端粒酶的研究进展(2)
中图分类号:Q55文献标识码:A文章编号:1002-5064(2001)04-0005-04#综述与专论#
端粒酶的研究进展
Advance s of the Research on the Telomerase
陈新荣林爱星*陈永福
CH EN X in-ro ng LI N Ai-xing C H EN Y o ng-fu
中国农业大学西校区农业生物技术国家重点实验室,北京100094
National Laboratories for Agrbiotechnology,China Agricultural University,Beijing100094
摘要:端粒酶是由R NA模板和蛋白质催化亚基组成的核糖蛋白颗粒。它解决染色体的未端复制问题,归属于逆转录酶家族又和逆转录酶有一定的差别。端粒酶的缺失能在细胞和机体水平引起各种疾病的发生,且端粒的过度表达和细胞的永生化和癌变直接相关,其中端粒蛋白在此过程中可能起调控作用。端粒酶的结构和功能决定了它有广泛的应用前景。
关键词:端粒梅;端粒蛋白;永生化;肿瘤生成
A bstra ct:Telomerase is a r ibonucleoprotein r esponsible in most eukaryotes for replication of the end of chromosmes.Its
R NA subunit acts as a template for the systhesis of telomeric DNA,while a protein component catalyzes t his process to make up for conventional DNA polymerases.inability to replicate completely the end of linear DNA.It belongs to the re2 verse transcr iptase family but differ s from reverse tr anscriptase.T he absence of telomerase can induce many diseases in cell and organ level.The overexpression of telomerase has close relat ionship with cell.s immortalizat ion and tumorigenesis and t he telomere associated proteins play a important role in the process.The structure and function of telomerase suggest its extensive application in the near futur e.
K e y words:telomerase;telomere associated protein;immortal;tumor progression
染色体的未端复制问题是指线性DNA进行复制时,DNA聚合酶既不具有从头合成的能力又不具有3c y5c方向的合成能力,它必须以RNA为引物,当5c末端的引物被切除后,剩下5c未端的引物空隙没法填补这样就导致了子代DNA中的一条链比亲代DNA短出一段(至少相当于或大于RNA引物链的长度),如果没有适当的机制来补充这一段空隙,经过连续的复制后,子代DNA将越来越短。真核生物依靠端粒酶解决染色体的末端复制问题。端粒酶发挥作用时,它直接作用于端粒酶的领先链[1]进行阵发式的延伸,而端粒酶的滞后链是由DNA聚合酶按照常规的方式合成的,且端粒领先与滞后链的合成紧密相关。事实上,当滞后链的聚合酶出现某些缺限时,端粒酶也不再介导领先链的合成。如果滞后链不伴随领先链的合成而延长的话,端粒酶将在染色体的末端产生一段很长的单链片段,这种单链片段不仅容易引起染色体的高度重组,而且极容易被视作DNA损伤的信号引起细胞周期检测点的抑制。因此,领先链和滞后链的相伴而行对提高基因组的稳定性具有极其重要的意义。
1端粒酶的起源及其与逆转录酶的关系通常人们认为[2],真核生物的原始祖先是由古细菌和革兰氏阴性菌形成的嵌合体进化而来,形成通用原始祖先,它与紫细菌共生获得原始线粒体,和蓝细菌共生获得叶绿体。原生动物贾弟虫既没有线粒体也没有叶绿体,和最原始的真核生物相类似。然而,贾弟虫中却含有端粒序列(TAGGG)n,此序列的长度极有可能是由端粒酶来维持的,因而如果能
*通讯作者。E-mail:linaix@https://www.wendangku.net/doc/d85160344.html,
在贾弟虫中检测到端粒酶活性,则能有力地支持端粒酶是个很古老的结构这一假说。如果真如系统分析所假设的那样,端粒酶在古真核细胞中就已存在,那么一小部分昆虫的亚群和绝大多数植物一定是在其进化过程中把端粒酶丢失了,这些物种或者通过反转录转座或者通过重组来延伸他们的端粒DNA。
端粒酶以RNA为模板催化合成DNA,其结构和催化合成端粒的机制都与逆转录酶相似,人们也因此把它归属于逆转录酶家族。虽然端粒酶的结构和功能都已表明它隶属于逆转录酶家族这一事实确凿无疑,然而进一步的蛋白质序列分析表明端粒酶和反转录病毒及反转录转座子之间存在着明显的差别:如端粒酶中的T基元是在其它逆录酶中不存在的专属于端粒酶的特有基元,端粒酶中基元A和基元B c之间的距离明显长于其它逆转录酶之间的距离。Ware[3]总结了原生动物四膜虫端粒酶和反转录病毒的逆转录酶之间的几个较为明显的差别:一,反转录病毒能以不同的RNA分子作为模板合成DNA,而端粒酶的模板则限定于它分子本身内部的RNA;二,反转录病毒能以一段很长的RNA序列作为它的模板,而端粒酶只局限于模板区的少数碱基,其模板的界限由RNA分子的二级结构和端粒酶分子本身含有的信息所界定;三,端粒酶能一次应用同一DNA引物和RNA模板进行多次端粒重复序列的合成,而逆转录酶病毒一次只合成一段DNA。
2端粒酶的结构
端粒酶是一种由RNA和蛋白质亚基组成的核糖核蛋白颗粒。其中蛋白质发挥催化合成端粒重复序列的功能,人们把它命名为端粒酶反转录酶(Telomerase Reverse Transcriptases TERTs)[2],另外人们把芽殖酵母和裂殖酵母的催化亚基基因分别命名为EST2(Ever shorter telomeres2)和trt1+,GDP (基因组数据库)已批准把人类端粒酶催化亚基基因统一命名为hTERT,这个基因在被不同研究小组别分克隆出时曾给与了一些不同的名字,如hTRT (Nakamuraet et al,1997)、hEST2(Meyerson et al, 1997)等等。端粒酶中的RNA组分执行模板的功能,人们把它命名为端粒酶RNA(TR)。端粒酶的T ERT组分最先在游扑虫中被鉴定出,随后在包括人、老鼠、裂殖酵母、芽殖酵母[4]等的有机体内都检测到了端粒酶催化亚基活性的存在并克隆出了他们的T ERT基因。端粒酶的催化亚基从游扑虫到酵母到人结构都非常保守,它们都含有端粒酶特有基元T和7个保守的反转录酶基元[5]。端粒酶催化亚基中氨基酸的保守性对端粒酶发挥其正常的功能起重要作用,H aering等[6]发现,如果裂殖酵母端粒酶催化亚基的基元A、基元C、基元1和基元B c中的保守的天冬氨酸突变成丙氨酸,突变株会表现出生长缺限,端粒DNA的进行性丧失等特征,而进行体外实验时则表现出端粒酶活性的完全丢失。由于酵母、哺乳动物和小腔游扑虫在系统发生树上差异很大,而它们的端粒酶催化亚基的结构却高度保守,进一步说明端粒酶是一种非常古老的结构。
