微流控芯片荧光检测系统研究进展

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微流控芯片荧光检测系统研究进展

张 雯
钱金雄
肖彦革
陈缵光*
（中山大学 药学院
广州 510006）

摘要：微流控芯片以其微型、快速、高效和低耗等特点而成为当今分析科学的研究热点之一
本文就目前微流控芯片荧光检测系统的研究进展进行了综述
主要介绍微流控芯片中荧光检测系统
包括激光诱导荧光(LIF)、发光二极管(LED)诱导荧光和其他荧光检测装置的原理、光路结构及其应用
引用文献57篇

关键词：微流控芯片；荧光检测；综述
中图分类号:O657.8
Advance of Fluorescence Detection System in Microfluidic Chip
ZHANG Wen, QIAN Jinxiong, XIAO Yange and CHEN Zuanguang*
(School of Pharmaceutical Sciences
Sun Yat-sen University
Guangzhou 510006
China)

Abstract：Microfluidic chip is one of the hot topics in the current analytical science due to its properties such as miniaturization, fast speed, high efficiency and low consumption. The optical structures of fluorescence detections, including laser induced fluorescence (LIF) detection, light-emitting diode (LED) induced fluorescence detection, other fluorescence detections in microfluidic chip and their applications were reviewed.
Key words：microfluidic chip；fluorescence detection；review

自微流控芯片问世以来
检测器研究一直是人们关注的热点
微流控芯片中各种生物和化学过程通常是在微米量级的通道几何结构内完成的
因此
要求其检测器具有灵敏度高、响应速度快、微型化等特点

荧光检测(Fluorescence detection
FD)技术因具有准确度好、灵敏度高等特点
是目前微流控系统最常用的检测技术之一
微流控芯片的主要研究对象
如蛋白质、脱氧核糖核酸及氨基酸等自身带有荧光基团、或者衍生化后可产生荧光
均可采用荧光检测技术
检出限达10-14 mol·L-1[1]
甚至可检测到单个DNA分子[2]
液芯波导管[3]的引入使检测系统的性能大有改善
本文就目前微流控芯片荧光检测系统的研究进展进行综述
主要介绍用于微流控芯片的激光诱导荧光(LIF)、发光二极管(LED)诱导荧光和其他荧光检测方法和装置
以及它们的具体应用

1. 荧光检测系统概述
　许多化合物如有机胺、维生素、激素、酶等被入射光（即激发光）照射
吸收一定波长的光后
分子中的某些电子从基态向较高能级跃迁
电子之间发生碰撞消耗部分能量而无辐射地降到第一电子激发态的最低振动能级
再回到基态的不同振动能级
同时发射出比吸收光波长更长的荧光
荧光强度与入射光强度、量子效率、样品浓度成正比

要实现高灵敏度的荧光检测
关键在于降低背景

光
特别是激发光背景的影响
因此检测系统的光路结构设计十分重要
目前报道的有正交型、非共焦型、共聚焦型、平行型等（表1）
常用的光学元件包括光源、透镜、滤光片、分色镜、光纤、物镜、光电转换元件等

表1 微流控芯片荧光检测系统的4种光路结构比较
Table 1 Comparison of four schematic diagrams of fluorescence detection system
on microfluidic chip
类别 结构特点 优 点 缺 点 参考
文献 正交型 激发光路和发射光路相互垂直的结构
有效降低激发光对检测的干扰
提高检测灵敏度 结构相对复杂
不利于微型化 [4, 5] 非共焦型 激光束经过透镜聚光和反射镜反射
以适当的入射角度照射芯片的检测区域
激发产生的荧光经物镜收集聚光
并由滤光片滤除激发光和其他杂散光后
用光电倍增管进行检测
结构简单、易微型化 激发光和杂散光的干扰大
必须优化激光束的入射角度和荧光信号的收集角度 [6] 共聚焦型 激光束由二向色镜反射并由显微物镜聚焦后垂直照射到芯片的检测区域
激发产生的荧光经二向色镜投射
并由与显微物镜同轴且共焦的显微目镜聚焦
再经干涉滤光片滤除干扰光后进行检测
对荧光与激发光、反射光、杂散光的分离较非共焦型更为完全 结构较复杂
不易微型化 [7, 8] 平行型 激发光路与发射光路平行
激发光经过滤光片滤过后
垂直照射芯片的检测区域
产生的荧光经光纤收集聚光
并由发射滤光片滤除激发光和其他杂散光后
进入光电倍增管进行检测
结构紧凑、易微型化 激发光干扰较大
对发射滤光片的截止效率要求高 [9] 由于研究对象和技术方法等实际情况的差异
不同的研究小组在光路的设计、光学元件的配置上各有所不同

