病毒效价测定
【求助】病毒浓度测定
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我现在要用分离培养的犬细小病毒免疫犬获得阳性血清，但是我现在的细胞培养物都已经破碎离心并且PEG沉淀浓缩了的，现在不知道怎么测定浓缩液里细小
病毒的含量？
我知道一个紫外吸收法测蛋白含量的，公式是：蛋白浓度=，我现在的浓缩物可以用紫外吸收法测吗得用多少nm的波长
据偶所知,测病毒的滴度,可测A260,测出的是滴度=A260*稀释比例*10(12次幂)(pt/ml),然后按此值减少100倍,便是pfu/ml了,不过这是近似值
抗血清制备及抗体效价测定
摘要............................................................................. .. (4) 【实验过程】 (5) PartⅠ. NDV 抗血清制备 (5) 一、实验原理 (5) 二、实验仪器、材料和试剂 (7) 1. 仪器 (7) 2. 材料 (7) 3. 试剂 (7) 三、方法和步骤 (7) （一）NDV 兔抗血清制备 (7) 1. 家兔捉拿方法 (7) 2. 家兔固定方法 (8) 3. 初次免疫 (9) 4. 二次免疫 (10) 5. 终末免疫 (10) 6. 试血 (10) 7. 颈动脉放血 (10) 8. 血清分离 (12)
9. 抗血清保存 (12) （二）NDV 鼠抗血清制备 (12) 1. 小白鼠的捉拿和固定 (12) 2. 初次免疫 (13) 3. 二次免疫 (15) 4. 终末免疫 (15) 5. 试血 (16) 6．放血 (18) 7．血清分离 (19) 8．抗血清保存 (19) Part Ⅱ. 琼脂双扩散实验检测抗体效价 (19) 一、基本原理 (19) 二、实验仪器、材料和试剂 (20) 1. 仪器 (20) 2. 材料 (20) 3. 试剂 (20) 三、方法和步骤 (20) 1. 灭活鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株抗原提取 . 20 2. 1%琼脂糖配制 (20) 3. 倒平板 (21) 4. 打孔 (21) 5. 稀释抗血清 (22)
6. 加样 (22) 7. 孵育 (23) 8. 结果观察 (23) Part Ⅲ. 酶联免疫吸附试验测定 NDV 抗血清效价 (23) 一、基本原理 (23) 二、实验仪器、材料和试剂 (24) 1. 仪器 (24) 2. 材料 (24) 3. 试剂 (24) 三、方法和步骤 (25) 1. 鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活抗原提取 . 25 2、抗原包被 (25) 3. 封闭 (25) 4. 洗板 (25) 5. 稀释抗血清 (25) 6. 加抗血清 (26) 7. 洗板 (26) 8. 加酶标二抗 (26) 9. 洗板 (27) 10. 显色 (27) 11. 终止 (27) 12. 读数 (27)
噬菌斑测病毒滴度
杆状病毒滴度检测 实验概要 本实验介绍了检测病毒滴度的方法。 实验原理 根据噬菌斑数计算病毒滴度。 工具/原料 ? 1. 4% agarose gel：2g agrose 50ml 水，高压灭菌 ?2×Grace（unsupplemented）：9.14g粉末（invitrogen）0.07gNaHCO3 H2O，调PH6.1，定容至100ml，无菌过滤 ?supplemented Grace：1×Grace添加 3.33mg/ml Lactalbumin，3.33mg/ml yeastolate，无菌过滤 ? 4. 高温灭活FBS ?主要设备 1. 6孔板 2. 12ml离心管 3. 100ml无菌玻璃瓶 4. 无菌吸管 5. 70℃水浴锅 ?实验材料 杆状病毒，SF9：5×105cells/ml 方法/步骤 1. 1
无菌条件下，2ml/孔细胞（5×105cells/ml）种入6孔板，室温孵育1h使其贴壁，孵育后镜检其贴壁程度； 2. 2 将4% agarose gel放入70℃水浴锅融解，空100ml无菌瓶与2×Grace放入40℃水浴锅预热； 3. 3 将杆状病毒用无血清supplemented Grace梯度稀释：10-1~10-8。 4. 4 弃6孔板内上清，快速加入稀释好的病毒，1ml/孔，复孔，室温孵育1h。 5. 5 配置上层琼脂：加20ml高温灭活FBS到2×Grace 100ml，25ml 2×Grace（含FBS）12.5ml 无菌水12.5ml 4% agarose gel，至预热的100ml无菌瓶，轻轻混匀，放入37℃水浴锅备用； 6. 6 弃6孔板内上清，快速加2ml上层琼脂，以防菌层干燥，静置10-20min使其凝固； 7.7 将6孔板放入27℃培养箱，培养4－10天；
慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤
一、包装细胞293T 细胞的培养 一、293T 细胞的冻存 1. 随着传代的次数增加，293T 细胞会出现生长状态下降，出现突变等。所以要在细胞购进时就进行冻存。 2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。 3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's 液洗去残留的培养基。 4. 加入0.25% 的胰酶，消化10-20s 后倒去。 5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。 6. 细胞计数。 7. 将细胞离心，1000rpm ，2min 。 8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70% 完全培养基+20%FBS+10% DMSO ）重悬细胞，密度为3X 10 6个/ml。 10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。 二、293T 细胞的传代 1. 当细胞生长至汇合率达到80~90% 需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。 2. 消化细胞，方法同上。 3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。密度为 3 X10 5个/ml。 4. 分到10cm 培养皿中，10ml/ 皿。 三、293T 细胞的复苏 1. 当细胞传代次数过多（超过50 代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。 2. 打开水浴锅，设置温度为40 C。 3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min 内使细胞溶液完全溶解。 4. 将1ml 细胞溶液加入9 ml 完全培养基中并混匀后转入10cm 培养皿。 5. 放回37 C、3%CO 2和95%相对湿度的培养箱中培养。 6. 第二天观察细胞存活率。倒掉旧的培养基，加入10ml 新鲜培养基。 二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定 1. 所用病毒检测引物为WPRE 特异引物，序列如下 只供学习与交流