2.1TR的二级结构
从1995年Feng[7]克隆出人端粒酶RNA组分开始,TR的二级结构便成为人们非常感兴趣的课题。为了研究TR二级结构的通用性,Chen等[4]克隆了32个新的端粒酶RNA基因,这些基因归属于5类不同脊推动物门,32个物种包括18种哺乳动物、2种禽、1种爬行动物、7种两栖动物和4种鱼。应用系统发生比较法发现,在所有脊推动物的TR中都有一个包含4个保守结构域的二级结构。用系统比较分析法得出的T R二级结构与用同样方法分析24种不同游扑虫所得的二级结构一致,表明TR的二级结构存在广泛的保守性。然而,序列分析的结果却表明,不同物种的TR之间缺乏序列的一致性。Chen认为,端粒酶在进化过程中受到的进化压力相对较小,因而产生了较快的进化率,导致碱基序列间差异较大,而其二级结构的保守性说明其功能的保守性。只要能维护功能,用什么样的碱基对来维持其相对保守的二级结构并不很重要。Tfzati[13]的最新研究证明了这一点。他们采用突变法证明酵母T R模板的边界是RNA本身的结构,而不是由RNA 特定的碱基序列来界定的。
2.2.1端粒蛋白功能端粒长度的维持是一个非常复杂的过程,除了端粒酶在其中发挥重要作用之外还涉及到多个端粒蛋白和调节因子的参与。在此我们仅以芽殖酵母为例探讨诸端粒蛋白质所涉及的功能。在芽殖酵母(S.cerevisiae)中至少有25种[1]端粒蛋白质基因参与了端粒长度的调控。其中,一
些基因产物有助于把端粒酶招募到染色体的末端保护染色体末端免遭降解;一些基因产物通过DNA重组维护端粒长度;另外一些基因产物对端粒酶进行正调控或负调控;还有一些基因产物则通过间接的方式和端粒酶发生作用。这些基因通过什么机制调节端粒酶的活性到目前尚不很清楚。
2.2.2端粒蛋白的保守性虽然哺乳动物和酵母的端粒之间存在高度的保守性,两者的端粒酶之间也存在着明显的相关性,但是在它们的端粒蛋白质水平上却找不到统一的途径。早在90年代初就已鉴定的人类端粒重复序列结合蛋白TRF1和TRF2以及与T RF相互作用的端粒结合蛋白T IN2和tankyrase在酵母中都找不到其类似物。同样,芽殖酵母中的一系列端粒蛋白在哺乳动物中也没有找到对应物。对这个问题的突破自于Li等[8]的工作。他们在培养的哈雷细胞中找到了酵母端粒蛋白scRapl的类似物并将之命名为hRapl,虽然hRap1不象scRapl那样直接作用于端粒DNA,它必须由T RF2招募才能发挥功能,但是这两种蛋白的结构和功能都具有明显的相关性。进一步把端粒蛋白之间的比较延伸到裂殖酵母,Li发现裂殖酵母(S. pombe)中最主要的端粒蛋白T aZl[9]就是TRF的同源类似物,表明TRFs在真核生物界具有高度保守性。综合他们的研究认为,原始的端粒既含有端粒蛋白TRF又含有端粒蛋白Rapl。芽殖酵母在其进化过程中丢失了端粒蛋白TRF组分而保留了Rap 组分,这种有选择性的保留可能与端粒重复序列的改变有关。
3端粒酶与疾病的关系
不管是在器官水平上,还是在机体水平上端粒酶和许多重要的生理过程和病理过程都紧密相关。Lee[11]发现,端粒酶在高度再生器官系统中发挥重要作用。缺失端粒酶模板RNA的小鼠(mTR-/-
小鼠)在连续传代时,mTR-/-小鼠的后代丧失了精子生成的能力,同时细胞程序性凋亡速度加快,造血细胞造血功能下降,与这些缺陷相应的是端粒序列丢失和染色体丢失及染色体末端相互融合。Her2 rera等[12]发现,mTR-/-小鼠的后代经抗原免疫后生发中心的数量与野生型小鼠相比急剧下降。通常情况下抗原免疫后,野生型脾细胞的端粒延长,脾脏生发中心端粒酶催化亚基也同时高水平表达。生发中心的特征是选择性地把B淋巴细胞扩增成记忆B细胞,被维持的端粒长度则使生发中心在免疫反应中使B淋巴细胞得以大量扩增。综合他们的研究可得结论:端粒酶介导了由抗体引起的免疫反应。此外,H errera[13]还在机体水平上研究了mT P-/-
小鼠表现出的一系列功能障碍。他们在C57BL6背景下产生出mTR-/-突变小鼠,这些突变鼠的端粒比原始的C57BL6/129S混合遗传背景下的小鼠的端粒明显缩短,其寿命也由mTR-/-小鼠的六代降低到四代,与突变鼠生存能力减弱的同时还伴随后代端粒的缩短、不育、脾脏萎缩,B细胞和T细胞扩增能力下降,血液学的异常化和小肠萎缩。另外Rudolph[14]也发现在机体的衰老过程中,端粒长度在维持机体健康方面发挥重要作用。
由于端粒酶的缺限引起疾病的最典型的例子是先天性角化不良症[15]。与X染色连锁的人类疾病先天性角化不良症(DKC)是由于编码角化蛋白(dyskerin)的基因发生突变引起的。患者在高度再生组织如皮肤和骨髓出现障碍且容易诱导形成肿瘤,其染色体也表现出不稳定性。角化蛋白是一种假尿苷合成酶,DKC的发生是由于核糖体RNA的处理过程出现了障碍。Mitchell发现,角化蛋白质不仅和H/ACA核仁小RNA有关,而且和含有H/ ACA RNA基元的端粒酶RNA也有密不可分的关系。处于病理状态的DKC细胞低水平地表达端粒酶RNA,由此产生低水平的端粒酶活性和较之正常细胞更短的端粒长度,最终限制了皮肤和血液的再生能力。
4端粒酶的应用
人类细胞经过一定次数的细胞分裂后,最终都要进入复制衰老状态而终止分裂。Bodnar等[10]最先在两种人类端粒酶负责表达的体细胞(视网膜色素上皮细胞和包皮成纤维细胞)中异位表达了人端粒酶催化亚基的基因,与对照组相比,转染了包含hTERT载体的克隆表达了端粒酶的活性,延长了他们的端粒长度,细胞分裂也变得极其旺盛,并且细胞衰老的生物标记物)B半乳糖苷酶的表达量也显著减少。最引人注目的是表达了端粒酶活性的克隆仍保持了其核型的正常且已经超过了他们普通细胞寿
命的至少20代。由于端粒酶在人体的许多正常细胞(如种细胞和干细胞)中都表达且细胞仍保留复制的潜能和各项生理功能的正常,这就表明端粒酶活性的表达本身并不是致癌的。这个结论进一步被Jing[16]和Morales[17]等的实验所证明。Jiang等在人的皮肤成纤维细胞(BJ)和视网膜色素上皮细胞(RPE)中表达了端粒酶催化亚基基因后,这两种细胞的寿命至少延长了一倍。在进行血清饥饿,高细胞浓度,G1或G2检测点阻塞和纺缍体抑制实验时,细胞也表现出正常的生长控制。Morales把端粒酶和病毒癌蛋白HPV16E6/E7(使细胞周期检测点控制物P53和pRB失活的一种蛋白)一起转染到人正常的皮肤成纤维细胞中时发现,端粒酶表达的细胞仍对异常的繁殖信号保持着适当的反应。综合三个研究小组的研究表明,端粒酶的异位表达并不引起染色体的异常和类似癌细胞特征的不正常核型的出现。
当端粒酶催化亚基基因在转入细胞内既能延长细胞寿命又不影响细胞其它功能的正常发挥时,延长寿命的细胞就能有效地治疗细胞的衰老,其中包括皮肤的衰老、肌肉的退化和动脉粥样硬化[10]。在体外延长细胞寿命的细胞具有更为广泛的用途:首先,在研究生长和分化的生理生化特征方面克隆的永生化细胞比已经建立的肿瘤细胞系具有更大的优势,因为它更能代表机体内的正常的生理状态;其次,能长期生存的正常的人类细胞可用来生产工程化的生物技术产品;再次,扩增了数代的遗传上重新年轻化的细胞可在基因治疗时用作自体的或异体的细胞。这样一来,经端粒酶处理过的年轻化的细胞不管是在生物学研究、制药工业和医学上都具有重要意义。
