咖啡酸锗对小鼠肝癌H22免疫器官的影响
肝癌免疫治疗不良反应管理的实践与探索
肝癌免疫治疗不良反应管理的实践与探索 IMbrave150研究中T+A（阿替利珠单抗+贝伐珠单抗）联合方案带来的疗效优势，引领免疫联合治疗在肝癌治疗中的未来趋势。T+A方案不仅在疗效上被证明优于索拉非尼，在安全性上也超乎了大部分人的预期，优于单药的索拉非尼。 肝癌免疫治疗不良反应的管理 1.不同免疫检查点抑制剂的不良反应并不相同，联合方案并未导致毒性1+1＞2 ①免疫治疗通过阻断免疫检查点解除对免疫系统的抑制，恢复免疫效应细胞的活性，从而增强免疫系统的功能，杀伤肿瘤，但免疫功能增强也会引起免疫相关不良反应（irAE）。不同的免疫检查点抑制剂如抗PD-1、抗PD-L1及抗CTLA-4作用机制不尽相同。请从作用机制角度结合临床实践谈谈不同的免疫检查点抑制剂免疫相关不良反应的差别？ 答：就作用机制而言，CTLA-4单抗作用于外周淋巴结的初始T细胞，通过阻断CTLA-4与B7分子的结合，解除T细胞的抑制信号，从而恢复T细胞杀伤肿瘤的能力，而后T细胞再从淋巴结迁出，浸润至外周肿瘤部位去杀伤肿瘤细胞。因而其作用于肿瘤免疫循环中的早期阶段。PD-1单抗和PD-L1单抗主要作用于肿瘤组织内，处于肿瘤免疫循环偏晚期阶段。PD-1单抗通过阻断PD-1与肿瘤细胞表面高度表达的PD-L1结合，从而恢复T细胞的活性以杀伤肿瘤细胞，同时也阻断了PD-1与PD-L2的结合通路。PD-L1单抗阻断肿瘤细胞及其周围浸润的免疫细胞上的PD-L1，对PD-1与PD-L2通路没有阻断作用，可避免正常组织免疫反应的加重。 不同免疫检查点抑制剂的不良反应（AE）存在一定差异。就发生时间而言，CTLA-4单抗发生时间相对较早。就发生率而言，双免疫治疗最高，单免疫药物次之；而单药中，CTLA-4单抗发生率最高。从理论上说，PD-1单抗的AE发生率略高于PD-L1单抗，但JAMA Oncology 上的几项荟萃分析研究显示PD-1单抗与PD-L1单抗AE发生率基本相当。 PD-L1与PD-1和B7.1结合，PD-L1抑制剂通过双重阻断可以更好地激活抗癌免疫力，但同时PD-L1抑制剂又保留了PD-L2/PD-1这个维持正常组织免疫稳态的通路，最大程度减少自
小鼠在免疫抗原后机体产生的特异性免疫应答研究
实验目的：验证小鼠在接受抗原之后机体产生了特异性免疫反应，并观察小鼠各项生理指标以及免疫器官的反应状况，再观察T细胞和B细胞在此应答的反应状况。 实验假设：小鼠免疫灭活疫苗之后，机体会逐渐产生特异性免疫应答，一方面T 细胞在接受抗原刺激之后，经过阳性和阴性选择，T细胞从CD4，CD8双阳性选择为单阳性T细胞，并逐步转移，最终到达淋巴结等组织产生效应；另一方面，B细胞也会发育分化为浆细胞和记忆细胞，相应的浆细胞产生抗体以应对抗原。由于小鼠在接受抗原之后，免疫细胞在胸腺和脾脏内的数量和种类将发生变化，另外小鼠血清中也会产生相应的抗体。 因此假设，在排出其他偶然因素引起的误差的情况下，有以下结果： 1. 免疫后的小鼠胸腺大小比对照组更小，脾脏大小比对照组更大；另外免疫后小鼠的淋巴结比对照组更大。 2. 免疫后的小鼠胸腺免疫细胞数量小于对照组，脾脏免疫细胞数量大于对照组。 3. 免疫后小鼠胸腺中的单阳性淋巴细胞比对照组单阳性淋巴细胞更多，双阳性淋巴细胞比对照组更少；免疫后小鼠的脾脏中单阳性淋巴细胞数量多于对照组单阳性淋巴细胞数量。 4. 免疫后小鼠血清里面的抗体检测呈阳性，对照组小鼠血清抗体检测呈阴性。预期结果： 预计结果与假设一致，即： 1. 免疫后的小鼠胸腺大小比对照组更小，脾脏大小比对照组更大；另外免疫后小鼠的淋巴结比对照组更大。 2. 免疫后的小鼠胸腺免疫细胞数量小于对照组，脾脏免疫细胞数量大于对照组。 3. 免疫后小鼠胸腺中的单阳性淋巴细胞比对照组单阳性淋巴细胞更多，双阳性淋巴细胞比对照组更少；免疫后小鼠的脾脏中单阳性淋巴细胞数量多于对照组单阳性淋巴细胞数量。 4. 免疫后小鼠血清里面的抗体检测呈阳性，对照组小鼠血清抗体检测呈阴性。实验方法：
小鼠免疫细胞
免疫细胞的观察与小鼠脾脏淋巴细胞的提取 一、实验目的 1、明确各免疫器官分布与形态结构，能熟练找到各免疫器官，弄清中枢免疫器官与外周免疫器官的区别与联系。 2、掌握密度梯度离心法分离小鼠脾脏淋巴细胞的方法，熟悉脾脏淋巴细胞的形态与功能。 二、实验原理 脾脏是外周免疫器官之一，是人体最大的淋巴器官。它生在腹腔左上方，质地比较脆，容易外伤。一般来讲，脾脏有三大功能： 首先它是人体的“血库”，当人体休息、安静时，它贮存血液，当处于运动、失血、缺氧等应激状态时，它又将血液排送到血循环中，以增加血容量； 其次，脾脏犹如一台“过滤器”，当血液中出现病菌、抗原、异物、原虫时，脾脏中的巨噬细胞、淋巴细胞就会将其吃掉； 此外，脾脏还可以制造免疫球蛋白、补体等免疫物质，发挥免疫作用。脾是血循环中重要的滤过器，能清除血液中的异物、病菌以及衰老死亡的细胞，特别是红细胞和血小板。因此，脾功能亢进时可能会引起红细胞及血小板的减少。脾脏还有产生淋巴细胞的功能。 我们利用小鼠来观察脾脏的淋巴细胞。 小鼠淋巴细胞的比重为1.088，利用比重为1.088的淋巴细胞分离液，将脾细胞悬液置于分离液上层，通过梯度离心的方法，在分离液与脾细胞悬液交界液面处分离得到脾脏淋巴细胞。 三、实验器材 KM种小鼠，PBS缓冲液，淋巴细胞分离液，200目不锈钢网，解剖器械 四、实验步骤 1、杀死老鼠，取出小鼠的脾脏，在pbs缓冲液中冲洗干净。 2、将小鼠脾脏至于200目铜网中，铜网绑定在烧杯上面，剪碎、碾磨，边碾磨边加PBS 冲洗，制得脾细胞悬液。 3、将制得的脾细胞悬液转移到10ml的离心管中，1000r/min 5min离心洗涤，倒掉上清，加入5mlPBS再离心洗涤一次。 4、加入5mlPBS将洗涤的脾脏细胞吹散、悬浮，缓慢加入淋巴细胞分离液上层，细胞悬液与分离液体体积比为1:1。 5、2000r/min离心30min。 6、小心吸取中间层细胞，1000r/min 5min离心洗涤两次。 7、将制得的淋巴细胞滴于玻片，镜检。
