Strep-tag Newsletter-蛋白亲和纯化
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Strep -tag? Protein Purification System
One of the most widely used affinity chromatography systems
Short tag not influencing the protein
h Rapid one-step purification under physiological conditions h Unsurpassed purity and bioactivity
h The Strep -tag? purification system is based on the highly selective and easily controllable interaction between the Strep -tag?II peptide and the biotin bind-ing site of a specially engineered streptavidin called Strep -Tactin?. Strep -tag?II binds Strep -Tactin? nearly 100 times tighter than streptavidin, but elutes under gentle, physiological conditions . Rapid, one-step affinity purification results in active fusion proteins of highest purity . Physiological buffers like PBS in com-bination with a wide range of detergents, chelators, salt, and redox conditions can be used (see https://www.wendangku.net/doc/d27620515.html,). The competitive elution with desthio-biotin, an inexpensive, reversibly binding and stable analog of biotin, enables unparalleled purification factors . The system is safe and easy to use; column regeneration and activity status are visualized by a color change on the purifi-cation column (see page 3).
Strep -tag?II and Strep -Tactin? – an advantageous combination
A particular benefit of Strep -tag?II is its neutral amino acid composition that does not hamper protein folding or secretion, nor does it interfere with protein function. Strep -tag? enables purification of recombinant proteins to over 99% purity in a single step from crude lysates. The extraordinary purification fac-tors are based on i) very low tendency of Strep -Tactin? to bind other proteins non-specifically, ii) highly specifc Strep -tag?II:Strep -Tactin? interaction and iii) specific competitive elution with minute amounts of desthiobiotin. Moreover, extreme stability of Strep -Tactin? is the basis of robust affinity resins.
High affinity One-STrEP-tag - the tag for demanding protein purifications
The development of a tandem arrangement of two Strep -tag?II sequences, the so-called One-STrEP-tag, even improved performance by increasing purifica-tion yields of poorly expressed proteins due to a higher affinity to Strep -Tactin?. It is especially suited for batch purification and isolation of protein complexes (see page 8). Furthermore, it sustains elevated detergent concentrations to re-
duce background.
Strep -tag? II NH 2-WSHPQFEK-COOH
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The Strep -tag? protein purification cycle
Purification procedure under physiological conditions
The purification of Strep -tag?II fusion proteins is easy, straightforward and user-friendly . The complete procedure can be performed under nearly physiological conditions, e.g. in PBS buffer and for elution in PBS/2.5 mM des-thiobiotin buffer:
Steps 1 + 2: The cell lysate is added to the column. Once the tagged protein has bound specifically to Strep -Tactin? the host proteins are washed away rapidly with small amounts of physiological wash buffer.
Step 3: Then, bound Strep -tag?II protein is gently eluted by adding wash buf-fer containing additionally 2.5 mM desthiobiotin which specifically competes for the biotin binding pocket.
Since the buffer conditions during elution essentially remain unchanged , po-tentially unspecifically binding proteins (without Strep -tag?) will not be eluted and, thus, will not contaminate the protein of interest. Next to the specific bind-ing of Strep -tag? to Strep -Tactin?, this is the second specificity conferring step of this purification procedure, yielding extremely high protein purity.
Steps 4 + 5: To regenerate the column the yellow azo dye HABA (2- [4’-hy-droxy-benzeneazo] benzoic acid) is added in excess to displace desthiobiotin from the binding pocket. Once HABA binds to the binding site, the color turns to red conveniently indicating the regeneration and activity status of the column.
Step 6: HABA can be removed simply by adding wash buffer. Once the red color has disappeared the column can be re-used. Strep -Tactin? resin can be regener-ated and re-used 3 to 5 times without loss in performance.
Purification of a GFP-Strep -tag?II fusion protein, which has been overexpressed in E. coli .
new or 1
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121084
E l u t e d p r o t e i n a m o u n t [m g ]
binding capacity
95755025
A v e r a g e p r o t e i n p u r i t y [%]
Strep -Tactin ? Super ow ? high capacity Ni-NTA Super ow ?
Now with Strep -Tactin? Superflow? high capacity resin!
Get more protein with optimal purity!
Strep -Tactin? columns regenerated with HABA (see also Strep -tag? purification cycle on page 3): Strep -Tactin? MacroPrep?, Superflow? and
Sepharose? (left to right). Since MacroPrep? is not as transparent as Sepharose? or Superflow?, the color shift to red is less visible.
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The double-tag protein purification process
Ni-NTA cartridge
Strep -Tactin?cartridge
Strep -Tactin?Ni-NTA
Possible variants in case of proteolysis Strep -tag?Protein of interest 6xHistidine -tag
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Protein:protein interaction
Isolating protein complexes at high purity
Both, Strep -tag? and One-STrEP-tag, are efficient tools to meet the challenge of isolating protein complexes at high purity without losing transient bind-ers. Owing to the complexity of this research area, no general solution can be provided. IBA`s four approaches described below provide, however, a compre-hensive basis for efficiently finding an optimal strategy for investigating a given protein complex. Request IBA Newsletter issue 7 for details.
In brief:
The One-STrEP system (one-step purification with One-STrEP-tag on Strep -Tac-tin?) is recommended for getting started. It needs one tag and one purification step only and is validated for eukaryotes and prokaryotes. Due to its excellent performance, this method yields a favorable signal-to-noise ratio in most cases. Mild elution and fast washing allow the isolation of even weekly interacting preys.
In case the One-STrEP system provides suboptimal data the “One-TAP ” system (One-tag Tandem Affinity Purification with One-STrEP-tag on Strep -Tactin? and Strep MAB-Classic ; the latter see page 6) extends the options of the One-STrEP system since it adds a second independent purification step yet with the same tag. Two different purification steps may better discriminate specific from non-specific binding but bear the risk of losing weakly interacting partners. Two different tags increase the risk of non-specific binding or interference with the native conformation of the bait necessary for an effective binding of as-sociated proteins. Although a successful approach has already been published (Gl?ckner et al., 2007, Proteomics 7, 4228-4234), we recommend the “Two-TAP ” system (Two-tag Tandem Affinity Purification with One-STrEP-tag on Strep -Tactin? and FLAG?-tag on M2 mAb ) only as an option in case of unsatisfying data with the One-STrEP or “One-TAP” approach and not as first choice starting point.
In addition to these non-covalent capture methods of potential preys, SPINE (Strep -Protein Interaction Experiment with Strep -tag?II) adds the possibility to covalently link the preys to its bait by formaldehyde cross-linking . This link-age is achieved in the living organism enabling a time resolved snapshot of interacting proteins. SPINE is currently validated in prokaryotes only but its ad-aptation to mammalian systems is under way.
Protein Immobilization
Via Strep MAB-Immo
Strep MAB-Immo antibody
To efficiently immobilize Strep -tag? proteins on solid phases
the Strep MAB-Immo antibody is the reagent of choice. Strep MAB-Immo is a mu-rine, high-affinity Strep -tag?II specific monoclonal antibody which is especially suited for stable, mild and oriented immobilization of Strep -tag?II fusion pro-teins. To realize this, the antibody can be coated on e.g. microplates or columns (see page 9), Biacore CM5 sensor chips or other biochips. The nearly irreversible binding* is achieved both for fusion proteins carrying a C- or N- terminal Strep -tag?. The Strep -tag? must be N-terminally extended by a SerAla linker (recombi-nant protein-SA-WSHPQFEK or SA-WSHPQFEK-recombinant protein).Cat. no. 2-1517-001
Note: The antibody is not recommended for detec-tion of Strep -tag?II fusion proteins in Western blots. Use IBA cat. no. 2-1509-001(page 7) for Western blots.