腺病毒中文操作手册
腺病毒载体操作手册中文版 腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章 AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 4.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体 5 4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生 5 4.2.1 共转化的一般原则 5 4.2.2 共转化方法 5 4.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 6 4.4.1 细胞铺板 6 4.4.2 磷酸钙转化技术 7 第五章常用技术 8 5.1 QBI-293A细胞培养 8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖 8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存 8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生 9 5.2.1 感染QBI-293A细胞 9 5.2.2 病毒空斑形成 9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞 9 5.3 MOI测定 10 5.4 腺病毒感染力测定 10
5.4.1 X-Gal染色 11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化 11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送 11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12 5.5.3 Western杂交 13 5.5.4 Southern杂交和点杂交 13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 14 5.5.6 免疫测定 14 5.5.7 功能测定 14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增 15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒 16 5.7.1 不连续密度梯度离心 17 5.7.2 连续密度梯度离心 17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集 17 5.8 病毒滴度测定 18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19 5.8.2 空斑测定法 20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法 20 第六章疑难解答 22 6.1 QBI-293A细胞培养 22 6.2 感染力测定 22 6.3 转移载体克隆 23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组24 6.5 转染QBI-293A细胞 25 6.6 筛选和测定 25 6.7 在QBI-293A细胞中表达 26 6.8 重组腺病毒的扩增 26 6.9 纯化 26 6.10 病毒滴度测定 27 缩写英文全称中文全称 Ad Adenovirus 腺病毒 Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒 AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素 β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶 bp Base Pair 碱基对
血型抗体效价测定
血型抗体效价测定 目的了解血型抗体效价测定的操作方法。 原理将被检抗血清作倍比稀释后，加入一定量的抗原红细胞，观察凝集强度。以抗体稀释后仍能与抗原红细胞出现1个（+）凝集的试管稀释倍数之倒数定为该抗体的效价。 器材小试管、刻度吸管、37°C水浴箱。 试剂1.标准2%A型红细胞生理盐水悬液。 2．生理盐水。 标本被检者血清。 操作以抗A效价测定为例。 1．血清倍比稀释取10支小试管，每管加入生理盐水0.1ml。在第1管中加入0.1ml被检者血清，混匀后吸取0.1ml加入第2管，依此类推，至第 10管，最后弃去0.1ml。 2．加入抗原红细胞于每管中加入2%A型红细胞生理盐水悬液0.1ml，混匀。 3．温育置15~20°C室温中温育15min。 4．离心和观察结果以1000r/min离心1min，以出现1个（+）凝集强度试管的血清稀释倍数的倒数定为该抗血清效价。 注意事项 1．倍比稀释要准确，避免稀释不匀出现跳管现象。 2．离心后试管内上清液出现溶血，表明不仅有抗原抗体反应，而且有补体激活，具有重要临床意义。 血型抗体效价测定 目的了解血型抗体效价测定的操作方法。 原理将被检抗血清作倍比稀释后，加入一定量的抗原红细胞，观察凝集强度。以抗体稀释后仍能与抗原红细胞出现1个（+）凝集的试管稀释倍数之倒数定为该抗体的效价。 器材小试管、刻度吸管、37°C水浴箱。 试剂1.标准2%A型红细胞生理盐水悬液。 2．生理盐水。 标本被检者血清。 操作以抗A效价测定为例。 1．血清倍比稀释取10支小试管，每管加入生理盐水0.1ml。在第1管中加入0.1ml被检者血清，混匀后吸取0.1ml加入第2管，依此类推，至第10管，最后弃去0.1ml。 2．加入抗原红细胞于每管中加入2%A型红细胞生理盐水悬液0.1ml，混匀。 3．温育置15~20°C室温中温育15min。 4．离心和观察结果以1000r/min离心1min，以出现1个（+）凝集强度试管的血清稀释倍数的倒数定为该抗血清效价。 注意事项 1．倍比稀释要准确，避免稀释不匀出现跳管现象。