2. 激光诱导荧光(LIF)检测系统
激光具有能量高、方向性好、易聚焦等特点
特别适合作为微流控芯片中荧光检测器的光源
以提高检测的灵敏度
激光诱导荧光（Laser induced fluorescence, LIF）检测是目前最灵敏的检测方法之一
其检出限一般为10-12 ~ 10-9 mol·L-1
最低可达10-14 mol·L-1[1]
采用一些改进技术（如光子记数、双光子激发等）对于某些荧光效率高的物质甚至可达单分子检测[10]
LIF检测法还具有良好的选择性和较宽的线性范围

早期使用的光源是氩离子激光器
功率大
输出稳定
汇聚效果好
但体积庞大
不利于仪器微型化
已逐渐被半导体激光器取代
半导体激光器功率输出稳定
价格较低、体积较小、寿命长[11]

2.1. 单通道芯片LIF检测
单通道微流控芯片激光诱导荧光检测器是人们研究最早
也是目前研究较成熟、应用广泛的一类LIF检测器
但此类装置大多是研究者自行搭建
缺

乏商品化的仪器
Ocvirk等[12]以488 nm氩离子激光器为激发光源
采用共聚焦光路以降低背景噪音
在玻璃芯片上对荧光素的检出限分别达到300 fmol·L-1（连续流动模式
S/N=6.1）和1 pmol·L-1（区带电泳模式
S/N=5.8）
林炳承课题组[13]研制了一种通用型激光诱导荧光微流控芯片分析仪
采用电荷耦合器件(Charge coupled device, CCD)监测通道
三维调节聚焦
发射波长滤光片可方便地更换以适应多种染料选择
以罗丹明6G 荧光试剂作为检测物质
检出限为6. 67×10-13 mol·L-1

通过采用多种方法
可以进一步提高其检测灵敏度
如Effenhauser等[14] 通过光子计数技术
对PDMS芯片电泳分离的603bpDNA片段进行检测（YOYO-1标记）
检出限达到了10-21 mol水平
而Fister等[15]采用单光子雪崩二极管（SPAD）作为检测元件
利用双脉冲计数法
对经芯片电泳分离的罗丹明6G和罗丹明B的检出限分别达到1.7×10-15 mol·L-1和8.5×10-15 mol·L-1
分离时间小于35s
相对迁移时间的不确定性小于2.0%
方肇伦课题组[16]采用正交型的光路结构
在微流控芯片系统中使用一个简单的LIF检测器
从芯片侧壁检测微通道中激发的荧光
以减少来自光源的散射光干扰
从而达到高灵敏度检测的目的
此项研究利用芯片上激光的散射光强度分布的显著差异
接收光信号时避开散射光以达到信噪比(S/N)的最大优化
荧光接收角度为45° 时结果最佳
所接收的散射光强度仅为接收角度为90° 时的三十八分之一
以荧光素钠和异硫氰酸荧光素标记的氨基酸为样品进行检测
检出限达1.1 pM(S/N=3)
与优化后的微流控芯片共聚焦LIF系统性能相当

采用半导体激光器作为激发光源
可大大减小LIF检测器的体积、重量和功耗
从而适于搭建微型化分析系统
Shrinivasan等[17]使用波长为635 nm的红色半导体激光器作为光源
研制了一种低成本、低功耗的小型荧光检测器
光电二极管加上运算放大器进行信号采集
该系统功率仅270 mW
与传统使用氩离子激光器和光电倍增管的检测系统相比
成本减少了98 %
能耗只有传统的五千分之一
在微分析系统中
采用此微型LIF检测器进行DNA定量分析
误差小于15 %