*KD Strep MAB-Immo:SerAla-Strep -tag?II ~1pM
Protein Immobilization on chips recombinant protein Strep -tag? II Strep MAB-Immo
See
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Strep MAB-Immo coated microplates
Antibody-based highly efficient immobilization of Strep -tag? proteins with high wash stability
Strep MAB-Immo coated microplates can be used for efficient, mild and oriented immobilization of SerAla-Strep -tag?II fusion proteins for ELISA or other assays for protein analysis. Also small amounts of such proteins are bound with high efficiency to the microplate (see graphic on the right) and will not elute during the assay due to nearly irreversible binding activity of Strep MAB-Immo. Features
Ready-to-use 96well plates for your own protein assay
? Efficient immobilization of minute amounts of SerAla-? Strep -tag?II fusion proteins saves your starting material
High wash stability during the assay (nearly no off-rate!)? High reproducibility ? Cat. no. 2-1521-001
Gravity flow Strep MAB-Immo MacroPrep? Column
Stable immobilization of proteins on columns
Strep MAB-Immo columns are designed for the stable and oriented immobiliza-tion of proteins. Analyzing e.g. the interaction of proteins the column can be a helpful tool, since the interactome can be immobilized via a Strep -tagged bait protein. The prey proteins may then be sequentially eluted from the bait using adequate buffers. The bait proteins are presumed to stay bound under a wide range of buffer conditions.
Cat. nos. 2-1536-001 (1 ml); 2-1536-505 (5 x 0.2 ml)
Note: Gravity flow Strep MAB-Immo MacroPrep Columns are not recommended for the purification of One-STrEP-tag or Strep -tag?II fusion proteins because elution is not possible under physiological condi-tions.
Via Strep -Tactin?
Strep -Tactin? coated microplates
Antibody-free option for immobilization of Strep -tag? proteins
The ready-to-use Strep -Tactin? coated microplates provide the power of our Strep -tag? system in a solid-phase, multi-well format for convenient assays and high-throughput screenings of biomolecules tagged with Strep -tag?II. The strips are supplied framed in sets of 12, resulting in a 96-well configuration compatible with standard multichannel pipettes and automated plate washers and plate readers. The biomolecules are presented to interacting partners in a uniform manner which results in reliable and reproducible assay formats.Features
Oriented binding of recombinant proteins with N-terminal, C-terminal or ? internal Strep -tag?II
Minimal non-specific binding
? Minimal coefficients of variation (cv; see right)
? Lower affinity than ? Strep MAB-Immo (above) and, therefore, especially suited for One-STrEP-tag or for multimeric Strep -tag?II fusion proteins Cost-effective ? Cat. no. 2-1501-001
Strep MAB-Immo based microplate assay showing efficient binding of minute amunts of SerAla- Strep -tag?II fusion protein (BAP) until saturation: BAP = bacterial alkaline phosphatase, C-terminally fused with Strep -tag?II via SerAla linker
Microplate consisting of twelve 8-well strips coated with Strep MAB-Immo (see above) or Strep -Tactin? (see below).
1 ml Gravity flow Strep MAB-Immo MacroPrep? column
Strep -Tactin? coated microplate is incubated with different amounts of recombinant E. coli alkaline phosphatase/Strep -tag?II fusion protein, washed and bound AP-activity is colorimetrically determined.
1.2
0.6
initial conc. 10 pmol/well cv = 1.56%
cv = 1.35%
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Large proteins
Oat phytochrome A,124 kDa
Reference:
Murphy J T & Lagarias J C,1997: Photochem. Photobiol.,65, 750-758. Purification and characterization of
