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中国农业科学 2007,40(8):1843-1848
Scientia Agricultura Sinica
化学去核卵母细胞为受体的小鼠体细胞核移植
杜卫华1，2，李世杰3，郑 敏1，戴蕴平1，李 宁1
（1中国农业大学农业生物技术国家重点实验室，北京 100094；2中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100094；
3河北农业大学生命科学院，保定 071001）
摘要：【目的】本研究旨在探索一种崭新的、化学试剂诱导去核卵母细胞为核受体的、无透明带的、手工体细胞核移植方法。【方法】将第一次减数分裂期小鼠卵母细胞进行诱导去核并去除透明带，去核卵胞质与胎儿成纤维细胞粘合、电融合和SrCl2激活后，体外培养重构胚。【结果】重构胚融合率和激活率分别为84.8％和93.6％；
胚胎2-细胞发育率为24.7％，4-细胞率为6.74％；2-细胞期克隆胚移植假孕受体后，没有获得怀孕受体；分别以“血清饥饿”胎儿成纤维细胞、新鲜细胞和冷冻保存细胞为供体作核移植，结果表明，冷冻保存细胞的融合率（69.3％）与其余两组（80.6％和84.8％）呈显著差异（P＜0.05）；激活率、2-细胞和4-细胞发育率，则3组间差异不显著（P＞0.05）。【结论】本文将小鼠卵母细胞的化学去核与无透明带技术相结合，获得的克隆胚目前已发育到4－细胞期；另外，供体细胞的3种准备方式均不影响胚胎发育率。该方法属手工克隆，它的成功将会大大简化核移植程序，提高核移植总效率。
关键词：化学去核；无透明带；手工克隆（HMC）；小鼠
Reconstruction of Mouse Embryos with Chemically
Enucleated Oocytes
DU Wei-hua1,2, LI Shi-jie3, ZHENG Min1, DAI Yun-ping1, LI Ning1
(1State Key Laboratory for Agribiotechnology, China Agricultural University, Beijing 100094; 2Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100094; 3College of Life Science, Hebei Agricultural University, Baoding 071001)
Abstract: 【Objective】The objective of this sludy was to describe a handmade cloning method which combines the chemical induced enuleation and zona-free technology in embryo culture. 【Method】Enuleated oocytes were derived by exposing the oocytes to demecolcine and cytoheximide supplemented mdium sequently and its chromosome was depleted to the first polar body. Then the zona and polar body of oocytes treated with drugs were removed by transferring into the M2 containing 0.5% protease. The mouse fetal fibroblast cells were glued to the zona-free oocytes membrane with phytohemagglutinin. Consequently the oocyte-cell couplets were fused by electronic pulse and the reconstructed embryos were transferred into M16 and cultured in well of well after activation with SrCl2 for 6 h. 【Result】The rate of successful fusion was 84.8% and 24.7% of reconstructed embryo cleaved. Embryos in 4-cell stage were derived by this method (6.74%). No pregnancy was observed after the 2-cell embryos were transferred to the surrogate mouse. Additionally, the effect of 3 protocols for donor preparation on the development of reconstructed embryos was studied. The results showed that there were no significant differences among groups except fusion rate(P＞0.05). And thus the freeze preservation is a simple but efficacious protocol for preparing donor cells in nuclear transfer. 【Conclusion】Further research is required to improve the developmental potential of reconstructed embryos produced by this new method and its availability will greatly facilitate the nuclear transfer in mammal.
