猪IL-2真核表达质粒对猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因疫苗诱导小鼠细胞免疫增强作用的研究
兽医免疫学
猪IL 2真核表达质粒对猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因疫苗诱导小鼠细胞免疫增强作用的研究
陈希文程安春汪铭书希尼尼根豆文波张平英李雪梅王刚刘伍梅
(动物疫病与人类健康四川省重点实验室,四川农业大学动物科技学院,雅安625014)
中国图书分类号S852 43文献标识码A文章编号1000 484X(2005)01 0060 05
[摘要]目的:研究猪白细胞介素2真核表达质粒(pcDNA IL 2)对猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因疫苗(pcDNA PRRSV ORF5)诱导BALB/c小鼠产生细胞免疫应答的影响。方法:用pcDNA IL 2与PRRSV ORF5基因疫苗(pcDNA PRRSV ORF5)共同免疫B ALB/c小鼠,以空载质粒pcDNA为阴性对照,PBS为空白对照;采用流式细胞仪(FACS)、淋巴细胞增殖试验(MTT法)分别对小鼠外周血中CD4+、CD8+T淋巴细胞数和淋巴细胞的转化功能进行了检测。结果:pcDNA IL 2与pcDNA PRRSV ORF5共同免疫小鼠后外周血对ConA有明显的反应性,CD4+、CD8+T淋巴细胞数在免疫后7天显著超过对照组,共同组与单独pcDNA PRRSV ORF5组有显著差异(P<0 01)。结论:pcDNA PRRSV ORF5免疫小鼠能够诱导其机体产生良好的细胞免疫应答,猪pcDNA IL 2能够显著增强pcDNA PRRSV ORF5诱导小鼠细胞免疫的能力。
[关键词]猪白细胞介素2真核表达质粒;猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因疫苗;细胞免疫;小鼠
Studies of the pig interleukin2(IL 2)eukaryon expression plasmid on cellu lar im mune responses of BALB/c mice immuned with pcDNA PRRSV ORF5DNA vac cine
C HEN Xi Wen,C HE NG An Chun,WANG Ming Shu,XINI Ni Gen,DOU Wen Bo,Z HANG Ping Y ing,LI Xue Mei, WANG Gang,LIU Wu Mei.Key Labo rato ry o f Animal Disease andHuman Health o f Sichuan Pro vince,College o f Animal Science and Veterinary Medicine o f Sichuan Agriculture University,Ya!an625014,China
[Abstract]Objective:To study the effect of pig interleukin2(IL 2)eukaryon expression plas mid on cellular i mmune responses of BALB/c mice immuned with pcDNA PRRSV ORF5DNA vaccine.Methods:B ALB/c mice were immunized with pcDNA PRRSV ORF5DNA vaccine and pi g interleukin2(IL 2)eukaryon expression plas mid by the routes of co injection and DNA vaccine injection alone respectively, wi th PBS and pcDNA3 1(+)as controls.Fluoresecence Activated Cell Sorter(FACS),T lymphocyte proliferati on test(MTT)were used to de tect the number of CD4+、CD8+and the T lymphocyte proliferation in peripheral blood of mice vacci nated.Results:Con A response of T lym phocytes in blood was higher in experimen t group than the control group(P<0 01).The number of CD4+and CD8+T lymphocytes was sig nificantly higher i n experiment groups than that of the control group7days after vaccination.The experimen t group vaccinated with DNA vac cine and pig IL 2eukaryon expression plasmid co injecti on showed higher cellular immune response than that vaccinated with DNA vaccine alone.Conclusion:pcDNA PRRSV ORF5DNA vaccine could induce higher response of cellular immune response and pi g IL 2eukaryon ex pression plasmid was effecti ve adjuvant which could signi ficantly enhance the i mmunogenicity of pcDNA PRRSV ORF5DNA vaccine.
[Key words]Pig interleukin2(IL 2)eukaryon expression plasmid;Porcine reproductive and respiratory syndrome virus ORF5DNA vaccine;Cellular i mmune response;Mice
白细胞介素2(Interleukin 2,I L 2)是由T淋巴细胞或T淋巴细胞系分泌产生的一种极为重要的淋巴因子,自从1983年Taniguch首次克隆了人IL 2cD NA以来,迄今为止已有30多种哺乳动物的IL 2基因被克隆,并已被广泛应用于DNA疫苗的免疫试验
四川省生物技术项目(01NG018 03),国家科技攻关重大项目(2004BA901A03)和四川省重点建设学科项目(SZD0418)
作者简介:陈希文(1977年-),男,在读硕士研究生,主要从事动物传染病病原与生物制品学研究;
指导教师及通讯作者:程安春(1965年-),男,教授,博士生导师,主
要从事动物传染病教学和研究工作,E mail:
Anc hun@https://www.wendangku.net/doc/df6192904.html,或chenganchun@hotmail.