recombinant affinity peptidetagged oat phytochrome A.
Membrane protein complex purification reduced to one step instead of five!
Multimeric membrane protein complexes
P . denitrificans cytochrome c oxidase
Reference:
Kleymann G, Ostermeier C,Ludwig B, Skerra A & Michel H, 1995: Bio/ Technology13, 155-160. Engineered Fv fragments as a tool for the onestep purification of integral multisubunit membrane protein complexes.
In contrast to other systems
Strep -tag? works excellently with metal ion containing proteins!
Metalloenzymes
E. coli alkaline phosphatase Reference:
Hengsakul M, Cass AEG,1997: J. Mol. Biol. 266:621-632.
Alkaline phosphatase-Strep-tag fusion protein binding to streptavidin: Resonant mirror studies.
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Ease the way from genes to proteins
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G e n e T A G n o l o g i e s
P r o t e i n T A G n o l o g i e s
W o r k o w r e c o m b i n a n t p r o t e i n p r o d u c t i o n
Synthetic DNA/RNA
Cloning, PCR
StarGate ?StarGate ?vectors
Oligonucleotide synthesis
Transfection MATra
Protein Expression
Cell Lysis StarGate ?StarGate ?
IBAlyse
Protein Puri cation
Strep -Tactin? resins & tags (Strep , His, GST, FLAG)
Protein Immobilization /
Assay
Protein expression &
puri cation
Contract manufacturing
(pre-/GMP)Protein Interaction One-STrEP-tag
Monoclonal antibody
production
Protein Detection
Strep MAB antibodies Strep -Tactin? conjugates
TAGnologies Products
Services
Strep -tag
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Immobilization plates Magnetic beads Spin columns
蛋白纯化的一般原则及方法选择
随着分子生物学的发展，越来越多的科研人员熟练掌握了分子生物学的各种试验技术，并研制成套试剂盒，使基因克隆表达变得越来越容易lIl。但分子生物学的上游工作往往并非是最终目的，分子克隆与表达的关键是要拿到纯的表达产物，以研究其生物学作用，或者大量生产出可用于疾病治疗的生物制品。相对与上游工作来说，分子克隆的下游工作显得更难，蛋白纯化工作非常复杂，除了要保证纯度外，蛋白产品还必须保持其生物学活性。纯化工艺必须能够每次都能产生相同数量和质量的蛋白，重复性良好。这就要求应用适应性非常强的方法而不是用能得到纯蛋白的最好方法去纯化蛋白。在实验室条件下的好方法却可能在大规模生产应用中失败，因为后者要求规模化，且在每日的应用中要有很好的重复性。本文综述了蛋白质纯化的基本原则和各种蛋白纯化技术的原理、优点及局限性，以期对蛋白纯化的方法选择及整体方案的制定提供一定的指导。 1 蛋白纯化的一般原则 蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开，由于此时样本体积大、成分杂，要求所用的树脂高容量、高流速，颗粒大、粒径分布宽．并可 以迅速将蛋白与污染物分开，防止目的蛋白被降解。精细纯化阶段则需要更高的分辨率，此阶段是要把目的蛋白与那些大小及理化性质接近的蛋白区分开来，要用更小的树脂颗粒以提高分辨常用的离子交换柱和疏水柱，应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。选择性指树脂与目的蛋白结合的特异性，柱效则是指蛋白的各成分逐个从树脂上集中洗脱的能力，洗脱峰越窄，柱效越好。仅有好的选择性，洗脱峰太宽，蛋白照样不能有效分离。 2.各种蛋白纯化方法及优缺点 2.1蛋白沉淀蛋白能溶于水是因为其表面有亲水性氨基酸。在蛋白质的等电点处若溶液的离子强度特别高或特别低，蛋白则倾向于从溶液中析出。硫酸铵是沉淀蛋白质最常用的盐，因为它在冷的缓冲液中溶解性好，冷的缓冲液有利于保护蛋白的活性。硫酸铵分馏常用做纯化的第一步，它可以初步粗提蛋白质，去除非蛋白成分。蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳定，可以短期在这种状态下保存中间产物，当前蛋白质纯化多采用这种办法进行粗分离翻。在规模化生产上硫酸铵沉淀方法仍存在一些问题，硫酸铵对不锈钢器具的腐蚀性很强。其他的盐如硫酸钠不存在这种问题，但其纯化效果不如硫酸铵。除了盐析外蛋白还可以用多聚物如PEG 和防冻剂沉淀出来，PEG是一种惰性物质，同硫酸铵一样对蛋白有稳定效果， 在缓慢搅拌下逐渐提高冷的蛋白溶液中的PEG浓度，蛋白沉淀可通过离心或过滤获得，蛋白可在这种状态下长期保存而不损坏。蛋白沉淀对蛋白纯化来说并不是多么好的方法，因为它只能达到几倍的纯化效果，而我们在达到目的前需要上千倍的纯化。其好处是可以把蛋白从混杂有蛋白酶和其他有害杂质的培养基及细胞裂解物中解脱出来。
A蛋白亲和层析法纯化单克隆抗体
摘要：世界首个单克隆抗体（monoclonal antibody，简称单抗）于1986 年，获得美国食品与药品监督管理局的上市批准，拉开了单抗药物发展的序幕，成为生物医药领域中最耀眼的明珠。单克隆抗体纯化过程中a蛋白（protein a）层析介质的选择尤为重要，可以影响抗体的纯度。本文主要阐述单抗纯化过程中a蛋白亲和层析的相关内容。 关键词：a蛋白；耐碱性；动态载量 全球医药行业走向趋势是精准医疗时代，单抗是其中较为成熟的领域，引领了生物制药产业发展最为重要的驱动力。单抗药物主要是由中国仓鼠卵巢细胞（chinese hamster ovary cell，简称 cho 细胞）表达产生，由 cho 细胞分泌的外源蛋白分子，通过纯化过程实现由细胞培养液中回收。随着单抗生产上游改造、培养参数的优化，其产量已达5-10g/l，同时也增加了下游蛋白回收中去除各种宿主杂质的负担。宿主蛋白残留的组成随着培养条件的改变显现出显著的变化，单抗药物杂质主要包括与产品相关的污染物和工艺相关的污染物。 根据终产品纯度、杂质含量的严格要求，单抗目前采用三步纯化策略：粗纯（样品捕获）、中度纯化和精细纯化，该策略工艺复杂、对操作要求严格，导致纯化成本一般占总生产成本的 50%-80%。用a蛋白亲和层析凝胶捕获抗体是大规模单抗纯化的首要步骤，一步纯化可使蛋白纯度达 95%以上。但a蛋白树脂价格昂贵，在大规模生产中，a蛋白纯化步骤的成本占整个抗体纯化成本的 35%以上。因此，蛋白 a 纯化效率的提高是进一步提高产品质量、降低生产成本的关键[1]。 1 a蛋白的性质金黄色葡萄球菌 a蛋白（staphylococal protein a，spa）是一种从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质。能特异性地与人或哺乳动物抗体（主要是igg）的fc区域结合。