mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。 吸取1mg/ mL酪氨酸标准溶液10.00 mL，用0.1mol/L盐酸定容至100 mL，即得到100ug/ mL L－酪氨酸标准溶液。此溶液在冰箱内贮存或立即使用。 5分析步骤 5.1标准曲线的绘制 5.1.1L—酪氨酸标准溶液：按表1配置。L—酪氨酸稀释液应在稀释后立即进行测 定。
木瓜蛋白酶的提取
木瓜蛋白酶的提取、分离纯化及其生物学研究综述及实验方法 13生物技术第二大组第二小组 组员：王玓玥（组长）、王子贺、王思瑶、王宇涛、王守鑫、谭国栋一、研究背景： 在经济飞速发展的今天，人们的生活水平已远远不只在于吃饱穿暖，食品的安全和营养问题受到人们越来越多的关注，绿色健康的生活也成为大家共同的追求，木瓜蛋白酶以它自身耐热及特殊结构等特点被广泛的用于食品行业，如何分离纯化得到高纯度低成本的木瓜蛋白酶则是人们现在研究的重点，本小组便也以此为研究主题展开实验。 二、木瓜蛋白酶基本介绍：木瓜蛋白酶，又称木瓜酶，是一 种蛋白水解酶。木瓜蛋白酶是番木瓜中含有的一种低特异性蛋白水解酶，广泛地存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸，属于巯基蛋白酶，它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特点，这种蛋白水解酶，分子量为23406，由一种单肽链组成，含有212个氨基酸残基。至少有三个氨基酸残基存在于酶的活性中心部位，他们分别是Cys25、His159和Asp158，当Cys25被氧化剂氧化或与金属离子结合时，酶的活力被抑制，而还原剂半胱氨酸（或亚硫酸盐）或EDTA能恢复酶的活力木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。它的外观
为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性；木瓜蛋白酶溶于水和甘油，水溶液为无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。木瓜蛋白酶是一种含巯基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶 的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，但几乎不能分解蛋白胨。木瓜蛋白酶的最适合PH值6～7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点（pI）为8.75；木瓜蛋白酶的最适合温度55～65℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。。另外六个半胱氨酸残基形成了三对二硫键,且都不在活性部位。纯木瓜蛋白酶制品可含有：（1）木瓜蛋白酶，分子量21000，约占可溶性蛋白质的10%；（2）木瓜凝乳蛋白酶，分子量26000，约占可溶性蛋白质的45%；（3）
木瓜蛋白酶
发酵工程与设备课程论文 题目木瓜蛋白酶 班别学号 姓名 成绩
木瓜蛋白酶 摘要：木瓜蛋白酶是一种能分解蛋白质的蛋白酶。先了解木瓜蛋白酶的制备及保存，接着分析它的化学修饰和酶活力的影响。最后，木瓜蛋白酶的固定化及方法以及它在各个行业的应用。Abstract: Papain is a protease that breaks down proteins.To understand the preparation and preservation of papain and then analyzed its chemical modification and enzyme activities.Finally, the immobilized papain and the method and its application in various industries 关键字：木瓜蛋白酶化学修饰酶活力固定化行业的应用Keywords:papain Chemical modification enzyme immobilization industry applications 木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。它的外观为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性。它是利用未成熟的番木瓜果实中的乳汁，采用现代生物工程技术提炼而成的纯天然生物酶制品。它是一种含疏基肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，还具有合成功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。溶于水和甘油，水溶液无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。 作为植物来源的蛋白酶来说，此酶研究进展的最快。此酶主要是以内肽酶的形态起作用。活性的产生，而半胱氨酸残基是不可缺少的，所以是硫基蛋白酶的一种，底物的特异性不太严格，分子量为23400，氨基酸残基数212。 一、木瓜蛋白酶的制备及保存 木瓜蛋白酶的制备是将未成熟番木瓜果实割取乳液去杂，在室温下，入半胱氨酸溶液在研钵中充分磨匀，静置后取上清液即