com。中,研究发现IL 2能通过多种作用环节促进T细胞的增殖、活化,并刺激MHC?类抗原等多种细胞表面分子的表达和多种细胞因子的产生,从而造成有利于免疫应答的局部微环境来调节和增强DNA疫苗的免疫效果,发挥其佐剂效应[1 3]。为了探讨猪IL 2真核表达质粒作为pcDNA PRRSV ORF5基因疫苗佐剂的可能性,我们构建了编码PRRSV主蛋白GP5的重组真核表达质粒pcDNA PRRSV ORF5作为基因疫苗,采用猪pcDNA I L 2作为佐剂,研究pcD NA I L 2对pcDNA PRRSV ORF5基因疫苗诱导B ALB/c小鼠产生细胞免疫应答的影响,为pcDNA PRRSV ORF5基因疫苗的临床应用提供科学依据。
1材料与方法
1 1材料
1 1 1细胞、毒株及质粒Marc 145细胞、大肠杆菌JM109、含pGE M T IL 2质粒的大肠杆菌JM109、猪繁殖与呼吸综合征病毒四川分离株1(PRRSV SC1),由动物疫病与人类健康四川省重点实验室保存;pcDNA3 1(+)质粒:Invitrogen产品。
1 1 2实验小鼠80只,为纯系3周龄雌性B ALB/ c小鼠,每只18~22g,血清中PRRS抗体阴性(购自四川大学实验动物中心)。
1 1 3主要试剂Ba mHI,EcoRI,XbaI,10#buffer K, pGEM T载体,2#rapid ligation buffer,x gal,IP TG,T4 DNA Ligase等均购自大连宝生物、天泰、上海联合基因公司。培养基RPMI1640(GIBC O BRL公司产品),按说明书用双蒸水配制,过滤除菌,临用前加双抗。刀豆蛋白A(ConA)(Sigma公司产品),用RPMI1640培养液配成1mg/ml浓度过滤除菌。MTT(Sigma公司产品),临用前用PB S配成5mg/ml浓度过滤除菌。淋巴细胞分层液(上海华精生物高科技有限公司产品),荧光素(FI TC)标记抗小鼠CD4+、CD8+单克隆抗体(批号:119451,Bio Legend公司产品)。
1 1 4主要仪器流式细胞仪(Fluoresecence Acti vated Cell Sorter,FACS,E LI TE E SP,Coulter公司);酶联免疫检测仪(EL#800型,Bio tek公司);超净工作台(SW CJ 2FD型,苏州安泰空气技术有限公司);台式水平离心机(B ECKMAN C OULTER TM公司,美国)。
1 2方法
1 2 1基因疫苗pc DNA PRRSV ORF5和猪pcDNA
I L 2的构建及制备参照文献[4]进行,以PRRSV SC1的核酸为模板,用RT PCR法扩增ORF5基因cDNA片段,将其与克隆载体pGE M T连接,构建成pGE M T ORF5重组质粒。再用Bam HI、EcoRI酶切消化,回收目的基因片段ORF5并通过粘端连接重组于真核表达载体pcDNA3 1(+),构建成pcDNA PRRSV ORF5基因疫苗。用Bam HI、XbaI酶切消化,从pGE M T IL 2质粒中扩增猪I L 2基因,并将其重组于真核表达载体pcDNA3 1(+),构建成猪pcD NA IL 2真核表达质粒。构建成的上述真核表达质粒分别经酶切分析,PC R扩增和DNA序列测序(上海基因联合公司)进行鉴定。以碱裂解法大量制备真核表达质粒pcDNA PRRSV ORF5和猪pcDNA IL 2,采用聚乙二醇(PEG)沉淀法纯化。
1 2 2基因疫苗的免疫将80只B ALB/c小鼠随机分成4组,20只/组。其中,A组肌肉注射pcDNA PRRSV ORF5100 g/只;B组肌肉注射pcDNA PRRSV ORF5100 g/只+猪pcDNA IL 2100 g/只; C组肌肉注射空载体质粒pcDNA200 g/只;D组肌肉注射PBS200 g/只为对照。上述各组均分别免疫2次,间隔15天。在免疫前,给需要肌肉注射的
B ALB/c小鼠左右肢股四头肌按100 l/只注射
0 5%盐酸普鲁卡因注射液进行预处理,使肌肉处于再生状态,以提高DNA的摄取率,3天后在相同部位进行DNA免疫。
1 2 3血样的采集在第一次免疫后第7、15、28、41、55、70天各时间点从各组随机取3只小鼠,用摘眼球法取抗凝血两份,分别用于分离淋巴细胞作淋巴细胞转化实验和分析T细胞亚群CD4+、CD8+数量变化关系。
1 2 4淋巴细胞转化实验
1 2 4 1外周血淋巴细胞的分离参照文献[5]进行,即取抗凝血0 5ml,加Hank!s液0 5ml,混匀。轻轻加在1ml淋巴细胞分层液面上,2000r/min离心15分钟。小心收集中间层淋巴细胞,以Hank!s 液离心洗涤细胞沉淀2次,再以完全RPMI1640培养基(含青霉素200U/ml,链霉素200 g/ml,小牛血清10%,Hepes20mmol/L),将细胞稀释成1#107 m1-1,制成单细胞悬液。
1 2 4 2淋巴细胞的诱导培养参照文献[6]进行,即取100 l单细胞悬液于96孔培养板内,其中ConA终浓度为25 g/ml,并设阴性对照。每个样本设3个重复孔,置5%CO2,37?培养68小时后加入MTT,10 l/孔(5mg/ml),继续培养4小时。最后每孔加100 l酸化的SDS(即10%SDS0 04mol/L HCl)终止反应,再继续作用2小时。
1 2 4 3检测及数据处理在酶联免疫检测仪上测定OD490nm的值,将所得的数据用SPSS10 0和SigmaPlot9 0进行统计学处理。
1 2 5T淋巴细胞亚类数量的检测
1 2 5 1外周血淋巴细胞的预处理取抗凝血0 1 ml,加8ml红细胞裂解液,室温作用10分钟,1500 r/min离心10分钟,弃上清液,加5ml PBS,混悬, 1500r/min离心10分钟,重复2次。
1 2 5 2T淋巴细胞的荧光标记FI TC标记抗小鼠单克隆抗体(0 1mg/ml),稀释10倍(0 01mg/ ml)。每管取细胞悬液0 5ml,分别稀释单抗10 l (0 1 g),4?作用1小时,再加PBS缓冲液1ml低速混匀,离心5分钟,离心力200g,弃上清,将管底细胞用1ml PBS悬浮,测样。
1 2 5 3FACS检测及数据处理FACS检测3000
个细胞,所得数据用SPSS10 0和SigmaPlot 9 0进行统计学处理。
2 结果
2 1 基因疫苗接种后对小鼠的临床影响 小鼠接种猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因疫苗后,精神、食欲均未发现异常反应,每次采样时对各组小鼠器官进行剖检,均未发现肉眼可见的形态学病变。2 2 pcDNA IL 2和pcDNA PRRSV ORF5基因疫苗共同肌注免疫小鼠后小鼠外周血T 淋巴细胞转化效果 A 、B 两组小鼠免疫后,其OD 490值从第7天起,就明显高于C 、D 组,有极显著差异(P <0 01)。同时,B 组从第7天起,就一直高于A 组,A 、B 两组间差异极显著(P <0 01),见图1。
2 3 猪pcD NA I L 2和pcD NA PRRSV ORF5基因疫苗共同肌注免疫小鼠后T 淋巴细胞亚群数量的动态变化2 3 1 猪pc DNA I L 2和pcDNA PRRSV ORF5基因疫苗共同肌注免疫小鼠后小鼠CD4+
T 淋巴细胞亚群数量的动态变化 A 、B 两组外周血CD4+T 淋巴细胞数从免疫后的7天起就高于C 、D 组,在55天时达最大值,差异极显著(P <0 01),直到第70天仍有显著差异(P <0 05)。B 组从第7天起就一直高于A 组,组间差异显著(P <0 05),见图2。
2 3 2 pcDNA I L 2和pcDNA PRRSV ORF5基因疫苗共同肌注免疫小鼠后小鼠CD8+
T 淋巴细胞亚群数量的动态变化 A 、B 、C 、D 各组外周血CD8+T 淋巴细胞数从免疫后的7天起,都逐渐下降,在第15天时最低,然后逐渐上升,之后又有不同程度的下降。在41天时试验组A 、B 与对照组C 、D 有极显著差异(P <0 01)。B 组在整个试验过程中都高于A 组,在15天、41天时,差异极显著(P <0 01),见图3
。
图1 pcDNA IL 2和pcDNA PRRSV ORF5基因疫苗共同免疫小鼠后T 淋巴细胞增殖试验
Fig 1 C hanges of T lymphocyte proliferation test after inocu
lation pcD NA IL 2+pcD NA PRRSV ORF5DNA vac cine in BA LB/c mice
Note:# P <0 05,## P <0 01vs PBS group;* P <0 05,**
P <0 01vs pcDNA PRRSV ORF5group.