天然的a蛋白是十种氨基酸组成。由于不含有胱氨酸及半胱氨酸，所以无二硫键。紫外光谱和吸收系数为 a275nm %=1.65，等电点为ph5.1。spa十分稳定，用4mol/l尿素、硫氰盐酸、6mol/l的盐酸胍和ph2.5的酸性条件，以及加热煮沸均不影响其活性。分子量：全长的spa 54kd，去掉与细胞壁结合部分的spa 42kd。spa与igg结合的亚类主要是igg1、igg2和igg4。近几年来基因工程的spa出现，解决了天然a蛋白的耐碱性问题，mabselect sure是基因工程的spa，去掉了天然spa的dace 区域，对于b区域进行了修饰，将不耐受naoh的氨基酸去掉。使修饰后的spa可以耐受0.1-0.5m的naoh；这就很好的解决了层析介质cip的问题，同时修饰后的spa也耐受蛋白酶。减少在纯化过程中蛋白酶对spa的作用，使洗脱收集液中spa的脱落更低。 2 结合单抗的a蛋白层析介质的选择 在a蛋白捕获步骤中主要去除的杂质大部分是hcp和基因组dna；由于a蛋白层析介质对聚体没有去除作用，所以在此捕获步骤中应采取尽量减少聚体的形成策略，例如：提高洗脱ph，加入添加剂等；在此捕获步骤中会有a蛋白（配基）的脱落。在a蛋白捕获过程中，培养上清中的蛋白酶会降解层析介质的配基a蛋白，以及a蛋白与介质骨架的偶联方式，这些都是protein a的脱落原因，所以选择a蛋白脱落较低的层析介质是非常必要的[2]。 2.1 a蛋白层析介质相关指标 耐碱性：药物gmp生产最基本的要求是无菌、无热源。naoh 是最好的除菌、出热源的试剂。同时naoh也是公认的cip试剂，使用naoh 可以很好的除去残留在层析介质上的杂质，以确保工艺的稳定性以及层析介质的寿命；?郧?naoh的成本低。naoh是公认的cip试剂，实验表明，naoh的清洗效果高于其他试剂，适合琼脂糖基架的填料。而对照的可控玻璃基架（cpg）填料的清洗结果表明，盐酸胍比磷酸更为有效。cpg填料在高ph下不稳定，不适合用naoh 清洗。传统的a蛋白的清洗试剂，如：尿素，盐酸胍等的清洗试剂效果不理想，?郧以谂渲檬
重组蛋白和多肽的分离纯化
重组蛋白和多肽的分离纯化 1.概述 分离纯化组成了基因工程的下游处理（downstream processing）阶段，这一过程又和上游过程紧密相联系，上游过程的诸方面影响到下游的分离纯化，所以在进行目标蛋白质表达纯化时要统一考虑和整体设计，并充分考虑上游因素对下游的影响，如是否带有亲和标签，是否进行分泌表达。目前应用最广泛的表达系统有三大类，分别是大肠杆菌表达系统、酵母表达系统和CHO细胞表达系统，不同的表达系统和培养方法显著影响下游的处理过程，目标蛋白表达是否形成包涵体，目标蛋白表达的定位（胞内、细胞内膜、周质空间和胞外），蛋白表达的量都依赖于所选择的表达系统。选择将所表达的蛋白分泌到细胞外或周质空间可以避免破碎细胞的步骤，并且由于蛋白质种类少，目标蛋白容易纯化；而在细胞质内表达蛋白，可能是可溶性表达，可能形成包涵体，可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤，而包涵体易于分离，纯度较高，但回收具有生物活性的蛋白却变的相当困难，需要对聚集的蛋白进行变复性，通常活性蛋白的得率比较低，表1列出了不同策略对表达、纯化的影响，对于其中的有些缺点可以通过一定的方法进行克服和避免，如利用DNA重组技术给外源蛋白加上一个亲和纯化的标签，有助于可溶性外源蛋白的选择性纯化，并能保护目标蛋白不被降解（96）。 表 1 重组蛋白不同表达策略的优点和缺点 表达策略优点缺点 分泌表达至细胞外增强正确二硫键的形成 降低蛋白酶对表达蛋白的降解 可获得确定的N末端 显著减少杂蛋白水平，简化纯化 不需要细胞破碎表达水平低 多数蛋白不能进行分泌表达表达蛋白需要进行浓缩 细胞周质空间表达增强正确二硫键的形成 可获得确定的N末端 显著减少杂蛋白水平，简化纯化好些蛋白不能分泌进入周质空间 没有大规模选择性的释放周质空间蛋白的技术 周质蛋白酶可引起重组蛋白酶解 胞内包涵体表达包涵体易于分离 保护蛋白质不被降解 蛋白质不具有活性对宿主细胞生长 没有大的影响，通常可获得高的表 达水平需要体外的折叠和溶解，得率较低具有不确定N末端 胞内可溶性蛋白表达不需要体外溶解和折叠 一般具有正确的结构和功能高水平的表达常难以得到需要复杂的纯化 可发生蛋白质的酶解 具有不确定的N末端 在细胞的提取物中，除了目标蛋白外，还含有其它各种性质的蛋白、核酸、多糖等。在这样一个混合体系中，蛋白质纯化要求将目标蛋白与其它的成分分离，得到一定的量，达到一定的纯度，同时要尽可能保留蛋白的生物活性，并使蛋白保持完整。所以蛋白质的分离纯化可以看作是一系列的分部收集过程，总是希望目标蛋白富集于其中的一个收集部位，而大量的杂蛋白存在于其它的收集部位。当然对目标蛋白纯度的要求要根据纯化蛋白的用途而定，对于治疗性的蛋白要求有大于99%的纯度，并对处方有活性和稳定性的要求，对于某些酶的纯度则要求较低，需要在纯度和得率之间进行一个平衡，所以下游的工艺流程取决于最终对目标蛋白的要求。 蛋白质的功能依赖于蛋白质的结构，对于有生物活性的蛋白质，在分离纯化过程中必须根据目标蛋白的特点，采用合适的操作条件和方法，保证目标蛋白的活性尽量不损失。除了在分离纯化的初期，要采用快速的方法除去影响目标蛋白稳定性的杂质，还要严格控制涉及蛋白质变性的各种因素，来避免蛋白质失去活性。蛋白质的构象稳定性可以通过测定蛋白质变性反应时折叠（f）和去折叠（u）间自由能的变化（ΔG f→u）来衡量，ΔG f→u越大蛋白质就越稳定。根据报导蛋白质的ΔG f→u在5—20kcal/molX围之间，单个氢键可造成0.5—2kcal/mol自由能的变化，一个离子对可造成0.4—1.0kcal/mol自由能的变化，因此ΔG f→u相对比较小，这样天然状态仅仅比去折叠状态稳定一点，所以必须克服蛋
AKTA蛋白纯化系统操作
AKTA蛋白纯化系统操作 AKTA蛋白纯化系统是当前蛋白纯化工作经常用到的一组设备，自动化程度很高。AKTA系统依据不同的配置，可以分为AKTA EXPLORER、AKTA PILOT、AKTA PURIFIER等多种型号的设备。以下以AKTA EXPLORER为例简单介绍AKTA蛋白纯化系统的一般操作。 1、认识AKTA。 AKTA explorer 是为方法开拓及研究应用而设计的全自动液相色谱系统。该色谱系统的分离装置有三个主要组件，在底部平台的左侧整齐堆起（Fig 1）。它们是： FIG 1、AKTA EXPLORER主机 ? Pump-900 为双通道高效梯度泵系列。在AKTAexplorer 100，流速范围0.01-100 ml/min，压力高达10 Mpa（泵名为P-901）。在AKTA explore10，流速范围0.001-10 ml/min，压力高达25 Mpa（泵名为P-903）。 ? Monitor UV-900，同时监控190－700 nm 范围内高达3 个波长的多波长紫外-可见（UV-Vis）监测器。（针对部分AKTA PURIFIER机型，尚有UPC-900监测器可供选择，光源为汞灯光源，一次可以监控一个波长，安装滤光片后，可以在选择的波长范围内进行切换。）? Monitor pH/C-900，在线电导和pH 监测的组合监测器。 Fig 2、AKTA EXPLORER硬件模式图
AKTA EXPLORER系统的主要组成部件可以用模式图表示（Fig 2）。组成部件，如混合器、柱及不同的阀安装在右边部分。打开装阀的门可全部看到。柱被挂在装阀的门的外侧。 分离装置由UNICORN 软件控制。软件安装于一独立的电脑主机之中，在电脑与色谱系统之间的通信由数据采集装置CU950进行控制。 2、一般操作 2.1 开机 按位于底部平台前左侧的ON/OFF 按钮，打开色谱系统，然后打开电脑电源。待仪器自检完毕（CU950上面的3个指示灯完全点亮并不闪烁）。双击桌面上UNICORN图标，进入操作界面。UNICORN的操作界面分为四个窗口（Fig 3） Fig 3、Unicorn的操作界面 2.2准备工作溶液和样品 所有的工作溶液和样品必须经过0.45μm的滤膜过滤，样品也可高速离心后取上清备用。当缓冲液中含有有机溶剂（如乙腈、甲醇），需在使用前用低频超声脱气10min。 2.3清洗及管道准备 首先将A泵的进液管道（A1）放入缓冲液或平衡液中，将B泵的进液管道(B1)放入高盐溶液中，在system control窗口点击工具栏内的manual，选择pump→pump wash explorer，选中A1,B1管道为ON，execute。泵清洗将自动结束。(Fig 4) Fig 4、AKTA Explorer的泵清洗操作 2.4安装层析柱