病毒滴度测定完整版本
可以采用倍比稀释来测定病毒的滴度。 第一个Ep管中加入10uL病毒原液，记为1E+1 uL ； 第二个Ep管中进行了第一次十倍稀释，所得病毒原液为第一个Ep中的1/10，记为1E+0 uL； 第三个Ep管中进行了第二次十倍稀释，所得病毒原液为第二个Ep中的1/10，记为1E-1 uL ； 依次类推… 第七个Ep管中进行了第六次十倍稀释，所得病毒原液为第六个Ep中的1/10，记为1E-5 uL ； 第八个Ep管中进行了第七次十倍稀释，所得病毒原液为第七个Ep中的1/10，记为1E-6 uL ； 换句话说：如果在加入1E-5 uL 病毒原液的孔中观察到3个带有荧光的细胞，说明该孔中至少有3个病毒颗粒感染了细胞，则该病毒的滴度等于带有荧光的细胞数除以病毒原液量，本例子中就是3/(1E-5)=3E+5，单位为TU/ uL ，也就等于3E+8 TU/mL。 稀释计数法 滴度单位：TU/mL，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。「TU」为「transducing units」的缩写，中文为「转导单位」，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。 第一天细胞准备 将生长状态良好的293 T 细胞消化计数后稀释至1×100 000/mL，加入96 孔板，100 μL/孔，为每个病毒准备10 个孔。放入37℃，5% 二氧化碳培养箱中培养。 第二天加病毒 在EP 管中做10 倍梯度稀释，连续10 个稀释度。稀释方法如下：每种病毒准备10 个1.5mL EP 管，每管加入90 μL 培养液，往第一个管中加入10 μL 病毒原液，混匀后，吸取10 μL 加入第二个管混匀。依此类推，做十个稀释度（10—0.00000001）。 吸取96 孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。并做好标记。 第三天追加培养液 在每个孔再加入100 μL 完全培养液，利于细胞的生长。 第四天观察结果并计算滴度 在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。假设为X 和Y，则滴度（TU/mL）=（X+Y×10）×1000/2/X 孔的病毒液的含量（μL）。 定量PCR 法 病毒感染1 天前，取6 孔板接种HOS 细胞。每孔细胞为5×100 000 个。 接种细胞24 小时后，取两个孔的细胞用血球计数板计数，确定感染时细胞的实际数目，记为N。 弃去其他培养板中的培养基，更换为含有5 μg/mL polybrene 的新鲜培养基。将浓缩病毒用培养基稀释200 倍，也就是取1 μL 病毒加入到199 μL 的培养基中。在3 个培养孔中分别加入0.5 μL，5 μL 和50 μL 的稀释病毒。 感染开始后20 小时，除去培养上清，换为500 μL 含DNaseI 的新鲜培养基。在37℃消化15 分钟，这一步是要除去残余的质粒DNA。然后换为2 mL 正常的培养基，继续培养48 小时。 用0.5 mL 0.25% 胰酶-EDTA 溶液消化细胞，在37℃放置1 分钟。用培养基吹洗下，离心收集细胞。按照DNeasy 试剂盒的说明抽提基因组DNA 。每个样品管中加入200 μL 洗脱液洗下DNA 。用DNA 定量试剂盒定量（Bio-Rad）。基因组DNA 可以稳定保存在-20℃至少两个月。 准备PCR 所需的试剂和样品。为病毒序列检测引物配总管Ⅰ： Forward primer （100 pmol/mL）：0.1μL ×n Reverse primer （100 pmol/mL）：0.1μL ×n Probe （100 pmol/mL)：0.1μL ×n 水：19.7 μL ×n n = number of reactions。例如：总反应数为40，将1 mL 2×TaqMan Universal PCR Master Mix，4 μL forward
甲氧西林耐药_敏感金黄色葡萄球菌基因分型和毒力基因检测_王俊瑞
中国感染与化疗杂志２０１５年１月２０日第１５卷第１期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，Ｊａｎ．２０１５，Ｖｏｌ．１５，Ｎｏ．１·论著· 甲氧西林耐药／敏感金黄色葡萄球菌基因分型和毒力基因检测 王俊瑞１， 杜小莉２， 塔 拉１， 崔晶花２， 福 泉１， 韩艳秋 １ 摘要： 目的 分析耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（金葡菌）（ＭＲＳＡ）和甲氧西林敏感金葡菌（ＭＳＳＡ）临床分离株基因分型及毒力基因分布特征是否存在差异，了解金葡菌耐药性演变与毒力变迁之间的相关性。方法 采用脉冲场凝胶电泳（ＰＦＧＥ）方法和多位点序列分型（ＭＬＳＴ）方法对呼和浩特地区住院患者中分离的３０株ＭＲＳＡ和３０株ＭＳＳＡ进行分子分型，同步采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法检测菌株毒力基因。结果 ６０株金葡菌ＰＦＧＥ分型共分１９个型，ＭＳＳＡ菌株分布在Ｉ和Ｈ型等１６个基因型中，而ＭＲＳＡ株主要集中分布在Ｋ和Ｍ２个基因型中。２０株不同ＰＦＧＥ型菌株ＭＬＳＴ分型结果显示，ＭＲＳＡ株主要为ＳＴ－２３９型；ＭＳＳＡ株呈多样性分布特征，主要以ＳＴ－５型、ＳＴ－７型、ＳＴ－ １５型为主。毒力基因在ＭＲＳＡ和ＭＳＳＡ中分布差异显著。ＭＳＳＡ毒力基因整体携带率明显高于ＭＲＳＡ（５３．９％对４０．０％，χ２ ＝３ ２．７，Ｐ＜０．０１）。ＭＲＳＡ株ｓｅａ、ｃｎａ和ｃａｐ８基因携带率明显高于ＭＳＳＡ携带率（Ｐ＜０．０１），而ｓｅｃ、ｓｅｇ、ｓｅｉ、ｓｅｍ、ｓｅｎ、ｓｅｏ、ｆｎｂＢ、ｅｂｐＳ、ｃａｐ５基因携带率明显低于ＭＳＳＡ（Ｐ＜０．０５）。结论 呼和浩特地区金葡菌临床分离株基因型呈现多样化分布特点，ＭＲＳＡ主要以ＳＴ－２３９型为主。ＭＳＳＡ毒力基因携带率高，特定毒力因子在ＭＲＳＡ和ＭＳＳＡ株中呈现一定聚集分布特征，金葡菌特定耐药性的获得可能伴随特定毒力特征的变化。 关键词： 金黄色葡萄球菌； 耐药性； 毒力基因； 分子分型 中图分类号：Ｒ３７８．１１ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００９－７７０８（２０１５）０１－００７０－ ０６ 基金项目： 国家自然科学基金（８１２６０２４４）。 作者单位： １．内蒙古医科大学附属医院检验科，呼和浩特０１００５０； ２． 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所。 