2.2. 多通道阵列芯片LIF检测
随着微机电加工技术的发展
人们已经实现在芯片上加工出上百条并行的微通道
进行高通量的反应和分离
以满足药物筛选和基因测序等领域的需求
对阵列微流控芯片进行快速高灵敏度的检测
促进了微流控芯片实验室技术向通量化方向发展

采用多道扫描荧光检测技术
可以在阵列式微流控芯片上实现高通量、高速度的检测分析
Mathies课题组[18]设计了一种旋转扫描的共聚焦激光诱导荧光四色检测器
用于96通道圆

盘式毛细管阵列电泳芯片分析的检测
检测器的扫描物镜头在步进电极的带动下
依次对芯片上各通道的检测点进行荧光检测
利用共聚焦光路系统将激发光和荧光分开
荧光信号由二个四色检测装置[19]进行检测
他们用该检测器
在120 s内完成了芯片上96个通道和384个通道中DNA片段的高通量快速荧光检测分析
测序速度达到1.7 kbp·min-1
比目前商用毛细管阵列电泳测序技术快5倍
该系统适用于低浓度、试剂量少的样品
且在样品的制备处理方面表现出许多优势
有可能成为下一代高性能DNA测序平台[20]

采用电荷耦合器件（CCD）作为检测器是多通道阵列芯片的另一种检测方式
林炳承课题组[21]采用473 nm半导体固体激光器作为光源
激发光束经凹面镜汇聚、柱面镜扩展成一条宽4mm的线状激光后
滤去杂光聚焦于芯片阵列通道上
激发微通道中的荧光物质产生荧光
发出的荧光经过收集、滤过杂散光后进入CCD检测
Okagbare等[22]用波长为660nm的激光作激发光源
电子倍增电荷耦合器件(EMCCD)转换光电信号
在30通道的微芯片上进行单分子荧光检测
该检测系统对荧光标记的单个DNA分子具有足够的灵敏度
检测速率达到4.02×105个·s-1
将通道变窄
缩短间距
可进一步提高检测速度
McKenna等[23]构建了一个高通量细胞计数微流控芯片系统
可在6～10 min内对384份样品进行细胞筛选
Garcia-Alonso等[24]使用倒置显微镜检测荧光
在8通道的微芯片上进行化合物的毒性筛选
陈伟等[25]建立了一种快速、超灵敏的检测方法
在5 min内可完成对7-ACZP (7-aminoclonazepam)的检测
线性范围1.1～60.1 μg·L-1
检出限为0.021μg·L-1
Emory等[26]使用CCD相机延时合成(TDI)模式
对多条微流体通道同时进行单分子的跟踪和检测
可实现1.7×107个·s-1的高通量检测

3. 发光二极管(LED)诱导荧光检测系统
在半导体激光器发展的同时
半导体发光二极管(LED)也日益受到重视
LED是一种体积更小
寿命更长、价格更低的发光器件
能极大地简化检测器的结构
目前
多种波长的高亮度LED已上市
利于实现对各种生物样品、金属离子及中药提取物的荧光检测[27, 28]

为了减少激发光干扰
LED诱导荧光检测系统光路多为正交型
H Nakajima等[29]采用LED、两个圆柱型透镜、一棱镜及一分色镜、电荷耦合器件(CCD)、聚合物芯片等组建了微芯片传感器
实现了低分子物质的在线分析
Xu等[30]采用共聚焦光路结构
先通过聚合酶链反应(PCR)
然后在芯片毛细管电泳上用490 nm的LED作激发光源
进行双链DNA片段一步测定
关亚风课题组研制了一种LED诱导荧光检测系统
通过柱上检测可与微通道分析系统在线联用
对FITC标记的苯丙氨酸浓

度检出限达10-8 mol·L-1[31]
Pais等[32]使用绿光LED作为光源、两块偏振镜分别过滤激发光与发射荧光
建立了一种高灵敏度的荧光分析方法
对罗丹明6G和荧光素的检出限分别为100 nmol·L-1和10 μmol·L-1