肝癌患者在术前术后的护理要点
肝癌患者术前术后护理的要点 1、注意观察病情的突然变化：在术前护理过程中，肝疾病可能发生多种危重并发症，如原发性肝癌破裂出血时，突然发生急性腹膜炎表现及内出血表现：部分病人可发生上消化道大出血、肝性脑病等。少数病人亦可因胆道出血而表现出上消化道出血症状。 2、心理护理：由于表现较重的疼痛、发热、黄疸、营养不良，或由于病人对治疗方案及手术预后的顾虑，病人常有复杂的心理状态，如焦虑、恐惧或绝望。在做好对症护理以减轻病人痛苦的同时，应对病人多加体贴及安慰。适当介绍有关治疗方法和意义。对病人要注意医疗保护制度。在医疗护理过程中，争取得到病人、家庭和社会的良好配合。 3、改善肝功能及全身营养状况：术前应注意休息并积极纠正营养不良、贫血、低蛋白血症及凝血功能障碍，采取有效保肝措施，最好是能在术术前辅以硒维康片进行补硒，通过补硒可提升患者的免疫力，增强患者对于手术的耐受性，有助于治疗效果的提升，并且硒也可以很好的修复患者受损的细胞，可加快患者在术后的恢复以及手术创面的愈合。 4、防治感染：肝手术前两日使用抗生素，以预防手术前后感染发生。对其他肝疾病合并感染时，要及时给予大量有效抗生素，合理安排给药时间，正确选择给药方法及途径，注意药物的副作用，避免使用对肝有害的药物。 5、肠道准备：对拟行广泛肝组织切除术或肝血管结扎术、栓塞
术者，尤其是合并肝硬变者，为抑制其肠道内细菌，清除肠道内粪便，以减轻术后腹胀及血氨本源，防止肝性脑病等并发症发生，术前3天应进行必要的肠道准备。 6、其他工作：肝手术前一般需放置胃管，必要时也需留置尿管。广泛肝切除术术中术后输血量可能较大，术前应备足血液，以新鲜血为佳，避免术中输入大量库存血而引起凝血障碍。 7、饮食疗法，包括药膳和日常饮食的调养。药膳是食物与药物的巧妙结合，既有强身作用，又可起到药物治疗作用，是中医保健的一大优势。药膳需要以中医理论为基础去调配，要因人、因时灵活选材。另外，日常所吃的许多食物也有寒、热、温、凉之别，可根据肿瘤的病性不同而调配日常饮食，从而达到治疗或辅助治疗疾病、改善症状的目的。比如放疗时，病人常会出现口干舌燥、便秘等症，饮食就可以选用养阴、清热、生津之品，如冬瓜、白萝卜、梨、猕猴桃等。如有脾胃虚寒症状，可选健脾温阳食物，如桂圆、干姜、羊肉等。还有一个忌口问题，这在我们临床上经常会碰到，其实忌口更多的是前人流传下来的一种说法，目前还没有严格的科学依据来证明或者否定其意义。所以我们建议患者不要盲从，“杂食”很重要，只有荤素搭配，新鲜，易消化，才能保证均衡，有利于机体的康复。 患上肝癌，积极治疗是一方面，术前术后的科学护理也是重要的一部分。如果护理科学合理，患者康复的可能就快一些，如果护理不科学，患者康复的就可能慢一些，甚至情况变得更糟糕。因此患者家属要掌握护理的要点，进行科学合理的护理。
小鼠免疫
小鼠免疫 免疫是单抗制备过程中的重要环节之一。即用目的抗原免疫小鼠，抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B 淋巴细胞。 一、血清效价的影响因素 小鼠免疫效价的高低直接影响单抗的制备。单抗免疫程序不同，包括免疫用的动物，抗原的性质、抗原量、免疫途径、免疫间隔时间、是否应用佐剂均会影响免疫效果。 二、免疫材料 1．免疫用的动物 抗原与免疫动物种属差异越远越好，小鼠、大鼠、亚美尼亚仓鼠和兔中分离的淋巴细胞的杂交瘤技术已经很成熟。小鼠是极好的免疫接种对象，原因是：1）小鼠易操作；2）多个纯系株易得到且价格合理；3）有很多试剂可用以检测鼠源免疫球蛋白；4）小鼠对外来蛋白质能产生良好的免疫应答；5）小鼠淋巴细胞能够和多种鼠源骨髓瘤细胞系发生有效融合。 2．免疫原（抗原） 颗粒性抗原：颗粒性抗原免疫原性强，如肿瘤细胞、淋巴细胞、?细菌等可作为抗原，不加佐剂直接进行免疫，就可获得较好的免疫效果。 可溶性抗原：因其免疫原性较弱，一般要加佐剂，如系半抗原，?应先制备成人工免疫原，再加佐剂。 免疫原的形式会影响宿主体液免疫产生的抗体谱，因此选择免疫原制备抗体时应该考虑到所制备抗体的最终用途，并应该根据其用途决定何种方法筛选抗体
更合适。一般认为，影响免疫血清中lg亚类谱的因素主要包括免疫原、接种途径、佐剂和动物遗传背景等。且主要由初次基础免疫所决定，加强免疫的作用主要是提高特异性抗体的滴度。 3．佐剂 目的：1）增强抗原对机体的免疫原性；2）增强抗体的产生能力；3）为制备出高效价的免疫血清；4）增强可溶性抗原的免疫原性；5）在某种情况下，改变Ag免疫应答类型；6）延长抗原在免疫动物的时间；7）改变抗原的分布；8）增强共刺激信号和激活免疫系统而刺激淋巴细胞增殖。 种类：氢氧化铝佐剂、明矾佐剂（常用于肌肉、皮下注射）、弗氏佐剂。 弗氏佐剂是最主要的免疫佐剂，热处理杀死的分歧杆菌可以引起炎症反应，募集淋巴细胞到抗原沉积部位，但若重复刺激可导致肉芽肿的形成，故不能重复使用。 三、免疫策略 1．免疫途径 途径的选择取决于抗原的生物学特性和理化特性。有静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮内注射、脾内注射、皮下注射、淋巴结注射等。 脾内免疫会产生IgM 类抗体，分泌该类抗体的杂交瘤细胞株相对IgG 类较不稳定，且IgM 类抗体的一些性质测定会有困难，一般不建议使用。脾内免疫操作困难，实验动物极易死亡，所以也不常用此种方法。 一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1ml左右。 2．免疫方案 典型的免疫策略依赖于抗原的反复刺激，以增强特异性免疫应答并使其成熟。
2020原发性肝癌的免疫治疗方案