作者简介： 王俊瑞（１９８１—），男，博士，主治医师，主要从事金黄色葡萄球菌感染致病机制研究。 通信作者：韩艳秋，Ｅ－ｍａｉｌ：ｑｙ ｈ１０１６＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ。Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ａｎｄ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅＳｔａｐｈｙ ｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓＷＡＮＧ Ｊｕｎｒｕｉ，ＤＵ Ｘｉａｏｌｉ，ＴＡ Ｌａ，ＣＵＩ Ｊｉｎｇｈｕａ，ＦＵ Ｑｕａｎ，ＨＡＮ Ｙａｎｑｉｕ． （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｏｈｈｏｔ ０１００５０，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｌｕｃｉｄａｔｅ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）ａｎｄ ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＳＳＡ）ｉｎ ｔｅｒｍｓ ｏｆ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ａｎｄ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍＨｏｈｈｏｔ，ａｎｄ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｃｈａｎｇｉｎｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ．ＭｅｔｈｏｄｓＰｕｌｓｅｄ ｆｉｅｌｄ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＰＦＧＥ）ａｎｄ ｍｕｌｔｉ ｌｏｃｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔｙｐｉｎｇ（ＭＬＳＴ）ｍｅｔｈｏｄｓ ｗｅｒｅ ｅｍｐｌｏｙｅｄ ｔｏ ｄｏ ｍｏｌｅｃｕｌａｒｔｙｐｉｎｇ ｆｏｒ ３０ ＭＲＳＡ ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ ３０ ＭＳＳＡ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｉｎｐａｔｉｅｎｔｓ ｉｎ Ｈｏｈｈｏｔ，Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ．ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｕｓｅｄｔｏ ｐｒｏｆｉｌｅ ｔｈｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ａｍｏｎｇ ｔｈｅｓｅ ｓｔｒａｉｎｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ＰＦＧＥ ｔｙｐｉｎｇ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ６０ Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ ｉｎｔｏ １９ ｍａｊｏｒ ｔｙｐｅｓ．ＭＳＳＡ ｓｔｒａｉｎｓ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ １６ ｔｙｐｅｓ，ｍａｉｎｌｙ ｔｙｐｅｓ Ｉ ａｎｄ Ｈ．ＭＲＳＡ ｓｔｒａｉｎｓ ｍａｉｎｌｙ ｂｅｌｏｎｇｅｄｔｏ ｔｙｐｅｓ ｏｆ Ｋ ａｎｄ Ｍ．Ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ２０ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ＰＦＧＥ ｔｙｐｅｓ，ＭＲＳＡ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｍａｉｎｌｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ ＳＴ－２３９ ｔｙｐｅ．ＭＳＳＡ ｓｔｒａｉｎｓ ｓｈｏｗｅｄ ｄｉｖｅｒｓｅ ＳＴｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｐ ｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｔｙｐｅｓ ｗｅｒｅ ＳＴ－５，ＳＴ－７ ａｎｄ ＳＴ－１５．Ｔｈｅ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅｇｅｎｅｓ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｂｅｔｗｅｅｎ ＭＳＳＡ ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄＭＲＳＡ ｓｔｒａｉｎｓ．Ｔｈｅ ｏｖｅｒａｌｌ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎＭＳＳＡ ｓｔｒａｉｎｓ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ＭＲＳＡｓｔｒａｉｎｓ（５３．９％ｖｅｒｓｕｓ ４０．０％，χ２ ＝３ ２．７，Ｐ＜０．０１）．Ｔｈｅｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ｓｅａ，ｃｎａ ａｎｄ ｃａｐ８ ｇｅｎｅｓ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇ ｈｅｒ ｉｎ ＭＲＳＡ ｓｔｒａｉｎｓ ｔｈａｎ ｉｎ ＭＳＳＡ ｓｔｒａｉｎｓ（Ｐ＜０．０１），０ ７
腺病毒质量检定方法
