胰岛素制备

胰岛素制备 Prepared on 22 November 2020

生物技术制药参考资料

基因工程制备胰岛素

一、胰岛素的定义

胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。

二、目前临床使用的胰岛素来源

1、动物胰岛素：从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体。

2、半合成人胰岛素：将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素。

3、重组人胰岛素（现阶段临床最常使用的胰岛素）：利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同。

三、目前，国际上生产医用重组人胰岛素(recombi—nant human insulin，rhI)的方法

1、用基因工程大肠杆菌escherichia coli，E．CO一)分别发酵生产人胰岛素(human insulin，hi)的A、B链，然后经化学再氧化法，使两条链在一定条件下重新形成二硫键，得到hI。这一方法缺点较多，目前已较少使用；

2、用基因工程E．coli发酵生产人胰岛素原(hu—man peoinsulin，hPI)，后经加工形成hI。E．coli系统表达量高，但缺点是不利于表达hI这样的小蛋白，产物易降解，故常采用融和蛋白形式将hPI连接在一个较大的蛋白质后，表达产物需经过一系列复杂的后加工才能形成有活性的hi；

3、通过基因工程酵母菌发酵生产hPI，经后加工形成hI。酵母系统下游后加工比细菌表达系统简单，但缺点是生产慢，生产周期长，且重组蛋白分泌量少(1～50 mg／L)，产量低。因此，虽然rhI投放市场已久，但人们一直在努力寻求和探索更加有效的表达系统和高效的表达策略I2 J，尤其是对E．CO一尻表达系统的研究更是越来越深入，用E．coli系统表达hPI的策略也越来越多。另一方面，在胰岛素的基因工程生产中，下游处理非常复杂，复杂的下游处理极大地降低了胰岛素的最终收率。本研究围绕着提高重组目的蛋白表达量，简化下游处理过程等方面进行探索，建立了一套经过优化的高效完整的基因工程E．coli发酵表达(His)6一Arg—Arg一人胰岛素原[(His)6一Arg—Arg—human proinsulin，PPh —PI]，后加工成hI的制备工艺。

四、基因工程制备胰岛素

1、提取目的基因：既从人的DNA中提取胰岛素基因，可使用限制性内切酶将目的基因从原DNA中分离。主要有如下4种方法：

（1）鸟枪法：用一大堆限制性核酸内切酶对附近基因进行剪切，再提取所需要的。至于如何筛选，用DNA分子杂交，即DNA探针

（2）人工合成法：根据转录蛋白或者mRNA推导出基因序列，然后人工合成，没有内含子。

（3）从基因文库中提取：也就是事先已经提取完毕的拿来用

（4）PCR扩增技术：用于大量生产该段基因片段，用于商业化运作……

2、提取质粒：使用细胞工程,培养大肠杆菌，从大肠杆菌的细胞质中提取质粒，质粒

为环状。主要有如下2种方法：

（1）碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。

（2）煮沸法

3、基因重组：取出目的基因与质粒，先利用同种限制性内切酶将质粒切开，再使用DNA连接酶将目的基因与质粒“缝合”，形成一个能表达出胰岛素的DNA质粒。

4、将质粒送回大肠杆菌：再大肠杆菌的培养液中加入含有Ca+的物质，如CaCl2,这使细胞会吸收外源基因，此时将重组的质粒也放入培养液中，大肠杆菌便会将重组质粒吸收。

将大肠杆菌用氯化钙处理，以增大大肠杆菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒能够进入受体细胞，此时的细胞处于感受态（理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态）。

5、胰岛素的产生：再大肠杆菌内，质粒通过表达转录与翻译后，便产生出胰岛素蛋白质。通过大肠杆菌的大量繁衍，便可大量生产出胰岛素。（注意：大肠杆菌产出的是多肽链，因为原核生物没有内质网、高尔基体等，不能进行多肽的折叠、修饰等，还需人为进行菌体外加工。）

五、关于胰岛素制备的一些问题

人体是这么产生胰岛素的

第11对染色体短臂上胰岛素基因区DNA向mRNA转录，mRNA从细胞核移向细胞浆的内质网，转译成由105个氨基酸残基构成的前胰岛素原。前胰岛素原经过蛋白水解作用除其前肽，生成86个氨基酸组成的长肽链——胰岛素原（Proinsulin）。胰岛素原随细胞浆中的微泡进入高尔基体，连接上二硫键，经蛋白水解酶的作用，切去31、32、60三个精氨酸连接的链，断链生成没有作用的C肽，形成α链和β链的胰岛素，分泌到B细胞外，进入血液循环中。

大肠杆菌没有高尔基体等细胞器，基因工程如何利用大肠杆菌合成胰岛素

《微生物学教程》（周德庆）：1978年美国的2个实验室合作，通过基因工程使合成了人胰岛素。在实验室中将人胰岛素基因A、B链的人工合成基因分别组合到的不同质粒上，然后再移至菌体内，着种重组质粒在细胞内进行正常的复制和表达，从而使带有A、B链基因的工程菌株分别产生人胰岛素A、B链，然后再用人工的方法，在体外通过二硫键使这2条链连接成有活性的人胰岛素。

所以大肠杆菌产生的胰岛素，需要用人工的方法，在体外通过二硫键使这2条链连接成有活性的人胰岛素。

大肠杆菌是原核生物，细胞器只有线粒体，但它有相关的酶在细胞质内。和蓝藻进行光合作用一样，蓝藻也没有叶绿体，但它可以合成相关的酶。因此，只需要细胞质就可以了！

1、合成胰岛素需要高尔基体和线粒体是对人或真核生物而言

2、原核生物的生长和发育也需要蛋白质，从哪里来的呢当然是自身合成，

这说明原核生物合成蛋白质只需要线粒体和一些酶，当然还有能量

人体产生胰岛素首先是一个基因转录成一个mRNA，再翻译为一条肽链，这条肽链再加工，就形成了由二硫键连接的2条肽链。

通过基因工程在产生胰岛素是先分别形成A、B链的2个基因，转录形成2个mRNA，翻译成2条肽链，在外通过二硫键使这2条链连接成有活性的人胰岛素。

六、胰岛素的研究历史

胰岛素的发现是20 世纪生物医学界最为重大的成就之一。同时胰岛素的问世也引起了许多科学家的兴趣。他们对胰岛素的生产、生物合成、化学合成、结构、功能、作用机制等进行了一系列的研究并获得了多个里程碑式的成果。

动物胰岛素的生产起始于加拿大的ConnaughtLaboratories，大量生产主要在美国的礼来（EliLilly）公司。1923年末商品胰岛素已广泛应用于临床。我国动物胰岛素的生产起步也