以光纤作为传光介质
能够减小光斑的直径
起汇聚作用
美国哈佛大学Whitesides课题组报道了一种的PDMS芯片[33]
该芯片中集成有荧光检测单元
分为三层：通道层靠近分离通道的边缘埋有一根光纤
光纤通过与外部473 nm的LED耦合以传输激发光；底层PDMS基片中埋入微型雪崩二极管(μAPD)作为感光元件
表面覆盖一层PC聚合物滤光片
该系统对荧光素的检出限为25×10-9 mol·L-1
且被成功地用于蛋白质和小分子混合物的电泳分离和检测
崔大付等[34]在光纤型微流控芯片上建立了用蓝色LED诱导荧光检测系统
LED激发光通过连接在芯片上的光纤传递
到达检测区域
利于实现仪器的微型化
对FITC的检出限达22 nmol·L-1 (S/N=5)
Uchiyama等[35]将蓝色LED直接埋入上层聚酯盖片中
在与LED垂直的下层聚酯芯片的通道侧旁固定一多模光纤以收集荧光
将其直接导入光电倍增管中进行检测

由于光纤纤芯直径（一般为62.5 μm）与微流控沟道的深度尺寸（50～100 μm）非常接近
同时用于激发光的传输和荧光信号的采集[33]
提高激发效率和检测灵敏度
Destandau等[36]将刻有Y形通道的PDMS板固定在玻璃基板上
用LED作激发光源
两根光纤分别用于激发光的传导和荧光的收集
对水溶液中钾离子的浓度进行检测
检出限为0.5 mmol·L-1
且不受钠离子的干扰
Irawan等[37]用蓝色LED、PMMA或石英材料的光纤和小型光电倍增管搭建了一个紧凑型的荧光检测系统
能够检测到磷酸盐缓冲液中0.005 mg·L-1的荧光素
结果可重复
将该系统应用于多通道检测[38]
对荧光素的检出限达到0.01 ng·L-1
重现性良好
相邻通道间未观察到相互干扰的现象
该系统还可应用于芯片上的免疫检测

使用液芯波导技术
是提高荧光检测灵敏度的另一种有效方法
Dasgupta等最先使用Teflon AF-1600材料涂覆的毛细管作为液芯波导管
实现毛细管电泳中的荧光检测[39]
王世立等[40]在微流控芯片上利用LED作为激发光源
结合液芯光纤波导池传输荧光
有效地减小了激发光干扰
以波长470 mm的LED为激发光源
用液芯波导H-通道微芯片与流动注射联用
对FITC衍生精氨酸的检出限为1.6 fmol
实现了微流控芯片分析系统中的LED-液芯波导诱导荧光检测
在此基础上使用同步双波长调节
提高了检测的信噪比[41]

光波导元件的芯片集成对提高LIF检测单元在微流控芯片上的集成度具有重要意义
通过常规刻蚀手段在平板芯片上形成可定向排列的波导

结构
以提高其检测通量和微型光学元件排列的紧凑性
如Mogensen等[42]在一块芯片上刻蚀一系列并行的光波导结构(图7)
可将一束激光分成128道平行光束
而且仅需一个光电倍增管（PMT）就可同时检测所有波导通道
他们利用该芯片测定了荧光微粒在微通道中的流速
赵琰等[43]提出了一种液芯波导免疫分析阵列芯片的检测系统
结合光强差技术提高了ELISA的灵敏度
辣根过氧化酶(HRP)的线性范围为1×10-10～9×10-10 g·L-1
检出限为3.0×10-11 g·L-1
相对标准偏差小于1％
线性范围的下限与检出限均比普通的光度法改善了100倍
将其应用于血清和尿液中β2-微球蛋白的免疫分析
与标准方法所得结果相符
Bliss等[44]将荧光染料掺入PDMS材料中
通过调节极性控制染料分子的扩散入液芯波导管程度
这些分子选择性地吸收激发光并传送被测样品发出的荧光
以此进行DNA片段的分析与检测