一、无菌检查 (2) （一）薄膜过滤法 (3) （二）直接接种法 (3) 二、支原体检查 (4) 第一法细胞培养法 (4) 第二法指示细胞培养法（DNA染色法） (5) 三、细胞内、外源病毒因子检查 (7) 1 细胞形态观察及红细胞吸附试验（简称血吸附试验） (7) 2 不同细胞传代培养法检测病毒因子 (7) 3 接种动物和鸡胚法检测病毒因子 (8) 4 逆转录病毒及其他内源性病毒或病毒核酸的检测 (8) 1）逆转录酶活性测定 (8) 2）透射电镜检查 (11) 3）感染性试验 (11) 5 特殊外源病毒因子的检测 (11) 四、致瘤性检查 (11) 五、感染效率和病毒的产量等的测定 (12) 六、细胞鉴别（染色体检查） (12) 七、病毒敏感性检查 (13) 八、细胞功能检查 (13) 九、重组腺病毒滴度的测定 (14) 十、病毒比滴度（比活性IU）测定 (16) 十一、E1A区、E2B区、AA V及插入基因的检测 (16) 一）E1A区的检测 (16) 二）E2B区的检测 (17) 三）AA V的检测 (18) 四）插入基因的检测 (18) 十二、病毒外源因子检查 (19) 十三、内毒素测定 (19) 供试品溶液的制备 (19) 确定最大有效稀释倍数（MVD） (20) 方法1 凝胶法 (20) 鲎试剂灵敏度复核试验 (21) 干扰试验 (21) 检查法 (23) 十四效力试验插入基因表达活性测定，插入基因的生物学活性测定 (24) 十五复制型病毒（RCA）检测A549细胞检测法 (24) 十六腺相关病毒的检测采用PCR法 (26) 十七残留量测定应根据生产工艺及成品的添加成份，对有潜在危险性的成份进行残留量检测： (27) 1残余宿主DNA含量测定 (27) 2残余牛血清白蛋白含量测定 (27) 3残余核酸酶含量测定 (28) 十八重组病毒制品的稳定性试验 (28)
慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤
一、293T细胞的冻存 1. 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。所以要在细胞购进时就进行冻存。 2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。 3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。 4. 加入%的胰酶，消化10-20s后倒去。 5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。 6. 细胞计数。 7.将细胞离心，1000rpm，2min。 8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。 10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。 二、293T细胞的传代 1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。 2. 消化细胞，方法同上。 3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。密度为3×105个/ml。 4. 分到10cm培养皿中，10ml/皿。 三、293T细胞的复苏 1. 当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。 2. 打开水浴锅，设置温度为40℃。 3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。 4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。 5. 放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。 6. 第二天观察细胞存活率。倒掉旧的培养基，加入10ml新鲜培养基。 二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定 1. 所用病毒检测引物为WPRE特异引物，序列如下 5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3' (forward primer),
动物源性肠出血性大肠杆菌O157：H7毒力基因的多重PCR快速检测研究_陈雅君
中国人兽共患病学报 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｚｏｏｎｏｓｅｓ ２０１３，２９（７ ）ＤＯＩ：１０．３９６９／ｃｊｚ．ｊ ．ｉｓｓｎ．１００２－２６９４．２０１３．０７．００９动物源性肠出血性大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７及 其３个毒力基因的多重ＰＣＲ快速检测研究 陈雅君１，２，王亚宾１，张莉娟１，张龙现１，２，陈丽颖１，刘中原１，申 果１，胡 慧１， ２， 摘 要：目的 建立快速、特异的分离鉴定大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７及其３个主要毒力基因（ｈｙｌＡ、ｅａｅＡ和ｓｔｘ２基因）的多重ＰＣＲ方法。方法 根据ＧｅｎＢａｎｋ公布的大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７菌体抗原ｒｆｂＥ基因、鞭毛抗原ｆｌｉＣ基因、溶血素（ｈｌｙＡ）基因、紧密黏附素（ｅａｅＡ）基因和志贺样毒素２（ｓｔｘ２）基因为靶基因，设计５对特异性引物，在同一扩增体系中进行ＰＣＲ，优化反应体系，测定特异性和灵敏度，并进行了临床样品的检测。结果 该方法扩增目的基因片段分别为３２７ｂｐ、２４７ｂｐ、４９４ｂｐ 、３８４ｂｐ和７ ７９ｂｐ，特异性和灵敏度均高，细菌纯培养物的检测灵敏度为１０４ ｃｆｕ／ｍＬ。结论 初步建立了快速、灵敏、特异的检测肠出血性大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７及其３个毒力基因的多重ＰＣＲ方法，可用于临床动物携带大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７的分子流行病学调查及食品微生物检测。 关键词：动物源性；肠出血性大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７；毒力基因；多重ＰＣＲ 中图分类号： Ｓ８５５．１文献标识码：Ａ 文章编号：１００２－２６９４（２０１３）０７－０６８６－０６ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｉｍａｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７∶Ｈ７ａｎｄ ｉｔｓ ｔｈｒｅｅ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｂｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅＣＨＥＮ Ｙａ－ｊｕｎ１，２，ＷＡＮＧ Ｙａ－ｂｉｎ１，ＺＨＡＮＧ Ｌｉ－ｊｕａｎ１，ＺＨＡＮＧ Ｌｏｎｇ －ｘｉａｎ１，２ ，ＣＨＥＮ Ｌｉ－ｙｉｎｇ１，ＬＩＵ Ｚｈｏｎｇ－ｙ ｕａｎ１，ＳＨＥＮ Ｇｕｏ１，ＨＵ Ｈｕｉ １，２ （１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｅｎａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈｅｎｇ ｚｈｏｕ４５０００２，Ｃｈｉｎａ；２．