蛋白质纯化的方法选择
蛋白质纯化的方法选择 随着分子生物学的发展，越来越多的科研人员熟练掌握了分子生物学的各种试验技术，并研制成套试剂盒，使基因克隆表达变得越来越容易。但分子生物学的上游工作往往并非是最终目的，分子克隆与表达的关键是要拿到纯的表达产物，以研究其生物学作用，或者大量生产出可用于疾病治疗的生物制品。相对与上游工作来说，分子克隆的下游工作显得更难，蛋白纯化工作非常复杂，除了要保证纯度外，蛋白产品还必须保持其生物学活性。纯化工艺必须能够每次都能产生相同数量和质量的蛋白，重复性良好。这就要求应用适应性非常强的方法而不是用能得到纯蛋白的最好方法去纯化蛋白。在实验室条件下的好方法却可能在大规模生产应用中失败，因为后者要求规模化，且在每日的应用中要有很好的重复性。本文综述了蛋白质纯化的基本原则和各种蛋白纯化技术的原理、优点及局限性，以期对蛋白纯化的方法选择及整体方案的制定提供一定的指导。 1、蛋白纯化的一般原则 蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开，由于此时样本体积大、成分杂，要求所用的树脂高容量、高流速，颗粒大、粒径分布宽．并可以迅速将蛋白与污染物分开，防止目的蛋白被降解。精细纯化阶段则需要更高的分辨率，此阶段是要把目的蛋白与那些大小及理化性质接近的蛋白区分开来，要用更小的树脂颗粒以提高分辨率，常用离子交换柱和疏水柱，应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。选择性树脂与目的蛋白结合的特异性，柱效则是指各蛋白成分逐个从树脂上集中洗脱的能力，洗脱峰越窄，柱效越好。仅有好的选择性，洗脱峰太宽，蛋白照样不能有效分离。 2、各种蛋白纯化方法及其优、缺点 2．1 蛋白沉淀蛋白能溶于水是因为其表面有亲水性氨基酸，在蛋白质的等电点处若溶液的离子强度特别高或者特别低，蛋白则倾向于从溶液中析出。硫酸铵是沉淀蛋白最常用的盐，因为它在冷的缓冲液中溶解性好，冷的缓冲液有利于保持目的蛋白的活性。硫酸铵分馏常用作试验室蛋白纯化的第一步，它可以初步粗提蛋白质，去除非蛋白成分。蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳定，可以短期在这种状态下保存中间产物，当前蛋白质纯化多采用这种办法进行粗分离翻。在规模化生产上硫酸铵沉淀方法仍存在一些问题，硫酸铵对不锈钢器具的腐蚀性很强。其他的盐如硫酸钠不存在这种问题，但其纯化效果不如硫酸铵。除了盐析外蛋白还可以用多聚物如PEG和防冻剂沉淀出来，PEG是一种惰性物质，同硫酸铵一样对蛋白有稳定效果，在缓慢搅拌下逐渐提高冷的蛋白溶液中的PEG浓度，蛋白沉淀可通过离心或过滤获得，蛋白可在这种状态下长期保存而不损坏。蛋白沉淀对蛋白纯化来说并不是多么好的方法，因为它只能达到几倍的纯化效果，而我们在达到目的前需要上千倍的纯化。其好处是可以把蛋白从混杂有蛋白酶和其他有害杂质的培养基及细胞裂解物中解脱出来。 2．2 缓冲液的更换虽然更换缓冲液不能提高蛋白纯度，但它却在蛋白纯化方案中起着极其重要的作用。不同的蛋白纯化方法需要不同pH及不同离子强度的缓冲液。假如你用硫酸铵将蛋白沉淀出来，毫无疑问蛋白是处在高盐环境中，需要想办法脱盐，可用的方法有利用半透膜透析，通过勤换透析液体去除盐分，此法尚可，但需几个小时，通常要过夜，也难以用于大规模纯化中。新型的设备将透析膜夹在两个板中间，板的一侧加缓冲液，另一侧加需脱盐的蛋白溶液，并在蛋白溶液一侧通过泵加压，可以使两侧溶液在数小时内达到平衡，若增加对蛋白溶液的压力，还可迫使水分和盐更多通过透析膜进入透析液达到对蛋白浓缩的目的。也有出售的脱盐柱，柱内的填料是小孔径的颗粒，蛋白分子不能进入孔内，先于高浓度盐离子从柱中流出，从而使二者分离。蛋白纯化的每一步都会造成目的蛋白的丢失，缓冲液平衡的步骤尤甚。蛋白会结合在任何它能接触的表面上，剪切力、起泡沫和离子强度的快速变化很容易让蛋白失活。 2．3 离子交换色谱这是在所有的蛋白纯化与浓缩方法中最有效方法。基于蛋白与离子交换树脂间的相互电荷作用，通过选择不同的缓冲液，同一种蛋白既可以和阴离子交换树脂（能结合带负电荷的分子）结合，也可以和阳离子交换树脂结合。树脂所用的带电基团有四种：二乙基氨基乙基用于弱的阴离子交换树脂；羧甲基用于弱的阳离子交换树脂；季铵用于强阴离子交换树脂；甲基磺酸酯用于强阳离子交换树脂。蛋白质由氨基酸组成，氨基酸在不同的pH环境中所带总电荷不同。大多数蛋白在生理pH（pH6～8）下带负电荷，需用阴离子交换柱纯化，极端的pH下蛋白会变性失活．应尽量避免。由于在某个特定的pH下不同的蛋白所带电荷数不同，与树脂的结合力也不同，随着缓冲液中盐浓度的增加或pH的变化，蛋白按结合力的强弱被依次洗脱。在工业化生产中更多地是改变盐浓度而不是去改变pH值，因为前者更容易控制。在实验室中几乎总是用盐浓度梯度去洗脱离子交换柱，利用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升，当离子强度能够中和蛋白的电荷时，蛋白就被从柱上洗脱下来。但在工业生产中盐浓度很难精确控制，所以常用分步洗脱而不足连续升高的盐梯度。与排阻层析相比，离子交换特异性更好，有更多的参数可以调整以获得最优的纯化效果，树脂也比较便宜。值得一提的是，即便是用最精确控制的条件，仅用离子交换单一的方法也得不到纯的蛋白，还需要其他的纯化步骤。
蛋白纯化离子交换层析法
蛋白纯化离子交换层析 研究生的生活，单调的科研，重复的脚印，匆匆的轨迹，踩着早上的时光一如往常的走进实验室，摊开实验记录本，写上日期，就像每天写日记一样开始计划今天的实验日记，用笔似乎要绘制一副有关实验的画面。 如果你处在这样的科研氛围里，慢慢的就会体味到科学本身就像窗外的大自然一样的美，绿色撩人，诗意陶醉…… 今天，我们写下的实验日记——蛋白纯化离子交换层析法，文章详细的总结了离子交换层析的定义、离子交换层析的原理、离子交换剂的种类，似乎要提醒一下脑子要保持清醒了，不然，看完之后，你能分清楚阴阳离子交换剂的概念，熟知它们的区别么？ ————你会创造规律科研生活的美 我，生在春天里，刚发芽的地方是实验室 知了也睡了，而我刷夜实验室 因为我在等待秋天收获的季节 虽然有可能错过成功的喜悦，却收获心灵上的成长
离子交换层析技术是以离子交换剂为固定相，常见的离子交换剂是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质，通过共价键结合某种电荷基团，形成带电基质，带异性电荷的平衡离子能够通过静电力作用结合在电荷基质上，而平衡离子能够与样品流动相中的离子基团发生可逆交换而吸附在交换剂上，不同带电荷蛋白间结合吸附固定相的能力不同。离子交换技术就是根据蛋白质样品间带电性质的差别而进行分离的一种层析方法。 常见的离子交换剂有离子交换纤维素、离子交换树脂和离子交换葡聚糖凝胶。根据与高分子聚合物基质共价结合的电荷基团的性质不同，可以将离子交换剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂，在阳离子交换剂中，带正电荷的平衡离子能够和流动相中带正电荷的离子基团进行交换。例如DEAE纤维素阳离子交换剂，当纤维素交换剂分子上结合阳离子基团二乙氨乙基（DEAE）时，形成阳离子纤维素—O—C6 H14N+H，可与带负电荷的蛋白质进行结合，交换阴离子。 根据与高分子聚合物基质共价结合的电荷基团的解离度不同，又可以分为强酸型、中等酸型、弱酸型三类阳离子交换剂，强酸型离子交换剂在较大的pH范围内电荷基团完全解离，而弱酸型只能在较小的pH范围内完全解离，如结合羧甲基的离子交换剂在pH小于6时就失去了交换能力。 强酸型阳离子交换剂一般结合的基团有：磺酸甲基、磺酸乙基；中等酸型阳离子交换剂有：磷酸基团和亚磷酸基团；弱酸型离子交换剂有：酚羟基和羧基类； 在阴离子交换剂中，带负电荷的平衡离子能与流动相中带负电的离子基团进行交换，例如阴离子交换剂CM纤维素，当纤维素交换剂分子上结合羧甲基（CM）时，形成带有负电荷的阴离子（纤维素－O－CH2－COO一），可与带正电荷蛋白质结合，交换阳离子。 根据与高分子聚合物基质共价结合的电荷基团的解离度不同，可分为强碱型、中等碱型、弱碱型阴离子交换剂。一般结合季胺基团基质的交换剂为强碱型离子交换剂，结合叔胺、仲胺、伯胺等为中等或者弱碱型离子交换剂。 蛋白质是两性电解质，当溶液的pH值与蛋白质等电点相同时，蛋白质的静
重组蛋白纯化基本策略