不晚。解放前，上海的杨氏药厂已能生产结晶猪胰岛素。解放后，国内的生产厂家主要是上海生化药厂和徐州生化药厂。为了使胰岛素能就地取材，就地生产，最好不用减压蒸发去乙醇。为此，南京和上海分别试用了离子交换法和锌沉淀法。

1978年美国的2个实验室合作，通过基因工程使合成了人胰岛素。在实验室中将人胰岛素基因A、B链的人工合成基因分别组合到的不同质粒上，然后再移至菌体内，着种重组质粒在细胞内进行正常的复制和表达，从而使带有A、B链基因的工程菌株分别产生人胰岛素A、B链，然后再用人工的方法，在体外通过二硫键使这2条链连接成有活性的人胰岛素。

随着科学技术的发展，现在科学家已经改为用酵母菌、昆虫培养细胞、或哺乳动物培养细胞等真核细胞作为表达载体，而少用大肠杆菌。

重组DNA 技术的出现为利用微生物生产人胰岛素铺平了道路。1979 年，美国Genentech 公司的Goedell等报道了化学合成的人胰岛素基因在大肠杆菌中的表达。1982 年，美国礼来公司生产的重组人胰岛素Humulin上市。为改进重组人胰岛素的生产，丹麦的诺和诺德（Novo Nordisk）公司用酿酒酵母真核细胞表达一种胰岛素单链前体，在前体中B1 至B29通过甘- 甘- 赖三肽和A1 至A21 相连接。近年来，国产的重组人胰岛素相继问世。通化东宝公司于1998 年获准生产人胰岛素注射液，商品名甘舒霖。深圳科兴公司的苏泌啉和徐州万邦公司的万邦林也于2002 年和2003年获得生产批文。

虽然重组人胰岛素已在临床上广泛应用，但是由于胰岛素分子容易聚合，在浓度较高的胰岛素注射液中主要以二体和六体的形式存在。为了解决这个问题，通过蛋白质工程开发出的单体速效胰岛素也应运而生。首先，美国的礼来公司开发了单体胰岛素Humalog，其中B28 位的脯氨酸和B29位的赖氨酸互换。随后，丹麦的诺和诺德公司也开发了单体胰岛素Novorapid，其中B28 位的脯氨酸突变成天冬氨酸。1972 年，前苏联的生物化学杂志上报道了胰岛素用胃蛋白酶水解去除B26至B30的肽段后可以得到保留胰岛素活性的去五肽胰岛素。

由于胰岛素对治疗糖尿病的重要作用，关于胰岛素的品种、剂型、生产方法等的报道日新月异、层出不穷。

七、胰岛素的展望

胰岛素是由胰产生的一种蛋白。它在人体新陈代谢中起着重要作用，如果体内不足就会引发糖尿病，因此胰岛素是治疗糖尿病的特效药。这种病发病率很高，困扰着上千万人。过去从猪、牛胰中提取胰岛素，产量低，满足不了患者的需求。现在利用基因工程技术，有两种方法可以让微生物发酵产生胰岛素。一种是先在大肠杆菌中分别合成胰岛素A 链和B链，然后再在体外用化学方法将两条链连接成胰岛素。美国Eli lilly公司采用这种方法生产胰岛素。另一种是采用分泌型载体表达胰岛素原，然后再将其转化为胰岛素。丹麦Novo Nordisk公司就是采用重组酵母分泌产生胰岛素原，再用酶法转化为人胰岛素。

地特胰岛素

新一代长效胰岛素类似物——地特胰岛素 人胰岛素类似物的出现及不断更新,正是为了弥补人胰岛素的局限性,满足不同的治疗需求,如作用时间长,低血糖发生危险低,患者体重增加少。新一代长效胰岛素类似物——地特胰岛素不仅使胰岛素作用时间延长至24小时,而且显示出降低低血糖风险,减少体重增加的特性,成为了新一代安全、有效的基础胰岛素。本届EASD年会上,来自美国、德国、英国等多个国家的研究者发布了地特胰岛素的最新研究结果,阐释了其长效、安全降糖的特性,指出地特胰岛素与其他基础胰岛素相比,在有效降糖同时低血糖发生较少,并具有独特的减少体重增加的作用。 地特胰岛素每日一次有效降糖 地特胰岛素作为新一代的长效可溶性胰岛素类似物,是第一个采用化学修饰的方法获得的胰岛素类似物,即将人胰岛素B链上天然排列在第30位的苏氨酸去掉后,通过酰化反应,在第29位赖氨酸上结合1个14碳脂肪酸(肉豆蔻酸)。一方面,这个14碳脂肪酸侧链可使地特胰岛素在皮下注射后形成双六聚体而延缓吸收,同时还与皮下组织的白蛋白可逆性结合,进一步减缓入血速度。另一方面,地特胰岛素在进入外周血循环后,98%与白蛋白可逆性结合,靶器官分布也延缓。这些特点使地特胰岛素的作用时间长达24小时,只需每日使用1次即可有效降低血糖。地特胰岛素的降糖疗效已在多项研究中得到证实,结果显示,无论在药代动力学还是控制血糖的药效学方面,地特胰岛素均与甘精胰岛素相似。 PREDICTIVE研究是在1型或2型糖尿病患者中进行的地特胰岛素相关国际性大规模观察性研究。对于降糖疗效的观察结果显示,对于既往未接受过胰岛素治疗的患者,初始使用地特胰岛素治疗3个月后,糖化血红蛋白(HbA1c)水平显著降低1.3%(8.9%对7.6%);对于既往接受中性鱼精蛋白锌胰岛素(NPH胰岛素)或甘精胰岛素治疗者,换用地特胰岛素治疗3个月后,HbA1c水平也分别显著降低0.2%和0.6%。这提示了地特胰岛素良好的降糖作用。另外,美国学者在2型糖尿病患者中进行的一项研究显示,地特胰岛素和甘精胰岛素每日注射1次,24小时降糖效果相当,无论是在基础时段(12PM-6AM)还是全天,二者对血糖的控制基本无显著差异。 地特胰岛素个体内变异小,降低低血糖风险 在胰岛素治疗中,血糖波动尤其是低血糖的发生一直以来都被视为难以避免的副作用,成为糖尿病治疗中的一大隐患。在基础胰岛素中,地特胰岛素表现出了较好的降低低血糖风险的作用。 对地特胰岛素相关多项Ⅲ期临床试验结果进行汇总分析显示,无论对于1型还是2型糖尿病患者,与NPH胰岛素相比,地特胰岛素可使空腹血糖的波动显著降低,即空腹血糖标准差显著较低。而空腹血糖波动的减小可使夜间低血糖事件发生率降低。 地特胰岛素在降低低血糖风险方面不仅显著优于NPH胰岛素,也优于甘精胰岛素,这在PREDICTIVE研究中得到证实。该研究的一项亚组分析显示,无论是1型还是2型糖尿病患者,从NPH胰岛素或甘精胰岛素治疗转换为地特胰岛素治疗3个月后,其空腹血糖变异显著降低(分别降低0.4 mmol/L和0.3 mmol/L),夜间低血糖发生危险也显著降低(分别降低81%和75%)(图1)。