Key words:Induced enucleation; Zona free; Handmade cloning (HMC); Mouse
收稿日期：2006-02-27；接受日期：2006-09-28
基金项目：国家“863”计划（2001AA213091）和北京市自然科学基金重大项目（5030001）
作者简介：杜卫华（1974-），女，山西太谷人，博士，研究方向为动物胚胎工程与繁殖。Tel：010-********；E-mail：dwh679@https://www.wendangku.net/doc/d07888430.html,。通讯作者李宁（1962-），男，江西南昌人，教授，研究方向为动物生物化学与分子生物学。Tel：010-********；E-mail：ninglbau@https://www.wendangku.net/doc/d07888430.html,
1844 中国农业科学40卷
0 前言
【研究意义】卵母细胞的化学去核是在极体排出阶段，采用干扰染色体分离或纺锤体正常功能的化学试剂，使其所有染色质通过纺锤丝牢固结合；同时蛋白合成抑制剂抑制细胞周期蛋白B的合成，降低促成熟因子浓度，因而极体借助于惯性将染色质和纺锤体全部带出胞外，达到去核目的。与传统的机械去核相比，该方法对卵母细胞无机械损伤，完全是极体的自然排放；同时细胞质及其中核重编程相关因子损失量小；而且高效、省时，程序简单，所得的卵胞质或许更适合于供体细胞核的重编程。【前人研究进展】目前经化学去核处理的MII期卵母细胞为受体，已获得克隆小鼠[1]。而在其它动物，化学去核只是作为辅助手段来制备克隆动物[2~4]。无透明带卵母细胞为受体，胚胎细胞克隆牛的成功诞生使核移植完全脱离显微操作[5]，发展为手工克隆（hand-made cloning，HMC）。2004年Tecirlioglu等采用该法成功获得体细胞克隆牛，这是科学家首次用无透明带方法制备的哺乳动物体细胞克隆，也是首次利用HMC获得体细胞克隆动物[6]。另外无透明带技术也应用于猪[7]、羊[8]和小鼠[9]，克隆胚发育到囊胚。【本研究切入点】本研究第一次减数分裂期小鼠卵母细胞经DC和CHXM的顺序、组合处理后，其所有染色质排放于第一极体，酶消化去除其透明带和极体，将去核卵胞质与体细胞粘合、电融合并经SrCl2激活后，体外培养重构胚；同时实验比较了血清饥饿胎儿成纤维细胞、新鲜细胞和冷冻保存细胞对体细胞核移植的影响。【拟解决的关键问题】以化学去核的小鼠卵母细胞为受体，胎儿成纤维细胞为供体，进行核移植；同时，比较供体细胞的3种准备方式对胚胎发育的影响。该方法完全丢弃了传统核移植的显微操作及其繁琐程序，属于HMC，它的成功将大大简化核移植程序，提高核移植效率，加快其产业化的步伐。
1 材料与方法
1.1 动物与试剂
雌性Balb/C×ICR F1小鼠、C57BL/6雌鼠、DBA2雄鼠均购自北京市维通利华公司。M199、PBS购自GIBCO公司；M16、M2、脱羰秋水仙碱（DC）、放线菌酮（CHXM）、链霉蛋白酶、植物凝集素（PHA）、Hoeschest33342等试剂均购自Sigma公司。
1.2 卵母细胞的化学去核和透明带的去除
根据之前的报道[10]进行，完全去核的卵胞质，置M16中，37℃、5%CO2培养箱中备用。
1.3 供体细胞－小鼠胎儿成纤维细胞系的建立
引颈处死妊娠15 d的孕鼠，解剖获得胎鼠，无菌处理；进行组织植块培养建系和传代。
1.4 核移植中供体细胞的制备
体外培养2～7代的小鼠胎儿成纤维细胞用于核移植。Ⅰ供体细胞的血清饥饿：核移植前5 d将培养液中的FBS浓度降到0.5%开始血清饥饿；在移核操作前2～3 h，0.1%胰蛋白酶溶液消化贴壁细胞，无Ca2＋、Mg2＋的平衡盐溶液终止消化，离心除去上清溶液，用10%血清的无Ca2＋、Mg2＋的平衡盐溶液将细胞沉淀重新悬浮，37℃培养箱中备用；Ⅱ新鲜供体细胞的准备:移核前2～3 h，处理细胞，方法同Ⅰ；Ⅲ-70℃冷冻保存供体细胞的准备：在移核操作前2～3 h，将冻存的细胞复苏，处理细胞，方法同Ⅰ。
1.5 供体细胞与无透明带去核卵母细胞的粘合和电
融合
将去核的无透明带卵胞质移入PHA液（200 μg·ml-1）；移入体细胞悬液，与体细胞粘贴，形成卵母细胞-体细胞复合体；复合体于融合液中平衡后，转入电击槽；施加1个5 v/mm、3 μs交流电脉冲和2个92 v/mm、70 μsec直流电脉冲；复合体移入M16，37℃、5％CO2培养，20～30 min后检查融合情况；融合的复合体移入M16+CB（5 μg·ml-1），直到激活。