2020原发性肝癌的免疫治疗方案 导读 原发性肝癌是目前我国第4位常见恶性肿瘤及第2位肿瘤致死病因，严重威胁我国人民的生命和健康。原发性肝癌主要包括肝细胞癌（HCC）、肝内胆管癌（ICC）和HCC-ICC混合型3种不同病理学类型，其中HCC 占85%～90%。肝癌的治疗方式如肝切除术或肝移植术仅适用于早期患者，现有的全身治疗方案疗效也有限。 本文是美国学者发表在Hepatology（影响因子：14.679）上的一篇综述，总结了目前的一些免疫治疗方案，包括免疫检查点抑制剂联合靶向治疗、免疫检查点抑制剂联合治疗、免疫检查点抑制剂以外的免疫治疗以及疾病早期的免疫治疗。 1.CTLA-4靶向单抗 一项单组II期研究纳入21例晚期HCC、Child-Pugh A级或B级合并丙型肝炎患者，对抗CTLA-4抗体Tremelimumab进行评估。结果显示分别有45%和25%的患者出现3级AST和ALT升高。其中可评估疗效的17例患者的客观缓解率（ORR）为17%。全部21例患者的意向治疗分析显示，中位疾病进展时间（TTP）为6.48个月（95%CI 3.95-9.14），中位总生存期（OS）为8.2个月（95%CI 4.64-21.34）。
2.2.PD-1靶向单抗 目前，虽然PD-1单抗在I/II期研究中均出现ORR（14%~20%）和持久缓解，但将纳武利尤单克隆抗体（Nivolumab）作为一线治疗药物和将帕博利珠单克隆抗体（Pembrolizumab）作为二线治疗药物的III期研究均显示，患者的OS在统计学上无显著改善。开发生物标志物以改善患者的治疗选择，以及对联合治疗的研究，或许能激发出免疫检查点抑制剂治疗HCC的全部潜力。 3.PD-1单抗的生物标志物探索 在接受抗PD-1单抗治疗的晚期HCC患者中，几种潜在的生物标志物可能与ORR和OS改善相关。在CheckMate 040试验中，晚期HCC患者接受Nivolumab单抗治疗，结果显示，肿瘤细胞PD-L1表达增加的患者，ORR显著更高[完全缓解（CR）+部分缓解（PR）vs病情稳定（SD），p = 0.00009]。此外，CD3表达也与ORR显著相关（CR + PR vs. SD，p = 0.05）。在可评估的37例肿瘤患者子集中，部分炎症标志物如IFN-γmRNA和T细胞耗竭与抗PD-1治疗后ORR和OS改善显著相关。相反，Wnt/β-catenin的突变与接受抗PD-1治疗的HCC患者的不良预后相关。总之，这仍是一个需要积极研究的领域，多种生物标志物相组合可能有助于改善患者的治疗选择。 1.抗PD-1/PD-L1和抗VEGF轴靶向药物联合使用 临床前研究已证实联合阻断PD-1和VEGF轴具有协同抗肿瘤作用。美
肝癌患者术前血清AFP水平NLR与术后早期复发的相关性
四论著四 肝癌患者术前血清A F P 水平N L R 与术后早期复发的相关性 张庆辉一 梁艳华 作者简介:张庆辉,男,42岁, 汉族,硕士,副主任医师三主要研究成果:发表专业论文20余篇三研究方向:肝脏二胆道恶性肿瘤诊断与治疗三 ?摘要?目的一探讨肝癌患者术前血清甲胎蛋白水平二中性粒细胞与淋巴细胞比值与术后早期复发的相关性三方法一将行肝癌根治术的60例患者按术后24个月复发情况分为早期复发组 (36例)和非早期复发组(24例)三采用受试者工作特征曲线确定中性粒细胞与淋巴细胞比值预测肝癌患者术后早期复发的最佳临界值,并对肝癌术后早期复发的危险因素进行单因素分析及多因素L o g i s t i c 回归分析三结果一受试者工作特征曲线显示,中性粒细胞与淋巴细胞比值用于预测肝癌术后早期复发有统计学意义(P <0.05),曲线下面积是0.731,95%C I 为0.605 0.857,约登指数为0.445,中性粒细胞与淋巴细胞比值用于预测肿瘤复发的界值为2.645,灵敏度为0.528,特异度为0.917三单因素分析显示,有无血管侵犯二有无门脉癌栓二肿瘤数目二肿瘤直径二术前血清甲胎蛋白水平及中性粒细胞与淋巴细胞比值为肝癌患者早期复发的可疑因素(P <0.05或0.01)三多因素L o g i s t i c 回归分析显示,肿瘤直径?5c m 二术前血清甲胎蛋白水平?400n g 四m l -1 二中性粒细胞与淋巴细胞比值?2.65是肝癌早期复发的独立危险因素三结论一肿瘤直径二术前血清甲胎蛋白水平二中性粒细胞与淋巴细胞比值为肝癌术后早期复发的独立危险因素三 ?关键词?肝癌;手术;早期复发;甲胎蛋白;中性粒细胞与淋巴细胞比值d o i :10.3969/j .i s s n .1672-187X.2020.06.012?中图分类号?R735.7一? 文献标识码?A C o r r e l a t i o nb e t w e e n p r e o p e r a t i v e s e r u m A F Pl e v e l ,N L Ra n d e a r l yp o s t o p e r a t i v e r e c u r r e n c e i n p a t i e n t sw i t h l i v e r c a n c e r Z h a n g Q i n g h u i ,L i a n g Y a n h u a (X u c h a n g C e n t r a l H o s p i t a l A f f i l i a t e d t o H e n a n U n i v e r s i t y o f S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y ,X u c h a n g 461000,H e n a n ,C h i n a ) ?A b s t r a c t ?O b j e c t i v e 一T o e x p l o r e t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n p r e o p e r a t i v e s e r u m A F P l e v e l ,N L Ra n de a r l y p o s t o p e r a t i v e r e c u r r e n c e i n p a t i e n t sw i t h l i v e r c a n c e r .M e t h o d s 一60p