人胰岛素的制备

人胰岛素的制备

一、获得目的基因 从供体细胞中提取mRNA，以其为模板，在反转录酶的作用下，反转录合成胰岛素mRNA互补DNA，再以cDNA第一链为模板，在反转录酶或DNA聚合酶I的作用在，最终合成编码它的双链DNA序列。即得到了目的基因。 反转录-聚合酶链反应法 (一)从人体细胞内提取胰岛素基因转录的mRNA 1, 细胞总RNA的提取 : 取胰岛B细胞，用PBS洗后，加入TRIZOL试将细胞破裂，后用DEPC处理，多次离心后，取RNA白色沉淀，测OD值，电泳。 2 ，从总RNA中分离mRNA： 取上述提取的总RNA若干，加入Buffer OBB ，Oligotex Suspension ，打匀。 70℃水浴（裂解RNA的二级结构）， 20-30℃条件下，静置（让Oligotex 与mRNA结合）。将Oligotex/mRNA复合物的沉淀加到EP管SPIN柱上高速离心，加Buffer将其他RNA洗脱，最后用琼脂糖凝胶电泳纯化mRNA。 （二）mRNA转录合成cDNA第一链 cone 第一链的合成 加入上步获得的mRNA和适当引物于EP管中，加入RNase-free water，混匀后,70℃反应10分钟，反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min;稍微离心一下,顺序加入缓冲液、 RNA酶抑制剂、反转录酶、 dNTP（加入放射性同位素 利于检验），混匀，稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟。取出置于冰上。

电泳分析，同位素活性测定。 （三）PCR法扩增，特异合成目的cDNA链 通过胰岛素的特异引物，用PCR法进行扩增，特异的合成胰岛素的cDNA 链。 PCR法的操作步骤： 预变性 引物退火 引物延伸 循环25-35次 最后延伸 ?前端引物： ?5’-ggt tcc gga tct ggt tct ggt tct ctg gtc ccc cgc ggt agt cac cac cac cac cac cac cgt ttt gtg aac caa cac ctg tgc ggc-3’ ?后端引物： ?5’-agt gtc gac tta gtt gca gta gtt ctc cag ctg gta-3’ 二、组建重组质粒 采用pQE--30质粒作为载体，用双酶切法进行基因重组。 １.双酶切法 用两种酶限制性内切核酸酸消化载体DNA和外源DNA片段，使载体和外源目的基因的两端分别形成不同黏性末端，将它们混合，在连接酶的作用下相同的黏性末端可退火连接成重组DNA分子，从而实现DNA的定向连接。 ２.重组过程 pQE--30用Hind Ⅲ和BamHⅠ酶切，琼脂糖凝胶电泳分离、回收纯化酶切片段。外源DNA片段同样也用Hind Ⅲ和BamHⅠ酶切并回收纯化酶切片段。双酶切后的载体外源DNA片段混合退火，因为Hind Ⅲ和BamHⅠ的黏性末端不匹配，避免了载体和外源DNA片段的自身连接，外源DNA片段只能定向地连接到载体的Hind Ⅲ和BamHⅠ位点之间。当然也不可避免发生载体的Hind Ⅲ和BamHⅠ的黏性末端之间的两个碱基互补形成开环，转到大肠杆菌中被修复，但这样的重组子占少数，是低效转化。 三、构建基因工程菌 (一)重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建 A链和B链同时表达法 将人胰岛素的A链和B链编码序列拼接在一起，然后组装在大肠杆菌-半乳糖苷酶基因的下游。重组子表达出的融合蛋白经CNBr处理后，分离纯化A-B链多肽，然后再根据两条链连接处的氨基酸残基性质，采用相应的裂解方法获得A 链和B链肽段，最终通过体外化学折叠制备具有活性的重组人胰岛素。重组DNA 的转化 1, CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞：

地特胰岛素注射液说明书

地特胰岛素注射液说明书 以下内容仅供参考，请以药品包装盒中的说明书为准。 【药品名称】 通用名称：地特胰岛素注射液 【成份】 活性成份：地特胰岛素（通过基因重组技术,利用酵母生产的)。1 ml 溶液含有 1D0 单位（U），相当于 14.2 mg 的地特胰岛素。1 支含有 3 ml 溶液（相当于 300U 的地特胰岛素）。1 单位（U）地特胰岛素相当于 1 国际单位（IU）人胰岛素。 【适应症】 用于治疗糖尿病。 【规格】 3 ml：300 单位（笔芯） 【用法用量】 . 本品是可溶性的基础胰岛素类似物，其作用持续时间长达 24 小时。

. . 与其他胰岛素制剂相比，地特胰岛素用于基础-餐时治疔方案时不引起体重增加。 . . 与中性精蛋白锌胰岛素（NPH 胰岛素）相比较，本品引起夜间低血糖的风险较低，因而用于基础-餐时方案治疔时，可以进行更为积极的剂 M 调整以实现血糖达标。 . . 以空腹血糖作为评价指标，地特胰岛素较人 NPH 胰岛素可以更好地控制血糖。 . . 地特胰岛素可以作为基础胰岛素单独使用或者与餐时胰岛素联合使用。还可以与口服抗糖尿病药物联合使用。 . . 与口服抗糖尿病药物联合治疗时，推荐采用地特胰岛素毎日一次给药，起姶剂量为 10U 或 0.1-0.2U/kg。地特胰岛素

的剂量应根据患者的个体化需要进行调整。根据临床研究结果，可使用以下剂量调整指南。 . 成人 1 型和 2 型糖尿病患者的剂量调整指南： 【如何注射本品】 . 本品皮下注射。注射技巧请参照注射系统使用说明。 . . 在从皮下拔出针头之前，应始终按住注射推键。注射后针头应在皮下停留至少 6 秒。以确保胰岛素完全注射入体内。 . . 每次注射后必须卸下并丢开针头，否则药液可能会漏出，导致剂量不准确。 . 【不良反应】 安全性概况摘要 .