图2 pcDNA IL 2和pcD NA PRRSV ORF5基因疫苗共同免
疫小鼠后外周血CD4+
动态变化Fig 2 The CD 4+in the peripheral blood of BALB/c mice af
ter inoculation pcD NA IL 2+pcDNA PRRSV ORF 5DNA vaccine
Note:# P <0 05,## P <0 01vs PBS group;* P <0 05,**
P <0 01vs pcD NA PRRSV ORF5group.
图3 pcDNA IL 2和pcD NA PRRSV ORF5基因疫苗共同免
疫小鼠后外周血CD8+
动态变化
Fig 3 The CD 8+
in the peripheral blood of BALB/c mice af
ter inoculation pcD NA IL 2+pcDNA PRRSV ORF 5DNA vaccine
Note:# P <0 05,## P <0 01vs PBS group;* P <0 05,**
P <0 01vs pcD NA PRRSV ORF5group.
3 讨论
3 1 机体免疫应答的最终免疫效应与细胞水平的T 、B 淋巴细胞的免疫功能表现以及多种免疫活性细胞的相互作用密切相关[7]。在抗原及有丝分裂原ConA 和LPS 的刺激下,淋巴细胞转化为淋巴母细胞的效率是考察机体免疫功能状态的重要指标之一[8],ConA 诱导T 淋巴细胞增殖,LPS 诱导B 淋巴细胞增殖。由图1可以看出,本研究在用pcDNA PRRSV ORF5基因疫苗免疫小鼠后,在不同时间小
鼠外周血淋巴细胞对ConA 有明显的反应性,由图2、3可以看出,小鼠在接种基因疫苗后,各组外周血CD4+、CD8+T 淋巴细胞数明显高于对照组。以上结果表明,pcDNA PRRSV ORF5基因疫苗免疫小鼠后,诱导小鼠产生了较强的细胞介导的免疫应答。这不
仅证实了基因疫苗在诱导机体免疫应答方面有近似天然病原体感染的优点,而且也首次证实了猪繁殖与呼吸综合征病毒SC1株基因疫苗pcDNA PRRSV ORF5有较强的免疫原性,为PRRSV基因疫苗的临床应用提供科学依据。
3 2许多细胞因子已被证实能增强DNA免疫应答的强度,发挥佐剂的作用,其中以IL 2的应用最为广泛[9 12]。在对人类和多种哺乳动物的研究表明, I L 2可以促进T、B淋巴细胞的增殖、分化,对自然杀伤细胞(NK)、淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)等都有多种促进作用[13 15]。C how等(1997)[10]构建了编码HBV中等蛋白(pre s2+s)与I L 2共表达的质粒,经接种小鼠后,观察到其诱导的抗HBV抗体产生及T细胞增殖反应,比单纯表达中等蛋白的重组质粒显著增强,提示表达的IL 2可促进HB V DNA疫苗的免疫应答。Geissler等(1997)[12]将编码丙型肝炎病毒(HCV)核心抗原的表达质粒与小鼠IL 2真核表达质粒共同肌肉注射免疫小鼠,结果显示,IL 2真核表达质粒可增强核心抗原对B、T淋巴细胞的刺激强度,抗HCV核心抗体阳转率从40%增加到80%,针对HC V核心蛋白的特异性C TL活性及CD4+T淋巴细胞的增殖反应也显著增强。Xin等(1998)[16]发现,IL 2真核表达质粒可增强HI V DNA疫苗诱导细胞免疫应答的能力。本研究中,我们将猪pcDNA IL 2和pcDNA PRRSV ORF5基因疫苗共同肌注免疫小鼠来探讨其对机体免疫功能的影响,结果表明注射有猪pcDNA IL 2的实验组,无论是T淋巴细胞亚群数量,还是T淋巴细胞的转化功能,都显著高于单独注射pcDNA PRRSV ORF5基因疫苗实验组(P< 0 01),表明猪pcDNA I L 2在小鼠体内得到了表达,并对基因免疫小鼠的细胞免疫功能有极显著的促进作用,也表明猪pc DNA I L 2可作为佐剂与pcDNA PRRSV ORF5基因疫苗共同使用来提高DNA疫苗的免疫效果。
在实践中,与细胞因子联合应用的方法包括: 在注射重组质粒DNA的同时注射细胞因子;%将重组质粒与编码细胞因子的质粒混合后注射;&将外源基因与编码细胞因子的基因形成融合基因,克隆于真核表达载体,然后再注射。目前认为,注射编码细胞因子质粒比注射细胞因子更为有效,这可能是因为细胞因子半衰期很短,注射的细胞因子除了少部分与免疫活性细胞结合外,大部分进入血液后被清除,不能有效地维持对免疫活性细胞较长时间的刺激;而注射的细胞因子质粒DNA经细胞摄取后,表达的细胞因子能较长时间地刺激免疫活性细胞,促进它们的摄取、呈递抗原的功能,持续活化T、B 淋巴细胞,促进细胞免疫和体液免疫应答[17,18]。本研究检测至70天时,T淋巴细胞增殖能力和CD4+T 淋巴细胞仍显著高于无免疫增强剂组的结果进一步证实了这一观点。
本研究结果表明,猪繁殖与呼吸综合征病毒SC1株基因疫苗pcDNA PRRSV ORF5可诱导小鼠产生良好的细胞免疫应答,猪pcDNA IL 2对基因免疫小鼠的细胞免疫功能有极显著的促进作用,猪pcD NA IL 2可作为佐剂与pc DNA PRRSV ORF5基因疫苗共同使用来提高DNA疫苗的免疫效果,这一结论必将为研制PRRSV ORF5基因疫苗以及其临床应用提供有意义的基础数据和资料。