捕获阶段：目标是澄清、浓缩和稳定目标蛋白。中度纯化阶段：目标是除去大多数大量杂质，如其它蛋白、核酸、内毒素和病毒等。精制阶段：除去残余的痕量杂质和必须去除的杂质。分离方法的选择根据蛋白质的特殊性质采用不同的分离方法：蛋白质的性质方法电荷（等电点）离子交换（IEX）分子量凝胶过滤（GF）疏水性疏水（HIC）反相（RPC）特异性结合亲和（AC）每一种方法都有分辨率、处理量、速度和回收率之间的平衡。分辨率：由选择的方法和层析介质生成窄峰的能力来实现。总的来说，当杂质和目标蛋白性质相似时，在纯化的最后阶段分辨率是重要因素。处理量：一般指在纯化过程中目标蛋白的上样量。如上样体积、浓度等。速度：在初纯化中是重要因素，此时杂质如蛋白酶必须尽快除去。回收率：随着纯化的进行渐趋重要，因为纯化产物的价值在增加。在三阶段纯化策略中每一种方法的适用性见下表：技术主要特点捕获中度纯化精制样品起始状态样品最终状态IEX高分辨率高容量高速度低离子强度样品体积不限高离子强度或pH改变。样品浓缩HIC 分辨率好容量好高速度高离子强度样品体积不限低离子强度样品浓缩AC高分辨率高容量高速度结合条件特殊样品体积不限洗脱条件特殊样品浓缩GF高分辨率（使用Supedex）样品体积（<总柱体积的5%）和流速范围有限制缓冲液更换（如果需要）样品稀释RPC高分辨率需要有机溶剂在有机溶剂中，有损失生物活性的风险提示：1、通过组和各种方法使纯化步骤之间的样品处理减至最少，以避免需要调节样品。第一个步骤的产物的洗脱条件应适宜于下一个步骤的起始条件。2、硫酸铵沉淀是常用的样品澄清和浓缩方法，所以HIC是捕获阶段的理想方法。3、 GF很适宜在由浓缩效应的方法（IEX、 HIC、 AC）后使用，凝胶过滤对上样体积有限制，但不受缓冲液条件的影响。4、在捕获阶段选择对目标蛋白具有最高选择性或／和处理量的方法5、如果对目标蛋白的性质了解甚少的情况下，可采用IEX-HIC-GF的方法组合作为标准方案。6、只要目标蛋白耐受的情况下，可以考虑采用RPC 方法用于精制阶段。注：应该指出，三阶段纯化策略不是说所有的策略都必须是三个纯化步骤。所用的步骤数目取决于纯度要求和蛋白的最终用途。 蛋白质的蛋白质特性与分离纯化技术的选择 摘要：蛋白质的一级、二级、三级和四级结构决定了它的物理、化学、生物化学、物理化学和生物学性质，综述了不同蛋白质之间的性质存在差异或者改变条件是使之具有差异，利用一种同时多种性质差异，在兼顾收率和纯度的情况下，选择蛋白质提纯的方法。 关键词：蛋白质分离纯化 前言： 蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有成千种不同的蛋白质。蛋白质的分离和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务，到目前为止，还没有一个单独的或一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来，但对任何一种蛋白质都有可能选择一套适当的分离提纯程序来获取高纯度的制品。
蛋白纯化系统Biologic-LP使用说明
蛋白纯化系统Biologic-LP使用说明 Biologic-LP是蛋白质层析纯化系统, 其原理是利用不同蛋白分子所具有的特性（如等电点、分子量及亲水或疏水性）与层析柱中的介质产生的吸附作用后，再用相应的洗脱液来对吸附在层析柱上的蛋白进行洗脱。根据目标蛋白及不同层析柱介质的特性，设计相应的洗脱程序可以使目标蛋白与其他杂蛋白先后从层析柱上洗脱下来。通过观察紫外光的吸收峰，可分别收集不同时段洗脱下来的蛋白液。蛋白混合物通过这样的程序可被分离至单个蛋白。通常分布在混合物中的目标蛋白需要通过组合而不是单一的层析路线来进行分离操作。常规的分离路线如通过疏水层析—离子交换—疏水层析的技术路线来有效分离目标蛋白。 本层析系统使用主要分为三个部分。首先在使用前确认分离的技术路线和使用的层析柱。其次根据层析柱使用的要求配制相关试剂和确定层析过程的参数。最后通过层析操作分离纯化目标蛋白，并清洗层析柱和管道以确保仪器能长期有效使用。 一设计蛋白的纯化路线及选择不同的层析柱及层析方法根据目标蛋白的特性及来源，设计纯化的路线并确定每一步操作所需要的层析柱及层析方法。根据不同层析方法的要求，准备蛋白样品及洗脱液及洗脱方式（如线形洗脱或梯度洗脱）。而后确认层析操作中的主要参数。
二层析系统的操作 以下是对所有层析操作中共同的步骤进行的描述。特别注意的是不同的分离方式如离子交换和疏水层析它们的原理和参数设置完全不同。这里仅就相同的操作进行描述，具体的参数设置见使用说明书并咨询负责本仪器的老师，切不可擅自操作，以免破坏仪器。 1、确定目标蛋白层析柱的选择，不同的分离方式选择不同的层析柱。 2、样品制备。根据层析柱介质对蛋白样品的要求，制备样品和洗脱 液。所有用于层析的溶液及样品均要通过0.45μm膜过滤，以免堵塞层析柱。 3、打开层析仪电源，按照显示屏的提示，分别设置好A液、B液、 流速、时间等相关参数，并将接样管插入接样仪。 4、打开电脑及Biologic-LP Data View软件，观察层析过程是否正常 或是否需要调整，做好接样前的准备。 三、层析系统的维护 操作结束后，按仪器使用说明，清洗层析柱及管道，将层析柱保存好，备用。特别注意不同的层析柱要求的清洗方式不同，对管道的清洗也不同，层析柱的保存方式也不同。清洗和保存时一定要按照使用说明书的要求进行操作，不能出现错误以免对层析系统造成破坏。
(推荐)蛋白纯化-Ni亲和层析柱法
Ni亲和层析柱法纯化带组氨酸标签的重组蛋白 纯化设备： 纯化仪：?KTA purifier(GE Healthcare, Uppsala, Sweden) Ni亲和层析柱：HisTrap TM HP-5 mL (GE Healthcare, , Uppsala, Sweden) 试剂： 所有上柱的试剂均需经0.2 μM孔径过滤器过滤并超声波震荡除气处理方可使用。 Binding Buffer：20 mM Na2HPO4-NaH2PO4, pH 7.4, 500 mM NaCl, 5 mM 咪唑 Elution Buffer：20 mM Na2HPO4-NaH2PO4, pH 7.4, 500 mM NaCl, 500 mM 咪唑 Stripping Buffer: 20 mM Na2HPO4-NaH2PO4, pH 7.4, 500 mM NaCl, 50 mM EDTA 20%乙醇：200 mL无水乙醇，加蒸馏水定容至1L 0.1M NiSO4: 称取2.6284g NiSO4·6H2O，加蒸馏水溶解，定容至100 mL 操作步骤： 1 样品前处理 取诱导后菌液50 mL，4℃、5000 rpmin离心10 min收集菌体，以25 mL Binding Buffer 重悬菌体，冰浴下超声波破碎至澄清，4℃、12000 rpmin离心25 min，取上清，经0.2 μM 孔径过滤器过滤后待用。 2 Ni柱前处理 上样前，使用10倍柱体积的Binding Buffer以5 mL/min的流速平衡镍柱。 3 上样 经离心、过滤处理后的样品以1 mL/min的流速通过衡流泵加载到平衡后的Ni柱上，收集穿透液，可反复上样以提高样品的挂柱效率。 4 平衡上样后的Ni柱 将已结合目的蛋白的Ni柱回接到?KTA pur ifier上，用10倍柱体积的Binding Buffer 以5 mL/min的流速再次平衡镍柱以去除未结合上的蛋白。 5 梯度洗脱 以梯度的Elution Buffer/Binding Buffer混合液洗脱Ni柱(梯度的界定因蛋白而不同，可经预实验确定)，流速为5 mL/min，并监测OD280值，收集蛋白吸收峰对应的洗脱液
分离纯化蛋白质的方法及原理