胰岛素制备

生物技术制药参考资料 基因工程制备胰岛素 一、胰岛素的定义 胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。 二、目前临床使用的胰岛素来源 1、动物胰岛素：从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体。 2、半合成人胰岛素：将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素。 3、重组人胰岛素（现阶段临床最常使用的胰岛素）：利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同。 三、目前，国际上生产医用重组人胰岛素(recombi—nant human insulin，rhI)的方法 1、用基因工程大肠杆菌escherichia coli，E．CO一)分别发酵生产人胰岛素(human insulin，hi)的A、B链，然后经化学再氧化法，使两条链在一定条件下重新形成二硫键，得到hI。这一方法缺点较多，目前已较少使用； 2、用基因工程E．coli发酵生产人胰岛素原(hu—man peoinsulin，hPI)，后经加工形成hI。E．coli系统表达量高，但缺点是不利于表达hI这样的小蛋白，产物易降解，故常采用融和蛋白形式将hPI连接在一个较大的蛋白质后，表达产物需经过一系列复杂的后加工才能形成有活性的hi； 3、通过基因工程酵母菌发酵生产hPI，经后加工形成hI。酵母系统下游后加工比细菌表达系统简单，但缺点是生产慢，生产周期长，且重组蛋白分泌量少(1～50 mg／L)，产量低。因此，虽然rhI投放市场已久，但人们一直在努力寻求和探索更加有效的表达系统和高效的表达策略I2 J，尤其是对E．CO一尻表达系统的研究更是越来越深入，用E．coli系统表达hPI的策略也越来越多。另一方面，在胰岛素的基因工程生产中，下游处理非常复杂，复杂的下游处理极大地降低了胰岛素的最终收率。本研究围绕着提高重组目的蛋白表达量，简化下游处理过程等方面进行探索，建立了一套经过优化的高效完整的基因工程E．coli发酵表达(His)6一Arg—Arg一人胰岛素原[(His)6一Arg—Arg—human proinsulin，PPh—PI]，后加工成hI的制备工艺。 四、基因工程制备胰岛素 1、提取目的基因：既从人的DNA中提取胰岛素基因，可使用限制性内切酶将目的基因从原DNA中分离。主要有如下4种方法： （1）鸟枪法：用一大堆限制性核酸内切酶对附近基因进行剪切，再提取所需要的。至于如何筛选，用DNA分子杂交，即DNA探针 （2）人工合成法：根据转录蛋白或者mRNA推导出基因序列，然后人工合成，没有内含子。 （3）从基因文库中提取：也就是事先已经提取完毕的拿来用 （4）PCR扩增技术：用于大量生产该段基因片段，用于商业化运作…… 2、提取质粒：使用细胞工程,培养大肠杆菌，从大肠杆菌的细胞质中提取质粒，质粒为 环状。主要有如下2种方法： （1）碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。 （2）煮沸法

(完整word版)人胰岛素的工业制备

人工胰岛素制备工艺的研究及其进展 摘要:据WHO 统计，全世界糖尿病患者已接近1.2亿，而我国目前糖尿病患者的总数已达到3000万人，跃居世界第二位，其中数百万患者长期使用胰岛素治疗。如今我国经济发展迅速，同时也带来了巨大生活的压力和健康问题，并且带有一定的遗传因素，数百万患者需要长期使用胰岛素治疗。胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。而目前临床使用的胰岛素有三种来源：1、动物胰岛素（从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体）。2、半合成胰岛素（将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素）。3、重组人工胰岛素（利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同）。可见第三种方法是目前最好的副作用最小，而且简单安全的方法。所以针对重组人工胰岛素的制备做了以下研究。 关键词:重组人工胰岛素；大肠杆菌；(His)6一Arg—Arg一人胰岛素原； 在当今世界范围内，诺和诺德、辉瑞、万安特以及我们国内的通化东宝、深圳科兴等生物技术公司在胰岛素的生产技术上已经都是很先进的水平了，也就是重组人工胰岛素的制备方法。 这种方法是自从动物中提取胰岛素和人工合成胰岛素的方法以来，最简便而且是最有效最安全的制备胰岛素的方法。它是发酵工程技术和基因工程技术结合的产物，也是造福人类的新一代药物生产方法。不仅在治疗糖尿病方面的作用突出，同时对治疗癌症等严重影响人类健康的疾病的治疗开创了思路。 所以，作为本科生的生物技术专业制药方向的大学生来说，这种利用基因工程，发酵工程等方法工业制备胰岛素的原理和流程的工艺，和这种开拓创新的思维是我们必须要了解和学习得。 1重组人工胰岛素的生产原理 通过基因工程酵母菌发酵生产hPI，经后加工形成hI。酵母系统下游后加工比细菌表达系统简单，但缺点是生产慢，生产周期长，且重组蛋白分泌量少(1～50 mg／L)，产量低。因此，虽然rhI投放市场已久，但人们一直在努力寻求和探索更加有效的表达系统和高效的表达策略I2 J，尤其是对E．CO一尻表达系统的研究更是越来越深入，用E．coli系统表达hPI的策略也越来越多。另一方面，在胰岛素的基因工程生产中，下游处理非常复杂，复杂的下游处理极大地降低了胰岛素的最终收率。本研究围绕着提高重组目的蛋白表达量，简化下游处理过程等方面进行探索，建立了一套经过优化的

胰岛素制备

生物技术制药参考资料 09级制药工程（1）班叶溢民090219011 基因工程制备胰岛素 一、胰岛素的定义 胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。 二、目前临床使用的胰岛素来源 1、动物胰岛素：从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体。 2、半合成人胰岛素：将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素。 3、重组人胰岛素（现阶段临床最常使用的胰岛素）：利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同。 三、目前，国际上生产医用重组人胰岛素(recombi—nant human insulin，rhI)的方法 1、用基因工程大肠杆菌escherichia coli，E．CO一)分别发酵生产人胰岛素(human insulin，hi)的A、B链，然后经化学再氧化法，使两条链在一定条件下重新形成二硫键，得到hI。这一方法缺点较多，目前已较少使用； 2、用基因工程E．coli发酵生产人胰岛素原(hu—man peoinsulin，hPI)，后经加工形成hI。E．coli系统表达量高，但缺点是不利于表达hI这样的小蛋白，产物易降解，故常采用融和蛋白形式将hPI连接在一个较大的蛋白质后，表达产物需经过一系列复杂的后加工才能形成有活性的hi； 3、通过基因工程酵母菌发酵生产hPI，经后加工形成hI。酵母系统下游后加工比细菌表达系统简单，但缺点是生产慢，生产周期长，且重组蛋白分泌量少(1～50 mg／L)，产量低。因此，虽然rhI投放市场已久，但人们一直在努力寻求和探索更加有效的表达系统和高效的表达策略I2 J，尤其是对E．CO一尻表达系统的研究更是越来越深入，用E．coli系统表达hPI的策略也越来越多。另一方面，在胰岛素的基因工程生产中，下游处理非常复杂，复杂的下游处理极大地降低了胰岛素的最终收率。本研究围绕着提高重组目的蛋白表达量，简化下游处理过程等方面进行探索，建立了一套经过优化的高效完整的基因工程E．coli发酵表达(His)6一Arg—Arg一人胰岛素原[(His)6一Arg—Arg—human proinsulin，PPh—PI]，后加工成hI的制备工艺。 四、基因工程制备胰岛素 1、提取目的基因：既从人的DNA中提取胰岛素基因，可使用限制性内切酶将目的基因从原DNA中分离。主要有如下4种方法： （1）鸟枪法：用一大堆限制性核酸内切酶对附近基因进行剪切，再提取所需要的。至于如何筛选，用DNA分子杂交，即DNA探针 （2）人工合成法：根据转录蛋白或者mRNA推导出基因序列，然后人工合成，没有内含子。 （3）从基因文库中提取：也就是事先已经提取完毕的拿来用 （4）PCR扩增技术：用于大量生产该段基因片段，用于商业化运作…… 2、提取质粒：使用细胞工程,培养大肠杆菌，从大肠杆菌的细胞质中提取质粒，质粒为 环状。主要有如下2种方法： （1）碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于