酶活力的测定 国标
木瓜蛋白酶活力的测定 一、试剂与溶液 1. 三氯乙酸 称取三氯乙酸6.54g，用水溶解并定容至100mL。 2. L-酪氨酸标准储备溶液（100μg/mL） 精确称取L-酪氨酸0.1000g，用1mol/L盐酸溶液60mL溶解后定容至100mL，即为1mg/mL酪氨酸溶液。 吸取1mg/mL酪氨酸溶液10.00mL，用0.1mol/L盐酸溶液定容至100mL，即得到100μg/mL的L-酪氨酸标准储备溶液。 3. 氢氧化钠溶液（20g/L） 称取氢氧化钠2g，加水搅拌溶解。待溶液到室温后，以水定容至100mL，搅拌均匀。 4. 盐酸溶液 1mol/L:取22.5ml的浓盐酸溶液，加水定容至250ml。 0.1mol/L：取1.8ml的浓盐酸溶液，加水定容至200ml。 5. 酪蛋白溶液（10.0g/L） 称取标准酪蛋白1g，用少量氢氧化钠溶液润湿，加入相应的缓冲溶液约80mL，在沸水浴中100℃加热回流30min。冷却到室温后转入100mL容量瓶中，用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为3d。使用前重新确认并调整pH至规定值。
二、分析步骤 1. 标准曲线的绘制 L-酪氨酸标准溶液：按表1配制。L-酪氨酸稀释液应在稀释后立即进行测定。 表1 L-酪氨酸标准溶液 分别取上述所配的溶液，以0管为空白，利用紫外分光光度计于波长275nm下测定吸光度。以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线。利用回归方程，计算出吸光度为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K值。其K值应在130~135范围内，如不符合，需重新配制试剂，进行实验。 2. 样品的测定 待测酶液的制备：称取酶样品1g。然后用磷酸缓冲溶液充分溶解，定容至50ml。 测定：先将酪蛋白溶液置于（40±0.2）℃恒温水浴中，预热5min，
2020年测定蛋白酶活力实验(课件)
2020年测定蛋白酶活力实验 （课件） 测定蛋白酶活力实验 一、实验目的?１.加深了解酶活力的概念.?2。学习掌握测定蛋白酶活力的方法。 二、实验原理?酶活力指酶催化某一特定反应的能力。其大小可用在一定条件下酶催化反应进行一定时间后，反应体系中底物的减少量或产物的生成量来表示。 酶活力单位是表示酶活力大小的重要指标。本实验规定酶活力单位(U)为一定条件下每分钟分解1μｇ酪氨酸所需的酶量。实验选用枯草杆菌蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸的反应体系。产物酪氨酸在碱性条件下与Fｏlin-酚试剂反应生成蓝色化合物,该蓝色化合物在680nm 处有最大光吸收，其吸光值与酪氨酸含量呈正比. 因此通过测定一定条件下产物酪氨酸的含量变化，可计算出蛋白酶的活力. 三、仪器和试剂?仪器：?恒温水浴锅、分光光度计、试管及试管架、干燥滤纸、玻璃漏斗。?原料?枯草杆菌蛋白酶：称取1g 枯草杆菌蛋白酶粉，用少量0.0２ｍoｌ/L，pH7.5磷酸缓冲液溶解并定容至100mL，震荡1５分
钟，使充分溶解，干纱布过滤,取滤液冰箱备用。使用时视酶活力高低用缓冲液适当稀释.?试剂?1. Folin－酚试剂：?在2L 磨口回流瓶中加入钨酸钠（Ｎａ2WoＯ4 . 2H2O）1０0g，钼酸钠（Na２WｏＯ４. 2H2O）25g,蒸馏水７00mL，８5％磷酸５0ｍL 以及浓盐酸100ｍL,充分混匀后,微火回流加热1０小时。再加入硫酸锂15０g,蒸馏水5０mL 和液溴数滴，摇匀后开口继续煮沸15min，以驱赶过剩的溴。冷却后加蒸馏水定容至1000mL，过滤,溶液呈黄绿色，置于棕色试剂瓶中暗处贮藏。使用前用标准NａOH 溶液、酚酞为指示剂标定酸度（约为2moｌ/L),然后加水稀释至1mｏｌ／Ｌ，即可使用.?２.0.2mol/L 盐酸溶液3．0.04moｌ/L 氢氧化钠溶液?4．0。5５mol/L 碳 10%三氯乙酸溶液酸钠溶液?5 . 6. ０．0２mol／LpＨ7。5磷酸缓冲液：称取磷酸氢二钠(Na2ＨPO4 ． 12H2O)7。１6g，用水定容至100mL(A 液);称取磷酸二氢钠（Na2HPＯ4 .１2H2Ｏ）3.1２ｇ,用水定容至１0０mL(B 液)。取 A 液84mL，Ｂ液１6mL 混合后，得到0．2mol/LpH 7.５磷酸缓冲液，可长期 7。标准酪氨酸溶液存放。临用时稀释10倍即可。? （50μg/mL）：称取１２．5ｍg 以烘干至恒重的酪氨酸，用0.2ｍoｌ/L 盐酸约３0mＬ溶解后，蒸馏水定容至２50mL。
蛋白酶活性的测定