目前对端粒酶研究最感兴趣的莫过于以端粒为焦点寻找抑制肿瘤的药物。较流行的观点认为,如果没有端粒酶的激活,当早期的肿瘤细胞在把它们的端粒耗尽到一个临介点时它们最终会经历终端生长抑制或者死亡。端粒的缩短可看作是一种抑制肿瘤的机制,抑制端粒酶的不合时机的表达,使细胞不能维持它们的端粒DNA的长度,也就抑制了肿瘤的发生。要想通过端粒抑制肿瘤,通常必须符合以下条件[18]:抑制剂应能降低端粒酶的活性但又不能影响细胞的生长速率;加入抑制剂后应该让端粒随着细胞分裂进行性地缩短;加入的抑制剂应能引起表达细胞的死亡或经历生长抑制;降低繁殖力所需的时间应随端粒起始长度的改变而改变;不抑制端粒酶活性的化学相关分子不应引起端粒缩短或细胞繁殖力的下降。早在1995年Feng[7]就发现,当在哈雷细胞中转染进hT R的反意RNA之后,哈雷细胞不仅丢失了其端粒DNA,而且在繁殖3~26代之后开始死亡。在此基础之上,Herbert等[18]以寡聚核苷酸和2c-0-MeRNA寡聚体作抑制剂抑制端粒酶的活性,发现抑制剂不仅导致了端粒进行性的缩短,而且引起自发永生化的人类乳腺上皮细胞经历了细胞的程序性死亡。且端粒的缩短又是可逆转的,如果终止抑制剂的加入,端粒又重新获得他们的起始长度。他们的结果表明,端粒酶完全可作为制仲瘤抑制的靶基因,且抑制剂的类型不受抑制剂本身化学类型的限制。
参考文献
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端粒及端粒酶的研究进展
生物化学与生物物理进展 PROGRESS IN BIOCHEMISTRY AND BIOPHYSICS 1999年 第26卷 第5期 Vol.26 No.5 1999 端粒及端粒酶的研究进展 任建国 周军 戴尧仁 摘要 端粒是染色体末端独特的蛋白质-DNA结构，在保护染色体的完整性和维持细胞的复制能力方面起着重要的作用.端粒酶则是由RNA和蛋白质亚基组成的、能够延长端粒的一种特殊反转录酶.端粒长度和端粒酶活性的变化与细胞衰老和癌变密切相关.端粒结合蛋白可能通过调节端粒酶的活性来调节端粒长度，进而控制细胞的衰老、永生化和癌变.研制端粒酶的专一性抑制剂在肿瘤治疗方面有着广阔的前景. 关键词 端粒，端粒酶，衰老，永生化，癌变 学科分类号 Q50 Progress in the Studies of Telomere and Telomerase. REN Jian-Guo, ZHOU Jun, DAI Yao-Ren (Department of Biological Science and Biotechnology, Tsinghua University, Beijing 100084, China). Abstract Telomeres are unique DNA-protein complexes at the terminals of chromosomes that play a critical role in protecting chromosomal integrity and in maintaining cellular replicative potential. Telomerase is a specialized reverse transcriptase, composed of both RNA and protein subunits, that elongates telomeric repeats. The changes in telomere length and telomerase activity are closely linked to cell aging and carcinogenesis. Telomere binding-protein may regulate telomere length by regulating telomerase activity, and then control cell aging, immortalization and carcinogenesis.The development of specific telomerase inhibitors will have broad prospect in the aspect of tumor therapy. Key words telomere, telomerase, aging, immortalization,carcinogenesis 近年来，有关端粒及端粒酶的研究异常活跃，许多新的结构和功能的发现使之成为生物学和医学关注的热点.本文拟对端粒及端粒酶的最新进展予以阐述. 1 端粒(telomere) 端粒是真核细胞内染色体末端的蛋白质-DNA结构，其功能是完成染色体末端的复制，防止染色体免遭融合、重组和降解［1～3］.从单细胞的有机体到高等的动植物，端粒的结构和功能都很保守. 1.1 端粒DNA
端粒和端粒酶的研究及应用
端粒和端粒酶的研究及应用 2005-4-11 https://www.wendangku.net/doc/d85160344.html, 来源：丁香园 10:56:00 摘要：古往今来，“长生不老”成为人们一直追求的梦想，曾经有多少人用各种方法来延缓衰老，但终未取得显著效果。近年来研究证实，端粒缩短导致衰老。本文就端粒、端粒酶与衰老的关系做一综述。 关键词：端粒、端粒酶、衰老 最早观察染色体末端的科学家始于19世纪末期，Rabl[1]在1885年注意到染色体上所有的末端都处于细胞核的一侧。20世纪30年代，两个著名的遗传学家McClintock B [2]和Muller HJ [3]发现了染色体的末端可维持染色体的稳定性和完整性。Muller将它定义为“telomere”，这是由希腊词根“末端”（telos）及“部分”（meros）组成的。30多年前，Hayflick[4]首次提出将体外培养的正常人成纤维细胞的“有限复制力”作为细胞衰老的表征。在此过程中，细胞群中的大部分细胞经历了一定次数的分裂后便停止了，但它们并没有死亡，仍保持着代谢活性，只是在基因表达方式上有一定的改变。于是Hayflick猜测细胞内有一个限制细胞
分裂次数的“钟”，后来通过细胞核移植实验发现，这种“钟”在细胞核的染色体末端——端粒。但端粒究竟是怎样的复杂结构呢？Blackburn和Gall[5] 于1978年首次阐明了四膜虫rDNA分子的末端结构，他们发现这种rDNA每条链的末端均含有大量的重复片段，并且这些大量重复的片段多是由富含G、C的脱氧核苷酸形成的简单序列串联而成。在1985年，CW?Greider和EH?Blackburn发现将一段单链的末端寡聚核苷酸加至四膜虫的提取物中后，端粒的长度延长了，这就说明了确实有这样的一种酶存在[6]，并将它命名为“端粒酶”（telomerase）。之后，耶鲁大学Morin 于1989年在人宫颈癌细胞中也发现了人端粒酶[7] 。近年来，随着人体端粒酶的发现和端粒学说的提出，已经知道决定细胞衰老的“生物钟”就是染色体末端的端粒DNA，它可随着年龄的增长而缩短。 一、衰老机理及假说 许多人错误的认为，退休是一个人进入生理老年的开端。而老年则是衰老的标志，其实，这是不科学的。人体的所有器官和组织都由细胞组成，但组成器官和组织的细胞有两大类，即干细胞和非干细胞。人体衰老正是由细胞特别是干细胞衰老引起的。医学家认为，如果人类若能避免一些疾患和意外事故，人类寿命的上限应当是130岁。在人类基因组计划之前和进行之中，对长寿的分子生物学研究就有了许多显著的成果与发现。总的归纳起来便是：衰老是一种多基因的复合调控过程，表现为染色体端粒长度的改变、DNA损伤（包括单链和双链的断裂）、DNA的甲基化和细胞的氧化损害等。这些因素的综合作用，才造成了寿命的长短。
端粒酶的研究现状及进展
