中药有效成分的提取与分离
中药有效成分的提取与分离（讲义）
、尸、-
前言
中药是我国人民数千年来同疾病作斗争的有力武器，是我国医药宝库的重要组成部分。然而中药的化学成分比较复杂，每种中药中都含有多种成分，但并不是每种成分都能起到防治疾病的效果，我们通常将中药含有的成分分为有效成分和无效成分两大类。所谓无效成分是相对有效成分来说的，或者是到目前还没发现它具有显著生物活性。所谓有效成分，即被证明具有医疗效用或生物活性的物质，一般有效成分含量往往很低。我国的天然药物资源十分丰富，为了发现新的活性成分，寻找新的药物，就必须首先从复杂的中草药成分中，提取出有活性的组分。
中药防治疾病的物质基础是其中的有效化学成分，因此，提取、分离和纯化中药中的化学成分，是进一步测定其化学结构、研究其药理作用和毒性的首要条件，也是进行结构改造、化学合成和研究结构一疗效关系的前提，同时，只有搞清楚中药的有效成分才能有效地进行药材的引种栽培、产品的质量控制、工艺改进和稳定性考核，研究药物在体内的代谢和生物利用度，探计和提高中药的临床疗效，从中药成分中发现具有生物活性的先导化合物，进而研制有自主知识产权的创新药物。总而言之，对中药进行化学成分的研究，提取和分离出其有效成分或有效成分群，是一切有关中药研究的关键。
中药活性成分结构类型丰富，理化性质差异较大（有的性质相当不稳定），因此提取分离的方法也不尽相同。从一个粗提物中要分得纯化合物，常需要经过许多纯化步骤，其过程往往相当烦琐、耗时，且花费很大。因此，正确掌握提取分离的实验操作以及熟悉快速、有效的新的提取分离技术在分离目约化合物中就显得尤为重要。
一、中药有效成分的提取主要提取方法：经典的溶剂提取法，其次还有水蒸气蒸馏
法、升华法、压榨
1. 溶剂提取法
1.1 原理：溶剂提取法是根据中草药中各种成分在溶剂中的溶解性质，选用对活性成分溶解度大，对不需要溶出成分溶解度小的溶剂，而将有效成分从药材组
织内溶解出来的方法。当溶剂加到中草药原料（需适当粉碎）中时，溶剂由于扩散、渗透作用逐渐通过细胞壁透入到细胞内，溶解了可溶性物质，而造成细胞内外的浓度差，于是细胞内的浓溶液不断向外扩散，溶剂又不断进入药材组织细胞中，如此多次往返，直至细胞内外溶液浓度达到动态平衡时，将此饱和溶液滤
出，继续多次加入新溶剂，就可以把所需要的成分近于完全溶出或大部溶出。
1.2 溶剂的选择：运用溶剂提取法的关键，是选择适当的溶剂。溶剂选择适
当，就可以比较顺利地将需要的成分提取出来。选择溶剂要注意以下三点：① 溶剂对有效成分溶解度大，对杂质溶解度小；② 溶剂不能与中药的成分起化学变化；
③ 溶剂要经济、易得、使用安全等。常用溶剂如下。
1.2.1 水：是一种强的极性溶剂。中草药中亲水性的成分，如无机盐、糖类、鞣质、氨基酸、蛋白质、有机酸盐、生物碱盐及甙类等都能被水溶出。为了增加某些成分的溶解度，也常采用酸水及碱水作为提取溶剂。
1.2.2 亲水性的有机溶剂：也就是一般所说的与水能混溶的有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙酮等，以乙醇最常用。乙醇的溶解性能比较好，对中草药细胞的穿透能力较强。亲水性的成分除蛋白质、粘液质、果胶、淀粉和部分多糖等外，大多能在乙醇中溶解。难溶于水的亲脂性成分，在乙醇中的溶解度也较大。还可以根据被提取物质的性质，采用不同浓度的乙醇进行提取。
1.2.3 亲脂性的有机溶剂：也就是一般所说的与水不能混溶的有机溶剂，如石油醚、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷等。这些溶剂的选择性能强，不能或不容易提出亲水性杂质。但这类溶剂挥发性大，多易燃，一般有毒，价格较贵，设备要求较高，且它们透入植物组织的能力较弱，往往需要长时间反复提取才能提取完全。如果药材中含有较多的水分，用这类溶剂就很难浸出其有效成分，因此，大量提取中草药原料时，直接应用这类溶剂有一定的局限性。
1.3 提取方法主要包括：浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法及连续回流提取法等。
1.3.1 浸渍法：浸渍法系将中草药粉末或碎块装入适当的容器中，加入适宜的溶剂（如乙醇、稀醇或水），浸渍药材以溶出其中成分的方法。本法比较简单易行，但浸出率较差，且如用水为溶剂，其提取液易于发霉变质。
1.3.2 渗漉法：渗漉法是将中草药粉末装在渗漉器中，不断添加新溶剂，使其渗透过药材，自上而下从渗漉器下部流出浸出液的一种浸出方法。当溶剂渗进药粉