（二）利用溶解度差别 影响蛋白质溶解度的外部因素有：1、溶液的pH；2、离子强度；3、介电常数；4、温度。但在同一的特定外部条件下，不同蛋白质具有不同的溶解度。 1、等电点沉淀：原理：蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。因此在其他条件相同时，他的溶解度达到最低点。在等电点之上或者之下时，蛋白质分子携带同种符号的净电荷而互相排斥，阻止了单个分子聚集成沉淀，因此溶解度较大。不同蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时的溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。当pH被调到蛋白质混合物中其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来，那些等电点高于或低于该pH的蛋白质则仍留在溶液中。这样沉淀出来的蛋白质保持着天然的构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。 5、盐析与盐溶：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质与水分子之间的相互作用却加强，因而溶解度增高。球蛋白溶液在透析过程中往往沉淀析出，这就是因为透析除去了盐类离子，使蛋白质分子之间的相互吸引增加，引起蛋白质分子的凝集并沉淀。当溶液的离子强度增加到一定程度时，蛋白质溶解程度开始下降。当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析。盐析作用主要是由于大量中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水。此时那些被迫与蛋白质表面的疏水集团接触并掩盖他们的水分子成为下一步最自由的可利用的水分子，因此被移去以溶剂化盐离子，留下暴露出来的疏水基团。蛋白质疏水表面进一步暴露，由于疏水作用蛋白质聚集而沉淀。 盐析沉淀的蛋白质保持着他的天然构象，能再溶解。盐析的中性盐以硫酸铵为最佳，在水中的溶解度很高，而溶解度的温度系数较低。 3、有机溶剂分级分离法：与水互溶的有机溶剂（甲醇、乙醇和丙酮等）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。在室温下有机溶剂会引起蛋白质变性，如果预先将有机溶剂冷却到-40°C以下，然后在不断搅拌下逐滴加入有机溶剂，以防局部浓度过高，那么变性可以得到很大程度缓解。蛋白质在有机溶剂中的溶解度也随温度、pH和离子强度而变化。在一定温度、pH和离子强度条件下，引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同，因此控制有机溶剂浓度也可以分
Ni柱亲和层析纯化poly-his变性重组蛋白的标准操作规程
Ni柱亲和层析纯化poly-his变性重组蛋白的标准操作规程（编号：066）1、目的及适用范围 利用Ni2+鳌合层析纯化体外表达的带有His标签的包涵体重组蛋白。 2、主要仪器 超声破碎仪、冷冻离心机、Ni柱、垂直混匀仪 3、主要试剂 3.1 裂解Buffer：50mM Tris，5mM EDTA，0.8%NaCl，pH8.5 3.2 变性剂：6M盐酸胍，2mM EDTA， 50mM Tris，10mM DTT，pH8.5 3.3 Buffer B：8M尿素，0.1M NaH2PO4，10mM Tris，pH8.0 3.4 Buffer C：8M尿素，0.1M NaH2PO4，10mM Tris，pH6.3 3.5 Buffer D：8M尿素，0.1M NaH2PO4，10mM Tris，pH5.9 3.6 Buffer E：8M尿素，0.1M NaH2PO4，10mM Tris，pH 4.5 4、相关的预处理 Ni柱的预处理： 4.1用5个柱体积的无菌水冲洗柱子； 4.2用5个柱体积的0.1M NiSO4冲洗柱子，使柱子挂Ni； 4.3用5个柱体积的无菌水冲洗柱子，除去多余的Ni； 4.4用5个柱体积的酸性Buffer冲洗柱子（使柱子变得疏松）； 4.5用5个柱体积的Buffer B平衡柱子。 5、操作步骤 5.1蛋白的纯化 5.1.1大肠杆菌诱导表达目的蛋白； 5.1.2 4500rpm，离心10-15min，收集菌体； 5.1.3用裂解buffer重悬菌体，8000rpm离心10min，弃上清，收集菌体； 5.1.4 将菌体用裂解buffer重悬，超声破碎菌体； 5.1.5 4℃，12000rpm离心15min，弃上清； 5.1.6 将沉淀用PBST洗涤，4℃，12000rpm离心10min，重复1次； 135
蛋白纯化层析柱
蛋白纯化层析柱 2011-06-15 15:19:14 易生物仪器浏览次数:1164 网友评论 0 条 从个人学术性实验室到大型的医药制造企业，小型或者大规模的蛋白纯化通常都需要几种类型的液相色谱仪。这些相关的大部分技术已应用了多年，但是新型柱料的发展为这些利用蛋白物理和化学特性进行分离的，经过时间考验的方法注入了新的力量。其中最值得提到的就是... 关键词:蛋白离子交换分离分子物质树脂从个人学术性实验室到大型的医药制造企业，小型或者大规模的蛋白纯化通常都需要几种类型的液相色谱仪。这些相关的大部分技术已应用了多年，但是新型柱料的发展为这些利用蛋白物理和化学特性进行分离的，经过时间考验的方法注入了新的力量。其中最值得提到的就是凝胶过滤层析技术(gel filtration，GF)，离子交换层析技术(ion exchange，IEX)，羟基磷灰石层析(hydroxyapatite，HAP)和疏水作用层析(hydrophobic interaction，HI)，以及亲和层析和高效液相色谱方法(high-performance liquid chromatography，HPLC)。 对于一个初接触蛋白纯化的新手而言，从哪儿下手也许是令人头疼的一件事，但是幸运的是目前这些流程都已经逐步系统化了。GE Healthcare(原Amersham Biosciences)的技术顾问Andrew Mitchell解释道，通常利用液相色谱技术进行蛋白纯化有三步: 捕获——从细胞其它成份，比如DNA和RNA中分离需要的蛋白; 区分——从与目的蛋白具有相近的大小，或者相似的物理/化学特征的污染物中分离蛋白; 修饰——使分离得到的样品处于可使用状态。 这每一个纯化的步骤都有特定的色谱层析技术和最佳的beads大小。
重组蛋白质的分离纯化 (1)
重组蛋白质的分离纯化 摘要：90年代以来基因重组技术得到很大的发展，基因工程产品的分离纯化的成本约占其全部成本的60%～80%，因此重组蛋白的分离纯化技术越来越重要。本文主要介绍了沉淀、液液萃取、层析等常用分离重组蛋白方法的原理及应用，旨在为开展蛋白质的制备及其应用研究提供理论依据。 关键词：重组蛋白质；分离；纯化；沉淀；液液萃取；层析；包涵体 随着基因重组技术的发展，出现了很多基因工程产品，而作为基因工程技术的下游工程中的基因重组蛋白的分离纯化技术越来越显示其重要性。据有人统计,基因工程产品的分离纯化成本约占到其全部成本的60%～80%[1]。由此可见产品的分离纯化是获得目的产物的关键一步，也是比较困难的一步，它标志着生物产业的高低。 纯化重组蛋白质和普通蛋白质的不同就在于要选择合适的表达系统，因为表达系统决定了细胞培养过程中产物的性质以及可能产生的杂蛋白，而纯化重组蛋白质的主要目的是去除杂蛋白质，通常对一种重组蛋白质的纯化会采用多个系统[2]。但是重组蛋白有几种不同的表达形式，如细胞外的分泌表达；细胞内可溶性表达以及包涵体形式的存在，因此对于重组蛋白的纯化要依据其表达形式的不同，采取不同的纯化工艺。 与传统方式相似，重组蛋白的分离纯化也是利用其物理和化学性质的差异，即以分子的大小、形状、溶解度、等电点、亲疏水性以及与其它分子的亲和性等性质建立起来的。目前主要的纯化方法有浓缩沉淀法，层析和电泳技术。 重组蛋白质在分离纯化的过程中，必须维持一定的浓度和生物活性形式，以及防止被降解。因此从生物体中有效分离纯化重组蛋白质一直是个难题。90 年代以来,国内外许多科学工作者在蛋白质分离纯化技术和工艺上进行了大量的研制和开发,将原有的纯化技术水平提高到一个新的高度。本文将简单介绍一些传统的分离纯化方法，并介绍近10 年来重组蛋白分离纯化中的新进展和一些新出现的技术。 1 沉淀分离技术 1.1 盐析法其原理是蛋白质在高浓度盐溶液中，随着盐浓度的逐渐增加，由于蛋白质水化膜被破坏、溶解度下降而从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同,因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀分离各种蛋白质。盐析法的特点是成本低,不需要特别设备，操作简单、安全,对蛋白质的一些生物活性成分破坏较少,缺点是选择性不强。 1.2 有机溶剂沉淀法向蛋白质溶液中加入丙酮或乙醇等水溶性有机溶剂，降低水的活度，随着有机溶剂浓度的增大，水对蛋白质分子表面荷电基团或亲水基团的水化程度降低，溶液的介电常数下降，蛋白质分子间的静电引力增大，从而使蛋白质凝聚和沉淀。其特点是：选择性高；其次，沉淀后所得产品不需脱盐，残留的沉淀剂通过挥发即可除去。但是有机沉淀剂对具有生物活性的蛋白质、酶类具有失活作用，因而常常需在低温下进行操作。 1.3 等电点沉淀法其原理是通过调节溶液的pH值，使两性电解质在溶液pH值处于等电
蛋白纯化AKTA操作说明#(优选.)