人体衰老的钥匙--端粒酶的研究现状及进展 摘要：端粒酶是基本的核蛋白逆转录酶，可将端粒DNA加至真核细胞染色体末端。端粒在不同物种细胞中对于保持染色体稳定性和细胞活性有重要作用，端粒酶能延长缩短的端粒（缩短的端粒其细胞复制能力受限），从而增强体外细胞的增殖能力。端粒酶在正常人体组织中的活性被抑制，在肿瘤中被重新激活，端粒酶可能参与恶性转化。端粒酶在保持端粒稳定、基因组完整、细胞长期的活性和潜在的继续增殖能力等方面有重要作用。 端粒酶的存在，算是把 DNA 克隆机制的缺陷填补起来，藉由把端粒修复延长，可以让端粒不会因细胞分裂而有所损耗，使得细胞分裂克隆的次数增加。 但是，在正常人体细胞中，端粒酶的活性受到相当严密的调控，只有在造血细胞、干细胞和生殖细胞，这些必须不断分裂克隆的细胞之中，才可以侦测到具有活性的端粒酶。当细胞分化成熟后，必须负责身体中各种不同组织的需求，各司其职，于是，端粒酶的活性就会渐渐的消失对细胞来说，本身是否能持续分裂克隆下去并不重要，而是分化成熟的细胞将背负更重大的使命，就是让组织器官运作，使生命延续，但不是永续，这种世代交替的轮回即是造物者对于生命设计的巧思。 关键词:端粒酶；研究现状；进展 1 发展概况 科学家们在寻找导致细胞死亡的基因时，发现了一种叫科学家们在寻找导致细胞死亡的基因时，发现了一种叫端粒的存在于染色体顶端的物质。端粒本身没有任何密码功能，它就像一顶高帽子置于染色体头上。在新细胞中，细胞每分裂一次，染色体顶端的端粒就缩短一次，当端粒不能再缩短时，细胞就无法继续分裂了。这时候细胞也就到了普遍认为的分裂100次的极限并开始死亡。因此，端粒被科学家们视为“生命时钟”。 科学家由此又开始研究精子和癌细胞内的染色体端粒是如何长时间不被缩短的原因。1984年，分子生物学家在对单细胞生物进行研究后，发现了一种能维持端粒长度的端粒酶，并揭示了它在人体内的奇特作用：除了人类生殖细胞和部分体细胞外，端粒酶几乎对其他所有细胞不起作用，但它却能维持癌细胞端粒的长度，使其无限制扩增。
端粒与端粒酶
端粒是真核生物染色体末端的DNA重复片段，由许多个短的富含G重复序列组成的3撇端。并突出于另一条DNA链的5撇端，和许多蛋白质构成。这些重复序列并不含有遗传信息，形态上，染色体DNA末端膨大成粒状。像两顶帽子盖在了染色体的两端，作为染色体末端的保护帽。 端粒存在戴帽和非戴帽两种状态，戴帽状态是端粒的功能状态。细胞可以继续分裂；非戴帽状态会引发细胞周期的阻滞。在正常的细胞分裂时，端粒可以在两种状态间变换，随着细胞分裂的继续，越来越多的细胞粒处于非戴帽状态，继而出现衰老与细胞死亡。 端粒的功能是完成染色体末端的复制，防止染色体相互融合、重组和降解，维持染色体的完整性。端粒的DNA序列既有高度的保守性又有种属的特异性。在生物体内，正常体细胞端粒的长度是有限的，随着细胞的持续分裂，端粒就会缓慢缩短，当端粒再也无法保护染色体免受伤害时，细胞就会停止分裂，或者变得不稳定。因此，生物体细胞分裂的次数是有限的。端粒的长度决定了细胞的寿命，所以端粒又被称为“生命的时钟”。 端粒酶的主要成分是RNA和蛋白质，即核糖核酸蛋白质复合体。是端粒重复序列延伸的反转录DNA聚合酶。真核细胞染色体末端DNA的复制不是由DNA聚合酶完成的，而是由端粒酶催化合成的。以其自身RNA组分为模板，并且RNA上含有引物特异识别位点。蛋白质具有催化活性，以端粒3撇端为引物，通过反复延伸与移位，又反复地将重复片段加到突出的3撇端上，而互补的富含C的延伸像后随链那样复制，未补偿由去除引物引起的末端缩短。因此在端粒的保护中，端粒酶起着至关重要的作用。但端粒的延长并非只有端粒酶一种途径，而是存在端粒酶依赖和非端粒酶依赖两种。 人端粒酶结构主要包括3部分：端粒酶RNA(hTR);端粒酶催化亚单位（hTERT）和端粒相关蛋白质（TPI/TLPI） 人体细胞中端粒酶合成和延长端粒的作用是在胚胎发育过程中完成的，当胚胎发育完成后，端粒酶活性在大多数组织中消失，除生殖细胞、造血干细胞以及外周淋巴细胞的等少数几种细胞外。由此认为胚胎期获得的端粒应以足够维系人体的整个生命过程中因细胞分裂所致的端粒缩短。端粒酶活性阳性细胞中的hTERT基因突变或沉默则细胞端粒酶活性消失。在端粒酶活性阴性的细胞中导入编码的hTERT基因，则可以重建细胞的端粒酶活性，结果细胞的端粒增长，寿命延长，老化过程延缓，甚至出现永生化现象。 目前认为，细胞的衰老是由端粒的丢失引起的，而端粒的丢失又与端粒酶的活性有关，人体细胞内端粒酶活性的缺失导致端粒缩短，这种缩短使得端粒最终不能被细胞识别，端粒一旦短于“关键长度”，就很有可能导致染色体双链断裂，使细胞进入M1期死亡状态。随着端粒的进一步丢失，将导致进一步的危机，即M2期死亡状态。当几千个端粒DNA丢失后，细胞就会停止分裂进入衰老状态。 新进研究显示引起细胞衰老的原因与端粒的长度无关，而与以下几个因素有关：端粒的位置效应、DNA损伤信号以及端粒富含G的3撇末端突出的缺失。 端粒和端粒酶的发现也是有关人体衰老、癌症和干细胞等研究的谜题拼图中重要的一片，次发现使我们对细胞的理解增加了新的维度，清楚地显示了疾病的机理，并将促使我们开发出潜在的新的疗法。尽管已有越来越多的有关端粒与端粒酶的研究成果，但这一领域仍然存在着不少有待解决的问题等待着人类去探索去认知。
小分子端粒酶抑制剂的研究进展
小分子端粒酶抑制剂的研究进展 肿瘤的发生是多阶段的复杂过程，原癌基因的激活、抑癌基因的失活是肿瘤发生的重要分子基础。肿瘤细胞获得无限增殖特性而成为永生化细胞，在这个过程中端粒酶起了重要作用，端粒酶的激活使肿瘤细胞的端粒不再进行性缩短而得以维持，避开了细胞正常的复制-衰亡机制的制约。研究发现，近90% 的肿瘤细胞都有端粒酶活性，而正常细胞或组织中几乎没有检测到端粒酶活性。端粒酶已成为当今肿瘤新的标志物和肿瘤治疗的新靶点，抑制端粒酶的活性已成为肿瘤治疗的一种新策略。本文作者就近年来出现的小分子端粒酶抑制剂进行综述。 1 端粒和端粒酶 端粒(telomere)位于真核生物染色体3' 末端，是由富含鸟嘌呤的DNA 重复序列和端粒结合蛋白组成的核蛋白复合物，它是染色体末端的一种特殊结构，能防止染色体DNA 降解、末端融合、缺失及非正常重组，维持染色体的完整和稳定，端粒结构对于保持染色体结构的完整性具有重要意义。研究证明，端粒与细胞的寿命密切相关。细胞在进行分裂时，由于受DNA 聚合酶的限制，每次分裂，染色体3' 末端将持续丧失50 ～ 200 b 的 DNA，端粒不断缩短，当其长度减小到一定的临界值时，细胞即趋向于衰老、死亡，因此，端粒被认为是绝大多数体细胞的“生物钟”。 端粒酶是一种特殊的DNA 聚合酶，具有逆转录酶活性，它有3 个主要组分: 人端粒酶催化亚单位(the human telomerase reverse transcriptase， hTERT)、人端粒酶核糖核酸(hTR)，以及端粒酶相关蛋白(TP1/TLP1)。端粒酶能以自身的 RNA 为模板，反转录成端粒的重复单元TTAGGG 加到人染色体末端，使端粒延长，阻止端粒随细胞分裂而缩短，使细胞绕过衰老途径成为永生化细胞，导致人类肿瘤的发生。一般认为，端粒酶的激活是恶性肿瘤发生过程中的一个后期事件，端粒酶使肿瘤细胞的端粒不再进行性缩短而得以维持，避开了细胞正常的复制-衰亡机制的制约而获得永生性。端粒酶在大多数肿瘤细胞高表达而在正常细
HIV整合酶抑制剂的研究进展