溶出成分比重加大而向下移动时，上层的溶液或稀浸液便置换其位置，造成良好的浓度差，使扩散能较好地进行，故浸出效果优于浸渍法。但应控制流速，在渗渡过程中随时自药面上补充新溶剂，使药材中有效成分充分浸出为止。渗漉法与浸渍法尤适用对一些易挥发成分的提取。
1.3.3 煎煮法：煎煮法是我国最早使用的传统的浸出方法。所用容器一般为陶器、砂罐或铜制、搪瓷器皿，不宜用铁锅，以免药液变色。直火加热时最好时常搅拌，以免局部药材受热太高，容易焦糊。有蒸汽加热设备的药厂，多采用大反应锅、大铜锅、大木桶，或水泥砌的池子中通入蒸汽加热。
1.3.4 回流提取法：最常用的提取方法。采用回流加热装置，以免溶剂挥发损失。小量操作时，可在圆底烧瓶上连接回流冷凝器。瓶内装药材容量不超过50%,溶剂浸过药材表面约1?2cm加热回流，一般保持沸腾若干小时小放冷过滤，再在药渣中加溶剂，作第二、三次加热回流分别约半小时，或至基本提尽有效成分为止。此法提取效率较以上几种方法高，由于受操作局限性，大量生产中多采用连续提取法。
1.3.5 连续提取法：应用挥发性有机溶剂提取中草药有效成分，不论小型实验或大型生产，均以连续提取法为好，而且需用溶剂量较少，提取成分也较完全。实验室常用索氏提取器。连续提取法，一般需数小时才能提取完全。提取成分受热时间较长，遇热不稳定易变化的成分不宜采用此法。
1.3.6 其他溶剂提取法超声提取、微波辅助提取、超临界流体萃取、酶提取
2. 其他提取方法
2.1 水蒸气蒸馏法：适用于能随水蒸气蒸馏而不被破坏的中草药成分的提取。此类成分的沸点多在100C以上，与水不相混溶或仅微溶，且在约100C时存一定
的蒸气压。当与水在一起加热时，其蒸气压和水的蒸气压总和为一个大气压时，液体就开始沸腾，水蒸气将挥发性物质一并带出。主要用于挥发油的提取。
2.2 升华法：固体物质受热直接气化，遇冷后又凝固为固体化合物，称为升
华。中草药中有一些成分具有升华的性质，故可利用升华法直接自中草药中提取出来。
3 影响提取效率的因素：原料粒度，提取温度及时间
二、中药有效成分的精制及粗分离
上述提取法所得到的中草药提取液或提取物仍然是混合物，需进一步除去杂质，分离并进行精制。具体的方法随各中草药的性质不同而异。
1. 溶剂分离法：一般是将上述总提取物，选用三、四种不同极性的溶剂，由低极性到高极性分步进行提取分离。也可利用其某些成分能在酸或碱中溶解，又在加碱或加酸变更溶液的pH 后，成不溶物而析出以达到分离。
2. 萃取法：利用提取物中齐成分在两种互不相溶的溶剂中的分配系数的不同而达到分离的方法。萃取时如果各组分在两相溶剂中的分配系数相差越大，则分离效率越高，分离的效果就越好。实验室萃取常用的有机溶剂有石油醚、氯仿、乙醚、乙酸乙脂、正丁醇等如果水提取液中的欲分离的成分是亲脂性的物质，一般多用亲脂性有机溶剂，如石油醚、苯、氯仿或乙醚与水相之间进行两相萃取; 如果有效成分是亲脂性弱的物质，在亲脂性溶剂中难溶解，就需要改用亲脂性弱的有机溶剂，例如乙酸乙酯、正丁醇等与水相之间进行两相萃取。例如提取黄酮类成分时，多用乙酸乙酯和水的两相萃取，提取亲水性强的皂苷类成分则多选用正丁醇和水作两相进行萃取。不过，一般有机溶剂亲水性越大，与水作两相进行奉取的效果就越不好，因为较多的亲水性杂质也会被萃取出来，影响到有效成分的进一步精制。两相溶剂萃取在操作中还要注意以下几点：
1）先用小试管猛烈振摇约1 分钟，观察萃取后二液层分层现象。如果容易产生乳化，大量提取时要避免猛烈振摇，可延长萃取时间。如碰到乳化现象，可
将乳化层分出，再用新溶剂萃取；或将乳化层抽滤，或将乳化层稍稍加热；或较长时间放置并不时旋转用玻璃棒轻微搅拌令其自然分层。
2）水提取液的浓度最好在比重1.1?1.2之间，过稀则溶剂用量太大，影响操
作。
3）溶剂与水溶液应保持一定量的比例，第一次提取时，溶剂要多一些，一般为水提取液的1/3 ，以后的用量可以少一些，一般1/4-1/6 。
4）一般萃取3?4 次即可。但亲水性较大的成分不易转入有机溶剂层时，须增加萃取次数，或改变萃取溶剂。
3. 沉淀法
沉淀法是在中草药提取液中加人某些试剂使其析出其中某种或某些成分，或析出其杂质，产生沉淀，以获得有效成分或除去杂质的方法，包括醇沉法、酸碱沉淀法、铅盐沉淀法等。
4. 其他方法：盐析法，透析法等。
三、中药有效成分的分离与纯化
中药有效成分的分离主要以色谱法为主，其中以柱色谱最为常用。我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。
1 、柱子可以分为：加压，常压，减压