大肠杆菌生产制备重组人胰岛素实用工艺

1.提取目的基因: 既从人的DNA中提取胰岛素基因,可使用限制性内切酶将目的基因从原DNA中分离. 2.提取质粒: 使用细胞工程,培养大肠杆菌,从大肠杆菌的细胞质中提取质粒,质粒为环状DNA. 3.基因重组: 取出目的基因与质粒,先利用同种限制性内切酶将质粒切开,再使用DNA连接酶将目的基因与质粒"缝合",形成一个能表达出胰岛素的DNA质粒. 4.将质粒送回大肠杆菌: 再大肠杆菌的培养液中加入含有Ca+的物质,如CaCl2,这使细胞会吸收外源基因.此时将重组的质粒也放入培养液中,大肠杆菌便会将重组质粒吸收. 5.胰岛素的产生: 再大肠杆菌内,质粒通过表达转录与翻译后,便产生出胰岛素蛋白质.通过大肠杆菌的大量繁衍,便可大量生产出胰岛素! 〖学习要求〗知道DNA的粗提取与鉴定的原理；掌握并能分析DNA粗提取的技术方法和要求；学会DNA分子的鉴定方法 【预习指导】在课前时间通过阅读教材、同学交流和讨论，完成下列问题，并 初步巩固。 一、基础知识 【活动1】阅读教材P54“基础知识”，讨论并回答下列问题： 1．（记忆）提取生物大分子的基本思路是利用它们的理化性质的不同进行分离。2．（记忆）DNA的溶解性特点： DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精而蛋白质溶于酒精。【思考1】据图5－1分析： DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度有何特点？在0.14mol/L时溶解度最小；

要使DNA溶解，需要使用什么浓度？较高浓度，可使DNA溶解； 要使DNA析出，又需要使用什么浓度？0.14mol/L可使DNA析出。 【思考2】利用DNA不溶于酒精的原理，可以达到将DNA和蛋白质进一步分离目的。 3．（记忆）DNA的耐受性特点： 蛋白酶能分解蛋白质而不能分解DNA；在60～80℃时蛋白质变性沉淀而DNA 分子不变性。洗涤剂能与蛋白质结合瓦解细胞膜而不破坏DNA分子。 4．（记忆）DNA的鉴定原理 当鉴定提取出的物质是否是DNA时，需要使用二苯胺（甲基绿）进行鉴定。在沸水浴条件下，该试剂与DNA反应，呈现（浅）蓝色。 二、实验设计 【活动2】阅读教材P55“实验设计”，讨论并回答下列问题： 1．（记忆）实验材料的选取：选取材料时应本着DNA含量高、材料易得、便于提取的原则。 【思考3】你认为教材提供的材料中哺乳动物的血液不适合提取DNA。 2．（记忆）破碎细胞，获取含DNA的滤液：

人胰岛素的生产

简介 胰岛素(Insulin)是糖尿病，尤其是I型糖尿病的特效药物 ，可以促进血液中葡萄糖的利用而降低血糖，并调节糖、脂肪及蛋白质代谢。WHO 相关资料表明：糖尿病已成为继 心血管疾病、肿瘤之后的第 3 位主要疾病，严重威胁全人类健康，全球共有糖尿病患者 1.75亿人，中国糖尿病患 者9200 万人，已超越印度成为亚洲第一大国。2002 年到2012 年的十年间，全球胰岛素的销售额年复合增长率达14.5%；2010年全球胰岛素药物的销售额超过145亿美元，因此胰岛素药物的开发和生产具有重大的社会效益和经济 效益。 人胰岛素是利用基因重组技术生产出来的。是利用重组DNA 技术生产与天然胰岛素有相同的结构和功能。可调节糖代谢，促进肝脏、骨骼和脂肪组织对葡萄糖的摄取和利用，促进葡萄糖转变为糖原贮存于肌肉和肝脏内，并抑制糖原异生。 胰岛素由A、B两个肽链组成。人胰岛素(Insulin Human)A链有11种21个氨基酸，B链有15种30个氨基酸，共26种51个氨基酸组成。

主要成份 活性成份：人胰岛素 非活性成份：甘油、间–甲酚 其结构式： 分子式：C257H338N65O77S6 分子量：5807.69 生产企业 中国通化东宝、丹麦诺和诺德、美国礼来 目前，国际上生产医用重组人胰岛素的（recombinant human insulin,rhI）方法主要有三种： 1)用基因工程大肠杆菌(E.coli)分别发酵生产人胰岛素(human insulin，hI)的A、B链，然后经化学再氧化法，使两条链在一定条件下重新形成二硫键，得到hI。这一方法缺点较多，目前已较少使用； 2)用基因工程 E.coli发酵生产人胰岛素原(human pminsulin，hPI)，后经加工形成hI。E.coli系统表达量高，但缺点是不利于表达hI这样的小蛋白，产物易降解，故常采用融和蛋白形式将hPI连接在一个较大的蛋白质后，表达产物需经过一系列复杂的后加工才能形成有活性的hI；