2010年第30卷 有 机 化 学 V ol. 30, 2010 * E-mail: hliu@https://www.wendangku.net/doc/d85160344.html, Received April 16, 2009; revised August 6, 2009; accepted September 7, 2009. 国家高技术研究发展计划(“863”计划)(No. Grant 2006AA020602)资助项目. ·综述与进展· HIV 整合酶抑制剂的研究进展 郭涤亮a ,b 刘冠男a 周 宇a 李 建a 徐进宜b 蒋华良a 陈凯先a 柳 红*,a ,b (a 中国科学院上海药物研究所 新药研究国家重点实验室药物设计和发现中心 上海 201203) (b 中国药科大学药学院 南京210009) 摘要 HIV 整合酶是病毒DNA 复制所必需的3个基本酶之一, 是新批准上市的抗艾滋病药物Raltegravir (MK-0518, Isentress)的分子靶标. HIV 整合酶抑制剂已经成为新一类治疗获得性免疫缺陷综合症的药物. 对HIV 整合酶抑制剂的研究进展进行了综述, 为研究新型人类免疫缺陷病毒整合酶抑制剂提供参考. 关键词 人类免疫缺陷病毒; 整合酶抑制剂; 二酮酸类; Raltegravir Research Progress in HIV Integrase Inhibitors Guo, Diliang a ,b Liu, Guannan a Zhou, Yu a Li, Jian a Xu, Jinyi b Jiang, Hualiang a Chen, Kaixian a Liu, Hong *,a ,b (a Drug Discovery and Design Centre , State Key Laboratory of Drug Research , Shanghai Institute of Materia Medica , Chinese Academy of Sciences , Shanghai 201203) (b School of Pharmacy , China Pharmaceutical University , Nanjing 210009) Abstract HIV integrase is one of the three essential enzymes for viral DNA replication and the molecular target of the newly approved anti-AIDS drug raltegravir (MK-0518, Isentress). HIV integrase inhibitors have emerged as a new class of drugs for the treatment of AIDS. In this article, the recent progress of HIV inte-grase inhibitors is reviewed to provide some useful information for the further research and development of HIV integrase inhibitors. Keywords HIV; integrase inhibitor; diketoacid; Raltegravir 人类免疫缺陷病毒(HIV)感染引起的艾滋病(AIDS)是目前人类所经历的最严重的疾病之一, 截止2004年底, 全球已有4000万艾滋病毒携带者和艾滋病患者, 已有310万人死于艾滋病, 新感染艾滋病病毒的人数约为490万, 艾滋病在全球范围内的传播速度惊人. 鉴于此, 研究和开发抗艾滋病的新药显得日益紧迫和重要. 随着人类对HIV 病毒及其感染过程的研究不断深入, 以及各国药物研发人员的不断努力, 抗HIV 药物有了突飞猛进的发展, 尤其是全新作用机制的HIV 进入抑制剂和HIV 整合酶抑制剂的出现, 为抗HIV 药物的研制带来了新的 发展方向, 也为艾滋病治疗带来了新的希望. 1 抗艾滋病药物的作用机制和分类 抗艾滋病药物的作用机制是通过影响HIV 复制周期的某个环节, 从而抑制病毒的复制和感染. 根据HIV-1的生命周期, 目前抗艾滋病药物主要针对病毒复制过程的8个重要环节, 即HIV 对宿主细胞的依附(viral attachment)-进入抑制剂(entry inhibitor); 辅受体相互作用(coreceptor interaction)-进入抑制剂; HIV 与
端粒与端粒酶的研究进展
端粒与端粒酶的研究进展 【摘要】研究显示，端粒酶活性被激活，可维护端粒的长度，细胞将会延缓衰老，避免癌变。此外，端粒酶的发现还在理论上丰富和发展了分子肿瘤学，据研究显示90％的人体肿瘤与端粒酶相关，若我们通过端粒酶活性的检测，提前预知肿瘤的发生，从而提前预防和治疗，或者若我们能使癌细胞中的端粒酶再度“休眠”，恶性肿瘤就会停止生长，以此来治疗癌症。 【关键字】端粒端粒酶肿瘤癌症衰老染色体 1.端粒和端粒酶的概述 2009年，美国的三位科学家Elizabeth H·Blackburn、Carol W·Greider和Jack W·Szostak发表了题为“端粒和端粒酶是如何保护染色体的”而共同获得诺贝尔生理学或医学奖。也是从这一重大研究成果开始，端粒和端粒酶的研究为人类衰老和肿瘤带来了福音。 端粒是真核细胞染色体末端的帽子样的结构，它具有稳定染色体末端结构，防止染色体DNA降解和末端融合，保护染色体结构基因，调节正常细胞生长等作用。同种生物不同组织的细胞，甚至相同组织的不同细胞由于处于不同的生命时相，端粒的长度也不一样。由此可发现端粒的长度跟细胞的寿命、衰老与死亡有密切关系，所以端粒的长度被称为“生命时钟”【1】。 端粒酶(telomerase)是一种以自身RNA为模板，将端粒DNA合成至染色体的核糖核蛋白复合物(ribonucleoprotein，RNP)。端粒长度的维持需要端粒酶的激活。所以端粒酶在保持端粒稳定、基因组完整、细胞长期的活性和潜在的继续增殖能力等方面有重要作用。端粒酶的活性存在于人的生殖细胞、肿瘤细胞、永生化细胞系和再生性组织中，一般情况下酶的活性处于抑制状态，只有当端粒体受到损伤的时候，端粒酶才被激活。 由于端粒和端粒酶对肿瘤和癌症的发生有很大关系，所以近年来，端粒和端粒酶的研究也比较多，且主要是在妇产科学、基础医学、心血管疾病、泌尿科学、外科学等方面，其中端粒酶与肿瘤形成关系的研究占总文献比例最大【2】。 2.端粒和端粒酶的结构 端粒是存在于染色体3＇末端的特殊部位，通常由一些简单重复的序列组成。不同种类的细胞端粒重复序列不同，大多长约5-8bp。人类的端粒序列由5 ＇
蛋白酶抑制剂的研究进展
蛋白酶抑制剂的研究进展 郭川 微生物专业，200326031 摘要：自然界共发现四大类蛋白酶抑制剂:丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂和酸性蛋白酶抑制剂，本文就各大类蛋白酶抑制剂的结构特点，活性部位的研究概况及其在各领域应用的原理及进展。 关键词：蛋白酶抑制剂；结构；应用 天然的蛋白酶抑制剂(ＰＩ)是对蛋白水解酶有抑制活性的一种小分子蛋白质,由于其分子量较小,所以在生物中普遍存在。它能与蛋白酶的活性部位和变构部位结合,抑制酶的催化活性或阻止酶原转化有活性的酶。在一系列重要的生理、病理过程中:如凝血、纤溶、补体活化、感染、细胞迁移等，PI发挥着关键性的调控作用,是生物体内免疫系统的重要组成部分。从Ｋｕｎｉｔｚ等最早分离纯化出一种ＰＩ至今,已有多种ＰＩ被发现,根据其作用的蛋白酶主要分以下几类:抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等的丝氨酸蛋白酶抑制剂,抑制木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等的巯基蛋白酶抑制剂,抑制胃蛋白酶、组织蛋白酶Ｄ等的羧基蛋白酶抑制剂、抑制胶原酶、氨肽酶等的金属蛋白酶抑制剂等。而根据作用于酶的活性基团不同及其氨基酸序列的同源性,可将自然界发现的PI分为四大类:丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂(半胱氨酸蛋白酶抑制剂)、金属蛋白酶抑制剂和酸性蛋白酶抑制剂[1]。 