与常规的LIF检测器相比
目前
这种集成化荧光检测器的检测灵敏度要低一些
除了LED光强较弱外
还因为所用的LED光源光谱通带较宽
其半带宽通常为20～30 nm
导致很难将激发光与荧光有效地分离
王义明等[45]开发了一种新型的便携式荧光检测系统
应用在微流控阵列芯片上
该系统极其简单
使用一个扫描LED光源和一个单点光电传感器
无CCD、透镜、光纤或其他活动部件
脉冲驱动LED使灵敏度大大提高
并极大地减少能耗、降低光漂白效应
与传统的毛细管阵列电泳检测系统不同的是
目前该系统能以高扫描率扫描径向的毛细管阵列
用8通道的阵列芯片系统检测FITC标记的精氨酸试样
检出限可达640 amol

随着微型激光二极管等高质量光源的发展
这种微型化的荧光检测器将对微流控芯片的推广以致最终被公众广泛接受将起着十分重要的作用

4. 其他荧光检测系统
双光子激发荧光检测的特点是背景散射光的干扰小
信噪比高
由于荧光激发效率与入射光强成平方正比关系
探测灵敏体积被限制在焦点附近
更有利于实现单分子探测[46]
Zugel等[47]首次在芯片上实现了双光子激发荧光检测
采用平均功率120 mW、发射波长580 nm的染料激光器作激发光源
共聚焦的荧光显微镜为光学系统
时间相关的单光子计数器作为荧光检测部件
构成了双光子激发荧光检测器
对荧光素标记的β-萘胺检出限达6×10-8 mol·L-1
Schulze等[48]使用420 nm的激发光
在微流控芯片上实现了对天然蛋白和小分子芳烃的双光子激发荧光检测
检出限达10-6 mol·L-1

Dongre等[49]采用直接飞秒激光刻写(direct femtosecond laser writing)技术将光学波导管集成到普通石英微流控芯片上
通过光波导管传导连续激光器发出的入

射光
对经微流控芯片分离的、带有荧光标记的DNA分子进行检测；同一课题组的Martinez等[50]采用高数值孔径光纤
以90°收集激发产生的荧光
通过简单的后处理和规范化的技术将光子功能集成到微流控芯片上
运用先进而独特的三维飞秒激光刻写技术
可实现如分束镜或马赫-贞德干涉仪等更加复杂的功能
该装置结构紧凑、方便携带
克服了目前微流控芯片检测系统检测元件体积较大等缺点[51]
Kamei等[52]报道了一种微型集成荧光检测器
对常用的荧光标记染料有较高的灵敏度
适用于即时检测(POCT)
Bunyakul等[53]以SRB作荧光染料
在微芯片荧光检测系统上检测霍乱弧菌毒素B亚基(CTB)
检出限为6.6 μg·L-1
Wu等[54]在微芯片上实现了粒子计数与荧光检测同步进行
可以检测到直径0.9 μm的荧光粒子
Schultz等[55]报道了一种新型的荧光阵列生物传感检测器
成功地应用于DNA杂交分析

单一的检测方法具有局限性
将荧光检测与其他方法联用进行双重检测
可以得到化合物的更多信息
同时测定不同性质的各种物质
帮助确证峰的归属
本课题组[56]搭建了一种荧光/非接触电导双重检测器
在芯片微通道上进行荧光和非接触电导同点同步检测
对荧光素纳、FITC和FITC标记的精氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸的荧光检测LOD分别为0.02 , 0.05, 0.16, 0.15, 0.12 μmol·L-1
Lapos等[57]报道了一种在微流控芯片上同时进行安培/荧光双检测的方法
对多巴胺、儿茶酚、NBD-精氨酸与NBD-苯丙氨酸荧光检测的检出限分别为0.448 , 1.52, 16, 18 μmol·L-1

5. 展望
荧光检测技术为微流控芯片分析研究提供了更为灵敏的检测手段
多通道阵列芯片上荧光检测系统
将满足药物筛选和基因测序等领域高通量的需求
超高亮度LED的面世以及使用脉冲电源供电方式增加LED激发光强、联合液芯波导技术的应用
以及与其他检测技术联用等措施
能够进一步提高灵敏度
降低检出限
扩大应用范围

微流控分析技术自20世纪末兴起后
取得了迅速的发展
但目前商品化的荧光检测器
在不同程度上存在着价格昂贵、维护费用高、兼容性差等局限性
因此
研制成本低廉、集成度高、适合于商品化的微流控芯片荧光分析仪
成为当前分析仪器发展的重要目标之一


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