实验四蛋白酶活力的测定 一、实验目的 1、了解蛋白酶活力测定的原理； 2、掌握蛋白酶活力测定的方法。 二、实验原理 蛋白酶在一定条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键，也能够水解酰胺键和酯键，因此可用蛋白质或人工合成的酰胺及酯类化合物作为底物来测定蛋白酶的活力。 本实验选用酪蛋白为底物，测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。酪蛋白经蛋白酶作用后，降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸溶液中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。在280nm波长下测定溶液吸光度的增加，就可计算酶的活力。 三、实验试剂 ①微生物蛋白酶萃取液（ml）：称取酶制剂，加100ml蒸馏水搅拌30min，在4℃下离心分离后，将上层清夜置于冰箱中保存，使用前稀释一定倍数； ②L磷酸盐缓冲液（）； ③1%酪蛋白溶液：取酪蛋白，加100ml L磷酸盐缓冲液（），加热并搅拌使它完全分散，然后置于冰箱中保存； ④5%三氯醋酸（TCA）溶液。 四、实验步骤 1、将5%TCA溶液和1%酪蛋白溶液在37℃下保温。 2、取四支15ml具塞试管，分别标上记号A1、A0、B1和B0。在A1和A0试管中各吸入酶液，在B1和B0试管中各吸入酶液，分别用L磷酸盐缓冲液定容至。在
A0和B0试管中各吸入%三氯醋酸溶液，上述四支试管都置于37℃水浴中保温。 3、在各试管中吸入 1%酪蛋白溶液，在37℃下保温10min（准确计时）后，再向A1和B1试管中吸入%三氯醋酸溶液。 4、将试管从水浴中取出，在室温下放置1h，用少量上清液润湿滤纸后过滤，保留滤出液。 5、在280nm波长下，分别以A0和B0滤液为空白，测定A1和B1滤液的吸光度。 五、计算 1、在规定的实验条件下，以每分钟增加吸光度定义为一个酶单位。 2、每克酶制剂中酶活力的计算： ?A ×1000 / (t ×w) 酶活力单位/克酶制剂 式中，?A——样品与空白吸光度差值（即A1和B1的吸光值）；t ——酶作用时间（本实验为10min）；w——反应中酶的用量，g 六、说明 1、微生物蛋白酶粗提取液在较宽广的PH范围表现出活力，但是在接近中性条件下最有最高活力。 2、微生物蛋白酶在45℃以下可保持较长时间的稳定性。 七、思考题 1、蛋白酶有哪几类 2、影响酶活力的因素有哪些 3、使用紫外分光光度计时应注意哪些问题 六、数据记录与处理 A1 = B1 = 酶含量为 ml 酶活力1 = ?A × 1000 / (t × w) = ×1000/10/=×105酶活力单位/克酶制剂
1木瓜蛋白酶性质测定
木瓜蛋白酶性质测定 一、实验目的 1、学习并掌握木瓜蛋白酶活性测定的基本原理。 2、掌握影响木瓜蛋白酶性质的不同因素，如激活剂(如EDTA、半胱氨酸)，抑制剂、pH 等。 二、实验原理 木瓜蛋白酶（Papain）是一种巯基蛋白酶，它分解比胰脏蛋白水解酶更多、更广泛的蛋白底物。它也具有脂酶活力。其分子量约为23 000 左右。木瓜蛋白酶是单条肽链，由211个氨基酸残基折叠成两部分形成裂缝，酶分子只有1 个巯基，对酶活力是必需的，激活剂有半胱氨酸、硫化物、亚硫酸盐和 EDTA等；抑制剂有巯基试剂，包括重金属、羧基试剂和过氧化氢等。 酪蛋白是一种蛋白质，它被木瓜蛋白酶降解生成的酪氨酸在紫外光区275 nm 处有吸收峰，根据测定275 nm 处的吸收值，可以判定木瓜蛋白酶的酶活力。吸收值的大小与酪氨酸含量的多少有关，吸收值大说明酪氨酸含量高，也就是说木瓜蛋白酶分解的酪蛋白多，酶活力高。 三、仪器和试剂 1、市售木瓜蛋白酶； 2、仪器设备：磁力搅拌器（机）；离心机7000rpm（冷冻式）；紫外分光光度计；水浴槽；冰箱及常规玻璃仪器。 四、实验步骤 （一）激活剂（EDTA）对木瓜蛋白酶活力的影响 1、试剂 （1）3 mg·mL-1 木瓜蛋白酶液（用 0.1 mol/L 的磷酸缓冲液，pH 7.2 配制）；（2）0.1 mol·L-1的磷酸缓冲液，pH 7.2 ； （3）激活剂：用 0.1 mol·L-1磷酸缓冲液（pH 7.2）配制含10 m mol·L-1半胱氨酸，分别含有0，0.2，0.6，1.0，2.0，4.0 m mol·L-1EDTA 的6 种混合液；（4）1%酪蛋白溶液：用0.1 mol·L-1磷酸缓冲液（pH 7.2）配制； （5）15%三氯乙酸（TCA）溶液。 2、方法 EDTA 浓度 （mmol·L-1） 0 0.2 0.6 1.0 2.0 4.0 管号0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 酶液（mL）0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 EDTA（mL） 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 37 ℃水浴预热10 min 1%酪蛋白（mL）0 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 37 ℃水浴10 min TCA（mL） 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
测定蛋白酶活力实验