1.6 卵母细胞-体细胞复合体的化学激活
融合3 h后，将卵母细胞-体细胞复合体移入M16（无Ca2＋、Mg2＋）+SrCl2（10 mmol·L-1）；6 h后，移入培养滴M16，37℃、5%CO2培养箱培养。
1.7 重构胚的输卵管移植
依据Nagy描述的方法进行[11]。
1.8 统计方法
所得数据由SAS（edition 8.1）ANOVA 分析，P ＜0.05认为差异显著，P＞0.05差异不显著。
2 结果与分析
2.1 小鼠胎儿成纤维细胞系的建立
取5只15日龄的C57BL/6×DBA2 F1胎鼠，经植块培养后成功建立胎儿成纤维细胞系（图1-1）。该细胞的外形与体内成纤维细胞形状相似，胞体大致呈梭形；胞质近中央处有椭圆形细胞核，胞体一般铺展很开。接种密度较小时，细胞间排列疏松，有较大细胞间隙（图1-2）；密度较大时，细胞相互平行排列，
8期 杜卫华等：化学去核卵母细胞为受体的小鼠体细胞核移植
1845
1：原代培养细胞，可见组织块；2：接种密度小时，细胞间隙较大，细胞呈梭形
1: Primary cultured mouse fetal fibroblast cells with tissue mass; 2: Cells showing the typical spindle-shape when the density was small
图1 小鼠胎儿成纤维细胞的相差显微镜照片
Fig. 1 Phase-contrast photo microscopy of cultured mouse
fetal fibroblast cell
成群细胞呈漩涡状或放射状走形式。 2.2 小鼠体细胞核移植重构胚的制备
小鼠胎儿成纤维细胞（新鲜细胞）与去核卵母细胞（图2-1）经PHA 粘合后（图2-2），进行电融合，融合率达84.8%（表1）；经SrCl 2激活后，93.6%重
构胚形成1～3个原核（图2-3），表明重构胚已被激活。从激活处理开始计时，体外培养24 h 后，24.7%重构胚卵裂为2-细胞（图2-4）；48 h ，4-细胞率达6.74%（图2-5）。将部分2-细胞期胚胎移植假孕受体后，没有观察到受体怀孕。
2.3 体细胞的不同处理对重构胚发育的影响
试验中使用了3种不同处理的供体细胞：0.5%血清饥饿细胞、新鲜细胞和-70℃冷冻保存细胞。按同样
1：无透明带去核卵母为核移植的核受体；2：PHA 使去核卵母细胞与供体细胞粘合；3：SrCl 2激活后重构胚形成原核；4：重构胚分裂为2-细胞；5：4-细胞期的重构胚
1: Enucleated oocyte without zona in somatic nulear transfer; 2: Donar cell adhensive to the enuleated oocyte with PHA; 3: Pronulea formed after activation by SrCl 2; 4: 2-cell stage reconstructed embryo; 5: 4-cell stage reconstructed embryo
图2 小鼠体细胞核移植重构胚的制备
Fig. 2 Production of reconstructed embryos in mouse somatic nuclear transfer
表1 体细胞核移植重构胚的体外发育
Table 1 Development of reconstructed embryos with oocytes enucleated by chemical induction
体外发育阶段 Phase of development in vitro 操作卵数
Number of manipulated oocytes
融合数(率%)1)
Number of fused embryos
激活数(率%)2)
Number of activated embryos
2-细胞数(率%)3)
Number of 2-cell embryo
4-细胞数(率%)3) Number of 4-cell embryo
224 190(84.8) 178(93.6) 44(24.7) 12(6.74) 1) %基于操作卵数，2) %基于融合卵数，3) %基于激活卵数。下同
1)