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[收稿2004 06 29修回2004 10 11]
(编辑许四平)
猪呼吸道疾病综合征(PRDC)综合防制
猪呼吸道疾病综合征(PRDC)综合防制 【研究背景】近年来，猪呼吸道疾病综合征（porcine respiratory dis-ease complex，PRDC）在全国呈现地方流行趋势，发病率和死亡率高，给养猪业造成巨大的经济损失。也是全球养猪业面临的重大突出问题之一，现已成为中国养猪业中以经济学意义影响最大的疾病。 猪呼吸道疾病综合征（PRDC）是一种多因素性疾病，即猪群在亚健康状态下先后感染病毒、细菌、支原体等病原后，从而使猪呼吸系统表现出一系列综合症候群。猪呼吸道疾病综合征(PRDC)的危害体现在主要发生于仔猪、保育猪和生猪育肥阶段，一年四季均可发生，在秋末、冬季和春季为高发期，发病率通常在30-70%，死亡率在10-30%。特别是在13-15周龄和18- 20周龄，其较高的发病率和死亡率，治疗成本增加，以及延缓猪的生长速度、降低饲料效率和猪群整体的均匀度，出栏时间延长10- 25天等；猪场因该病导致的经济损失也最为严重。该病常用的药物有支原净、泰农、利高霉素、氟甲砜霉素、泰乐菌素、磺胺药、金霉素、恩诺沙星、阿莫西林等，这些药物理论上对发病早期的猪有一定的效果，而在临床实践上，往往是猪群发病多日、免疫力下降，而且病毒、细菌等混合感染严重，此时再用上述药物，效果不佳。 2003年以来，河南广安集团专家组在河南、山东、湖北等地的上百个规模猪场用防蓝灵 防控猪呼吸道疾病综合征（PRDC）的进行数据研究，并制定了综合防制措施，取得了显著效果。 一、试验研究依据 1、猪呼吸道疾病综合征综合防制措施的设计思路 1.1、完善强化日常防疫措施，防止病原传播； 1.2、制定和实施猪瘟等主要疾病的免疫程序，防止并发病； 1.3、防蓝灵保健，广谱抗菌、抗病毒、提高机体免疫力，控制并发病。 2、防蓝灵的药理作用及其机制 2.1防蓝灵组方：（1）替米考星、（2）免疫强化剂、（3）特殊营养元素等。本品主要以广谱抗菌、抗病毒和增强机体免疫力以及改善猪群生产性能指标为主，综合防控猪呼吸道疾病综合征（PRDC）。 2.2、现代药理学表明： （1）替米考星对G+、G- 和支原体均有效，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、胸膜肺炎放线杆菌、巴氏杆菌及畜禽
猪繁殖和呼吸障碍综合征
猪繁殖和呼吸障碍综合征 2009年08月24日来源：本站原创我要评论(0)作者：猪场动力 概述 猪繁殖和呼吸障碍综合征(Porcine reproductive and respiratorysyndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)引起的猪的一种高度传染性疾病，又称“猪蓝耳病”，本病以妊娠母猪的繁殖障碍(流产、死胎、木乃伊胎)及各种年龄猪特别是仔猪的呼吸道疾病为特征。本病是20世纪80年代末发生于养猪业发达国家的一种病毒性疾病，在世界各国引发了空前的“流产风暴”，给世界养猪业造成巨大的经济损失，现已成为规模化猪场繁殖障碍和呼吸道疾病的主要疫病之一。本病于1987年在美国首先发生，随后加拿大也报道了本病，90年代初欧洲开始流行，在我国，本病首先于1995年底在华北地区规模化猪场发生，其后短短几年时问在我国大部分养猪地区流行。本病曾称为“神秘猪病”、“新猪病”、“猪流行性流产和呼吸综合征”、“猪生殖与呼吸综合征”、“蓝耳病”、“猪瘟疫”等。1991年，欧洲学者提出将本病命名为“猪繁殖与呼吸综合征”，1992年在美国的明尼苏达州召开的第一届国际研讨会正式采用该命名，也是世界动物卫生组织(OIE)正式定名。OIE将该病列为B类传染病，我国也将其列为二类传染病。 病原 猪繁殖与呼吸综合征病毒为单股正链RNA病毒，属套式病毒目、动脉炎病毒科(Arterividdae)、动脉炎病毒属(Arterivirus)。呈球形，有囊膜，直径在40～60nm之间，表面有约5nm大小的突起。核衣壳呈二十面体对称，直径为25～30nm。无血凝活性，不凝集哺乳动物或禽类红细胞。有严格的宿主专一性，对巨噬细胞有专嗜性。病毒的增殖具有抗体依赖性增强作用，即在亚中和抗体水平存在的情况下，在细胞上的复制能力反而得到增强。病毒在氯化铯中的浮密度为1.13～1.19g/mL，在蔗糖梯度中的浮密度为1.18～1.23g/mL。病毒的稳定性受pH和温度的影响比较大。在pH小于5或大于7的条件下，其感染力降低95%以上。在pH7.5的培养液中可于-20℃和-70℃长期保存，在4℃则缓慢失去感染性。干燥可很快使病毒失活。对有机溶剂十分敏感，经氯仿处理后，其感染性可下降99.99％。对常用的化学消毒剂的抵抗力不强。 猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组长约15kb，含有9个开放阅读框，基因之间有部分重叠。可在猪原代肺泡巨噬细胞上增殖，猪繁殖与呼吸综合征病毒分为两个型，即以ATCC VR-2332毒株为代表的美洲型和以Lelystad virus(LV株)为代表的欧洲型。猪繁殖与呼吸综合征病毒具有变异性，欧洲和美洲分离毒株之间存在显著的抗原差异性，两者只有很少的交叉反应。序列分析表明北美两地区的分离株存在广泛的基因组变异，而欧洲毒株之间则呈较为保守性。不同毒株之间在毒力和致病力上有明显的差异。我国的猪繁殖与呼吸综合征病毒分离毒株均属美洲型，迄今还没有发现欧洲型毒株，同时我国的分离毒株也存在变异现象，现已发现有缺失变异毒株的存在。