a t i e n t sw h ou n d e r w e n t r a d i c a l h e p a -t e c t o m y w e r e s e l e c t e d a s t h e s t u d y s u b j e c t s .A c c o r d i n g t o t h e r e c u r r e n c ew i t h i n 24m o n t h s a f t e r o p e r a t i o n ,t h e y w e r e d i v i d e d i n t o e a r l y r e c u r r e n c e g r o u p (36c a s e s )a n dn o n -e a r l y r e c u r r e n c e g r o u p (24c a s e s ).R O C c u r v ew a s u s e d t o d e t e r m i n e t h e o p t i m a l t h r e s h o l d f o r p r e d i c t i n g e a r l y r e c u r r e n c e o f h e p a t o c e l l u l a r c a r c i n o -m a p a t i e n t s .T h e r i s k f a c t o r s o f e a r l y r e c u r r e n c e o f l i v e r c a n c e r a f t e r o p e r a t i o nw e r e a n a l y z e db y u n i v a r i a t e a n a l y s i s a n dm u l t i v a r i a t e l o g i s t i c r e g r e s s i o n a n a l y s i s .R e s u l t s 一T h e r e s u l t s o f R O Cc u r v e s h o w e d t h a tN L R u s e d t o p r e d i c t t h ee a r l y r e c u r r e n c eo f l i v e r c a n c e r a f t e r s u r g e r y h a ds t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t (P <0.05).T h e a r e a u n d e r t h eR O C c u r v ew a s 0.731,t h e 95%c o n f i d e n c e i n t e r v a l w a s 0.605t o 0.857,a n d t h eY o d e n i n d e xw a s 0.445.F r o mt h i s ,t h e c u t o f f v a l u e o fN L R f o r p r e d i c t i n g t u m o r r e c u r r e n c ew a s 2.645,t h e s e n -s i t i v i t y w a s 0.528,a n d t h e s p e c i f i c i t y w a s 0.917.U n i v a r i a t e a n a l y s i s s h o w e d t h a t t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f v a s c u l a r i n v a s i o n ,p o r t a l v e i nt u m o r t h r o m b u s ,t u m o rn u m b e r ,t u m o rd i a m e t e r ,p r e o p e r a t i v es e r u m A F P l e v e l a n dN L Rw e r e s u s p e c t e d f a c t o r s f o r e a r l y r e c u r r e n c e o f l i v e r c a n c e r p a t i e n t s (P <0.05o r 0.01).M u l t i v a r i a t e r e g r e s s i o na n a l y s i ss h o w e dt h a t t h et u m o rd i a m e t e r ?5c m ,p r e o p e r a t i v e A F P?400n g 四 m l -1 ,N L R?2.65w a s a n i n d e p e n d e n t r i s k f a c t o r f o r e a r l y r e c u r r e n c e o f l i v e r c a n c e r .C o n c l u s i o n s 一T u m o r d i a m e t e r ,p r e o p e r a t i v eA F P ,a n dN L R l e v e l s a r e i n d e p e n d e n t r i s k f a c t o r s f o r e a r l y r e c u r r e n c e o f l i v e r c a n c -e r a f t e r s u r g e r y .作者单位:461000 (河南四许昌)河南科技大学附属许昌市中心医院 ?A b s t r a c t ?l i v e r c a n c e r ;s u r g e r y ;e a r l y r e c u r r e n c e ;A F P ;N L R 8 4临床心身疾病杂志一2020年11月第26卷第6期一一JC l i nP s y c h o s o m D i s ,N o v .2020,V o l 26,N o .6