1 结构与功能 1.1丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serine Protease Inhibitor,Serpin） 丝氨酸蛋白酶抑制剂是一族由古代抑制剂趋异进化5亿年演变而来的结构序列同源的蛋白酶抑制剂。Sepin为单一肽链蛋白质。各种serpin大约有30％的同源序列，疏水区同源性高达70％。血浆中的serpin多被糖基化，糖链经天东酰胺的酰胺基与主链相连。位于抑制性serpin表面、距C端30～40个氨基酸处的环状结构区RSL（reactive site loop）中，存在能被靶酶的底物识别位点识别的氨基酸P1[2]；近C端与P1相邻的氨基酸为P1’，依此类推，即肽链结构表示为N端-P15～P9～P1-P1’～P9’～P15’-C端。在对靶酶的抑制中。Serpin 以RSL中的类底物反应活性位点与靶酶形成紧密的不易解离的酶-抑制剂复合物，同时P1-P1’间的反应活性位点断裂。几种perpin氨基酸序列比较发现，serpins各成员的抑制专一性是由P1决定的，且被抑制的酶特异性切点一致。如抗凝血酶，抑制以Arg羧基端为敏感部位的丝氨酸蛋白酶，其中P1为Arg[2]。 1.2巯基蛋白酶抑制剂（Cytsteine Proteinase Inhiitor，CPI） 对于丝氨酸蛋白酶抑制剂(SPI)已有大量研究,巯基蛋白酶抑制剂(CPI)的研究则相对要晚一些。而动物和微生物来源的CPI已有一些研究,发现它们在结构上具有同源性,Barrett等将CPI统称为胱蛋白超家族,并按分子内二硫键的有无与数量,分子量大小等将此家族分为3个成员(F1、F2、F3)。在3个家族中,大多数F1和F3的CPI中都有Glu53-Val54-Val55-Ala56-Gly57保守序列,其同源序列在其它CPI中也被发现,如Ｆ2中的Gln-Ｘ-Val-Ｙ-Gly和CHα-ras基因产物中的Gln-Val-Val肽段。人工合成的Glu-Val-Val-Ala-Gly 短肽也显示对木瓜蛋白酶有抑制活性,因此可以认为这一保守区段在抑制活性中起着全部或部分的关键作用[3]。对植物来源的ＣＰＩ研究的不多,已有报道的有水稻、鳄梨和大豆。水稻巯基蛋白酶抑制剂(Oryzacystatin,OC) 具有102个氨基酸残基,有典型的Glu-Val-Val-Ala-Gly保守序列,应与动物CPI同源进化而来。从OCI没有二硫键来看,它应归为F1成员,但从序列比较看,则更接近F3。对OCIGlu---Gly保守序列进行点突变试验表明,突变使其抑制活性大幅度下降,其中当Glu被Pro替代时则活性全无,由此说明,这一段保守序列在OCI的抑制活性中,同动物CPI一样必不可少。除Glu---Gly保守区域外,OCI序列中其
白细胞介素
白细胞介素 白细胞在人体内一起的非常重要的作用，如果体内的白细胞数量减少，人的免疫功能就会下降，这时人就会经不住外界病毒因素的侵犯，从而得各种各样的疾病。白细胞介素是细胞的一种因子，他们在白细胞工作时发挥了重要的作用。下面给大家介绍一下白细胞介素究竟是什么？ 白细胞介素是由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细 胞因子。由于最初是由白细胞产生又在白细胞间发挥作用，所以由此得名，现仍一直沿用。最初指由白细胞产生又在白细胞间起调节作用的细胞因子，现指一类分子结构和生物学功能已基本明确，具有重要调节作用而统一命名的细胞因子，它和血细胞生长因子同属细胞因子。两者相互协调，相互作用，共同完成造血和免疫调节功能。白细胞介素在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中起重要作用。 白细胞介素interleukin缩写为IL，功能关系免疫反应的表达和调节，这种调节有来源于淋巴细胞或巨噬细胞等的许多因
子参与。来源于淋巴细胞的有淋巴细胞活素，来源于巨噬细胞的总称为monokine，其中的各个因子的生物活性各有不同(例如巨噬细胞活化，促进T细胞繁殖等)，因子自身的物理化学性质多 不清楚。 1979年这方面的研究团体提出了在淋巴细胞活素及巨噬细 胞因子(monoki-ne)中，已作为一种分子提纯并弄清了性质的称 为白细胞间杀菌素。最初测定的为 IL1和IL2。IL1属于monokine，以前曾以淋巴细胞活化因子(lymphocyte activating factor) 命名。细胞促进蛋白质(mitogenic protein)以及B细胞活化因 子(B cell-activating factor)等七种名称称之。而IL2属于淋巴细胞活素，以前曾以胸腺细胞刺激因子(thymocyte stimulating factor)、T细胞生长因子(T cell growth factor)等六种名称称之。 在对免疫应答的研究过程中，在丝裂原刺激的细胞培养上清中发现了许多具有生物活性的分子，研究者各以自己测得的活性进行命名，十几年报道了近百种因子。后来借助分子生物学技术进行比较研究发现，以往许多以生物活性命名的因子实际上是具
端粒和端粒酶的发现历程——记诺贝尔生理学或医学奖
端粒和端粒酶的发现历程——记诺贝尔生理学或医学奖 引言－到底是"谁"得诺奖了？ 2009年诺贝尔生理学或医学奖授予了UCSF（加州大学旧金山分校）的Elizabeth Blackburn（简称Liz），Johns Hopkins University（约翰霍普金斯大学）的Carol Greider（简称Carol），以及Howard Medical School（哈佛医学院）的Jack Szostak。诺贝尔奖主页上介绍她/他们获奖的原因是揭示了"how chromosomes are protected by telomeres and the enzyme telomerase"（染色体是如何被端粒和端粒酶保护的），这样描 述是非常专业的。当然更多的公众媒体为了吸引眼球，会用"Aging Research Wins Nobel Prize"（衰老研究摘 取诺贝尔奖）的标题，这颇有误导之嫌。"揭开衰老与癌症的奥秘"，这样的标题更是耸人听闻，偏离这个诺贝 尔奖的用意了。 不可否认端粒和端粒酶的发现能获得诺贝尔奖，是因为它跟衰老和癌症的潜在关系获得了更多公众的关注。但 是迄今为止它只是衰老和癌症的correlator（相关者），勉强算得上indicator（指示者），还远不是causer （引起者）。当年发现衰老的细胞端粒变短之后，人们兴奋地以为找到了衰老的"时钟"，揭开了衰老的奥秘。 但是事实上端粒在生理条件下并不是细胞衰老的"瓶颈"，细胞或机体的衰老是其它原因导致的老化。小鼠的端 粒是比较长的，如果把小鼠的端粒酶RNA亚基敲除，它能活得很自在，并不会早衰，生殖力也正常。那也就是 说在当代的小鼠中，端粒缩短并不是小鼠衰老的原因。这样的小鼠可以一直传6代。当然越到后来，端粒越短，染色体也开始融合[1]。癌细胞的增殖需要端粒的不断复制，但是我们知道端粒酶激活只是癌细胞发生中比较重 要的一环，但远不是唯一的一环。端粒酶固然是治疗癌症的一个潜在靶标，但是癌细胞也能通过recombination （遗传重组）延长端粒，逃脱对端粒酶的依赖[2]。 所以，不能说是"衰老或癌症"的研究得诺奖了，它跟cell cycle（细胞周期）的研究得诺奖一样，更多的是对 细胞基本功能的重要研究的肯定。而这个研究的进程中贯穿着"发现现象/问题"-"提出概念/模型"-"实验验证" 的思路，整个过程就像相继解开一个个puzzle（智力谜团）一样有趣，充满了思想的光辉。"Nobel Prize in Medicine Awarded for Cracking DNA Puzzle"（诺贝尔医学奖授予解开DNA谜团"的研究"），这样的标题最为 精准。换个角度，我们不妨说是解"puzzle"得了诺奖。 相关链接：2009年诺贝尔生理学或医学奖揭晓 染色体DNA的两个难题以及端粒概念的提出 20世纪70年代初，对DNA聚合酶特性的深入了解引申出了一个染色体的复制问题。DNA聚合酶在复制DNA的时 候必须要有引物来起始，而且它的酶活性具有方向性，只能沿着DNA5'到3'的方向合成。染色体复制之初可以 由小RNA作为引物起始合成，之后细胞的修复机器启动，DNA聚合酶能够以反链DNA为模板，以之前合成的DNA 为引物，合成新的DNA取代染色体中间的RNA引物。但是线性染色体最末端的RNA引物因为没有另外的引物起始，没有办法被DNA取代。所以线性染色体DNA每复制一轮，RNA引物降解后末端都将缩短一个RNA引物的长度