测定蛋白酶活力实验 一、实验目的 1.加深了解酶活力的概念。 2.学习掌握测定蛋白酶活力的方法。 二、实验原理 酶活力指酶催化某一特定反应的能力。其大小可用在一定条件下酶催化反应进行一定时间后，反应体系中底物的减少量或产物的生成量来表示。 酶活力单位是表示酶活力大小的重要指标。本实验规定酶活力单位(U)为一定条件下每分钟分解1μg 酪氨酸所需的酶量。 实验选用枯草杆菌蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸的反应体系。产物酪氨酸在碱性条件下与Folin-酚试剂反应生成蓝色化合物，该蓝色化合物在680nm 处有最大光吸收，其吸光值与酪氨酸含量呈正比。 因此通过测定一定条件下产物酪氨酸的含量变化，可计算出蛋白酶的活力。 三、仪器和试剂 仪器:
恒温水浴锅、分光光度计、试管及试管架、干燥滤纸、玻璃漏斗。 原料 枯草杆菌蛋白酶：称取1g 枯草杆菌蛋白酶粉，用少量L，磷酸缓冲液溶解并定容至100mL，震荡15分钟，使充分溶解，干纱布过滤，取滤液冰箱备用。使用时视酶活力高低用缓冲液适当稀释。 试剂 1. Folin-酚试剂： 在2L 磨口 回流瓶中加入钨酸钠(Na2WoO4 . 2H2O)100g，钼酸钠(Na2WoO4 . 2H2O)25g，蒸馏水700mL，85%磷酸50mL 以及浓盐酸100mL，充分混匀后，微火回流加热10小时。再加入硫酸锂150g，蒸馏水50mL 和液溴数滴，摇匀后开口继续煮沸15min，以驱赶过剩的溴。冷却后加蒸馏水定容至1000mL，过滤，溶液呈黄绿色，置于棕色试剂瓶中暗处贮藏。使用前用标准NaOH 溶液、酚酞为指示剂标定酸度(约为 2mol/L)，然后加水稀释至1mol/L，即可使用。 2. 0.2mol/L 盐酸溶液 3. L 氢氧化钠溶液
木瓜蛋白酶中英文对照
Papain Papain [9001-73-4] Papain is a purified proteolytic substance derived from Carica papaya Linné(Fam.caricaceae).papain,when assayed directed herein, contains not less than 6000 units per mg. Papain of a higher digestive power may be reduced to the official standard by admixture with papain of lower activity ,lactose,or other suitable diluents. One USP Unit of papain is the activity that releases the of 1μg of tyrosine from a specified casein substance under the conditions of the Assay， using the enzyme concentration that liberates 40μg of tyrosine per mL of test solution. Packaging and storage－Preserve in tight,light-resistant containers in a cool place. USP reference standards (11)—USP papain RS. pH<791>:between 4.8 and 6.2 in a solution (1 in 50). Loss on drying <731>—Dry it in a vacuum oven at 60℃ for 4 hours : it losses not more than 7.0% of its weight. Assay (casein digestive power)— Dibasic sodium phosphate.,0.05M—dissolve 7.1g of anhydrous dibasic sodium phosphate in water to make 1000mL.add 1 drop of toluene as a preservative. Citric acid,0.05M—dissolve 10.5g of citric acid monohydrate in water to make 1000mL. Add 1 drop on toluene as a preservative. Casein substrate—Disperse 1 g of Hammersten-type casein in 50 mL on 0.05M Dibasic sodium phosphate. Place in a boiling water bath for 30 minutes with occasional stirring.Cool to room temperature ,and add 0.05 M Citric acid to adjust to a pH of 6.0±0.1.stir the solution rapidly and continuously during the addition of the 0.05M Citric acid to prevent precipitation of the casein. Dilute with water to 100 mL .prepare fresh daily. Buffer solution (Phosphate-Cysteine Disodium ethylenediaminetetraacetate Buffer)