用环磷酰胺建立小鼠免疫抑制动物模型
1材料与方法 1. 1. 2 主要试剂环磷酰胺、RPMI 1640 培养 液( 含L-谷氨酰胺，)、Hanks 液( HyClone)、MTT 试剂、 PBS 缓冲溶液( pH 值7. 2 ～ 7. 4，HyClone)、丝裂霉素C、SA 缓冲液，绵羊红细胞，补体( 豚鼠血清)、都氏试剂、LDH 基质液、 P815 细胞( 购于协和医科大学基础医学细胞中心)、YAC-1 细 胞、FITC-Anti-CD3、PE-Anti-CD4、PerCP-Anti-CD8 荧光抗体)。 1. 2 动物与分组 Balb /C 小鼠90 只，雌性，6 ～ 8 周龄，体重18 ～ 22g。颗粒饲料，室温(22 ± 2)℃，湿度60% ～ 80% 。 动物在实验室条件下检疫1 周后，实验分为3 项处理进 行，(1) 处理一:测定动物体重、脾脏重量及系数;(2) 处理二: 测定NK 细胞活性，细胞毒性T 细胞活性;(3) 处理三:测定血 清半数溶血值。每项处理随机分为空白对照组、CTX-1 组和 CTX-2 组。 1. 3 实验方法和测定指标 1. 3. 1 剂量选择试验前经急性经口毒性试验确定CTX 的LD50为240mg / kg，以1 /4 LD50做为本试验中CTX-1 组的 CTX 剂量，即60 mg / kg 环磷酰胺，用蒸馏水配制，每日经口给予。CTX-2 组每日经口给予蒸馏水，试验结束前一天经腹腔 注射给予动物200 mg / kg 环磷酰胺［2，3］( 用蒸馏水配制)。另设空白对照组，蒸馏水代替受试物，每日经口给予。动物灌胃 容积为0. 3ml /10g，每周称量体重调整灌胃量，连续灌胃4 周 后测定各项免疫指标。 1. 3. 2 血液中T、B 淋巴细胞分类计数［4］动物处死前眼 眶内眦静脉取血，EDTA-K2抗凝，每只设定3 支流式试管进行 测定，每管加入50μl 抗凝血。分别在3 管中加入CD3 /CD19 ，CD3 /CD4 /CD8.不同荧光素标记的单克隆小鼠抗体。每管加 入2ml FACS 红细胞裂解液，室温下避光保存20min。1200r / min 离心5min，弃去上清液。每管再加入2ml PBS，1200r /min 离心5min，弃去上清液。加入0. 5ml PBS 混匀后上流式细胞仪进行检测。 1. 3. 3 细胞毒性T 淋巴细胞活性试验［5，6］ 1. 3. 3. 1 脾细胞悬液的制备( 效应细胞) 无菌取脾，用4 层 纱布将脾磨碎，制成单细胞悬液。用Hank＇s 液洗2 次，每次离 心10min(1000r /min)。弃上清将细胞浆弹起，加入0. 5ml 灭 菌水20s，裂解红细胞后再加入5ml Hank’s 液，混匀后1000r / min，10min 离心，用1ml 含10% 小牛血清的RPMI1640 完全培 养液重悬，调整细胞浓度为2 × 107 个/ml;加0. 5ml 此细胞悬 液于24 孔培养板，留一孔不加脾细胞作为对照孔。 1. 3. 3. 2 制备刺激细胞1000r /min，10min 离心处于对数生 长期的P815 细胞，用5ml DMEM 培养液悬浮P815 细胞于 15ml 离心管中，计数细胞。加入丝裂霉素C，相当于50μg / (2 ～ 5) × 107 个细胞。用锡纸包裹离心管以避光，在37℃水浴 30min。用Hank’s 液洗P815 细胞3 次，之后Hank’s 液悬浮
第十章 免疫应答
第十章免疫应答 Chapter 10Immune Response 第一部分教学内容和要求 一、目的要求 ·掌握：免疫应答的基本概念和分类，免疫应答的基本过程，T、B细胞活化的双信号要求，T细胞应答的主要效应机制，B细胞对TD抗原的识别，抗体产生的一般规律；熟悉：固有免疫应答的作用时相，内源性与外源性抗原加工提呈的基本过程，免疫应答调节的基本内容；了解：黏膜免疫应答，T、B细胞活化信号转导的基本过程。 二、教学内容 1．固有性免疫应答的概念、组成及特点，适应性免疫应答的类型、发生的部位及基 本过程。 2．抗原的加工与提呈：内源性及外源性抗原的加工提呈途径。 3．T细胞介导的免疫应答：T细胞对抗原的识别，T细胞的活化、增殖与分化，T细胞 应答的效应；NK T细胞和γδT细胞介导的免疫应答。 4．B细胞介导的免疫应答：B细胞对TD抗原和TI抗原的免疫应答，抗体产生的一般规律。 5．T、B细胞活化的信号转导：抗原识别信号的转导过程，第二信号的转导过程。 6．黏膜免疫应答：黏膜免疫感应部位与效应部位，分泌性IgA及其转运。 7．免疫应答的调节：抗原、抗体和补体成分的调节，抑制性受体及信号转导水平的调节，凋亡对免疫应答的负反馈调节，免疫细胞间的调节，独特型网络的调节，神经内分泌系统对免疫应答的调节。 第二部分测试题 一、选择题 （一）单项选择题（A型题） 1.参与免疫应答的细胞都带有 A.抗原受体 B.SmIg C.SRBC受体 D.丝裂原受体 E.MHC分子 2.Th细胞对B细胞的辅助作用不包括 A.使B细胞增殖 B.使B细胞分化成浆细胞 C.使记忆性B细胞形成 D.使Ig轻链V、J基因片段连接 E.使抗体产生类别转换 3.高亲和力IL-2受体存在于 A.活化的巨噬细胞表面 B.初始Tc细胞表面 C.静止的巨噬细胞表面 D.活化Th细胞表面 E.初始Th细胞表面 4.下列哪些分子组合可产生协同刺激信号 A. CD28—B7 B. MHC—Ag—TCR C. MHCⅡ—CD4 D. SmIg—Ag E. MHC I—CD8 5.下列哪种分子不具有免疫调节作用 A.C9 B.C3b C.IL-2 D.IgG E.IgA 6．CD4+T细胞活化增殖过程中、提供第一和第二信号的细胞 A．APC B．CD8+ T细胞C．巨噬细胞D．DC细胞E．NK细胞 7. B细胞活化的第二信号由哪种细胞提供表面的协同刺激分子 A. DC细胞 B. Th细胞 C..巨噬细胞 D. NK细胞 E.Tc 细胞 8.下列哪一病理过程与T细胞介导的免疫应答无关 A.移植排斥反应 B.胞内菌感染 C.接触性皮炎 D.血型不合的溶血反应 E.肺结核空洞的形成