% was based on the total number of manipulated oocytes. 2) % was based on the number of fused embryos. 3）
% was based on the number of activated embryos. The same as below
的程序、相同的融合参数、激活和体外培养方案做核移植，结果显示（表2），冷冻保存供体细胞的融合率显著低于血清饥饿细胞和新鲜细胞（P ＜0.05＝，但激活率、重构胚的2-细胞率和4-细胞率均与其余两组无显著差异（P ＞0.05）。
3 讨论
本研究将第一次减数分裂期小鼠卵母细胞进行诱
导去核并去除透明带，去核卵胞质与胎儿成纤维细胞 粘合、电融合并SrCl 2激活后，体外培养重构胚。目前重构胚已发育到4-细胞期；2-细胞期克隆胚经输卵管移植假孕受体后，没有获得怀孕受体；分别以“血清饥饿”胎儿成纤维细胞、新鲜细胞和冷冻保存细胞为供体作核移植，结果除融合率外，3组间差异不显著（P ＞0.05）。本文将化学去核与无透明带技术相结合，完全丢弃了传统核移植的显微操作及其繁琐程序，
1846 中国农业科学40卷
表2 不同处理供体细胞对重构胚发育的影响
Table 2 Effect of somatic cell treated by different methods on the development of reconstructed embryos
供体细胞Donor cell
操作卵数
Number of manip-
ulated oocytes
融合数(率%)
Number of fused
embryos
激活数(率%)
Number of activated
embryos
2-细胞数(率%)
Number of 2-cell
embryo
4-细胞数(率%)
Number of 4-cell
embryo
血清饥饿细胞Serum starvation 256 206(80.5)A 184(89.3)A 43(23.4)A 13(7.1)A
新鲜细胞Fresh cell 224 190(84.8)A 178(93.6)A 44(24.7)A 12(6.7)A
冷冻保存细胞Freezing cell 218 151(69.3)B 138(91.4)A 29(21.0)A 7(5.1)A AB同一列如有不同字母则表明差异显著(P＜0.05)，如有相同字母表明差异不显著(P＞0.05)
AB values within columns with different superscripts are significantly different (P＜0.05)；with same superscripts are not significantly different (P＞0.05)
是纯粹的手工克隆，它的成功将会大大简化核移植程序，提高核移植总效率，同时提高了核移植的生产力。当然该方法体系还不成熟，有待于进一步研究和探索。
随着体细胞核移植在多种哺乳动物获得成功，核移植也得到不断发展[12]。传统核移植一般使用显微操作系统，包括“罗斯林方案”，其以乳腺上皮细胞为供体，生产了世界首例成年体细胞克隆绵羊[13]；其次是“檀香山方案”，借助压电装置将供体细胞核直接注射到卵母细胞质中，无需电融合[14~16]；第三种是损伤修复法，只利用传统显微操作注射供体细胞核于去核卵母细胞质[17]。
上述方案中去核过程均由物理方法完成，对卵母细胞的机械损伤较大；除了移走染色体外，还不可避免地造成细胞质含量的减少和一些重要的、存在于卵胞质中核重编程相关因子的丢失。化学去核借助于极体的自然排放，其损伤小，方法简单，因而备受关注。本文中，小鼠第一次分裂期卵母细胞的完全去核率平均为85.6%[10]，整个过程中无细胞死亡；与物理去核相比，去核率提高。而且将已激活的MⅡ期卵母细胞进行化学去核后，获得了克隆小鼠[1]；另外化学去核相关试剂也用于辅助制备体细胞克隆猪[2,3]、牛[18]和兔[4]，说明化学去核的卵母细胞质同样支持供体基因组的重编程和胚胎发育满期的能力。
核移植以卵母细胞为核受体，其最外层的透明带使显微操作在传统方法中成为必然，因此透明带的去除成为HMC的必备条件。Vajta等手工生产了牛体细胞克隆胚胎[19]；Tecirlioglu等获得首例体细胞克隆牛[6]，这是科学家首次通过手工核移植和无透明带技术生产的体细胞克隆。但目前并无利用无透明带小鼠卵母细胞做核移植受体的报道，本文将其应用于小鼠的手工克隆，克隆胚已发育到4-细胞期，可见无透明带技术也适用于小鼠，当然无透明带小鼠胚胎的体外培养体系还有待于进一步的改进，以提高其囊胚发育率[9]。