神经氨酸酶抑制剂的研究进展解析
上海应用技术学院 研究生课程（论文类）试卷 2 014 / 2 015学年第二学期 课程名称：新药研发与申报 课程代码：NX0702016 论文题目：神经氨酸酶抑制剂的研究进展 学生姓名：王震 专业﹑学号：化工1班，146061114 学院：化学与环境工程学院 课程（论文）成绩： 课程（论文）评分依据（必填）： 1.论文结构规范，检索的文献资料经认真的综合分析整理，选材精简得当，条理清晰，语言流畅， 版面整洁美观。得分为90-100分。 2.论文结构较规范，检索的文献资料经分析整理，材料组织得当，条理清晰，语言流畅。得分为 80-89分。 3.论文结构基本规范，内容有小问题，检索的文献资料经一般性分类整理，条理较清晰，得分为 70-79分。 4.论文结构基本规范，内容未经认真整理，一般性罗列所检索的文献资料。得分为60-69分。 5.达不到上述第4点要求的论文，得分为0-59分。 任课教师签字： 日期：年月日
神经氨酸酶抑制剂的研究进展 摘要：2009年高致病性的H1N1流感大爆发，再次向人们敲响了警钟：随着毒株变异性的加强，流感疫苗已无力完全遏制疫情的传播[1]。我们知道，流感病毒在感染和传播过程中，作为其四大活性位点之一（其他三个是血凝素、M2离子通道和部分RNA聚合酶）的神经氨酸酶（NA）起到了重要作用。因此，抗流感病毒神经氨酸酶抑制剂的设计与合成势在必行。本文综述了抗流感病毒神经氨酸酶抑制剂（NAIs）的研究进展。 关键词：神经氨酸酶；变异；抑制剂；合成
The development of neuraminidase inhibitors Abstract: The pandemic of influenza virus in 2009 to human beings sounded the alarm: the influenza vaccine was feeling powerless to suppress the transmission of epidemic with the strengthening of strain’s variability. As we know, in the process of influenza virus’ infection and propagation, the neuraminidase, one of four neuraminiric active site (another active site,ie,Hemagglutinin,M2 ion channels and RNA polymerase), played a important role. Therefore, the designing and synthesis of anti-influenza virus neuramnidase inhibitors are imperative. And this paper reviewed the development of influenza-resistant virus neuraminidase inhibitors. Keywords: neuraminidase; variation; inhibitors; synthesis
白细胞介素的制备及鉴定
白细胞介素的制备及鉴定 白细胞介素（IL）是指由白细胞或其他体细胞产生的能在白细胞间起调节和介导作用的因子。作为在免疫活性细胞间相互作用的介质和强有力的蛋白性调节因子，可以调节免疫反应、炎性反应、组织修复、组织移植反应和造血。白细胞介素已发现有多种，本实验以白细胞介素-2（IL-2）为例介绍IL的制备及鉴定方法。 一、目的要求 了解白细胞介素的概念、种类及其作用；掌握常用白细胞介素的制备及鉴定方法。二、实验原理 人或动物的脾细胞、淋巴细胞，在丝裂原刺激下诱生的天然白介素-2，主要存在于细胞的上清中。此为粗制天然白介素-2，然后通过硫酸铵沉淀、吸附等步骤进行纯化，并根据相关性质进行鉴定。 三、实验材料 RPMI1640培养基，丝裂原PHA，硫酸铵，吸附剂G2，细胞培养皿，细胞培养箱，离心机，清洁级小鼠。 四、实验方法 摘取小鼠的脾、四肢淋巴结、肠系膜淋巴结等组织，制成单个细胞悬液，用RPMI1640配成1.5×106个/ml细胞浓度，在PHA刺激下，37℃，5％CO2培养48h后离心取上清，用CTL细胞系检测其生物活性，即是粗制的天然白介素-2. 纯化步骤：在500ml收集的上清中缓慢加入固体硫酸铵，边加边搅拌，使其饱和度达45％，4℃搅拌过夜，9000r/m离心30min去沉淀。上清再加硫酸铵使其饱和度达80％，4℃搅拌过夜，9000r/m离心30min，取沉淀用PBS溶解，透析后用吸附剂G2 （30mg/ml）37℃搅拌吸附30min，离心、洗脱即得纯化的IL-2。 五、结果判定 （1）将获得的IL-2用Folin酚法测定蛋白含量。 （2）活性检定：采用CTL细胞株的渗入法进行活性鉴定，比活性必须在1×106U/mg 以上。 （3）纯度鉴定：用SDS-PAGE检测，银染法染色，在15ku出呈单一条带，然后经扫
端粒酶抑制剂
端粒酶抑制剂在肿瘤治疗中的最新研究进展 摘要：端粒酶是一种特殊的逆转录酶，能以自身的RNA为模板，反转录成端粒的重复单元TT AGGG加到人染色体末端，阻止端粒随细胞分裂而缩短，使细胞绕过衰老途径成为永生化细胞，导致人类肿瘤的发生。以端粒酶为靶点，可以有多种治疗途径，本文主要介绍了端粒酶抑制剂的研究现状及新进展，重点对新型G‐四联体稳定剂类端粒酶抑制剂、逆转录酶抑制剂及其他新型端粒酶抑制剂的研究进展进行介绍。 关键词：端粒酶抑制，G‐四联体，逆转录酶抑制剂，肿瘤，研究进展 The newest research progress of the telomerase inhibitors in cancer therapy Keywords:telomerase inhibitors，G-quadrplex DNA，Reverse transcriptase inhibitors，Tumor，research progress 引言：端粒酶作为一种负责延长端粒的核蛋白逆转录酶，对于细胞染色体的稳定性和细胞活性的维持有重要作用，端粒酶的活性在正常组织中被抑制，而在恶性肿瘤细胞中其阳性率可达84% ～95%，人体绝大部分恶性肿瘤的发生发展过程与端粒酶活性有非常紧密的联系，针对这一现象，并结合端粒酶本身的特点，人们开发出端粒酶抑制剂，应用不同端粒酶抑制剂针对端粒酶的不同组分及作用途径进行破坏或阻断，从而抑制端粒酶活性最终限制肿瘤的生长及发展，这是近年来国内外学者积极探索的一个方向。 1端粒与端粒酶概述 端粒是位于真核细胞染色体末端的一种特殊结构，由DNA片段和蛋白组成，其主要功能是维护染色体的完整性，端粒长度随着有丝分裂逐渐缩短，当缩短至不能维护染色体稳定时，则导致细胞凋亡。人端粒是染色体末端的一段富含GC 的重复序列，其生物学功能主要有：①保护染色体末端完整性；②参与染色体的