第2章 免疫组织和器官
第二章免疫器官和组织 免疫系统（immune system）是机体执行免疫应答及免疫功能的一个重要系统。免疫系统由免疫器官和组织、免疫细胞（如造血干细胞、抗原提呈细胞、淋巴细胞、NK细胞、粒细胞、肥大细胞、红细胞等）及免疫分子（如免疫球蛋白、补体、各种细胞因子和膜分子等）组成。本章重点介绍免疫器官和组织的结构与功能，免疫细胞和免疫分子将在后续相关章节介绍。 免疫组织（immune tissue）又称为淋巴组织（lymphoid tissue）。淋巴组织在人体内分布广泛，其中胃肠道、呼吸道、泌尿生殖道等黏膜下含有大量非包膜化的弥散淋巴组织（diffuse lymphoid tissue）和淋巴小结（lymphoid nodule），在黏膜局部抗感染免疫中发挥主要作用。淋巴组织是胸腺、脾、淋巴结等包膜化淋巴器官（lymphoid organ）的主要组分。淋巴器官因具有免疫功能，又被称为免疫器官（immune organ）。 免疫器官按其发生和功能不同，可分为中枢免疫器官和外周免疫器官（图2-1），二者通过血液循环及淋巴循环互相联系。中枢免疫器官发生较早，由骨髓和胸腺组成，多能造血干细胞在中枢免疫器官发育为成熟免疫细胞，并通过血液循环输送至外周免疫器官。外周免疫器官发生相对较晚，由淋巴结、脾及黏膜相关淋巴组织等组成，成熟免疫细胞在这些部位定居，并在接受抗原刺激后产生免疫应答。 淋巴细胞和单核细胞经血液循环和淋巴循环进出外周免疫器官和组织，构成免疫系统的完整网络，既能及时动员免疫细胞，使之聚集于皮肤及内脏各处病原体等抗原存在部位，又能使这些部位的抗原经抗原提呈细胞摄取并携带至相应外周免疫器官或组织，进而活化T细胞或B细胞，从而发挥适应性免疫应答及效应作用。 第一节中枢免疫器官和组织 中枢免疫器官（central immune organ）或称初级淋巴器官（primary lymphoid organ），是免疫细胞发生、分化、发育和成熟的场所。人或其他哺乳类动物的中枢免疫器官包括骨髓和胸腺。鸟类的腔上囊（法氏囊）是B细胞分化发育的场所。 一、骨髓 骨髓（bone marrow）是各类血细胞和免疫细胞发生及成熟的场所，是机体重要的中枢免疫器官。 （一）骨髓的结构与造血微环境 骨髓位于骨髓腔中，分为红骨髓和黄骨髓。红骨髓具有活跃的造血功能，由造血组织和
小鼠免疫组织及免疫细胞的观察
小鼠免疫组织及免疫细胞的观察 【实验原理】 免疫器官、组织及细胞是机体免疫系统的重要组成部分。中枢免疫器官包括胸腺和骨髓，是T淋巴细胞及其他各类免疫细胞发生、发育和分化的场所，外周免疫器官包括脾胀、淋巴结和粘膜相关淋巴组织是免疫应答的场所。各类免疫细胞直接参与免疫系统对抗原类物质的免疫应答，完善的免疫器官组织结构和正常的免疫细胞种类和数量是机体免疫功能发挥正常的基本条件。 【试剂和器材】 小鼠、棉签、解剖台、平皿、大头针、手术剪子、手术镊子、载玻片、瑞士染液、细胞筛 【操作方法】 1.取一只小鼠，采用颈部脱臼法处死，将小鼠放到解剖台上，沿腹中线剪开皮肤且不破坏腹膜和胸膜，剪开腹膜，打开腹腔和胸腔，观察胸腺所在的位置和形状。 2.分离脾细胞：取出脾胀，去除其周围的脂肪组织，用剪子剪碎脾脏，放入细胞筛中，用载玻片清研脾胀，滴加生理盐水，使脾细胞分散成细胞悬液。 3.脾细胞染色观察：取少量细胞悬液置于载玻片上，与室温晾干，加瑞士染色液甲染色1min，甩掉染液，用瑞士染色液乙染色5min，用自来水冲洗，让染液漂走，置于光学显微镜下观察染色脾细胞。 【结果观察】 小鼠脾细胞瑞士染色镜下观察 【注意事项】 1.正确抓取小鼠，防止被鼠咬伤。 2.脾脏分离完整，清研轻柔。 3.染色时间不宜过长或过短。. 【讨论】 脾脏具有多种重要的生理功能, 参与并调节血液、免疫、内分泌系统的运转, 绝非可有可无;脾脏功能在疾病的不同阶段扮演不同的角色,有时甚至完全相反, 即具有双向性、时向性的特点。 1.脾切除术后暴发性感染全脾切除术后 OPSI 的发生率约为 1 %～
2.4 %。虽然 OPSI的发生率不是很高,但脾脏切除后,在由肺炎球菌导致的感染中毒性休克中, 50 %患者的病情迅速进展, 并最终导致死亡。脾脏为全身最大的淋巴器官, 血循环相当丰富, 且脾脏具有延缓微循环的作用, 有利于清除和吞噬多种抗原, 减轻机体感染的发生。同时脾脏拥有大量重要的免疫细胞及免疫因子, 如 T 细胞、B 细胞、K 细胞、单核巨噬细胞、自然杀伤细胞、杀伤细胞、淋巴因子活化杀伤细胞(LAK 细胞)、树突状细胞。免疫因子包括 tufstin 因子、备解素即P因子、纤维结合蛋白免疫核糖核酸环磷酸鸟苷内源性细胞毒因子、调理素和补体等。而脾切除后,脾脏所产生的免疫因子及免疫细胞消失,血浆中免疫球蛋白IgM、IgG下降,巨噬细胞活性下降,补体旁路活性下降及自身抗体活性增强, 使免疫系统失衡,导致机体易感性增加,甚发生OPSI 。 2.关于tufstin是主要由脾脏产生的促吞噬激素, N ajjar 于 1970 年首先发现。是IgG分子Fc段的一种四肽(T hrLy s -P ro -A rg), 通过激活中性粒细胞发挥吞噬功能。需要在白细胞激肽酶及内羧基肽酶的共同作用下释放。脾切除、镰状红细胞贫血、特发性血小板减少性紫癜、A IDS 及一些腹部疾病可使其水平下降, 脾移植后可使 tufstin 的水平升高。虽然已发现其在免疫系统中的重要作用, 但具体机制仍不十分明了。理论上讲上述情况 tufstin 活性减低的原因包括低γ球蛋白血症、脾脏内中性粒细胞释放减少、白细胞激肽酶活性改变及 tufstin 分子异常。 3.脾脏的抗肿瘤功能机体发生肿瘤的主要原因为免疫系统监控失调, 而脾脏作为人体免疫系统的重要组成部分, 无疑与肿瘤的发生密切相关。临床观察发现, 脾脏不仅自身很少发生原发恶性肿瘤且少有转移瘤出现, 这也表明脾脏具有抗肿瘤的作用。目前大家较公认的观点为脾脏在肿瘤免疫中具有双向性、时向性的特点。表现为在肿瘤早期脾脏具有抗肿瘤作用, 而在晚期则表现为免疫抑制, 促进肿瘤生长。其抗肿瘤作用主要表现在:①可增强巨噬细胞的吞噬功能。②可增强巨噬细胞溶解瘤细胞及其过氧化酶作用。③通过增强 NK 细胞活性发挥抗肿瘤作用。④Chu 认为, tufstin 的抗肿瘤机制不仅通过增加巨噬细胞的肿瘤趋向性、吞噬能力和分泌能力, 更重要的是增加巨噬细胞产生氧自由基—超氧阴离子的能力, 对杀伤肿瘤细胞具有重要意义。关于脾脏边缘带淋巴瘤的研究表明, 肿瘤的发生也与脾脏免疫功能的下降有关。