比较地特胰岛素和甘精胰岛素分别联合门冬胰岛素治疗2型糖尿病的疗效

比较地特胰岛素和甘精胰岛素分别联合门冬胰岛素治疗2型糖尿病 的疗效 摘要目的对比地特胰岛素和甘精胰岛素分别联合门冬胰岛素治疗2型糖尿病的疗效。方法68例2型糖尿病患者随机分为两组，每组34例。对照组采用甘精胰岛素与门冬胰岛素联合治疗方案，观察组采用地特胰岛素与门冬胰岛素联合治疗方案，观察两组治疗效果。结果观察组空腹血糖指数、餐后2 h血糖指数及糖化血红蛋白（HbA1c）水平均明显低于对照组（P＜0.05）。观察组血糖达标率及低血糖率分别为88.2%和2.9%，明显优于对照组（P＜0.05）。两组胰岛素用量对比，差异无统计学意义（P>0.05）。结论在2型糖尿病临床治疗方案中，地特胰岛素与门冬胰岛素联合用药方案效果确切，可有效控制血糖波动，减少低血糖事件的发生，值得推广应用。 关键词2型糖尿病；门冬胰岛素；甘精胰岛素；地特胰岛素 Comparisons of curative effects between insulin detemir and insulin glargine in combination with insulin aspart in the treatment of type 2 diabetes mellitus DU Ling-chao. Ward Two of Internal Medicine，Dongguan City the Eighth People’s Hosptial/Dongguan City Children’s Hospital，Dongguan 523320，China 【Abstract】Objective To compare the curative effects between insulin detemir and insulin glargine in combination with insulin aspart in the treatment of type 2 diabetes mellitus. Methods A total of 68 of patients with type 2 diabetes mellitus were randomly divided into two groups，with 34 cases in each group. Control group received combined treatment by insulin glargine and insulin aspart，and observation group received combined treatment by insulin detemir and insulin aspart. Curative effects of the two groups were compared. Results The observation group had obviously lower levels of fasting blood glucose，2 hour postprandial blood glucose，and glycosylated hemoglobin （HbA1c）than the control group （P＜0.05）. The observation group had blood glucose standard rate and hypoglycemia rate as 88.2% and 2.9%，which were much lower than those in the control group （P＜0.05）. The difference of insulin dosage between the two groups had no statistical significance （P>0.05）. Conclusion Combination of insulin detemir and insulin aspart in treatment of type 2 diabetes mellitus can provide precise effect. This method can effectively control blood glucose and reduce incidence of hypoglycemia events，and it is worthy of promotion and application. 【Key words】Type 2 diabetes mellitus；Insulin aspart；Insulin glargine；Insulin detemir 糖尿病病理生理基礎为胰岛素抵抗以及分泌不足，通过给予胰岛素强化治疗则可有效改善患者胰岛细胞功能，缓解胰岛素抵抗[1]。基于此本文对比地特

大肠杆菌生产制备重组人胰岛素工艺

1.提取目的基因: 2.既从人的DNA中提取胰岛素基因,可使用限制性内切酶将目的基因从原DNA 中分离. 3.2.提取质粒: 4.使用细胞工程,培养大肠杆菌,从大肠杆菌的细胞质中提取质粒,质粒为环状DNA. 5.3.基因重组: 6.取出目的基因与质粒,先利用同种限制性内切酶将质粒切开,再使用DNA连接酶将目的基因与质粒"缝合",形成一个能表达出胰岛素的DNA质粒. 7.4.将质粒送回大肠杆菌: 8.再大肠杆菌的培养液中加入含有Ca+的物质,如CaCl2,这使细胞会吸收外源基因.此时将重组的质粒也放入培养液中,大肠杆菌便会将重组质粒吸收. 9.5.胰岛素的产生: 10.再大肠杆菌内,质粒通过表达转录与翻译后,便产生出胰岛素蛋白质.通过大肠杆菌的大量繁衍,便可大量生产出胰岛素! 〖学习要求〗知道DNA的粗提取与鉴定的原理；掌握并能分析DNA粗提取的技术方法和要求；学会DNA分子的鉴定方法 【预习指导】在课前时间通过阅读教材、同学交流和讨论，完成下列问题，并初步巩固。 一、基础知识 【活动1】阅读教材P54“基础知识”，讨论并回答下列问题： 1．（记忆）提取生物大分子的基本思路是利用它们的理化性质的不同进行分离。2．（记忆）DNA的溶解性特点： DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精而蛋白质溶于酒精。【思考1】据图5－1分析： DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度有何特点在L时溶解度最小；

要使DNA溶解，需要使用什么浓度较高浓度，可使DNA溶解； 要使DNA析出，又需要使用什么浓度L可使DNA析出。 【思考2】利用DNA不溶于酒精的原理，可以达到将DNA和蛋白质进一步分离目的。 3．（记忆）DNA的耐受性特点： 蛋白酶能分解蛋白质而不能分解DNA；在60～80℃时蛋白质变性沉淀而DNA 分子不变性。洗涤剂能与蛋白质结合瓦解细胞膜而不破坏DNA分子。 4．（记忆）DNA的鉴定原理 当鉴定提取出的物质是否是DNA时，需要使用二苯胺（甲基绿）进行鉴定。在沸水浴条件下，该试剂与DNA反应，呈现（浅）蓝色。 二、实验设计 【活动2】阅读教材P55“实验设计”，讨论并回答下列问题： 1．（记忆）实验材料的选取：选取材料时应本着DNA含量高、材料易得、便于提取的原则。 【思考3】你认为教材提供的材料中哺乳动物的血液不适合提取DNA。2．（记忆）破碎细胞，获取含DNA的滤液：

诺和灵R(生物合成人胰岛素注射液)

诺和灵R(生物合成人胰岛素注射液) 【药品名称】 商品名称：诺和灵R 通用名称：生物合成人胰岛素注射液 英文名称：Biosynthetic Human Insulin Injection 【成份】 中性胰岛素 【适应症】 本品具有降血糖作用,适用于治疗糖尿病。 【用法用量】 剂量因人而异,由医生根据患者的需要而定。用于糖尿病治疗的平均每日胰岛素需要量在每公斤体重0.5-1.0国际单位之间,有时会需要更多,因患者情况不同而有所不同。糖尿病患者良好的代谢控制可以延缓糖尿病晚期并发症的发生和发展。因此,建议患者达到最理想的代谢控制,包括血糖监测。老年患者治疗的主要目的是减轻症状和避免低血糖反应。本品可在大腿做皮下注射,如果方便的话,也可在腹壁,臀肌或三角肌区域做皮下注射。本品不可静脉给药。从腹壁皮下给药比从其它注射部位给药吸收更快。将皮肤捏起注射会减少误作肌肉注射的危险。注射后针头 【不良反应】 1.低血糖是胰岛素治疗经常发生的不良反应.低血糖的症状可以突然发生,包括冷汗、皮肤发冷苍白、神经紧张或震颤、焦虑、不同寻常的疲惫或衰弱、错乱、难以集中精力、瞌睡、过度饥饿、暂时的视觉改变、头痛、恶心和心悸.严重低血糖可能导致意识丧失及引起暂时的或永久的脑损伤或甚至死亡. 2.开始胰岛素治疗时可能出现水肿和屈光异常.这些症状通常是