各种酶活力测定方法及注意事项
碱性蛋白酶及各种蛋白酶活力测定方法及测定有感 因长期测定碱性蛋白酶酶活力与角蛋白酶活力与胶原酶活力和弹性蛋白酶活力，碱性蛋白酶活力测定还好，因有国家标准，测定按照国标来便可大大减少误差。其余酶活力测定过程中因无统一标准且底物差异大，导致长期酶活力测定的混乱，各种酶活力测定方法与各种试剂添加，最后实际测定的酶活力只能仅作参考。 以下是各种蛋白酶活力测定方法及标曲绘制： 碱性蛋白酶测定方法 根据国标GB/T 23527-2009 附录B 蛋白酶活力测定福林法 以下是方法
碱性蛋白酶的测定方法参考 GB/T 23527-2009 附录 B 中福林酚法进行，即 1 个酶活力单位（U/mL）定义为 1 mL 酶液在 40℃、pH= 10.5 条件下反应 1 min 水解酪蛋白产生 1 μg 酪氨酸所需要的酶量，主要步骤如下。 2.2.6.1 标准曲线的绘制 （1）L-酪氨酸标准溶液：按表 2-6 配制。 表 2-6 L-酪氨酸标准溶液配置表 Table 2-6 L-Tyrosine standard solution form 管号酪氨酸标准溶液的浓度/ （μg/mL） 取 100 μg/mL 酪氨酸标准 溶液的体积/（mL） 取水的体积/ （mL）
0 0 0 10 1 10 1 9 2 20 2 8 3 30 3 7 4 40 4 6 5 50 5 5 （2）分别取上述溶液各 1.00 mL，各加 0.4 mol/L 碳酸钠溶液 5.0 mL，福林试剂使用 液 1.00 mL，置于 40 ℃±0.2 ℃水浴锅中显色 20 min，用分光光度计于波长 680 nm，10 mm 比色皿，以不含酪氨酸的反应管作为空白，分别测定其吸光度值，以吸光度值 A 为纵坐标，酪氨酸浓度 C 为横坐标，绘制 L-酪氨酸标准曲线。 图 2-1 L-酪氨酸标准曲线 Fig. 2-1 L-tyrosine standard curve 根据作图或用回归方程计算出当吸光度为 1 时的酪氨酸的量（μg），既为吸光度常数 K 值。其 K 值应在 95-100 范围内。上图所示标准曲线符合要求，可用于下一步实验。 2.2.6.2 测定方法 （1）计算方法 X = A × K × 4 / 10 × n = 2 / 5 × A × K × n 式（2-1） 式中，X —样品的酶活力，μ/g； A —样品平行实验的平均吸光度； K —吸光常数； 4 —反应试剂的总体积，mL； 10—反应时间 10 min，以 1 min 计； n —稀释倍数。 （2）测定方法 ①先将干酪素溶液放入 40 ℃±0.2 ℃恒温水浴中，预热 5 min。 ②按下列程序操作，进行测定。 于 680 nm 波长，用 10 mm 比色皿测其吸光度。
紫外分光光度法测蛋白酶酶活-2013
2013/05/13 紫外分光光度法测蛋白酶酶活 1、原理 蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。根据吸光度计算其酶活力。酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。 2、试剂和溶液 三氯乙酸、氢氧化钠、盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、乳酸、乳酸钠、硼酸钠（硼砂）均为分析纯，酪素、酪氨酸为生化试剂。 2.1 三氯乙酸c（CCL3·COOH）=0.4mol/L 称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。 2.2 氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L 按GB601配制。 2.3 盐酸溶液c（HCL）＝1 mol/L及0.1 mol/L 1 mol/L HＣＬ:取90mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。 0.1 mol/L HＣＬ：取9mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。 2.4 缓冲溶液 a、磷酸缓冲液（pH＝7.5）适用于中性蛋白酶 称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4·12H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。 b、乳酸缓冲液（pH＝3.0）适用于酸性蛋白酶 甲液称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。 乙液称取乳酸钠（70％）16g，加水溶解并定容至1000 mL。 使用溶液取甲液8 mL，加乙液1 mL，混匀，稀释一倍，即成0.05moi/L乳酸缓冲溶液。 c、硼酸缓冲溶液（pH＝10.5）适用于碱性蛋白酶 甲液称取硼酸钠（硼砂）19.08g，加水溶解并定容至1000 mL。 乙液称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000 mL。 使用溶液取甲液500 mL、乙液400 mL混匀，用水稀释至1000mL。 上述各种缓冲溶液，均须用pH计校正。