白细胞介素-6和PCT的临床意义
降钙素原 英文全称：procalcitonin 英文缩写：PCT PCT是由116个氨基酸组成的分子量约为13KD的蛋白质，为降钙素（calcitonin）的前体。在正常情况下，PCT由甲状腺C细胞产生，在血液中的半衰期为25～30小时。当严重感染并有全身表现时，PCT水平明显升高，这时大部分由甲状腺以外的组织产生。许多学者已经报道过PCT是早期诊断新生儿脓毒败血症的一个重要标志物。诊断的灵敏度和特异性可高达100%。PCT在较轻感染不受影响，但在系统性细菌感染和败血症后开始升高。目前PCT被作为一个有早期诊断价值的，可反映全身感染程度，评价疗效及判断预后的指标。 PCT是一种蛋白质，当严重细菌、真菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时它在血浆中的水平升高。自身免疫、过敏和病毒感染时PCT 不会升高。局部有限的细菌感染、轻微的感染和慢性炎症不会导致其升高。细菌内毒素在诱导过程中担任了至关重要的作用。 PCT反映了全身炎症反应的活跃程度。影响PCT水平的因素包括被感染器官的大小和类型、细菌的种类、炎症的程度和免疫反应的状况。另外，PCT只是在少数患者的大型外科术后1~4d可以测到。 PCT水平的升高出现在严重休克、全身性炎症反应综合征（SIRS）和多器官功能紊乱综合征（MODS），即使没有细菌感染或细菌性病灶。但是，在这些病例中PCT水平通常低于那些有细菌性病灶的患者。从肠道释放细胞因子或细菌移位可能引起诱导。 PCT升高 PCT降低或稍微升高： 细菌性感染伴随系统性炎症反应，例如：腹膜炎、软组织感染病毒感染，例如：乙肝，HIV，CMV 脓毒症，MODS 自身免疫性疾病和慢性炎症 全身性真菌感染过敏反应（类型I~IV） 寄生虫感染（痢疾）局部局限性细菌感染、溃疡、浅表微生物移植发展 细菌引起的ARDS 中毒引起的ARDS 急性呼吸窘迫综合征。
SortaseA酶抑制剂的进展
提 要：Sortase A 酶是一种介导革兰氏阳性细菌细胞壁与表面蛋白共价结合的蛋白酶。近年来研究表明Sortase A 酶在变形链球菌黏附于牙面的过程中起到关键作用，而口腔变形链球菌是主要致龋菌之一，通过对Sortase A 酶的研究有望开辟新型抗菌药物的筛选途径和新的治疗方法。目前，有关用Sortase A 酶作为靶蛋白的研究主要集中在抑制剂的方面，尤其集中在对天然产物及其来源衍生物的研究，本文就该方面作一综述。 关键词：SrtA ；抑制剂；变形链球菌；天然产物；综述文献 中图分类号：R 780.2 文献标识码：A 文章编号：1005-4057(2012)02-0208-03DOI: 10.3969/j.issn.1005-4057.2012.02..037 Sortase A 酶抑制剂的研究进展 王敬雯（综述），陈 坤、姜 颖（审校） （广东医学院附属医院口腔科，广东湛江 524001） 基金项目：广东省自然科学基金博士启动项目 (No.9452402301002065) 收稿日期：2012-01-16；修订日期：2010-03-23作者简介：王敬雯(1985－)，女，在读硕士研究生。 变形链球菌(Streptococcus mutans, S. mutans)是人类龋病肽，C 末端信号肽部分被称之为细胞壁锚定信号(cell wall 的主要致病菌之一，其在牙面黏附定植是致龋的首要条件。sorting signal, cwss)，由35个氨基酸残基组成，包括一个保守在变形链球菌中，作为细菌黏结素的表面蛋白通过转肽酶的SrtA 酶识别序列，通常称为LPXTGX 基因序列区，为一段[1] Sortase A 酶(SrtA) 的羧基末端共价结合于细胞表面，因此疏水氨基酸区域和一个带正电荷的尾部。SrtA 酶催化的表[3]SrtA 酶在变形链球菌黏附、致龋中起重要作用。目前研究发面蛋白的锚定是通过以下几个步骤完成的：第一步，表面现，除分支杆菌属外所有革兰氏阳性细菌均有一个保守的转蛋白前体通过其氨基末端的信号肽进入细菌的分泌系统，肽酶SrtA 酶，SrtA 酶的编码基因srtA 基因的突变常常产生多C 末端的疏水区域和正电荷尾部使蛋白保留在胞膜内，这就种影响，包括细菌表面连接蛋白变化和细菌毒力改变。近年使得膜内的SrtA 酶可识别蛋白前体的LPXTG 结构域。第二来，关于用SrtA 酶作为靶蛋白的研究主要集中在天然产物中步：SrtA 酶催化LPXTG 区的苏氨酸和甘氨酸残基之间发生蛋抑制剂的研究，本文就这方面做一综述。白水解反应，释放C 末端的疏水区域和正电荷尾部，同时，SrtA 酶中保守的半胱氨酸与LPXT 基序的苏氨酸形成硫醚连1 SrtA 酶与变形链球菌的关系及致龋的作用机制 接。第三步苏氨酸的羟基端与细胞壁前体(脂质Ⅱ)交联桥结[1] 口腔变形链球菌是龋病重要的致病菌之一，Igarashi 等 构上的甘氨酸基团形成酰胺连接。第四步：脂质Ⅱ与蛋白前首先发现变形链球菌中的SrtA 酶并对其编码基因srtA 的序列体连接后，经过转糖基反应和转肽反应形成成熟的肽聚糖，进行测定。在这项研究中，确定srtA 基因存在于变形链球菌细胞壁达到成熟，表面蛋白即被共价连接到细胞壁上。 细胞壁中，同时完成了其完整的核苷酸序列测序。结果发SrtA 酶在变形链球菌致龋作用中起重要作用。近年研究现，变形链球菌的srtA 基因由741 bp 组成，该基因编码分子表明，无论是在有无唾液与蔗糖的环境下，SrtA 酶在牙面生[4] [5]量为27 489，由246个氨基酸组成的转肽酶蛋白，即SrtA 酶，物膜的形成中均起到关键性的作用。Lee 等通过动物实验它可以介导细菌表面蛋白的锚定。SrtA 酶的三维结构显示其发现，变形链球菌SrtA 酶的基因突变株的致龋性要明显低于由8条β-折叠、1条α-螺旋卷曲形成，其中有2条带有3个转亲代株，这提示srtA 基因与变形链球菌的致龋性密切相关。角的螺旋连接到β-折叠上，Cys184、Arg197和His120为2 以SrtA 酶作为靶点的抑制剂研究 SrtA 酶活性中心。此后，他们发现SrtA 中含有一种Cbz-近年来随着抗生素的大量滥用，细菌越来越易产生耐药LPAT 的氨基酸序列，其中Cbz 是一种苄氧羰基的保护组，性，传统的微生物来源的抗生素或其衍生物逐渐失效，而植T 部分是一种苏氨酸衍生物，可以替换羰基群-CH2-SH ，该物来源以及天然产物来源的抗生素越来越被医药界所接受，酶通过T 部分形成一种双硫键连接于活性位点Cys184的硫醇因此天然产物药物将成为抗菌药物的重要来源。由于SrtA 酶基，形成一种共价的SrtA ΔN59-LPAT 复合物，即苏氨酸介导[2] 在革兰氏阳性菌感染中有着至关重要的作用，因此对以产生催化作用的结构模型。 SrtA 酶作为靶点的抑制剂研究也被广泛关注。 变形链球菌表面蛋白A 的N 末端和C 末端都含有特征信号[6] 汉城国立大学的Kim 等最先在80种植物中筛选出SrtA 酶的抑制剂。SrtA 酶在pH 7.5条件下活性最强，在20～45℃时活性最稳定。在此pH 值与温度下测试80种植物对SrtA 酶裂解抑制活性，其中木防己、漆树、阔叶麦冬和黄花贝母，尤其是这些植物的根茎提取物乙酸乙酯，显示出较好的抑制活 208 第 30 卷第 2 期2012 年 4 月广东医学院学报 JOURNAL OF GUANGDONG MEDICAL COLLEGE V ol. 30 No. 2Apr. 2012