肝癌免疫治疗进展
【JAMA Oncology】肝癌免疫治疗药物汇总及展望 既往治疗捉襟见肘，免疫治疗迎来曙光 肝细胞癌（HCC）是发病率和死亡率均很高的恶性肿瘤，晚期HCC生存时间非常短，治疗手段极为有限。以索拉非尼（sorafenib）为代表的多激酶抑制剂（mTKI）打破了全身治疗的僵局，目前获批应用于临床的靶向药物还有乐伐替尼（lenvatinib）、瑞戈非尼（regorafenib）、卡博替尼（cabozantinib）和雷莫芦单抗（ramucirumab，VEGFR2单抗）。靶向治疗对于晚期HCC治疗具有里程碑式的意义，但其疗效仍有很大提升空间，以索拉非尼为例，推动其获批的Ⅲ期随机对照“SHARP”研究表明，索拉非尼对比安慰剂仅仅OS延长了2.8个月（10.7个月VS7.9个月）[1]。晚期HCC亟需更加有效更多样化的治疗选择。近几年来，针对程序性细胞死亡蛋受体（PD-1）和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）的免疫检查点抑制剂（ICB）在恶性肿瘤治疗领域获得快速发展，目前已有ICB获批HCC的二线以上治疗，更多的ICB药物正在进行热火朝天的研发或试验中。本文将汇总近年来用于HCC治疗的ICB和临床数据，以及能预测疗效的生物标志物的应用，并讨论针对已知的介导肿瘤免疫抑制的信号通路在HCC免疫治疗中的策略。 晚期HCC治疗ICB药物及临床数据汇总 目前已经被美国FDA批准可用于晚期HCC治疗的ICB的药物主要为帕博利珠单抗（pembrolizumab，PD-1单抗），那武尤利单抗（nivolumab，PD-1单抗），伊匹木单抗（ipilimumab，CTLA-4单抗）和阿替利珠单抗（atezolizumab，PDL-1单抗）。获批的方案和适应证主要为以下四个：1）
肝癌免疫治疗的研究现状及进展
肝癌免疫治疗的研究现状及进展 摘要】肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一。其发生与肿瘤的免疫逃逸密切相关。 随着免疫学和分子生物学的发展，免疫治疗已成为研究热点，并开始应用于临床，显示出广阔的应用前景。本文从主动免疫治疗和过继免疫治疗两个方面综述了肝 癌免疫治疗的现状和进展。 【关键词】肝癌免疫治疗 肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。目前治疗方法主要有手术切除、化疗栓塞、射频治疗、生物反应调节剂治疗等。放化疗最大的缺点是无特异性杀伤作用，副作用大，易对机体造成继发性损伤，即使是根治性手术也只能解决局部问题， 复发转移率高，预后差。研究表明，肿瘤的发生发展与机体免疫系统密切相关， 免疫逃逸是主要原因之一。如何打破免疫耐受，激活肿瘤的杀伤功能是肿瘤免疫 治疗的主要方向。目前，肝癌的免疫治疗有多种策略。 1 主动免疫 主动免疫是指利用肿瘤细胞的特异性抗原诱导机体产生特异性免疫，从而主 动杀伤肿瘤细胞。目前，肝癌的主动免疫包括树突状细胞疫苗、肿瘤细胞疫苗和 异种重组甲胎蛋白疫苗。 1.1树突状细胞疫苗 树突状细胞（DC）是体内功能最强的抗原提呈细胞。DC最重要的功能是激活静息T细胞。由于许多肿瘤患者缺乏功能性DC，不能刺激抗原特异性T细胞反应，因此在体外诱导功能性DC对于主动免疫治疗具有重要意义。目前，大多数实验 都是利用细胞因子或转录因子激活，或热休克蛋白和肿瘤细胞负载DC制备DC疫苗，然后将这些致敏DC疫苗回流体内，诱导机体产生有效的肿瘤免疫排斥反应。MAGE-1在肝癌中的表达率高达80%，提示MAGE-1可作为肝癌免疫治疗的靶点。吴鸣宇等MAGE-1肽负载DC体外诱导高特异性抗癌免疫应答。肿瘤睾丸抗原（Tumor testis antigen，CT）是20世纪90年代发现的一种肿瘤特异性抗原，除 睾丸外，在正常组织中不表达，但在多种肿瘤组织中高表达。肿瘤睾丸抗原NY-ESO-1是CT抗原中免疫原性最强的抗原。结果表明，NY-ESO-1在肝癌组织中的表达率较高（30%-40%）。张文敏等。用原核表达纯化的NY-ESO-1蛋白肽攻击DC，体外诱导特异性CTL对肝癌细胞的杀伤作用。结果表明，融合蛋白肽刺激DC可 有效刺激T细胞增殖，诱导CTL的产生。 1.2 甲胎蛋白(AFP)多肽疫苗 AFP不仅是肝癌诊断的标志物之一，而且是肝癌免疫治疗的潜在靶点。甲胎 蛋白多肽疫苗是一种刺激肝癌特异性免疫反应的疫苗。巴特菲尔德等人。报道10 例Ⅲ-Ⅳ期肝癌患者用甲胎蛋白肽休克DC疫苗治疗。6例AFP特异性T细胞增多，6例AFP特异性T细胞合成IFN-γ的比例增加。提示AFP靶向疫苗具有免疫活性。 1.3 肝癌肿瘤疫苗 肝癌疫苗是通过物理、化学和生物因素的处理，改变或消除自身或同种肝癌 细胞的致瘤性，保持免疫原性，输入体内，刺激机体产生特异性免疫应答。Yang 等人。结果表明，H22全细胞疫苗可诱导肝癌小鼠产生特异性免疫应答，明显延 长小鼠的存活时间。 2 过继免疫治疗 ATT是一种将具有抗瘤活性的免疫细胞诸如:LAK、TIL、CTL细胞、细 胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞),转移给肿瘤患者的被动免疫治疗方法.