猪呼吸道疾病综合症(完整版)
病猪 猪呼吸道疾病综合症是由细菌、病毒、支原体、环境应激等多种因素相互作用引起的呼吸道疾病的总称，往往是入侵的或正常携带的病原体同环境因素相互作用的结果。主要危害断奶后的保育猪及早期生长的育肥猪，病猪的主要特征为咳嗽、呼吸急促、眼鼻分泌物增多、发热、厌食，猪只体重迅速下降。 中文名：猪呼吸道疾病综合症英文名：porcine respiratory disease complex 病原学：细菌、病毒、支原体、环境应激等多种因素相互作用引起季节分布：四季 传染病：是传播途径：呼吸道传播 临床表现：咳嗽、呼吸急促、眼鼻分泌物增多、发热、厌食，只体 重迅速下降 疫苗预防：是 预防措施：加强饲养管理，减少应激提高营养水平，增强猪的抗 病能力做好免疫接种工作 主要器官病变 随着规模化、集约化养生产的迅速发展，病的发生与流行也出现了许多新的特点，以保育发热、咳嗽和呼吸困难为主要症状的疾病在许多规模化场迅速蔓延，由于病因复杂，一些专家将其称为复合病因呼吸道病。 该病是由细菌、病毒、支原体、环境应激等多种因素相互作用引起的呼吸道疾病的总称，往往是入侵的或正常携带的病原体同环境因素相互作用的结果。主要危害断奶后的保育及早期生长的育肥，病的主要特征为咳嗽、呼吸急促、眼鼻分泌物增多、发热、厌食，只体重迅速下降。该病一旦发生，如果仅采取单一的措施防治，效果往往不太理想。近年来，该病已成为影响养业经济效益的主要疾病，严重影响了养业的发展，给养业造成了巨大的经济损失。
猪呼吸道疾病综合症（PRDC）是猪在一定的应激环境下至少先后感染两种以上病源从而在猪的呼吸系统中表现一系列综合征群。目前猪呼吸道疾病综合征是中国养猪业中最重要以及经济学意义最大的疾病，猪场因为该病导致的经济损失也最为严重。近年来，成为世界各国养猪业疫病防治十分突出生的问题之一。猪呼吸道疾病综合症一年四季均可发生，在秋末、冬季和春季发病率最高，通常在30－70%，病死率在10－30%，主要发生于保育后期和生长育肥期，特别是在13－15周龄和18－20周龄。发病率30－50%，而死亡率较低。由于发病猪体温升高，所以采食量下降，生长速度缓慢，导致出栏时间延长10－25天。 猪呼吸道疾病综合症 - 呼吸道综合症对养业的主要危害 呼吸道综合症发病期间，常出现继发感染和混合感染，造成在诊断和控制上出现混乱，使药物应用和紧急注射不见明显效果，进一步增加了对呼吸道综合症的控制难度，使发病过程延长，短则1个月，长则2～3个月才能得到基本控制。 呼吸道综合症发病期间，母可能出现流产、产死胎、弱胎等；公可能出现跛行和睾丸炎等，进一步对场生产造成影响。康复生长明显受阻，日增重降低，料重比升高，推迟上市10～30天，甚至出现突然死亡的情况，给场造成严重的经济损失。 发病群的发病率和死淘率均升高。由于呼吸道综合症主要侵袭断奶后仔，而此时群正处于母源抗体保护力下降，自身免疫没有完全建立，消化和呼吸系统的功能尚未健全，又处于断奶应激和更替时期，所以呼吸道综合症发病场的群发病率高达30%～70%，死淘率高达10%～30%。 猪呼吸道疾病综合症 - 病原体 病毒性病原体 猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪Ⅱ型圆环病毒、猪流感病毒、猪巨大细胞病毒、包涵体鼻炎病毒等。 细菌性病原体
区分猪呼吸道疾病综合征临床症状及病因
区分猪呼吸道疾病综合征临床症状及病因 ?点击：721 ?日期：2014-06-09 09:17 ?来源：猪价格网 ? 1 PRDC临床症状差异大注意区分病型 许多有关PRDC的报道显示，体温升高、咳嗽和呼吸困难是本病的主要临床症状，但从近几年临床病例观察，许多病例不显示体温升高，而且咳嗽和呼吸困难等症状也不明显，或仅有不引人注意的浅表性呼吸增快或偶而咳嗽，但常有喷鼻、“鼻子不透气”、以至“流鼻血” 等症状。对这些猪进行剖检时，绝大多数肺部有严重以至极为严重的炎症、纤维化、硬化等病变，确诊它为PRDC是无可怀疑的，认为这属于PRDC的慢性型和隐性型，这种病型的病例远远多于急性型，这说明不少地方已成为PRDC的老疫区，并在逐渐扩大。 当前急性型的PRDC常呈爆发形式，多见于新疫区的猪群，可找出明显的激发因素或饲养管理失误因素，它发病初期具有明显的体温升高、咳嗽、发喘以及精神沉郁，采食废绝，或有腹泻、便秘现象。急性型的PRDC在病早期的皮肤常有弥漫性发红或伴有灰色瘀血、出血小斑点。部分慢性或隐性患猪皮肤呈暗红或浅灰色，被毛粗糙逆立，毛孔渗出浅红色液体并干涸结成棕黑色痂皮，附着于毛孔处。也见有极个别猪皮肤呈现苍白贫血现象。 相当数量的病猪于病的中、后期，在耳部、腹部、四肢末端、大腿后侧出现紫红、紫黑色出血斑。部分急性型病猪因治疗失误，如大剂量使用退烧药、抗病毒药和糖皮质激素等，而致体温降至常温或其以下，从而掩盖了热性病的症状，少数因药物的毒副作用发生贫血、黄疸。 在PRDC的临诊中，应特别注意体温不高，呼吸道症状不明显的病猪群，往往发生漏诊或误诊。应对此类病、死猪做剖检诊断，即可迅速得出确切诊断并分清病型，有助于及早采取相应的防控措施。近几年在某些猪群，还发现长势良好的猪，突发高度呼吸困难的同时，伴有瘫痪不能站立的情况，致死率达70%以上的情况，个别猪还有神经症状，对此类猪做剖检可确认属PRDC，但其发生瘫痪的机理有待研究，初步考虑可能与某些病原体的毒素有关。 2 患PRDC发生猝死的原因何在