压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。减压柱能够减少硅胶的使用量，
感觉能够节省一半甚至更多，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时
在柱子外面有水汽凝结），以及有些比较易分解的东西可能得不到，以前曾经大量的过减压柱，对它有比较深厚的感情，但是自从尝试了加压后，就几乎再也没动过减压的念头了。加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗剂走的快些。特别是在容易分解的样品的分离中适用。压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。
2、关于柱子的尺寸，应该是粗长的最好柱子长了，相应的塔板数就高。柱子粗了，上样后样品的原点就小（反映在柱子上就是样品层比较薄），这样相对的减小
了分离的难度。试想如果柱子十厘米，而样品就有二厘米，那么分离的难度可想而知，恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。而如果样品层只有0.5 厘米，那么各组分就比较容易得到完全分离了。现在见到的柱子径高比一般在1: 5?10,书中写硅胶量是样品量的30?40倍, 具体的选择要具体分析。如果所需组分和杂质分的比较开（是指在所需组分rf 在0.2?0.4,杂质相差0.1 以上）,就可以少用硅胶,用小柱子（例如200 毫克的样品，用2cm K20cm的柱子）;如果相差不到0.1，就要加大柱子，我觉得可以增加柱子的直径,比如用3cm 的,也可以减小淋洗剂的极性等等。
3、关于湿法、干法上样湿法省事，一般用淋洗剂溶解样品，也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等，但溶剂越少越好，不然溶剂就成了淋洗剂了。很多样品在上柱前是粘乎乎的，一般没关系。可是有的上样后在硅胶上又会析出，这一般都是比较大量的样品才会出现，是因为硅胶对样品的吸附饱和，而样品本身又是比较好的固体才会发生，这就应该先重结晶，得到大部分的产品后再柱分，如果不能重结晶那就不管它了，直接过就是了，样品随着淋洗剂流动会溶解的。有些样品溶解性差，能溶解的溶剂又不能上柱（比如DMFQMSO等，会随着溶剂一起走，显色是一个很长的脱尾），这时就必须用干法上柱了。溶剂的选择，当然是最便宜，最安全，最环保的了。所以大多选用石油醚，乙酸乙酯，二氯甲烷，甲醇等，（二氯它和硅胶的吸附是一个放热过程，所以夏天的时候经常会在柱子里产生气泡，天气冷的时候会好一些。甲醇，据说能溶解部分的硅胶，所以产品如果想过元素分析的话要留神，应该经过后继处理，比如说重结晶等）。这里要注意的是，一般在过柱同时进行的是减压旋蒸，石油醚和乙酸乙酯的比例由于挥发度的不同会导致极性的变化，一般会使得极性变大，在梯度淋洗时比较合适，正好极性越来越大了。
4、关于操作问题。
4.1 装柱。
柱子下面的活塞一定不要涂润滑剂，会被淋洗剂带到产品中的，可以采用四氟节门的。干法和湿法装柱觉得没什么区别，只要能把柱子装实就行。装完的柱子应该要适度的紧密（太密了淋洗剂走的太慢），一定要均匀（不然样品就会从一侧斜着下来）。但是柱子更忌讳的是开裂，会影响分离效果，甚至作废！
4.2 加样。
用少量的溶剂溶样品加样，加完后将下面的活塞打开，待溶剂层下降至石英
砂面时，再加少量的低极性溶剂，然后再打开活塞，如此两三次，一般石英砂就基本是白色的了。加入淋洗剂，一开始不要加压，等溶样品的溶剂和样品层有一段距离（2?4cm就够了），再加压，这样避免了溶剂（如二氯甲烷等）夹带样品快速下行。
4.3 淋洗剂的选择。
感觉上要使所需点在rf0.2 ?0.3 左右的比较好。不要认为在板上爬高了分的比较开，过柱子就用那种极性，如果rf 在0.6，即使相差0.2 也不容易在柱子上分开，因为柱子是一个多次爬板的状态，可以通过公式的比较：0.6/0.8 一次的分离度，肯定不如（0.2/0.3）的三次方或四次方大。
4.4 样品的收集。
用硅胶作固定相过柱子的原理是一个吸附与解吸的平衡。所以如果样品与硅胶的吸附比较强的话，就不容易流出。这样就会发生，后面的点先出，而前面的点后出。这时可以采用氧化铝作固定相。另外，收集的试管大小要以样品量而定。
4.5 最后的处理。
柱分后的产品，由于使用了大量的溶剂，其中的杂质也会累积到产品中，所以如果想送分析，最好用少量的溶剂洗涤一下，因为大部分的杂质是溶在溶剂里的，一洗基本就没了，必要时进行重结晶。