暂时的.3.胰岛素治疗过程中可能出现局部过敏反应(注射部位红、肿和痒).这些反应通常是暂时的,在继续治疗的过程中会消失.4.全身性的过敏反应有可能偶有发生,这钟全身反应可能严重,可能引起全身性的皮疹、发痒、出汗、胃肠道不适、淋巴水肿、呼吸困难、心悸及血压降低.全身性过敏发应有可能危及生命.5.未在注射区域内轮换注射部位可导致注射部位的脂肪萎缩. 【禁忌】 低血糖；对生物合成人胰岛素注射液或本品任何成份过敏者禁用。 【注意事项】 胰岛素注射剂量不足或治疗中断,会引起高血糖和糖尿病酮症酸中毒,特别是在1型糖尿病患者中.通常在大约数小时到数天内,高血糖的首发症状逐渐发生.症状有口渴、尿频、恶心、呕吐、瞌睡、皮肤发红干燥、口干、食欲不振、呼吸有丙酮味.1型糖尿病血糖过高未经治疗最终会导致糖尿病酮症酸中毒,这是有生命危险的情况.伴随疾病,特别是感染和发热通常应增加患者对胰岛素剂的需要量.肝、肾损害应减少胰岛素的需要量.如果患者增加体力运动或通常的饮食有所改变,必须调整胰岛素剂量患者用不同品牌和类型的胰岛素必须在严格的医疗监控下进行.以下的变化均需调整剂量:药物浓度、品牌(生产商)、类型(短效、中效、长效等)、种类(动物、人胰岛素类似物)、和/或生产工艺(基因重组、动物来源的胰岛素).患者使用本品,需要调整常用胰岛素剂量.如果需要调整剂量,则应在首次给药时进行,或者在开始治疗数周或数月内进行.少数从动物胰岛素转用本品,并发生过低血糖反应的患者报告使用人胰岛素时发生低血糖的先兆症状与使用动物胰岛素时的不同,或较不明显.血糖控制有显著改善的患者,如:接受胰岛素强化治疗的患者,他们的低血糖反应的先兆症状会有所改变,应给予相应的建议.由于会有使某些泵导管产生沉淀的危险,所以本品不要用于胰岛素泵作持续皮下胰岛素输注治疗(CSII)对驾驶和操纵机械能力的影响低血糖会影响患者集中精力及其反应能力.

地特胰岛素-诺和诺平说明书

诺和平?注射液说明书 【药品名称】 通用名：地特胰岛素注射液 商品名：诺和平?（Levemir?） 英文名：Insulin Detemir Injection 汉语拼音：DiTeYiDaoSu ZhuSheYe 【成份】 活性成份：地特胰岛素 (通过基因重组技术，利用酵母生产的)。1ml溶液含有100单位（U），相当于14.2mg的地特胰岛素。1支含有3ml溶液（相当于300U 的地特胰岛素）。1单位（U）地特胰岛素相当于1国际单位（IU）人胰岛素。 化学名称：赖氨酸B29（Nε-十四酰）去（B30）人胰岛素 分子式：C267H402N64O76S6 分子量：5916.9 其他成分：甘露醇、苯酚、间甲酚、醋酸锌、二水合磷酸氢二钠、氯化钠、盐酸、氢氧化钠、注射用水。 【性状】 本品为无色澄明液体。 【适应症】 用于治疗糖尿病。 【规格】 3ml：300单位（笔芯） 【用法用量】 本品是可溶性的基础胰岛素类似物，其作用持续时间长达24小时。与其他胰岛素制剂相比，地特胰岛素用于基础-餐时治疗方案时不引起体重增加。 与中性精蛋白锌胰岛素（NPH胰岛素）相比较，本品引起夜间低血糖的风险较低，因而用于基础-餐时方案治疗是，可以进行更为积极的计量调整已实现血糖达标。 以空腹血糖作为评价指标，地特胰岛素较人NPH胰岛素可以更好地控制血糖。

与口服降糖药联合治疗时，推荐采用地特胰岛素每日一次给药，起始剂量为10U或0.1～0.2U/Kg。地特胰岛素的剂量应根据患者的个体化需要进行调整。根据临床研究结果，可使用一下剂量调整指南： 早餐前自测血糖（SMPG*）平均值地特胰岛素剂量调整 ＞10.0mmol/L（180mg/dl）+8U 9.1～10.0mmol/L（163～180mg/dl）+6U 8.1～9.0mmol/L（145～162mg/dl）+4U 7.1～8.0mmol/L（127～144mg/dl）+2U 6.1～ 7.0mmol/L（109～126mg/dl）+2U 4.1～6.0mmol/L 不调整剂量（血糖目标） 如果其中一次SMPG测定值在一下范围 3.1～ 4.0mmol/L（56～72mg/dl）-2U ＜3.1 mmol/L（＜56mg/dl）-4U 自测血糖浓度 当地特胰岛素作为基础-餐时胰岛素治疗方案的一部分时，应根据患者的需要，每日注射一次或两次。本品用量应进行个体化调整。 对于为达到最佳的血糖控制而每日注射两次的患者，晚间注射可在晚间或睡前进行。如果患者体力活动增加、日常饮食改变或者在伴发疾病期间，也可能需要调整剂量。 由其它胰岛素转用本品： 由中效或者长效胰岛素转用本品的患者，可能需要调整注射剂量和注射时间。 和所有胰岛素一样，在转换期间和在本品开始治疗的几周内，建议密切监测血糖水平。 本品和抗糖尿病药物同时使用时，可能需要调整同时使用的短效/速效胰岛素制剂或口服抗糖尿病药物的剂量和/或给药时间。

大肠杆菌生产制备重组人胰岛素工艺

1.提取目的基因: 既从人的DNA 中提取胰岛素基因,可使用限制性内切酶将目的基因从原DNA 中分离. 2.提取质粒: 使用细胞工程,培养大肠杆菌,从大肠杆菌的细胞质中提取质粒,质粒为环状DNA. 3.基因重组: 取出目的基因与质粒,先利用同种限制性内切酶将质粒切开,再使用DNA 连接酶将目的基因与质粒"缝合",形成一个能表达出胰岛素的DNA 质粒. 4.将质粒送回大肠杆菌: 再大肠杆菌的培养液中加入含有Ca+ 的物质,如CaCl2 ,这使细胞会吸收外源基因此时将重组的质粒也放入培养液中,大肠杆菌便会将重组质粒吸收. 5.胰岛素的产生: 再大肠杆菌内,质粒通过表达转录与翻译后,便产生出胰岛素蛋白质.通过大肠杆菌的大量繁衍,便可大量生产出胰岛素! 〖学习要求〗知道DNA的粗提取与鉴定的原理；掌握并能分析DNA粗提取的技术方法和要求；学会DNA分子的鉴定方法 【预习指导】在课前时间通过阅读教材、同学交流和讨论，完成下列问题，并初步巩固。