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｚｏｏｎｏｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｈｅｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ４５０００２，Ｃｈｉｎａ）河南省重大公益科研项目（８１１００９１２３００） ；漯河市科技计划项目（０８１２０３ ）通讯作者：胡慧，Ｅｍａｉｌ：ｈｕｈｕｉ２００１＠１６３．ｃｏｍ 作者单位：１．河南农业大学牧医工程学院，郑州 ４５０００２； ２．河南省动物性食品安全重点实验室，郑州 ４５０００２ ＡＢＳＴＲＡＣＴ：Ａ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７ａｎｄｔｈｒｅｅ ｏｆ ｉｔｓ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ（ｈｙｌＡ，ｅａｅＡａｎｄ ｓｔｘ２ｇｅｎｅｓ）．Ｆｉｖｅ ｓｅｔｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆｒｆｂＥｇｅｎｅ，ｆ ｌｉＣｇｅｎｅ，ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ ｇｅｎｅ（ｈｌｙＡ），ｉｎｔｈｎｉｎ ｇｅｎｅ（ｅａｅＡ），ａｎｄ ｓｈｉｇａ－ｌｉｋｅ ｔｏｘｉｎ ｇｅｎｅ ２（ｓｔｘ２）ｏｆ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７．Ｔｈｅｙｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｎｄ ａｄｄｅｄ ｉｎｔｏ ｏｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ ｐｅｒｆｏｒｍ ＰＣＲ．Ｔｈｅ ｓｙｓｔｅｍ ｗａｓ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ，ａｎｄ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｓｅｎ－ｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｉｓ ｓｙｓｔｅｍ ｗｅｒｅ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ａｎｄ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｓｏｌａｔｅｓ．Ｔｈｅ ａｓｓａｙ ｗａｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ｔｈｅ ３２７ｂｐ，２４７ｂｐ，４９４ｂｐ，３８４ｂｐ，ａｎｄ ７７９ｂｐ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ｒｆｂＥ，ｆｌｉＣ，ｈｌｙＡ，ｅａｅＡａｎｄ ｓｔｘ２．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｗａｓ ｈｉｇｈｌｙｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ａｓｓａｙ ｗａｓ １０４ ｃｆｕ／ｍＬ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ｓａｍｐｌｅｓ．Ｉｔ＇ｓ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ａ ｒａｐｉｄ，ｓｐｅｃｉｆｉｃ，ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７ａｎｄ ｔｈｒｅｅ ｏｆ ｉｔｓ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｈａｓｂｅｅｎ ｓｔｕｄｉｅｄ ｐｒｉｍａｒｉｌｙ．Ａｎ ａｖａｉｌａｂｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｏ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７∶Ｈ７ｆｒｏｍ ｔｈｅｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄ ｆｏｏｄ ｓａｍｐ ｌｅｓ． ＫＥＹ ＷＯＲＤＳ：ａｎｉｍａｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ；ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７∶Ｈ７；ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ；ｍｕｌｔｉｐ ｌｅｘ ＰＣＲＳｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｈｅｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ Ｍａｊｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｕｎｄ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ Ｗｅｌｆａｒｅ（Ｎｏ．８１１００９１２３００），ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｒｉｏｒｉｔｙ Ｐｒｏｇｒａｍｓ ｉｎＳｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌｕｏｈｅ Ｃｉｔｙ（ Ｎｏ．０８１２０３）Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：Ｈｕ Ｈｕｉ，Ｅｍａｉｌ：ｈｕｈｕｉ２００１＠１６３．ｃｏｍ 肠出血性大肠杆菌（Ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇ ｉｃ Ｅｓｃｈｅ－ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，ＥＨＥＣ）Ｏ１５７∶Ｈ７是一种重要的人兽共患传染病病原菌， 该菌主要定居于一些反刍动物的肠道内，通过污染的水源及食物造成人与动物的感染。ＥＨＥＣ Ｏ１５７∶Ｈ７感染宿主后主要引发腹泻、出血性结肠炎，还可引发溶血性尿毒综合征及血 ６ ８６