肝癌患者手术前需要化疗吗
肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，平均患病年龄为44岁，根据统计，全世界每年新发肝癌患者约六十万，居恶性肿瘤的第五位。手术是治_疗肝癌常用的方法，通过切除病灶主体，减轻肿瘤负荷，控制病情发展，但手术也有一定的弊端，术后会伴随一定的复发转移几率，术后往往需要联合化疗等治_疗，不过现在也有很多患者被要求在手术前进行化疗，那术前化疗有什么用呢，肝癌患者手术前需要化疗吗？ 对于肝癌的治_疗，很多患者都希望能将肿块切除，控制病情发展，不过有很多患者在确诊时已是中晚期，此时手术难度大、风险也较高，若在术前进行化疗，可以减少组织中癌细胞的数量，缩小肿瘤体积，为手术创造条件，并提高手术的切除率。不过并非所有的患者都适合术前化疗，一般适用于无远处器官转移的中晚期患者，另外化疗也有一定的弊端，在杀死癌细胞时，也会损伤正常细胞，产生一系列的副作用，在治_疗前也要对患者的全身状况进行综合分析，对化疗敏感，身体状况较好的可以考虑，如果身体较差，对化疗不敏感，则应慎重考虑。 肝癌患者术前进行化疗虽然有助于提高手术的切除率，但手术的弊端还是不能忽视，术后仍会面临复发转移的情况，需要辅助其他方法进行综合治_疗。如果患者术前化疗_效果较好，术后仍然可以采用化疗，有助于抑杀术后残存的癌细胞，预防复发转移，但也要重视化疗副作用的缓解，建议患者辅助中医药的治_疗，有助于减轻化疗的副作用，缓解不适症状，增强化疗的敏感性，提高治_疗_效果，使治_疗顺利完成。对于不能或者不愿化疗的患者，可以考虑以中医为主进行巩固治_疗，有助于修复术后受损的机体，提高患者的免疫力和抵抗力，防治术后并发症和后遗症，还有助于抑制肿瘤细胞，稳定病情，降低术后复发转移几率，进一步延长患者生命。 目前，临床上常使用多种方法综合治_疗的手段来减轻对患者的伤害，提升治_疗_效果，其中中西医的综合治_疗备受人们关注，尤其是中医在综合治_疗中占据了重要的地位，郑州希福中医肿瘤医院院长袁希福也表示：“中医是治_疗癌症的重要手段之一，应当始终贯穿整个治_疗过程。”通过长期的研究与总结，袁希福指出肝癌的病机非常复杂，但主要病机可以简单地概括为三个字“虚、瘀、毒”。他强调:在治_疗中仅着眼于局部是不够的，要想达到治_疗目的，必须全面调理、重点用药，从而使人体达到自然状态下的阴阳平衡。就这样逐渐形成了他独特的中医抗癌三联平衡理论。 “三联平衡理论”的实质就是针对“虚”、“瘀”、“毒”三大病机，统筹兼顾，采取“扶元”、“通瘀”、“排毒”三大治_疗措施，有的放矢，重点用药，调节人体阴阳、气血、脏腑生理功能平衡，使人体达到自然状态下的康复。正如肿瘤患者用药，既不能过于攻伐，以免进一步加重元气损伤，又不能只为扶元固本，忽视对于其他病机的治_疗，只有三者兼顾，才能更有效地抗癌。多年来，众多肿瘤患者在该理论指导用药下减轻了痛苦，延长了生命，甚至一些患者实现了临床康复或长期带瘤生存。 部分参考案例： 案例1：白淑采，女，巨块型肝癌，河南省巩义市人 2000年10月18日，白淑采在河南省人民医院诊断为巨块型肝癌，医生看到诊断结果表示肿瘤太大，手术风险也很大。 白淑采万念俱灰，在老伴的多方打听下，得到了袁希福专治肿瘤的消息。10月20日，他们赶到郑州希福中医肿瘤医院寻求中医的治_疗，服药20副后，白淑采感到腹胀、肝区疼痛消失，能吃下饭了。看到疗_效后，他们继续服用中_药，慢慢的，白淑采恢复了精神，能继续劳动，肿块也变小了。 2013年12月，袁院长带领一行医护人员赶赴白淑采家中探望她，此时白淑采已经如同正常人一样生活劳动，一顿能吃两碗。袁院长亲自带她到巩义市人民医院复查并为其出资。根据检查发现，肝区肿块不仅缩小了很多，而且已经钙化，状况良好。截至2017年11月，