猪场常见呼吸道疾病的诊断与防治
猪场常见呼吸道疾病的诊断与防制 呼吸道疾病一直是困扰猪场的一类重要的病症，其病因复杂，病原多样，流行性广，防治困难，给猪场带来很大损失。影响猪呼吸道系统的主要病原有：猪瘟病毒，猪繁殖与呼吸综合征病毒，猪圆环病毒2型，猪伪狂犬病毒，肺炎支原体，副猪嗜血杆菌，多杀性巴氏杆菌，胸膜肺炎放线杆菌等；呼吸道疾病的控制应从猪场饲养管理，生物安全和防疫，疫苗免疫，药物预防等方面综合控制。 1．引起猪呼吸道疾病的主要病原，发病特点及诊断防治： 猪瘟病毒（CSFV）： 猪瘟引起的疾病病症包括急性型，慢性型和迟发型。急性猪瘟病猪体温高至℃，呈稽留热，畏寒打堆，腹泻后便秘，病猪鼻端，耳尖，四肢内侧，腹下，外阴等处出现出血变化。母猪可见流产，产死胎等症状。慢性猪瘟主要表现为消瘦，贫血。体温时高时低，生长发育不良，常常成为僵猪。猪瘟对呼吸系统的影响主要表现在能引起呼吸道的卡他性，纤维性和出血性炎症反应，引起免疫抑制并继发其它疾病感染。猪瘟病毒的血清型单一，绝大多数猪场进行了疫苗接种等预防措施，使得典型的猪瘟的发生率得到了有效的控制，目前猪瘟主要表现出非典型性，温和性和散发性，使得猪瘟的鉴别诊断存在一定的困难。而由于各个猪场疾病控制手段存在差异，猪瘟免疫也存在免疫耐受，抗体整齐度和滴度的不一致等，猪瘟的防控仍然存在较大的压力。 猪瘟的主要病理解剖特点有：肾脏表面出血；脾脏边缘出现出血性梗死；回肠和盲肠粘膜上有纽扣状溃疡。确诊还须借助实验室诊断，包括：免疫荧光试验、ELISA、反向间接血凝等，RT-PCR是借助于分子诊断技术对病毒核酸进行
快速诊断的方法，具有快速、敏感的特点。目前猪瘟防控主要通过疫苗免疫，有条件的猪场可以通过检测各阶段猪群的抗体水平，对免疫程序做出相应的调整。 猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）： 又名蓝耳病毒，传播迅速，主要通过呼吸道感染，是目前造成猪场生产不稳定的重要病原，蓝耳病毒属于动脉炎科，是一种RNA病毒，由于病原核酸存在变异性并在不同的毒株间存在抗原漂移，使得本病的防控存在很大难度。PRRSV有两个基因型，欧洲型（LV）和美洲型（VR2332）。在我国主要流行美洲型毒株。PRRSV主要通过在猪肺泡巨噬细胞（PAM）内增殖而感染机体，引起各阶段猪群呼吸障碍，肌肉震颤，共济失调，腹式呼吸，耳部及四肢末端发紫等病症，并能引发严重的免疫抑制。在母猪引起怀孕后期母猪流产，产死胎，木乃伊胎儿，或弱仔等。 本病的原发性感染只造成轻微的肺损害，而大部分呼吸症状和病变是由原发性感染后的继发感染所致。主要病理变化为弥漫性间质性肺炎，并伴有卡他性肺炎区。实验室诊断方法包括：血清中和试验（SN）；ELISA检测抗体；病毒分离鉴定；RT-PCR方法等。防制主要通过生物安全措施，定期消毒措施，对引进的种猪进行隔离，待检测结果表明不携带病毒时方可引入基础群。目前，国内外对控制PRRS也研制出了相应的疫苗，但灭活苗激起不了机体免疫应答，弱毒苗又存在的散毒的危险，并且有事实已证明，由于病毒本身的变异性使得疫苗在防控蓝耳病所起的作用上存在很多疑问，专家学者争论不已。但至少做好生物安全措施是绝无坏处的。 猪圆环病毒2型（PCV-2）：
猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)
猪繁殖与呼吸综合征（PRRS） PRRS，又称猪繁殖与呼吸综合征，猪蓝耳病，猪流行性流产----呼吸综合征，是近年来发现的一种病毒性传染病，给养猪业造成很大的经济损失。本病主要引起母猪繁殖障碍，仔猪肺炎和断奶前后仔猪的死亡率增高，自1987年在美国，1990年在欧洲被发现后传播蔓延速度十分惊人，病毒分离和血清检查表明，PRRS现已传遍世界主要养猪国家。1995年，我国在北京郊区首次暴发了PRRS，1996年以来，国内一些单位进行的流行病学和血清学调查证明，我国大部分省市都已有此病，且血清阳性率都很高，但呈地方性流行特征。特别是2002年大有全国一片蓝的趋势。 针对PRRS的现状，各国都已引起高度重视，近年来在流行病学，免疫学及致病机理，实验室诊断技术，综合防制等方面开展了大量的调查研究工作，PRRS的诊断与防制尤其成为当前兽医研究的一个热点。 （--）病原 PRRSV为一有囊膜的病毒，直径50---65nm,表面相对平滑，立方形核衣壳，核心直径25—35nm。PRRSV对热敏感，这种敏感性提示用于病毒分离的血清和组织样品应保存在-20C下或4C条件下，以保护样品的感染性，用脂溶剂氯仿和乙醚处理以后，PRRSV失去活性。北美和欧洲PRRSV分离株虽然不能凝集进行实验的各种红细胞，但最