腺病毒中文操作手册
腺病毒中文操作手 册
腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体 4 4.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体5 4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生5 4.2.1 共转化的一般原则 5 4.2.2 共转化方法 5 4.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 6 4.4.1 细胞铺板 6 4.4.2 磷酸钙转化技术7 第五章常见技术8 5.1 QBI-293A细胞培养8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2.1 感染QBI-293A细胞9 5.2.2 病毒空斑形成9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞9 5.3 MOI测定10 5.4 腺病毒感染力测定10
5.4.1 X-Gal染色11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表示和基因输送11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12 5.5.3 Western杂交13 5.5.4 Southern杂交和点杂交13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 14 5.5.6 免疫测定14 5.5.7 功能测定14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5.7.1 不连续密度梯度离心17 5.7.2 连续密度梯度离心17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集17 5.8 病毒滴度测定18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19 5.8.2 空斑测定法20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法20 第六章疑难解答22 6.1 QBI-293A细胞培养22 6.2 感染力测定22 6.3 转移载体克隆23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组24 6.5 转染QBI-293A细胞25 6.6 筛选和测定25 6.7 在QBI-293A细胞中表示26 6.8 重组腺病毒的扩增26 6.9 纯化26 6.10 病毒滴度测定 27 缩写英文全称中文全称 Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清
滴度检测方法
慢病毒滴度检测方法 空斑测定法 空斑法测定滴度的主要原理是病毒感染QBI-293A细胞后，通过一个感染周期便可再感染邻近细胞，直至形成一个成熟的空斑。这是所有生物学方法测定病毒滴度中最具挑战性的方法。由于许多因素如单层细胞质量、操作和观察方法等都可影响到最后的结果，因此这一方法得到的结果往往最不稳定。 1．5×105细胞/60mm培养皿用5ml DMEM5%培养，3-4小时后等细胞贴壁即可进行病毒感染。或者在病毒感染前一天加入3×105细胞/60mm培养皿。 2．在12孔板中稀释病毒，储存于-20℃或-80℃备用。第1个稀释孔将病毒保存液稀释至1ml，其它孔稀释至3ml，大体积可提高可重复性。稀释浓度原则视病毒浓度而定（纯化还是未纯化的），调节稀释度至10-100个病毒/孔，一般为10-12，这样稀释比大约为10-7~10-12。 稀释：将100ul病毒保存液加入900ul DMEM5%。用移液器上下吸打5次，此时稀释度为10-1。换用新枪头将300ul 10-1稀释液加入2.7ml DMEM5%吸打5次，稀释度为10-2。然后分别取300ul前一稀释液加入2.7ml DMEM5%，形成一系列稀释度，最后4个稀释度用于感染细胞。 注意：每次稀释时都必须换用新枪头。 3．吸去细胞培养液，每个培养皿中加入1ml病毒稀释液和1ml DMEM5%，十字形轻轻晃动混匀，37℃培养90分钟。 4．吸去培养液，按5.2.2中所述加入1.25%琼脂糖培养基。 5．37℃培养,经常注意是否有空斑形成和是否需要加入新鲜培养基。21天后应该可以看到空斑形成的白色小斑点。 结果:计数有多少个独立的空斑形成，将此数目乘以稀释度即可得到每毫升产生的空斑形成单位(PFU/ml)。 50%组织培养感染剂量法 此方法基于最高稀释度下在QBI-293A细胞中CPE的形成，它是昆腾公司用于测定滴度的标准方法。 细胞准备： 1．收集一瓶QBI-293A细胞，计数。 2．用DMEM 2%准备20ml 105/ml细胞。 3．用12道排枪在2块96孔板中每孔加入100ul细胞悬液。 5.8.3.2 准备稀释病毒液 1．第1管中加入0.9ml DMEM 2%，其余加入1.8ml。第1管中再加入0.1ml病毒保存液。 2．上下吸打5次混匀。 3．换用新枪头。 4．从第1管中吸取0.2ml加入第2管中。
慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤
一、包装细胞293T细胞的培养 一、293T细胞的冻存 1. 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。所以要在细胞购进时就进行冻存。 2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。 3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。 4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。 5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。 6. 细胞计数。 7.将细胞离心，1000rpm，2min。 8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。 10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。 二、293T细胞的传代 1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。 2. 消化细胞，方法同上。 3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。密度为3×105个/ml。 4. 分到10cm培养皿中，10ml/皿。 三、293T细胞的复苏 1. 当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。 2. 打开水浴锅，设置温度为40℃。 3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。 4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。 5. 放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。 6. 第二天观察细胞存活率。倒掉旧的培养基，加入10ml新鲜培养基。 二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定 1. 所用病毒检测引物为WPRE特异引物，序列如下
腺病毒常见问题与解答
腺病毒常见问题与解答 1、腺病毒载体对目的基因的长度是否有要求？ 有要求。对E1和E3双缺失的腺病毒载体，比如AdMax的Kit C、Kit D等，其总包装的 外源片断要求小于8 kb。而对于只有E1缺失或E3缺失的载体，比如Kit A、Kit B等，外源片断要求小于5 kb。注意，外源片断指包括启动子、外源基因和poly A等在内的整个插入片断。 2、我的试验需要多少总量的腺病毒载体？ 腺病毒介导外源基因的基因治疗研究一般分为体外培养细胞试验(体外试验)和动物试验(体内试验)两部分，不同的实验设计所需要的病毒量也不尽相同。根据经验，完成一个完 整的肿瘤治疗实验需要腺病毒的病毒量总量约为3×1012 VP左右. 3、如何提高腺病毒的活性？ 提高腺病毒的活性，关键应该是在病毒包装过程和扩增过程。纯化过程只是去掉有缺陷的病毒和细胞碎片等容易引起机体免疫反应的过程，如果扩增的病毒滴度高，那么纯化后就会更高的。 4、克隆到转移载体的基因中的5’和3’UTR（未翻译区）的额外的碱基会影响蛋白表达吗？ UTR尽可能短一些，特别是在5’要避免在mRNA里形成二级结构。在起始密码子ATG 前面可以加一小段（6-9bp）的碱基序列可以增强目的基因的表达，比如Kozak序列(GCCGCCACCATG)。 5、如何判断腺病毒载体是否能高效感染某种细胞？ 参照文献报道是很简单的办法，也可以用带报告基因的腺病毒先行预实验。 Ad5能高效感染绝大多数人类、小鼠等的体细胞（包括分裂和非分裂细胞），比如肝、肌肉、神经组织等。但对血液系统来源细胞和某些肿瘤细胞，比如乳腺癌、白血病细胞等，感染效率较低。 6、腺病毒载体在体外实验（in vitro）中应注意哪些问题？ 1）由于细胞表面受体的差异，腺病毒载体在不同的细胞中转导效率不同。可根据文献报道或用带报告基因的腺病毒载体判断病毒用量。 2）在细胞处于对数生长期时感染病毒效果较好。避免在消化细胞后立刻感染病毒，因为此时细胞膜上的病毒受体往往受到了暂时的破坏。培养过夜后再感染病毒，效果较好。 3）选择适当的转导MOI（病毒感染单位数/细胞数），可以在MOI为0.1~1000范围内进行试验( 10倍比稀释)。 4）感染病毒时细胞培养液的体积尽量小一些，以完全覆盖细胞为准。如24孔板可用200ul，6孔板1ml。 5）感染时间为90分钟，每15分钟轻轻晃动培养液一次，以混匀。 6）选择适当表达检测时间，一般感染病毒24h后就能检测到目的基因的表达，48小时表达达到较高水平。 7、用于体内试验的腺病毒，是否要求纯化？ 是的，病毒纯化是很必要的。因为细胞裂解液包含有缺损颗粒、大量的腺病毒fiber和penton蛋白（细胞毒素）、培养基、血清以及细胞碎片。这些杂质如果被注入动物体内，会
抗体效价测定操作规程
抗体效价测定操作规程 操作步骤： 一.IgG 类 I.IgG类抗体效价滴定，须取适量血清200］加等体积2—Me溶液混合，封口，置37C水浴箱作用60分钟，先稀释血清：200L病人血清 600L 生理盐水备用，排列6 支试管按顺序编号。第二管开始到第六管加样枪各加生理盐水200L，在第一管和第二管中各加入稀释血清200L，第二管混匀后移出200L转至第三管，以同样操作第六管，从第六管吸出200L 暂时保留在另一试管中（可做为第七管），以备必要时作进一步稀释。这样从第一管到第六管的血清稀释度依次是 1:8,1:16,1:32,1:64,1:128,1:256 。 2.加红细胞悬液（自配红细胞悬液同反定型试剂）每管各加2％相应红细胞悬液200L，混匀。（如待检血清抗体为抗A,则加入A型标准红细胞悬液；如待检血清抗体为抗B,则加入B型标准红细胞悬液；如待检血清中既有抗A又有抗B,则倍量稀释两份血清，一份加入A 型标准红细胞悬液，另一份加入B型标准红细胞悬液；） 3.先直接观察离心结果，之后在每管分别加入凝聚胺试剂盒中的R1 液3d,混合30S均匀后，在各加R2液2滴，操作方法同凝聚胺交叉配血法，然后判读结果。通常以肉眼观察到的第一个“±”的凝集管作为判断的终点, 终点血清稀释度的倒数为效价（Titer ）,或称滴度。 二.IgM 1?血清连续倍量稀释法先稀释血清：100L病人血清+700L生理盐
水备用，排列6 支试管按顺序编号。第二管开始到第六管加样枪各加生理盐水200L,第一管和第二管中各加入稀释血清200L,第二管混匀后移出200L转至第三管，以同样操作第六管，从第六管吸出200L 暂时保留在另一试管中（可做为第七管），以备必要时作进一步稀释。这样从第一管到第六管的血清稀释度依次是 1:8,1:16,1:32,1:64,1:128,1:256 。 2. 加红细胞悬液（自配红细胞悬液同反定型试剂）每管各加2％相应红细胞悬液200L,混匀。（如待检血清抗体为抗A,则加入A型标准红细胞悬液；如待检血清抗体为抗B,则加入B型标准红细胞悬液；如待检血清中既有抗A又有抗B,则倍量稀释两份血清，一份加入A 型标准红细胞悬液，另一份加入B型标准红细胞悬液；）三．此类为IgM 类盐水抗体可立即离心后观察。 四． 五．（学习的目的是增长知识，提高能力，相信一分耕耘一分收获，努力就一定可以获得应有的回报）