在核移植中，供体核的重编程涉及到染色质和细胞质成分的大量交换，核中超过75%蛋白从核中丢失[20]；另外卵母细胞质中存在减数分裂时调节染色体变化的细胞因子，如AKAP95（A-kinase anchoring protein 95）等，与供体核的重编程有关；所以供体核较长时间的暴露于卵母细胞质，使得这些因子从卵胞质从容进入供体核，有利于供体核的重编程[21]；因此笔者在供体细胞与去核卵母细胞融合后3h，进行激活，以提高供体核的重编程能力。
在激活后，93.6%重构胚形成1～3个原核（图2-3），该结果与第一只克隆小鼠结果相似[14]；在激活后5h，Wakayama发现：每一个重构胚的细胞质中均存在两个假原核，其周围还有明显的、不同数量的、大小不一的类核仁出现。在核移植过程中，当供体核与MII期卵母细胞融合后，胞质中的高活性MPF （maturation- promoting factors）引起核膜破裂和染色质凝集；激活后1 h，染色体分离并重新形成两个部分。而不同大小和数量的假原核的形成正是染色体随机分离的结果。
另外，本试验中24.7%重构胚卵裂为2-细胞，6.74%的重构胚发育到4-细胞期，显著低于传统的核移植方法，其原因主要有两个方面。第一，试验所采用的去核方法为化学物诱导去核，使用的试剂为DC，是微管蛋白的合成抑制剂；而微管蛋白是纺锤体的基本结构和功能单位；在去核过程中，DC抑制后期纺锤体极间牵丝微管蛋白的装配，阻止纺锤体的延伸，使其两端的染色质通过纺锤丝牢固结合，然后随第一极体排出的惯性将所有染色体带出胞外；且整个过程中，DC的作用时间长达10～12 h。而重构胚形成后，需要微管蛋白重新组装整个胚胎的细胞骨架，完成胚胎发育的正常功能。所以DC对微管蛋白的抑制作用的可逆性和可逆恢复的程度均影响重构胚以后的发育；目前，这方面的研究正在进行中。第二，本研究
8期杜卫华等：化学去核卵母细胞为受体的小鼠体细胞核移植 1847
获得的重构胚均为无透明带胚胎，其培养与有透明带胚胎大为不同。在培养过程中，需要避免胚胎间的粘连和融合；每个胚胎需要有单独的生长空间等等，因此高效的、无透明带小鼠胚胎的体外培养体系成为本研究必需具备的条件之一。然而，该试验所用的培养体系还不够完备，1-细胞无透明带受精卵的囊胚率仅为40%（数据未发表），远远低于有透明带的受精卵（88%）；因此该体外培养体系还需要进一步的优化。
体细胞核移植研究中，供体细胞的准备总体可分为3种。第一种是“血清饥饿”，使供体细胞达到休眠期（G0期），这在绵羊被认为是成年供体核支持胚胎发育到期的关键[13,22]。第二种方案是当细胞达到70%～80%汇合时直接消化脱壁，马上用于核移植；并首先成功获得转基因克隆牛[23]。第三种方案是在核移植之前，直接从新鲜组织分离供体细胞，然后借助于压电装置把供体细胞核直接注射到小鼠去核卵母细胞胞质中[14]。本文采用了冷冻保存供体细胞[24]，其原理为通过低温降低细胞的各种代谢。结果表明，与“血清饥饿”细胞和新鲜细胞相比，除融合率外，其胚胎发育率均没有显著差异，因此冷冻细胞也可作为核移植中供体细胞的准备方案之一。Liu等利用冷藏15d 左右的细胞作供体，结果与本实验相符[25]。冷冻或冷藏细胞可以一次准备大量来源相同、遗传特性一致的细胞，适用于大量而频繁的核移植循环中，尤其对于克隆动物的生产规模化具有启示意义，也特别适合珍稀动物或珍贵细胞。
与传统方法相比，手工克隆生产效率高，平均每人每天可操作150枚体外成熟卵母细胞，产生囊胚25～30枚，因而它可代替传统技术来大规模生产哺乳动物胚胎。本文将化学去核与无透明带技术相结合，以期提高核移植效率，简化核移植过程，进而推进体细胞核移植胚胎的商业化。
4 结论
4.1 以经化学去核处理的第一次减数分裂期小鼠卵母细胞为受体，胎儿成纤维细胞为核供体，构建的重构胚已发育到4-细胞期。
4.2 以“血清饥饿”胎儿成纤维细胞、新鲜细胞和冷冻保存细胞为供体作核移植，除融合率外，3组间差异不显著（P＞0.05）；所以冷冻也可作为小鼠核移植过程中供体细胞的准备方案。
4.3 将化学去核与无透明带技术相结合而成的手工克隆方法用于小鼠，获得重构胚。该方法的成功将简化核移植过程，提高体细胞克隆效率。
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（责任编辑林鉴非）