近的研究发现，部分毒株及用去污剂预处理的毒株可以表现出对一定动物红细胞的凝集性。 PRRSV具有严格的宿主特异性，最初是用猪肺泡巨噬细胞（PAM）及其它组织的巨噬细胞进行病毒的分离与鉴定的，在体外培养中，PRRSV可以在猪肺泡巨噬细胞（PAM）和非洲绿猴肾细胞（vero）及其衍生的细胞系如MARC—145，CL——2621中生长。 在肺泡巨噬细胞的培养物种加入PRRSV抗体后，可使病毒的复制增强，同样在病毒中加入PRRSV抗体后，其在妊娠期胎儿体内的复制也大为增强，这种现象称为抗体依赖性增强作用（ADE）其原因可能是病毒与抗体形成免疫复合物后借助细胞表面Fc受体与PAM结合，从而促进了病毒进入细胞。ADE在PRRS的发病机理及免疫学上具有重要意义。通过母原抗体获得被动免疫的仔猪，一旦母源抗体水平降至保护水平以下PRRSV就会表现出ADE，从而增强了仔猪的易感性。这种作用对本病的防制带来困难，因为疫苗诱导的抗体可能会增强野毒株在体内的复制，而野毒株产生的抗体也可能会增强疫苗毒的复制。 2 流行病学 最初多呈急性暴发，以后转为慢性和地方性流行。传染源为病猪和带毒猪，病毒感染后157天内可以从扁桃体上分离到病毒，在妊娠后90天易感染，且成为持续性感染猪
防蓝灵在猪呼吸道疾病综合征的应用成果
防蓝灵在猪呼吸道疾病综合征的应用数据研究 【研究背景】近年来，猪呼吸道疾病综合征（porcine respiratory dis-ease complex，PRDC）在全国呈现地方流行趋势，发病率和死亡率高，给养猪业造成巨大的经济损失。也是全球养猪业面临的重大突出问题之一，现已成为中国养猪业中以经济学意义影响最大的疾病。 猪呼吸道疾病综合征（PRDC）是一种多因素性疾病，即猪群在亚健康状态下先后感染病毒、细菌、支原体等病原后，从而使猪呼吸系统表现出一系列综合症候群。猪呼吸道疾病综合征(PRDC)的危害体现在主要发生于仔猪、保育猪和生猪育肥阶段，一年四季均可发生，在秋末、冬季和春季为高发期，发病率通常在30-70%，死亡率在10-30%。特别是在13-15周龄和18-20周龄，其较高的发病率和死亡率，治疗成本增加，以及延缓猪的生长速度、降低饲料效率和猪群整体的均匀度，出栏时间延长10-25天等；猪场因该病导致的经济损失也最为严重。该病常用的药物有支原净、泰农、利高霉素、氟甲砜霉素、泰乐菌素、磺胺药、金霉素、恩诺沙星、阿莫西林等，这些药物理论上对发病早期的猪有一定的效果，而在临床实践上，往往是猪群发病多日、免疫力下降，而且病毒、细菌等混合感染严重，此时再用上述药物，效果不佳。 2003年以来，河南广安集团专家组在河南、山东、湖北等地的上百个规模猪场用防蓝灵防控猪呼吸道疾病综合征（PRDC）的进行数据研究，并制定了综合防制措施，取得了显著效果。 一、试验研究依据 1、猪呼吸道疾病综合征综合防制措施的设计思路 1.1、完善强化日常防疫措施，防止病原传播； 1.2、制定和实施猪瘟等主要疾病的免疫程序，防止并发病； 1.3、防蓝灵保健，广谱抗菌、抗病毒、提高机体免疫力，控制并发病。 2、防蓝灵的药理作用及其机制 2.1防蓝灵组方：（1）替米考星、（2）免疫强化剂、（3）特殊营养元素等。本品主要以广谱抗菌、抗病毒和增强机体免疫力以及改善猪群生产性能指标为主，综合防控猪呼吸道疾病综合征（PRDC）。 2.2、现代药理学表明： （1）替米考星对G+、G-和支原体均有效，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、胸膜肺炎放线杆菌、巴氏杆菌及畜禽支原体均有超强的抗菌活性，且内服吸收快，组织穿透力强，可选择性的聚集肺部等。
区分猪呼吸道疾病综合征临床症状及病因
区分猪呼吸道疾病综合征临床症状及病因 核心提示： 有些养猪者常反映，“未见猪有任何症状”而发生突然死亡，也有的是 晚上饲喂时“正常”，第二天清晨发现巳死在圈舍内，上述这种情况以25～ 50kg的猪占比例较多，畜主往往怀疑为急性中毒致死。经我们剖检证实，它的 死亡原因可以确切认定是因患PRDC而致。 1 PRDC临床症状差异大注意区分病型 许多有关PRDC的报道显示，体温升高、咳嗽和呼吸困难是本病的主要临床症状，但从近几年临床病例观察，许多病例不显示体温升高，而且咳嗽和呼吸困难等症状也不明显，或仅有不引人注意的浅表性呼吸增快或偶而咳嗽，但常有喷鼻、“鼻子不透气”、以至“流鼻血”等症状。对这些猪进行剖检时，绝大多数肺部有严重以至极为严重的炎症、纤维化、硬化等病变，确诊它为PRDC是无可怀疑的，认为这属于PRDC的慢性型和隐性型，这种病型的病例远远多于急性型，这说明不少地方已成为PRDC的老疫区，并在逐渐扩大。 当前急性型的PRDC常呈爆发形式，多见于新疫区的猪群，可找出明显的激发因素或饲养管理失误因素，它发病初期具有明显的体温升高、咳嗽、发喘以及精神沉郁，采食废绝，或有腹泻、便秘现象。急性型的PRDC在病早期的皮肤常有弥漫性发红或伴有灰色瘀血、出血小斑点。部分慢性或隐性患猪皮肤呈暗红或浅灰色，被毛粗糙逆立，毛孔渗出浅红色液体并干涸结成棕黑色痂皮，附着于毛孔处。也见有极个别猪皮肤呈现苍白贫血现象。 相当数量的病猪于病的中、后期，在耳部、腹部、四肢末端、大腿后侧出现紫红、紫黑色出血斑。部分急性型病猪因治疗失误，如大剂量使用退烧药、抗病毒药