AKTA pure操作说明 分子筛层析操作步骤： 1. 开机： 打开AKTA pure开关，看指示灯，泵同步（泵内有注入液体的声音）。 2. 打开系统： 打开电脑：双击Unicorn 7.0打开系统，进入log on 界面，用户名默认为Default，输入密码：default，点ok键，出现提示对话框，继续点确定，进入系统。 注意：进入系统时会弹出三个界面：System Control界面，Evaluation界面和Administration界面。其中system Control界面为主操作窗口，所有的设置选项都是在该界面下完成：Manual---Execute Manual instructions---......；Evaluation界面为结果数据查看及处理窗口；Administration界面为Unicorn 7.0系统设置界面。 3. 洗泵： 把A1泵头从20%乙醇中取出，用去离子水冲洗，放入分子筛缓冲液中，在System Control界面下，点击manual---Execute Manual instructions---Pumps---Pump A wash---点开inlet，选择A1---Excuse。 4. 设置系统参数： 设柱压：Alams---alam systerm pressure---high alam---设置柱压---Execute； 设流速：Pumps---System flow ---设置system flow（1mL/min）---Execute。 注意：流速和柱压设置参照“GE蛋白纯化柱表”，不要超出最高限制。 5. 装柱子(先上后下)： 接柱子的上面：拧下连接进样阀和检测器之间的线，等进样阀出口有液体流出时，拧开柱上面线头的螺帽，将它连到进样阀出口； 接柱子的下面：去掉柱下端连接的注射器，连上接头，连上一段线，待液体滴出滴出液体滴到检测器上的连接口的洞里，滴满，将接头连到检测器的连接口里。 6.平衡柱子： 分子筛buffer平衡柱子，一般要两个小时左右，盐离子浓度达到5.5%左右。 7.设置系统及收集参数： 命名：先end---Manual instructions，点击browse，弹出select result name&location 界面，点开文件夹“defaultHome”，找到文件夹“labdata”，点开，选择自己名字 首字母缩写文件夹(已创建)，在界面下方“name”指令框进行命名。 注意：命名时要标明日期，柱子型号，样品名称。 设流速：Pumps---System flow---设流速（1 mL/min）---Execute； 设柱压：Alams--- alam systerm pressure---high alam---设置柱压---点击Execute； 洗A泵：Pumps---Pump A wash---点开inlet，选择A1---Excuse； 紫外调零：Monitors---Auto zero UV---Execute；
蛋白纯化办法大全及优缺点比较
蛋白纯化方法大全及优缺点比较 1.?蛋白沉淀蛋白能溶于水是因为其表面有亲水性氨基酸，在蛋白质的等电点处若溶液的离子强度特别高或者特别低，蛋白则倾向于从溶液中析出。硫酸铵是沉淀蛋白最常用的盐，因为它在冷的缓冲液中溶解性好，冷的缓冲液有利于保持目的蛋白的活性。硫酸铵分馏常用作试验室蛋白纯化的第一步，它可以初步粗提蛋白质，去除非蛋白成分。蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳定，可以短期在这种状态下保存中间产物，当前蛋白质纯化多采用这种办法进行粗分离翻。在规模化生产上硫酸铵沉淀方法仍存在一些问题，硫酸铵对不锈钢器具的腐蚀性很强。其他的盐如硫酸钠不存在这种问题，但其纯化效果不如硫酸铵。除了盐析外蛋白还可以用多聚物如PEG和防冻剂沉淀出来，PEG是一种惰性物质，同硫酸铵一样对蛋白有稳定效果，在缓慢搅拌下逐渐提高冷的蛋白溶液中的PEG浓度，蛋白沉淀可通过离心或过滤获得，蛋白可在这种状态下长期保存而不损坏。蛋白沉淀对蛋白纯化来说并不是多么好的方法，因为它只能达到几倍的纯化效果，而我们在达到目的前需要上千倍的纯化。其好处是可以把蛋白从混杂有蛋白酶和其他有害杂质的培养基及细胞裂解物中解脱出来。 2.缓冲液的更换?虽然更换缓冲液不能提高蛋白纯度，但它却在蛋白纯化方案中起着极其重要的作用。不同的蛋白纯化方法需要不同pH及不同离子强度的缓冲液。假如你用硫酸铵将蛋白沉淀出来，毫无疑问蛋白是处在高盐环境中，需要想办法脱盐，可用的方法有利用半透膜透析，通过勤换透析液体去除盐分，此法尚可，但需几个小时，通常要过夜，也难以用予大规模纯化中。新型的设备将透析膜夹在两个板中间，板的一侧加缓冲液，另一侧加需脱盐的蛋白溶液，并在蛋白溶液一侧通过泵加压，可以使两侧溶液在数小时内达到平衡，若增加对蛋白溶液的压力，还可迫使水分和盐更多通过透析膜进入透析液达到对蛋白浓缩的目的。也有出售的脱盐柱，柱内的填料是小孔径的颗粒，蛋白分子不能进入孔内，先于高浓度盐离子从柱中流出，从而使二者分离。蛋白纯化的每一步都会造成目的蛋白的丢失，缓冲液平衡的步骤尤甚。蛋白会结合在任何它能接触的表面上，剪切力、 起泡沫和离子强度的快速变化很容易让蛋白失活。 3.离子交换色谱这是在所有的蛋白纯化与浓缩方法中最有效方法。基于蛋白与离子交换树脂间的相互电荷作用，通过选择不同的缓冲液，同一种蛋白既可以和阴离子交换树脂（能结合带负电荷的分子）结合，也可以和阳离子交换树脂结合。树脂所用的带电基团有四种：二乙基氨基乙基用于弱的阴离子交换树脂；羧甲基用于弱的阳离子交换树脂；季铵用于强阴离子交换树脂；甲基磺酸酯用于强阳离子交换树脂。蛋白质由氨基酸组成，氨基酸在不同的pH环境中所带总电荷不同。大多数蛋白在生理pH（pH6～8）下带负电荷，需用阴离子交换柱纯化，