一、基础知识 活动1】阅读教材P54“基础知识”，讨论并回答下列问题： 1．（记忆）提取生物大分子的基本思路是利用它们的理化性质的不同进行分离。 2．（记忆）DNA的溶解性特点： DNA在不同浓度NaCl 溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精而蛋白质溶于酒精。 【思考1】据图5－1 分析： DNA在不同浓度NaCl 溶液中溶解度有何特点？在0.14mol/L 时溶解度最小； 要使DNA溶解，需要使用什么浓度？较高浓度，可使DNA溶解； 要使DNA析出，又需要使用什么浓度？0.14mol/L 可使DNA析出。【思考2】利用DNA不溶于酒精的原理，可以达到将DNA和蛋白质进一步分离目的。 3．（记忆）DNA的耐受性特点： 蛋白酶能分解蛋白质而不能分解DNA；在60～80℃时蛋白质变性沉淀而DNA 分子不变性。洗涤剂能与蛋白质结合瓦解细胞膜而不破坏DNA分子。

胰岛素制备

胰岛素制备 Prepared on 22 November 2020

生物技术制药参考资料 基因工程制备胰岛素 一、胰岛素的定义 胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。 二、目前临床使用的胰岛素来源 1、动物胰岛素：从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体。 2、半合成人胰岛素：将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素。 3、重组人胰岛素（现阶段临床最常使用的胰岛素）：利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同。 三、目前，国际上生产医用重组人胰岛素(recombi—nant human insulin，rhI)的方法 1、用基因工程大肠杆菌escherichia coli，E．CO一)分别发酵生产人胰岛素(human insulin，hi)的A、B链，然后经化学再氧化法，使两条链在一定条件下重新形成二硫键，得到hI。这一方法缺点较多，目前已较少使用； 2、用基因工程E．coli发酵生产人胰岛素原(hu—man peoinsulin，hPI)，后经加工形成hI。E．coli系统表达量高，但缺点是不利于表达hI这样的小蛋白，产物易降解，故常采用融和蛋白形式将hPI连接在一个较大的蛋白质后，表达产物需经过一系列复杂的后加工才能形成有活性的hi； 3、通过基因工程酵母菌发酵生产hPI，经后加工形成hI。酵母系统下游后加工比细菌表达系统简单，但缺点是生产慢，生产周期长，且重组蛋白分泌量少(1～50 mg／L)，产量低。因此，虽然rhI投放市场已久，但人们一直在努力寻求和探索更加有效的表达系统和高效的表达策略I2 J，尤其是对E．CO一尻表达系统的研究更是越来越深入，用E．coli系统表达hPI的策略也越来越多。另一方面，在胰岛素的基因工程生产中，下游处理非常复杂，复杂的下游处理极大地降低了胰岛素的最终收率。本研究围绕着提高重组目的蛋白表达量，简化下游处理过程等方面进行探索，建立了一套经过优化的高效完整的基因工程E．coli发酵表达(His)6一Arg—Arg一人胰岛素原[(His)6一Arg—Arg—human proinsulin，PPh —PI]，后加工成hI的制备工艺。 四、基因工程制备胰岛素 1、提取目的基因：既从人的DNA中提取胰岛素基因，可使用限制性内切酶将目的基因从原DNA中分离。主要有如下4种方法： （1）鸟枪法：用一大堆限制性核酸内切酶对附近基因进行剪切，再提取所需要的。至于如何筛选，用DNA分子杂交，即DNA探针 （2）人工合成法：根据转录蛋白或者mRNA推导出基因序列，然后人工合成，没有内含子。 （3）从基因文库中提取：也就是事先已经提取完毕的拿来用 （4）PCR扩增技术：用于大量生产该段基因片段，用于商业化运作…… 2、提取质粒：使用细胞工程,培养大肠杆菌，从大肠杆菌的细胞质中提取质粒，质粒 为环状。主要有如下2种方法： （1）碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。 （2）煮沸法

胰岛素的提取与制剂

胰岛素的提取与制剂 胰岛素的人工合成是科研领域内重大成就。在 class=GramE>生产中系用家畜（牛、羊、猪）或鱼类之新鲜胰脏以酸性乙醇破坏其胰酶后自胰岛中获得的胰腺内分泌物。lang=EN-US> 胰岛素的性质如下：胰岛素为白色或类白色无定形粉末，易溶于稀酸或稀碱水溶液中，也易溶于酸性（或碱性）稀醇（ lang=EN-US>80%以下）和稀丙酮水溶液中，在其他无水有机溶媒中均不溶。在酸性溶液中（如pH3．5）较稳定，在碱性溶液中极易 class=GramE>失活性，其他凡能改变蛋白质结构的因素如加热（800c以上）、强酸、强碱和蛋白酶等都可使胰岛素受到破坏。 胰岛索是一种分子量较小的蛋白质激素，其基本结构单位（单体）分子量近lang=EN-US>6000，其二聚体分子量为12，000，由四多 class=GramE>肽键链以六个二硫键相连结而成。其中含胱氨酸约占12%，胰岛素的生理效能与此种氨基酸中二硫键有着极密切的关系，任何一个二硫键断裂都能使胰岛素失去活力。 因胰岛素属于蛋白质，所以它具有一般蛋白质性质。近数十年来国内外生产胰岛素的方法主要有两种：一是"减压浓缩法"；另一种是"乙醚沉淀法"，即是将酸性乙醇提取class=GramE>液经过初步提纯后用大量乙醚将胰岛素沉淀下来，然后制成纤维状胰岛素再精制成结晶。由于以上两种方法均不甚理想。近年来又在探索新的制备方法，其中以"海藻酸吸附法"较为成熟，我国亦试制成功，但用于工业生产上，还须进一步改进。在实际生产中，中国目前仍用"减压浓缩法"，现将"减压浓缩法"生产胰岛 class=GramE>索介绍如下：提取粗制品： 将新鲜或冰冻猪胰（牛胰好）除去结缔组织等杂质，绞碎成冰胰浆。称重量置提取罐中，加入 lang=EN-US>1．5～2．0倍量的酸性酒精溶液，使PH为2 class=GramE>．5～3．0，醇含量为70%左右，在温度为13～150C搅拌提取3h,压滤，使浸液尽量滤出。残渣再用上法提取一次。 合并二次浸出液，放碱化罐中，在10～150C下加入氨水，使pH达8 class=GramE>．2～8，4，拌搅35/min立即压滤，于澄清的滤液中迅速加入24mol/L硫酸使pH调至 2 class=GramE>．5～3．0。在0℃左右放置过夜使酸性杂蛋白沉降，分取清液，真空浓缩（300C