和糖皮质激素等，而致体温降至常温或其以下，从而掩盖了热性病的症状，少数因药物的毒副作用发生贫血、黄疸。 在PRDC的临诊中，应特别注意体温不高，呼吸道症状不明显的病猪群，往往发生漏诊或误诊。应对此类病、死猪做剖检诊断，即可迅速得出确切诊断并分清病型，有助于及早采取相应的防控措施。近几年在某些猪群，还发现长势良好的猪，突发高度呼吸困难的同时，伴有瘫痪不能站立的情况，致死率达70%以上的情况，个别猪还有神经症状，对此类猪做剖检可确认属PRDC，但其发生瘫痪的机理有待研究，初步考虑可能与某些病原体的毒素有关。 2 患PRDC发生猝死的原因何在 有些养猪者常反映，“未见猪有任何症状”而发生突然死亡，也有的是晚上饲喂时“正常”，第二天清晨发现巳死在圈舍内，上述这种情况以25～50kg的猪占比例较多，畜主往往怀疑为急性中毒致死。经我们剖检证实，它的死亡原因可以确切认定是因患PRDC而致。 此种死亡多发生于两种情况，一种是肺部感染的急性发作，支气管、细支气管和肺泡中被分泌物充满而致缺氧引起急性死亡，死亡猪常在鼻孔流出泡沫性分泌物，有时带有血液，这种情况多见于新发病区(群)，往往是将要爆发PRDC的信号。另种情况是发生于隐性或慢性型猪群，而且大多是由急性型转化而来，剖检可见肺间质、肺泡中有较粘稠的液体存在，以及肺体积增大，重量增加，或呈纤维化、硬化形成的“橡皮肺”，常在应激因素作用下使病情加剧而突然死亡。间质性肺水肿和弥漫性肺间质的纤维化发展过程较慢，生前症状多不明显，常常有潜在性发生的特点，生前症状往往被忽略。
猪呼吸道疾病综合征的综合防治1
猪呼吸道疾病综合征的综合防治 猪呼吸道疾病综合征（PRDC），它是一种多原因疾病，由病毒、细菌、不良的饲养管理及易感猪群等因素相互作用而引起综合征，表现为呼吸困难，体温40℃反复，四肢末端、耳尖发红，病程长，治疗不及时有较高的死亡率。 1 PRDC的特点 . 1 PRDC与呼吸道的组织结构特点及其防御性密切相关 呼吸道包括上呼吸道（鼻、咽、喉、气管）和下呼吸道（各级气管），几乎都是由软骨作支架，其结构既能保证呼吸道的畅通，又可影响进入气体的速度，有利于颗粒沉着于气管上皮黏膜；呼吸道黏膜中含丰富的血管和黏液腺，有利于吸入气体的温度和湿度的提高，黏液腺分泌出的黏液对吸入气体中的尘埃和微生物具有吸附作用，然后借助上皮细胞纤毛运动向喉的方向移动而咳出。支气管黏液含有有溶菌酶，铁蛋白、溶解素等生化物质具有杀菌性质，这些生化物质能导致吸入呼吸道的微生物生化性失调而失去感染力；在病原微生微和其它不良因素的作用下，呼吸道的免疫防御系统会受到干扰，防御功能下降，从而导致呼吸疾病的发生和扩散。如副猪嗜血杆菌可使猪发生急性化脓性鼻炎和黏液纤毛细胞消失；猪蓝耳病病毒破坏肺巨噬细胞和淋巴细胞；猪伪狂犬病病毒可造成猪呼吸系统和消化系统紊乱，干扰机体的免疫力；猪肺炎支原体破坏及麻醉呼吸道黏膜纤毛系统；猪流感病毒也能破坏呼吸道黏膜纤毛系统，从而损伤呼吸道上皮细胞；病猪发热和厌食也影响机体免疫力。 病因包括原发性感染和继发性感染疾病。 一. 原发性感染包括 1.病毒性：猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪伪狂犬病病毒、猪流感病毒、猪呼吸道冠状病毒所致的。 2.细菌性：传染性胸膜肺炎和传染性萎缩性鼻炎。 3.其它：猪气喘病。 二. 继发感染疾病包括猪肺疫、猪链球菌病、猪副伤寒、猪副嗜血杆菌病等。如果在一个猪场中，发生和流行上述原发性感染疾病，同时又合并发生或继发感染，即可加重发病猪群的临床症状，造成极高的死亡率。除此而外，还有一些其它因素如猪群密度过大，不同日龄猪的混群饲养，来自不同猪或不同来源的猪只饲养在一起，不良的饲养方式，不同季节温度的巨变和猪舍温度变化过大，加之猪群因营养和疾病造成免疫力和抵抗力低下等，都可引起猪场或猪群PRDC的暴发和流行 除此之外，还有一些其它因素如猪群密度过大，不同日龄猪的混群饲养，不同猪或不同来源的猪混养，气温变化过大，加之猪群因营养和疾病造成免疫力和抵抗力低下等。 本病多爆发于6-10周龄保育猪和13-20周龄的生长育成猪，通常称18周龄墙。发病率在25-60%，发病猪的死亡率为20-90%，猪龄越小死亡率越高。病猪表现精神沉郁，采食量下降或无食欲，眼睛分泌物增多，出现结膜炎症状。急性发病体温升高，可发生突然死亡。大部分猪由急性变为慢性或在保育舍形成地方性流行，病猪生长缓慢，消瘦，死亡率、僵猪比例升高。哺乳仔猪以呼吸困难和神经症状为主，死亡率较高；如饲养管理条件较差，猪群密度过大或出现混合感染，发病率和临床表现更为严重。病猪在药物的辅助下逐渐康复，死亡率较低，上述临床症状在不同猪场表现的程度有所不同。 所有病猪均出现不同程度的肺炎。6~10周龄的保育猪剖检可见弥漫性间质性肺炎以及淋巴结的广泛肿大，肺出血、硬变和花斑样病变，个别肺有化脓灶，病猪肺部有不同程度的混合感染，有些病猪有广泛性多发性浆膜炎（胸腔、腹腔很多纤维蛋白渗出，并造成粘连），有些肺部病变与猪支原体肺炎相类似，除肺部出现病变外，小部分病猪可见肝肿大出血、淋巴结、肾、膀胱、喉头有出血点，部分猪出现末端紫色。1~3周发病的哺乳仔猪剖检可见心、肝、肺有出血性病变。