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11-2-其他类型HPLC色谱法-分子排阻

11-2-其他类型HPLC色谱法-分子排阻

第十一章其他类型高效液相色谱法

分子排阻色谱法

(体积排阻色谱法、分子筛色谱法)S ize-E xclusion C hromatography,

SEC

11-2-其他类型HPLC色谱法-分子排阻

一、概述

溶质与固定相或流动相无相互作用的分离方式。

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主要依据分子尺寸大小的差异来进行分离的方法,即固定相(多孔凝胶)能有效的进行分子量大小的分离。

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分析样品:多肽、蛋白质、

多糖等生物大分子、

高聚物

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优点:

1)分离时间短,溶质谱带窄;

2)根据分子大小,可预测分离时间;3)分离过程中无样品损耗和反应发生;4)柱几乎不失活,寿命长;

5)特别适用在未知样品的探索分离

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二、分离原理

具有不同分子大小的样品通过柱时,溶质分子能够被柱填料的孔径分类。

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二、分离原理

大分子不能进入凝胶孔

洞而被完全排除,只能

沿着凝胶颗粒之间的空

隙通过色谱柱,最先被

流动相洗脱出来。

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小分子能进入凝胶的绝大部分孔洞,在柱中收到更强的滞留,会更慢地被洗脱出来。

中等大小分子只能进入凝胶中一些适当的孔洞中,但不能进入更小的微孔,所以在柱中受到的滞留作用介于大分子与小分子之间。

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溶解样品的溶剂分子,分子量最小,可进入凝胶的所有孔洞,最后从柱中流出。

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V R : 洗脱溶质的保留体积;

V m : 色谱柱内凝胶颗粒之间的空间体积;V s : 凝胶内孔体积,即溶质分子可以渗透进去的体积洗脱体积V R =V m +K D ·V s

s m R D V V V K -=K D : 溶质分子能够渗入

填料内孔体积的分数二、分离原理

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当V R =V m 说明溶质完全不进入凝胶内部,此现象称为全排斥,此也为凝胶的排阻极限。

溶质分子能够渗入填料内孔体积的分数KDs m R D V V V K -=二、分离原理

K D =0

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当V R =V m +V s 说明溶质完全进入凝胶内部,此现象称为全渗透,此也为凝胶的渗透极限。

溶质分子能够渗入填料内孔体积的分数Kd

s

m R D V V V K -=二、分离原理

K D =1

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大部分溶质:二、分离原理

0

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葡聚糖凝胶

三、固定相

聚丙烯酰胺凝胶

琼脂糖凝胶

二乙烯基苯型凝胶

多孔球型硅胶

羟基化聚醚多空微球软质凝胶,不耐压:中、低压色谱刚性凝胶,耐压

半刚性凝胶

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四、流动相

1.对样品的溶解性好

2. 由于高分子量样品的扩散系数小,应尽可能采用低粘度的溶剂3. 与使用的凝胶固定相互相匹配,既要使凝胶浸润,又防止溶胀4. 与所使用的检测器相匹配

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流动相为有机溶剂:凝胶渗透色谱(gel permeation chromatography,GPC);

流动相为水:凝胶过滤色谱

(gel filtration chromatography,GFC)

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五、色谱柱的标定

目的:用以测定分子量及分子量分布

方法:用一系列已知分子量的标样制作标定曲线。

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例1:

测定多糖的分子量与分子量分布

-China Pharmacopoeia

SFDA已批准的多糖类药物:香菇多糖、黄芪多糖、肠多糖片、紫芝多糖片、人参多糖注射液、

灵孢多糖注射液……

1)系统校正:

根据供试品分子量的大小,选用5个已知分子量的

多糖标准品(如葡聚糖)作标定曲线。